Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN XUÂN VIỆT

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY, CHUYỂN HÓA
SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ
DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia lipolytica



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC







Hà Nội - 2014
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN XUÂN VIỆT

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY, CHUYỂN HÓA
SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ

DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia lipolytica

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGUYỄN THỊ HOÀI TRÂM
PGS.TS. NGÔ TỰ THÀNH




Hà Nội - 2014


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013




LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm và PGS.TS Ngô
Tự Thành những người đã trực tiếp hướng dẫn về khoa học và tận tình giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình tôi nghiên cứu, hoàn thành đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ Bộ môn Công nghệ Enzim và

Protein, Viện Công nghiệp Thực phẩm-Bộ Công thương đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ
bảo và chia sẻ với tôi trong thời gian thực tập.
Nhân dịp này, tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới
Ban Giám hiệu Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, và các
thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học đã động viên, chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và
tạo những điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.

Hà Nội tháng 6-2014.

Học viên: Nguyễn Xuân Việt









Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013




MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1

MỤC LỤC 2
DANH MỤC HÌNH VẼ 5
DANH MỤC BẢNG 6
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 7
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 7
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Nấm men Yarrowia lipolytica 4
1.2. Chất thơm từ lipit 7
1.2.1. Vài nét về các chất thơm dùng trong công nghiệp thực phẩm 7
1.2.2. Chất thơm -decalactone 8
1.2.3. Các con đƣờng tạo thành chất thơm γ-decalactone ở vi sinh vật 10
1.3. Chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone bằng
các chủng nấm men chuyển hóa chất béo 12
1.3.1. Nguồn cơ chất 12
1.3.2. Các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa axit ricinoleic thành chất
thơm γ- decalactone 14
1.4. Ứng dụng của nấm men chuyển hóa chất béo 14
1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất
thơm γ- decalactone bằng nấm men 17
1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất - decalactone trong và ngoài nƣớc 18
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trƣờng nghiên cứu 21
2.1.1. Vi sinh vật 21
2.1.2. Hóa chất 21
2.1.3. Thiết bị 21
2.1.4. Môi trƣờng 23


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt

Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013




2.2. Phƣơng pháp 23
2.2.1. Nhân giống và lên men trên máy lắc 23
2.2.2. Lên men theo mẻ trên nồi 5L 24
2.2.3. Lên men theo mẻ - có tiếp dần cơ chất, trên nồi 5L 24
2.2.4. Lên men theo mẻ trên nồi 50L 25
2.2.5. Lên men theo mẻ có - tiếp dần cơ chất, trên nồi 50L 25
2.2.6. Đếm số lƣợng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu 25
2.2.7. Lactone hóa dịch sau lên men 26
2.2.8. Chƣng cất dịch lên men đã đƣợc lactone hóa 26
2.2.9. Tách chiết -decalactone bằng dung môi 26
2.2.10. Loại bỏ dung môi khỏi dịch chiết 26
2.2.11 Làm sạch dịch chiết cô đặc 27
2.2.11.1 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng cách rửa kiềm 27
2.2.11.2 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng Na
2
SO
4
khan 27
2.2.12. Đánh giá cảm quan 27
2.2.13. Phân tích định lƣợng -decalactone bằng sắc ký khí 27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30
3.1. Lựa chọn điều kiện lên men trên máy lắc 30
3.1.1. Lựa chọn tốc độ lắc 30
3.1.2. Lựa chọn pH môi trƣờng lên men 30
3.1.3. Lựa chọn thời gian nhân giống 31

3.1.4. Lựa chọn tỷ lệ cấy giống 32
3.1.5. Lựa chọn thời gian lên men 33
3.1.6. Ứng dụng phƣơng pháp lên men tiếp dần cơ chất (fed-culture) 33
3.2. Nghiên cứu các phƣơng thức lên men ở quy mô 5L và 50L 35
3.2.1. Lên men ở quy mô 5L 35
3.2.2. Lên men ở quy mô pilot trên nồi dung tích 50 lít 40
3.2.3. So sánh tóm tắt các phƣơng thức lên men ở quy mô 5L và 50L 43
3.3. Lựa chọn điều kiện chiết rút và thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 44


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013




3.3.1. Lựa chọn điều kiện chiết rút γ-decalactone 44
3.3.2. Lựa chọn điều kiện thu nhận và làm sạch γ-decalactone từ dịch lên men 49
KẾT LUẬN 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57



Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013




DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Tế bào Yarrowia lipolytica sinh trưởng trong môi trường chứa methy
ricinoleate 6
Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế chuyển hóa axit ricinoleic thành chất thơm -decalactone 11
Hình 1.3: Một số hình ảnh về thầu dầu (Ricinus communis) 12
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của axit ricinoleic (12 hydroxy-9-octadecenoic acid)
13
Hình 3.1. Động học quá trình lên men theo phương thức batch culture, không
khống chế pH và DO trên nồi lên men dung tích 5L 36
Hình 3.2. Động học quá trình lên men theo phương thức batch culture, không
khống chế pH có khống chế DO (A), có khống chế pH và DO (B) quy mô 5L 38
Hình 3.3. Động học quá trình lên men theo phương thức Fed-batch culture, có
khống chế pH và DO, ở quy mô 5L 39
Hình 3.4. Động học quá trình lên men ở quy mô 50L, theo phương thức Batch
culture (A) và Fed-batch culture (B) 42
Hình 3.5. Sắc ký đồ γ-decalactone thu nhận từ dịch lên men chủng Y. lipolytica
VTP 5 (A), sau khi làm sạch bằng phương pháp “Chiết rút-làm sạch” (B), bằng
phương pháp “Chưng cất-chiết rút-làm sạch” (C), γ-decalactone cô đặc (D). 53



Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013




DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần axít hữu cơ trong dầu thầu dầu 13
Bảng 1.2. Một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm
- decalactone 14

Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng. 21
Bảng 2.2 Thiết bị trong nghiên cứu 22
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hiệu suất lên men 30
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu suất lên men 31
Bảng 3.3. Sự biến đổi mật độ tế bào theo thời gian nhân giống 32
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hiệu suất lên men trên máy lắc 32
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone
của chủng Y. lipolytica VTP5 33
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng dầu thầu dầu sử dụng ban đầu đến hiệu suất
tổng hợp γ-decalactone của chủng Y. lipolytica VTP5 34
Bảng 3.7. Tổng hợp kết quả lựa chọn điều kiện lên men sinh γ-decalactone nhờ Y.
lipolytica VTP5 ở quy mô máy lắc 34
Bảng 3.8. So sánh kết quả lên men theo 4 phương thức, trên thiết bị dung tích 5L 39
Bảng 3.9 So sánh lượng γ-decalactone cực đại cùng thời gian đạt được, ở quy mô
5L và 50L 43
Bảng 3.10. Lựa chọn dung môi tách chiết -decalactone từ dịch lên men……… 45
Bảng 3.11. Lựa chọn điều kiện lactone hóa để thu nhận γ-decalactone từ dịch lên
men 46
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thời gian chiết rút đến hiệu suất thu
nhận γ-decalactone từ dịch lên men 47
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi sử dụng đến hiệu suất chiết rút γ-
decalactone từ dịch lên men 48
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của số lần chiết rút đến hiệu suất chiết rút γ-decalactone từ
dịch lên men 48
Bảng 3.15. Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp
“chiết rút - làm sạch” 50
Bảng 3.16. Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp
“chưng cất - chiết rút- làm sạch” 50

Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013




DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Aox
Acyl-coA oxydase
ATP
Adenosin triphosphat
CoA
Coenzyme A
Cs
Cộng sự
FDA
Food and drug administration
GC
Gas chromatography (Sắc ký khí)
Mb
Megabase
POX
Peroxisomal acyl-CoA oxidase
v/p
Vòng/phút
Y- VTP5
Yarrowia lipolytica-VTP5
YM
Yeast Maltose

Y- MTLY36-2P
Yarrowia lipolytica- MTLY36-2P
DO
Dessolved Oxygen (Hàm lượng ôxy hòa tan)
YMA
Yeast Maltose Agar
S. cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
DE
Diethyl ether
U
Unit
L
Lít








Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
1
MỞ ĐẦU
Con người biết đến chất thơm và sử dụng chúng từ hàng nghìn năm nay. Nó làm
tăng chất lượng của nhiều sản phẩm, đặc biệt là thực phẩm. Khi đời sống ngày càng
phát triển, xã hội càng văn minh thì các chất thơm được sản xuất và sử dụng ngày
càng đa dạng và phong phú về cả số lượng lẫn chất lượng.

Hiện nay, ngành công nghiệp chế biến thực phẩm có nhu cầu rất lớn về các chất
phụ gia tạo hương. Hương tạo nên giá trị cảm quan và hương vi đặc trưng cho thực
phẩm. Trong quá trình chế biến thực phẩm, cấu tử hương trong nguyên liệu ban đầu
sẽ dần mất đi, điều đó bắt buộc các nhà công nghệ phải nghĩ tới phương án thêm
chất phụ gia tạo hương. Mặt khác, trong các sản phẩm thực phẩm pha chế (nước
ngọt, rượu mùi, sữa chua ) luôn cần sự có mặt của các chất tạo hương. Ngoài công
nghiệp thực phẩm ra, những ngành khác cũng có nhu cầu sử dụng các chất phụ gia
tạo hương, đó là: công nghiệp mỹ phẩm, chất phụ gia để sản xuất nước hoa, phấn
son, kem xoa; công nghiệp dược cần thêm các chất tạo hương vào thuốc, đặc biệt là
các loại thuốc cho trẻ em để làm át đi hương vị khó chịu của thuốc và làm cho thuốc
dễ uống hơn; việc sản xuất các hàng tiêu dùng như kem đánh răng, xà phòng thơm,
nước gội đầu, vv cũng cần bổ xung chất phụ gia tạo hương.
Trong số các cấu tử tạo hương như este, andehyde, lactone, alcohol thì
lactone là hợp chất khá phổ biến và là cấu tử hương thơm chính trong một số loại
hoa quả, thảo mộc như đào, mận, dừa, dâu tây Trong các lactone thì γ-decalactone
(C
10
H
18
O
2
) là có giá trị nhất, được nghiên cứu nhiều nhất. Chất này tồn tại trong tự
nhiên ở mức độ vi lượng, song là thành phần chủ đạo tạo nên hương thơm cho nhiều
loại quả. γ- decalacton có thể được tổng hợp bằng con đường sinh tổng hợp từ dầu
thực vật nhờ quá trình chuyển hoá của vi sinh vật.
Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu (castor oil), là một loại nguyên liệu
phù hợp cho quá trình tổng hợp γ-decalactone. Quá trình thuỷ phân dầu thầu dầu sẽ
tạo ra axit ricinoleic, đây là “cơ chất” để một số nấm men chuyển hóa thành chất
thơm, nhờ quá trình β-oxi hóa.

Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
2
Một số nấm men chuyển hóa chất béo (oleaginous yeasts) như Yarrowia
lipolytica, Rhodotorula sp., Candida sp., Lipomyces sp., Trichosporon sp.,…. có
khả năng sử dụng, chuyển hóa axít béo và các hợp chất kị nước. Trong số đó nấm
men Yarrowia lipolytica là loài được nghiên cứu nhiều nhất. Vấn đề nâng cao sự
chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà
khoa học cũng như các nhà sản xuất. Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta sẵn
có, rẻ tiền nhưng việc sử dụng nó cho việc nghiên cứu sinh tổng hợp chất thơm nhờ
vi sinh vật chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều. Vì những lẽ trên đây, chúng tôi
tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu
nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica”.

Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
3
Mục tiêu của đề tài

Chứng minh dầu thầu dầu Việt Nam như một nguyên liệu tiềm năng trong việc
sản xuất chất thơm –decalactone nhờ nấm men, cũng như nấm men Yarrowia
lipolytica VTP5 như một chủng tiềm năng cho việc sản xuất này.

Nội dung nghiên cứu

1. Lựa chọn điều kiện thích hợp để lên men chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu
thành chất thơm –decalactone bằng nấm men Yarrowia lipolytica VTP5, quy mô
trên máy lắc.
2. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình lên men đó trong các nồi lên
men dung tích 5L và 50L.
3. Tìm các điều kiện tách chiết và thu nhận chất thơm –decalactone từ dịch
lên men.

Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
4
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nấm men Yarrowia lipolytica
Nấm men Yarrowia lipolytica thuộc về nhóm các loài nấm men có khả năng
chuyển hóa chất béo, hay còn gọi là nấm men ưa béo (oleaginous yeasts). Trong đó
còn có các loài khác như Rhodotorula sp., Candida sp., Lipomyces sp.,
Trichosporon sp. Chúng có khả năng chuyển hóa chất béo, dầu và các hợp chất
hydrocacbon kị nước [11].
Yarrowia là chi nấm men duy nhất thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), chi này
cũng chỉ có một loài.
Nấm men này được phân lập lần đầu tiên từ bơ thực vật ở Hà Lan năm 1928,
lúc đầu có tên gọi là Torula lipolytica, sau đó được đổi thành Candida lipolytica và
đến nay là Yarrowia lipolytica. Nó thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, có khả
tạo rất nhiều sản phẩm khác nhau, và đã được đánh giá là nhóm nấm men không có
khả năng gây bệnh. Nhiều quy trình sản xuất cơ bản nhờ nấm men này được cấp
phép ứng dụng bởi Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA).
Hơn nữa, Yarrowia lipolytica cũng được sử dụng làm công cụ trong các nghiên cứu
về sự bài tiết protein, sự hình thành của peroxisome, về tính lưỡng hình của nấm
men, về sự phân hủy các hợp chất kỵ nước, cũng như trong nhiều các lĩnh vực khác

[16][18].
Đặc điểm hình thái, di truyền
Yarrowia lipolytica là loại nấm men lưỡng hình chuyển hóa chất béo, thường
được phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau, từ môi trường tự nhiên như nước
thải của nhà máy ép dầu, xưởng sản xuất thực phẩm có dầu, hay từ môi trường ô
nhiễm dầu. Hầu hết các tế bào phân lập được ở trạng thái đơn bội, nhưng một số ít ở
trạng thái lưỡng bội để hình thành bào tử túi chứa bốn bào tử. Các tế bào có thể biệt
hóa thành dạng đơn bào, dạng hệ sợi giả, hay dạng sợi, tùy thuộc vào điều kiện sinh
trưởng. Bộ gen trong nhân của Y. lipolytica có sáu nhiễm sắc thể, với kích thước
khoảng 20Mb. Nhiều trong số các gen xuất hiện tương tự như gen của nấm sợi hơn
là của nấm men truyền thống Saccharomyces cerevisiae. Việc giải mã trình tự bộ
gen của Y. lipolytica gần đây đã cho biết nhiều thông tin quan trọng về tích lũy và


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
5
phân giải lipit, về sự tương tác của cơ chất kỵ nước với các tế bào nấm men, sự hấp
phụ và vận chuyển của chúng, các quá trình oxy hóa các cơ chất này và các enzyme
khác nhau tham gia vào những quá trình đó. Một số enzyme liên quan đến sử dụng
cơ chất kỵ nước thuộc các loại multigene (đa gen). Ví dụ: lipases/esterase (LIP
genes), cytochromes P450 (ALK genes) và peroxisomal acyl-CoA oxidases (POX
genes) được mã hóa bởi một họ 5 gen có tên POX1, POX2, POX3, POX4, POX5,
những gen này mã hóa tổng hợp năm enzyme acyl-coenzyme A oxidases (Aox) là
Aox1, Aox2, Aox3, Aox4, Aox5. Các enzyme ở thể peroxi có vai trò quan trọng
trong sản xuất - decalactone từ methyl ricinoleate, một phần chuỗi ngắn riêng Aox
(Aox3) có liên quan đến quá trình tái tiêu thụ - decalactone. Khi những gen này bị
đột biến, tế bào không chết nhưng sự phân giải, sử dụng các cơ chất kỵ nước của
Yarrowia lipolytica bị ức chế [21][25][27].
Đặc điểm sinh lý học

Về nguồn cacbon
Ngoài việc sử dụng các cơ chất thông thường như các đường hexose, pentose,
thì Yarrowia lipolytica còn có thể sử dụng hiệu quả các cơ chất kỵ nước như ankan,
hydrocacbon thơm, chất béo… Việc sử dụng các cơ chất đặc biệt này có liên quan
đến cơ chế bám dính của cơ chất kỵ nước vào màng tế bào và cơ chế vận chuyển
các chất qua màng tế bào bằng các chất mang. Khi đó, những giọt nhỏ cơ chất kỵ
nước bám dính lên bề mặt tế bào (hình 1.1), tế bào tự thay đổi bề mặt như tạo bề
mặt gồ gề lồi lõm, và giảm độ dày thành tế bào. Sau đó chúng được vận chuyển chủ
động thông qua các kênh vận chuyển điện tử dày đặc trên màng tế bào [16].
Dưới đây (hình 1.1) là ảnh hiển vi của tế bào Yarrowia lipolytica trong môi
trường methy ricinoleate, minh họa cho hiện tượng vừa trình bày.








Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
6

Hình 1.1 Tế bào Yarrowia lipolytica sinh trưởng trong môi trường chứa methy
ricinoleate [16].
Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào, nếu là chất béo, trước hết chúng sẽ
chịu tác động của enzyme lipotic (lipase) để bị thủy phân thành glycerol và axít béo;
tiếp đó các cơ chất kỵ nước này sẽ được hydroxy hóa nhờ hệ ezyme có tên là
cytochrome P450 monoxidase khu trú trong lưới nội chất, rồi tiếp tục chịu tác động
của hệ enzyme oxidase chuyển thành andehyde béo; tiếp đó là quá trình oxi hóa
andehyde béo được xúc tác bởi aldehyde dehydrogenase [10].
Ngoài nguồn cacbon kể trên, Yarrowia lipolytica cũng có thể sử dụng ancol
(ankan, glycerin…), axit hữu cơ (axit axetic, axit xitric, axit succinic…) hay các
muối của các axit hữu cơ đó như những nguồn cacbon duy nhất để sinh trưởng, và
chuyển hóa các chất theo những hướng khác nhau [16].
Nhu cầu oxy
Nấm men Yarrowia lipolytica sống hiếu khí bắt buộc, sự sinh trưởng và trao
đổi chất của nó phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, đặc biệt là lượng oxy trong môi
trường nuôi cấy. Trong quá trình nuôi cấy, nhu cầu oxy cho sự sinh trưởng và trao
đổi chất của nấm men này phụ thuộc vào nồng độ ion sắt có trong môi trường [12].
Ngoài việc khuấy lắc, có nhiều phương pháp được áp dụng nhằm tăng hàm lượng


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
7
oxy trong môi trường nuôi cấy như sục khí nén, đặc biệt là bổ sung chất mang
perfluorocarbons (PFC) đã hòa tan oxy vào bình lên men trong giai đoạn sau của

quá trình nuôi cấy khi mà lượng oxy ban đầu đã được sử dụng đáng kể. Theo các
nghiên cứu, khi tăng nồng độ oxy trong môi trường lên men từ 10 đến 20% thì sản
lượng chất đã chuyển hóa tăng rõ rệt (từ 10-80%); việc tăng nồng độ oxy lên trên
20% không làm tăng thêm lượng sản phẩm [12].
1.2. Chất thơm từ lipit
1.2.1. Vài nét về các chất thơm dùng trong công nghiệp thực phẩm
Chất thơm là những chất có khả năng bay hơi một phần hay toàn phần trong
không khí, được cơ quan khứu giác cảm nhận mùi khi chúng lan truyền hay
khuyếch tán trong không khí với độ bay hơi vừa đủ và ở một khoảng cách nhất định
[2]. Các chất thơm có thể là một hợp chất hay hỗn hợp nhiều chất, có thể là chất rắn
hay chất lỏng hoặc chất khí.
Đến nay, người ta đã xác định được khoảng 7.000 chất bay hơi trong thực
phẩm và có khoảng hơn 8.000 chất bay hơi được tìm thấy trong mỹ phẩm và dược
phẩm. Các hợp chất thơm này chủ yếu thuộc các nhóm chất aldehit, xeton, ancol,
các axit hữu cơ, este, lactone…
Dựa vào nguồn gốc người ta chia chất thơm thành 3 loại: chất thơm tự nhiên;
chất thơm tổng hợp hoàn toàn (không có trong tự nhiên); và chất thơm tổng hợp
giống hợp chất tự nhiên [2].
Chất thơm tự nhiên được chiết tách từ nguyên liệu thiên nhiên có nguồn gốc
thực vật (tinh dầu, nhựa dầu thơm) hoặc động vật (xạ hương). Trong khi đó chất
thơm tổng hợp được tạo ra bằng con đường hoá học, có mùi giống các chất thơm
của tự nhiên hoặc các chất thơm mới chưa có trong tự nhiên. Trong công nghiệp
thực phẩm và dược phẩm, người ta chỉ được phép sử dụng các chất thơm có nguồn
gốc tự nhiên và các chất thơm tổng hợp giống hợp chất tự nhiên. Các chất thơm
tổng hợp hoàn toàn nếu được sử dụng phải được kiểm tra chặt chẽ về độ tinh khiết
và liều lượng sử dụng trong sản phẩm cuối cùng.


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013

8
Để sản xuất các chất thơm từ cơ chất tự nhiên người ta sử dụng enzyme hoặc
vi sinh vật. Các chất thơm được tạo thành theo cách này được gọi là “hợp chất tự
nhiên” bởi chúng được tạo ra từ các sản phẩm nông nghiệp thông qua hoạt tính sinh
học tự nhiên (enzyme và vi sinh vật) và nhờ đó, tỷ lệ các đồng phân (isomers) và
đồng vị (isotops) của các chất thơm này có thể so sánh được với sản phẩm chiết
xuất từ tự nhiên, không như các chất được tổng hợp bằng quá trình hóa học.
Trong thực phẩm, lipit được khử hoặc biến đổi nhờ các enzyme có sẵn trong
nguyên liệu thô hoặc enzyme được tạo ra do quá trình sinh trưởng trong môi trường
thực phẩm của vi sinh vật .
Mặc dù có nhiều nghiên cứu về chất thơm trong thực phẩm nhưng chỉ có một
số ít chất thơm được nghiên cứu để sản xuất bằng con đường sinh học. Trong số đó
được quan tâm nhiều nhất là các chất thơm họ lactone như -decalactone và các chất
thơm từ carotenoit.
Các chất thơm có sức hấp dẫn đặc biệt bởi nó liên quan đến hương vị và tạo
nên giá trị cảm quan cho thực phẩm. Trong đa số trường hợp, chất thơm đem lại cho
người sử dụng thực phẩm cảm giác ngon miệng. Chất thơm trong thực phẩm có thể
có sẵn từ nguyên liệu ban đầu, hay có thể được hình thành trong quá trình chế biến,
hoặc được thêm vào thực phẩm như chất phụ gia với mục đích tăng giá trị cảm quan
trong thực phẩm. Hiện nay ngành công nghiệp chế biến thực phẩm có nhu cầu rất
lớn về các chất phụ gia tạo hương. Trong quá trình chế biến thực phẩm và đồ uống,
các chất thơm có trong nguyên liệu ban đầu thường xuyên bị mất đi, khiến các nhà
công nghệ phải nghĩ tới phương án thêm chất phụ gia. Mặt khác các sản phẩm như
nước ngọt, rượu mùi, sữa chua,… luôn cần sự có mặt của các chất thơm. Ngoài
công nghiệp chế biến thực phẩm và đồ uống thì công nghiệp mỹ phẩm, chất tẩy rửa
và công nghiệp dược là các ngành có nhu cầu lớn sử dụng các chất phụ gia tạo
hương [2].
1.2.2. Chất thơm -decalactone
Trong số các cấu tử thơm như andehit, este, lactone,…thì lactone là hợp chất
khá phổ biến. Các lactone là cấu tử tạo hương thơm chính của của nhiều loại quả

Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
9
như đào, dừa, dâu tây và của rất nhiều thực phẩm chế biến từ thịt, các sản phẩm sữa,
các loại caramel [6].
Các lactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên, trong số đó -decalactone
(C
10
H
18
O
2
) có giá trị nhất và cũng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Chất này
tồn tại trong tự nhiên ở mức độ vi lượng, là thành phần chủ yếu tạo nên hương thơm
cho nhiều loại hoa quả. -decalactone có mùi thơm của quả đào, mùi hương của bơ
sữa, có cường độ mùi rất mạnh, và là phần chính của rất nhiều tổ hợp hương thơm
được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Hợp chất này
là một este nội phân tử của axit 4 hydroxy-decanoic, axit này trong điều kiện pH từ
1 đến 2 sẽ đóng vòng để tạo -decalactone.
Chất thơm -decalactone ở điều kiện thường là một chất lỏng trong suốt không
màu, hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu; hầu như
không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong các dung môi hữu cơ như rượu, dầu,
ete, diethyl ether, etyl axetat…
Tính chất lý - hóa của γ-decalactone
- Công thức phân tử C
10
H
18

O
2
(M =170).
- Công thức cấu tạo

- Nhiệt độ sôi: 218
o
C
- Tỷ trọng : 0,952
- Mùi : Hoa quả và bơ sữa.
-decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực phẩm.
Năm 1974, Ủy ban hợp tác Châu Âu đã đưa -decalactone vào danh sách những hợp
chất thơm tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm ở mức độ cao nhất (từ 5-20
ppm). Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này được sử dụng trong thực phẩm
cũng không quá 3 ppm và trong nước hoa từ 20-400 ppm [23]. Trên thế giới, -
decalactone được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, làm chất tạo


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
10
hương cho thực phẩm, kẹo cao su, kem đánh răng, đồ uống, nước hoa, sản phẩm
làm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc…
1.2.3. Các con đƣờng tạo thành chất thơm γ-decalactone ở vi sinh vật
γ-decalactone có mặt trong một số loại quả nhưng với hàm lượng rất ít. Bởi vậy
người ta đã tìm cách sản xuất chất thơm này với một lượng dồi dào nhờ vi sinh vật.
Tùy loại vi sinh vật mà chất này được tạo thành theo một trong hai con đường, đó là
tổng hợp sinh học (biosynthetic) và chuyển hoá sinh học (biotranformation). Con
đường chuyển hóa sinh học là con đường chính được ứng dụng trong công nghiệp sản
xuất chất thơm vì có khả năng cho năng xuất cao hơn tổng hợp sinh học [12].

Tổng hợp sinh học (biosynthetic) -decalactone là con đường tổng hợp nhờ vi
sinh vật mà không sử dụng chất béo hay dầu mỡ. Một số vi sinh vật có khả năng
tổng hợp -decalactone từ những hợp chất đơn giản. Berger (1986) là người đầu tiên
đã phát hiện ra sự có mặt của -decalactone trong môi trường nước thịt lên men bởi
các chủng nấm đảm (Basidomycetes) [12].
Chuyển hoá sinh học (biotranformation) là con đường tổng hợp γ-
decalactone nhờ các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng nguồn cơ chất như dầu,
các chất béo, trong dầu thầu dầu. Hợp phần chủ yếu của dầu thầu dầu là axit
ricinoleic, đóng vai trò vừa là nguồn cacbon vừa là cơ chất cảm ứng cho tổng hợp γ-
decalactone. Trong quá trình β-oxy hóa, axit ricinoleic bị cắt ngắn dần đến còn hai
nguyên tử cacbon và tạo ra acetyl-CoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình
Krebs để cung cấp năng lượng cho sinh vật. Quá trình β-oxy hóa tạo ra sản phẩm
trung gian là axit 4 - hydroxy decanoic, axit này trong điều kiện pH 1,5 đến 2 sẽ
đóng vòng để tạo γ-decalactone [39][40]. Quá trình này đã được tìm thấy ở một số
nấm men như Yarrowia lipolytica, Candida maltosa, Candida tropicalis….
Quá trình chuyển hóa axit ricinloneic thành chất thơm γ-decalactone nhờ vi
sinh vật thực chất là quá trình β-oxy hóa, nhờ hoạt động của các acyl coenzyme A
oxidase, diễn ra trong ty thể và các peroxisome. Quá trình β-oxy hóa nói trên bao
gồm 4 giai đoạn [24]:


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
11
1. Phản ứng khử hydro tạo liên kết đôi giữa 2 nguyên tử carbon ở vị trí  và 
(C-2 và C-3), tạo enoyl-CoA. Phản ứng do enzyme acyl-CoA dehydrogenase
xúc tác với sự tham gia của FAD.
2. Phản ứng hydrate hóa gắn H
2
O vào liên kết đôi tạo ra -

hydroxyacyl-CoA, được xúc tác bởi enzyme enoyl-CoA hydratase.
3. Phản ứng khử hydro đối với -hydroxy acyl-CoA, do enzyme -hydroxy
acyl-CoA dehydrogenase xúc tác, tạo ra -keto acyl-CoA và biến đổi NAD
+

thành NADH.
4. Phản ứng tách acetyl-CoA và tạo acyl-CoA mới ngắn hơn 2 nguyên tử C
được xúc tác bởi enzyme acyl-CoA acetyl transferase (còn gọi là thiolase).
Quá trình trên được lặp lại, axít béo bị cắt ngắn dần thành các acetyl CoA. Sau
một chu kỳ, tế bào thu được 2 cặp H
+
: 1 cặp cho FAD và 1 cặp cho NAD
+
và 1 phân
tử acetyl-CoA. Như vậy qua 4 giai đoạn thì phân tử axit béo lại ngắn đi 2 nguyên tử
cacbon để tạo thành acetyl CoA (hình 1.2).

Hình 1.2. Sơ đồ cơ chế chuyển hóa axit ricinoleic thành chất thơm -decalactone [24]


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
12
Trên sơ đồ, axít ricinoleic bị cắt dần thành từng mạch 2 cacbon, tạo ra acetyl
CoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình axit citric và chuỗi hô hấp tế bào, tạo
năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống của vi sinh vật. Quá trình này tạo ra
sản phẩm trung gian là axit 4 - hydroxy decanoic, axít này sẽ đóng vòng để tạo ra -
decalactone, β- oxy hóa là con đường chính trong công nghiệp để tổng hợp -
decalactone và các lactone khác vì cho năng suất cao [24][36][39].
1.3. Chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone

bằng các chủng nấm men chuyển hóa chất béo
1.3.1. Nguồn cơ chất
Nguồn axit ricinoleic để vi sinh vật sử dụng chuyển hóa thành - decalactone
là dầu thầu dầu. Cây, quả và dầu thầu dầu thương phẩm được minh họa ở hình 1.3 a
và b. Dầu thầu dầu có tên thương phẩm tiếng Anh là castor oil (hình 1.3 c), được
tách ra từ hạt cây thầu dầu (Ricinus communis) thuộc họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae), bộ Ba mảnh vỏ (Ephorbiales), bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng
hoặc trích ly.



a.Cây thầu dầu
b.Quả thầu dầu
c.Dầu thầu dầu
Hình 1.3. Một số hình ảnh về thầu dầu [5]
Hạt thầu dầu chứa khoảng 50-60% dầu. Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt,
không màu hoặc hơi vàng, mùi vị nhạt. Dầu thầu dầu chứa nhiều glyxerit như
stearin, cholesterin, palmitin nhưng chủ yếu là ricinolein và một ít axít béo như
linoleic, stearic. Ricinolein bị thủy phân tạo thành ricinoleic acid {một axit rượu béo


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
13
có công thức phân tử C
18
H
34
O
3

và danh pháp IUPAC [R,Z]-12 hydroxy-9-
octadecenoic acid (hình 1.4 )}.
O
OH
OH

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của axit ricinoleic (12 hydroxy-9-octadecenoic
acid) [18].
Axit này cấu tạo từ bộ khung 18 nguyên tử cacbon với một liên kết đôi ở giữa
nguyên tử cacbon số 9 và số 10, một nhóm hydroxyl gắn với nguyên tử cacbon số
12. Cấu trúc hóa học này khá tương đồng với 4- hydroxy decanoic mà dạng lactone
của nó là - decalactone. Đặc điểm này cho phép ta có ý tưởng về việc sinh chuyển
hóa dầu thầu dầu thành chất thơm [4].
Thành phần hóa học của dầu thầu dầu ở các nước như Việt Nam, Ấn Độ,
Braxin (bảng 1.1),…có sự khác biệt, tuy nhiên thành phần chính vẫn là axit
ricinoleic chiếm tới 83-90,4%. Hiện nay dầu thầu dầu là một trong những dầu công
nghiệp quan trọng nhất được sử dụng trực tiếp (ở dạng liên kết glyxerit) hoặc gián
tiếp (qua các biến đổi hóa học) trong rất nhiều lĩnh vực công nghiệp và đời sống.
Đặc biệt, dầu thầu dầu là nguồn nguyên liệu cho việc tổng hợp các hợp chất thơm
dạng lactone .
Bảng 1.1. Thành phần axít hữu cơ trong dầu thầu dầu [17].
Axit
Dầu Việt Nam (%)
Dầu Braxin (%)
Dầu Ấn Độ (%)
Ricinoleic
86,36
83- 90
87,4- 90,4
Linoleic

3,19- 5,98
2,9- 4,0
Oleic

2,96- 5,64
2,5- 4,0
Stearic

0,68- 1,84
0,9- 1,3
Palmitic

0,87- 2,35
0,8- 1,3
Dihydrostearic


0,5- 0,8



Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
14
1.3.2. Các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa axit ricinoleic
thành chất thơm γ- decalactone
Những loài vi sinh vật có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm
- decalactone bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men. Tuy nhiên sản lượng và
hiệu suất tổng hợp - decalactone của vi khuẩn và nấm mốc rất thấp, do đó các

nghiên cứu ứng dụng chủ yếu tập trung vào nhóm nấm men chuyển hóa chất béo.
Một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa chất béo được nêu trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất
thơm - decalactone
Vi sinh vật
Sản lƣợng
γ-decalactone
(g/L)
Hiệu suất tổng hợp
γ-decalactone/ castor
oil (g/g)
Tài liệu tham
khảo
Yarrowia lipolytica
0,61
0,0061
[17].
Sporidiobolus
odorus
1
0,10
[15].
Saccharomyces
cerevisiae
3,7
0,13
[13].
Yarrowia lipolitica
HR 145
(DSM 12397)

12,3
0,246
[33].
Yarrowia lipolytica
W29
0,621
0,062
[1].
Rhodotorula
aurantiaca
5,8
0,33
[8].

1.4. Ứng dụng của nấm men chuyển hóa chất béo
Sản xuất chất béo
Những chủng nấm men ưa béo có khả năng chuyển hóa chất béo cao nhất đã
được báo cáo bao gồm Candida 107, Rhorosporidium toruloides, Yarrowia


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
15
lipolytica. Hấp thụ lipit và axit béo ở nhóm nấm men này đã được nghiên cứu trên
một hệ thống lên men gồm hai giai đoạn trong nuôi cấy, theo đó ở giai đoạn đầu vi
sinh vật được nuôi trong điều kiện hạn chế nguồn cacbon; ở giai đoạn tiếp theo,
người ta bổ sung nguồn cacbon là glucose vào môi trường nuôi cấy, chính chất này
sẽ kích thích tế tào hấp thụ lipit. Lượng lipit được tích lũy có tỷ lệ rất cao: so với
trọng lượng khô của tế bào ở Rhodosporidium toruloides hoặc Rhodotorula
glutinis là hơn 70%, ở Y. lipolytica là từ 38% - 50% tùy thuộc chế độ nuôi cấy, với

Candida 107 tỷ lệ này là 28% [11][21][27].
Sản xuất carotenoids
Một số chủng nấm men chuyển hóa chất béo có khả năng tích lũy carotenoids
trong tế bào (tiền vitamin A, cơ chất tổng hợp chất thơm…). Về mặt sinh lý và sinh
thái vi sinh vật, việc tích lũy carotenoid giúp tế bào vi sinh vật tăng cường sức đề
kháng trước tác nhân bất lợi từ môi trường như tia tử ngoại. Một vài chủng trong số
đó đã được nghiên cứu và triển khai ứng dụng trong việc sản xuất carotennoid, như
Rhodotorula glutinis TISTR 5159, Rhodotorula glutinis CCY 20-2-26, Rhodototula
gracillis… Khả năng tích lũy carotenoid của chúng tăng lên khi nuôi cấy trong điều
kiện bất lợi như môi trường có H
2
O
2
đồng thời bị hạn chế nguồn nitơ, oxy. Khi đó
sản lượng carotenoid có thể đạt 26,30mg/L dịch nuôi cấy. Các chủng nấm men này
đã được ứng dụng để lên men trong đó sử dụng nguồn cacbon của nước thải từ các
nhà máy sản xuất dầu cọ, dầu đậu nành, mà chỉ cần bổ sung thêm nguồn nitơ là
(NH
4
)
2
SO
4
và chất hoạt động bề mặt như Tween 20 [14][26].
Sản xuất enzyme
Một trong những enzyme ngoại bào quan trọng nhất của vi sinh vật là lipase;
enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực
phẩm, dược phẩm, xử lý chất thải. Nhiều nhóm nấm men chuyển hóa chất béo có khả
năng tổng hợp lipase với sản lượng cao. Những cơ chất tốt nhất cho những chủng
nấm men này sử dụng để tổng hợp lipase là dầu cọ, dầu oliu, dầu hạt cải, dầu đậu

nành… Với nồng độ từ 0,4- 2% những dầu này có thể cho sản lượng lipase 30,4 U/ml


Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt
Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013
16
môi trường. Những loài nấm men chuyển hóa chất béo có khả năng tổng hợp lipase
được quan tâm nghiên cứu là Rhodotorula glutinis, Yarrowia lipolytica [30][32][35].
Tổng hợp chất thơm
Các nấm men ưa béo có khả năng chuyển hóa chất béo, dầu và các hợp chất
hydrocacbon kị nước là Yarrowia lipolytica, Rhodotorula sp., Candida sp.,
Lipomyces sp., Trichosporon sp.,… Đặc biệt loài Yarrowia lipolytica là loại nấm men
“không truyền thống” được nghiên cứu nhiều nhất. Yarrowia lipolytica có khả năng
sử dụng các cơ chất kỵ nước như các ankan, axít béo và dầu, một cách có hiệu quả,
như một nguồn dinh dưỡng chính để sinh tổng hợp sinh khối tế bào hoặc chuyển hóa
để tạo thành axít citric, axít 2-keto glutaric, các chất thơm họ lactone [23].
Sự phân giải chất béo C18 bởi nấm men thông thường dẫn tới sự tạo thành các
chất bay hơi axetyl (C2) và propionyl (C3). Tuy nhiên, một số chủng lại có khả
năng tạo thành các hợp chất C8 – C15 rất có giá trị thương mại. Các hợp chất vòng
lớn C15 có mùi xạ hương, các lactone C8 - C12 có hương hoa quả và hương béo
ngậy (dừa, đào, dâu tây, mơ,…) [19]. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tác
động đến đặc tính di truyền của các chủng, nhưng nguyên nhân tại sao một số chủng
có khả năng tạo thành các hợp chất này thì vẫn chưa được hiểu rõ. Vì vậy, việc phân
lập các chủng vi sinh vật mới, đặc biệt là nấm men có khả năng chuyển hóa sinh
học chất béo thành các chất thơm để tìm hiểu con đường trao đổi chất, mức độ dị
hóa, các chất trung gian tạo thành, hoạt tính β - oxy hóa,…Luôn luôn được các nhà
khoa học chú trọng đặc biệt. Việc lựa chọn các chủng nấm men có tiềm năng để
nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh chuyển hóa đạt hiệu quả cao nhằm ứng dụng
trong ngành sản xuất chất thơm họ lactone như - decalactone là sự quan tâm lớn
của các nhà khoa học.

Ngoài những ứng dụng chủ yếu trên đây, nấm men chuyển hóa chất béo còn có
thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác như sản xuất biodiesel, sản xuất axit
citric, làm vi nang sinh học, xử lý ô nhiễm môi trường (nhất là môi trường bị ô nhiễm
bởi chất thải chứa dầu như chất thải từ nhà máy chế biến dầu thực vật, từ các nhà máy
sữa, môi trường đất ô nhiễm bởi dầu, bởi hạt có dầu và thực phẩm phân hủy) [16].