Tách dòng và biểu hiện Cecropin trong các hệ Vector khác nhau114652

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






Ngô Thị Hà




TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CECROPIN
TRONG CÁC HỆ VECTOR KHÁC NHAU


Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Cán bộ hƣớng dẫn: PGS. TS. Võ Thị Thƣơng Lan



Hà Nội - 2011

Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
1
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. Tổng quan về tình hình kháng kháng sinh 2
1.1.1. Thực trạng kháng kháng sinh 2
1.1.2. Nguyên nhân và giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh 4
1.2. Peptide kháng khuẩn (AMPs) 6
1.2.1. Giới thiệu chung về AMPs 6
1.2.1.1. Hoạt tính sinh học của AMPs 7
1.2.1.2. Sự đa dạng của AMPs 7
1.2.1.3. Tiềm năng ứng dụng của AMPs 8
1.2.2. Peptide kha
́
ng khuâ
̉
n tích điện dƣơng (CAMPs) và cecropin 10
1.2.2.1. Giới thiệu chung về CAMPs 10
1.2.2.2. Peptide kháng khuẩn cecropin 11
 11
 13
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
2
 19

 20
1.3. Sản xuất cecropin theo con đường tái tổ hợp 21
1.3.1. Lựa chọn hệ thống tê
́
ba
̀
o biê
̉
u hiê
̣
n 21
1.3.2. Lựa chọn hệ thống vector biểu hiện 22
1.3.3. Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện 25
1.3.4. Tinh sạch cecropin tái tổ hợp 25
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Nguyên liệu 28
2.1.1. Các hệ vector 28
2.1.2. Các chủng vi khuẩn 28
2.1.3. Các cặp mồi 29
2.1.4. Gel sắc ký ái lực Glutathione Sepharose 4B, Ni-NTA agarose 29
2.1.5. Các hóa chất và thiết bị 30
2.2. Phương pháp 31
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 31
2.2.1.1. Tách dòng (subclone) các gen cecropin từ các vector nhân dòng sang
vector biểu hiện 32
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
3
2.2.1.2. Biểu hiện các cecropin dưới dạng protein dung hợp 33
2.2.1.3. Tinh sạch các cecropin dung hợp 34

2.2.1.4. Sử dụng protease để thu nhận cecropin 35
2.2.2. Tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp biến tính kiềm 35
2.2.3. Xử lý ADN với enzyme giới hạn 36
2.2.4. Biến nạp bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 37
2.2.5. Phƣơng pháp thẩm tách 37
2.2.6. Phƣơng pháp đo nồng độ protein 38
2.2.7. Phƣơng pháp điện di 38
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ 40
3.1. Tách dòng (subclone) chuyển các gen cecropin vào các vector biểu hiện
40
3.1.1. Chuyển các gen cecH và cecN sang vector pBS 40
3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pGEX-cecropin 42
3.1.3. Thiết kế vector biểu hiện pET-28a-cecropin 44
3.1.4. Thiết kế vector biểu hiện pET-32b-cecropin 45
3.2. Biểu hiện các cecropin tái tổ hợp 48
3.2.1. Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện các cecropin dung hợp 48
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
4
3.2.2. Xử lý cặn tế bào và thu nhận cecropin dung hợp dạng tan 55
3.2.3. Kết quả tinh sạch GST-cecropin, Trx-cecropin 57
3.2.4. Kết quả xử lý cecropin dung hợp GST-cecropin và Trx-cecropin với
protease 61
CHƢƠNG 4-THẢO LUẬN 65
4.1. Khả năng biểu hiện của cecropin dung hợp phụ thuộc vào hệ thống biểu
hiện 65
4.2. Trạng thái biểu hiện của cecropin phụ thuộc vào đuôi dung hợp 66
4.3. Phương pháp thu nhận cecropin dung hợp dạng hòa tan và cách thức tinh
sạch ảnh hưởng tới hiệu suất tinh sạch 68
KẾT LUẬN 72

KIẾN NGHỊ 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO 74






Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
5
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.  9
Bảng 2. 
 10
Bảng 3.  12
Bảng 4.   25
Bảng 5. T  29
Bảng 6.  







 






 36
Bảng 7.  48
Bảng 8. -cecropin 51
Bảng 9. -E. coli BL21 (DE3)
54
Bảng 10. --cecN 63




Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
6
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.  5
Hình 2.   Hyalophora cecropia  
 13
Hình 3.  . 15
Hình 4.  16
Hình 5.  18
Hình 6. -
 18
Hình 7.  21
Hình 8.  
AMPs E. coli 24
Hình 9.  32

Hình 10.  33
Hình 11.  34
Hình 12.        cecH  cecN  -cecH 
pJET1.2-cecN  40
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
7
Hình 13. cecH, cecN 
XbaXhoI 41
Hình 14. -cecH 
pBS-cecN 
enzyme Xba 41
Hình 15. cecH, cecN -cecH, pBS-cecN (A);
cecT -cecT  43
Hình 16.  -cecropin


(A) 

cecropin  44
Hình 17.              -28a-
cecropin  45
Hình 18. cecH, cecN cecT 
-NcoEcoRI 46
Hình 19.              -32b-
cecropin 

 1% (A, B, C) 



gen cecropin  47
Hình 20.           E. coli BL21 (DE3) mang
vector pGEX-cecH -PAGE 10% 49
Hình 21.           E. coli BL21 (DE3) mang
vector pGEX-cecN -PAGE 10% 49
Hình 22. E. coli mang vector pGEX-
cecT -PAGE 10% 50
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
8
Hình 23.           E. coli BL21 (DE3) mang
vector pGEX-cecN -PAGE 10% 50
Hình 24. E. coli E.
coli JM109 (B) mang vector pGEX-cecropin   
SDS-PAGE 10% 51
Hình 25.           E. coli BL21 (DE3) mang
vector pET-28a-cecH -28a-cecN  
SDS-PAGE 10% 52
Hình 26.           E. coli BL21 (DE3) mang
vector pET-32b-cecH -32b-cecN -PAGE 12% 53
Hình 27.           E. coli BL21 (DE3) mang
vector pET-32b-cecT -PAGE 12% 54
Hình 28.  E. coli JM109 mang vector
pET-32b-cecH -32b-cecN -PAGE 12% 55
Hình 29. 
-cecH (A), His+GST---
-PAGE 12% 56
Hình 30.  
---
E. coli -PAGE 10% 57

Hình 31-
E. coli 
-PAGE 10% 58
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
9
Hình 32-
E. coli E. coli 
  -PAGE
10% 59
Hình 33-cecH (A)
-E. coli -PAGE 12%
60
Hình 34-
E. coli -PAGE 12% 60
Hình 35-n gel SDS-PAGE 10%
62
Hình 36-cecH sau
 -PAGE 12%
63



MỞ ĐẦU
     i 7/4/2011, t           
  
. 
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
10

  p
 sinh.
 
    
  
Tron
ch y  t chi t cn tr, 
d 
AMPs n chung v cecropin n ri (1)
t (2) (3)
 
  

  cn tr  Vi 
     “Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector
khác nhau”
 


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về tình hình kháng kháng sinh
1.1.1. Thực trạng kháng kháng sinh
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
11
  
  [63,
79]. Khi   
   
 

 
 
T
    n  i 7/4/2011   
                 
 



Alexander Fleming (1881-1955) [72, 75]. 

Staphylococcus aureus 
penic    methicillin [7]. Ng nay,  
   tr th 
 v s kho nhn lo. 
 cao Klebsiella (15.1%), E. coli (13.3%), P. aeruginosa
(13.3%), Acinetobacter spp (9.9%)  S. aureus (9.3%). N
          -83%        
fluoroquinolon  
58 
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
12
50, 
  [79].                
 80]. 

   [1              
carbapenem (NDM- 
e NDM-1 

 [7, 79] 



;  [80

  h s 
  7%)
4%). B
 hai - 
sinh cho th            Acinetobacter spp,
Pseudomonas spp, E. coli  Klebsiella
tetracycline, streptomycine,     T        
  
          (GARP, Global Antibiotic Resistance
Partnership) 
[1]. B ch l  Streptococcus pneumoniae     
      penicillin  71.4%, 

 92.1%.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
13

-2001. N 2009  
 42%, k

 63% 




  
      -        [1].
 v m 
 (WHO, 2008).


sinh.
1.1.2. Nguyên nhân và giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh


[79]:
Th nh, k  
   
 . 
  ang 


Tuy nhin, 4 nguyn nh l xu ph ch y t ph con ng.  ch l
g h l; c; cng t p
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
14
 v thi   
  g ph khng nh d  t tr kh kh sinh hi
nay. V

  
c . 
 



Hình 1. 




 
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
15












 
ntimicrobial peptides) [7, 79 
th 
[22, 30 
  nay [28, 49].
1.2. Peptide kháng khuẩn (AMPs)
1.2.1. Giới thiệu chung về AMPs

 
.  u
 
[30, 57]   
 tham gia  [20, 28]. 
 . 
  
AMPs 
 [22, 45, 70].

1.2.1.1. Hoạt tính sinh học của AMPs
AMPs  20,
28, 37, 48 
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
16


28, 30].
1.2.1.2. Sự đa dạng của AMPs
AMPs 
 [28, 60, 
  
800  37]. D
  , AMPs 
4, 9]:
 
ra do 
  
 

g [62].
 

 Mannheimia haemolytica, Escherichia coli  Klebsiella pneumoniae [8   

(9].
   
 
 [5].  
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
17
cecropin, andropin, moricin, ceratotoxin,     hay magainin, dermaseptin,
brevinin-1, esculentins, ].
1.2.1.3. Tiềm năng ứng dụng của AMPs
              
AMPs 42, 58, 64]. 


, gen s  
 cho t
     [27, 47].    


 [22].
Bảng 1.   AMPs  [22].
Tên hãng
sản xuất
Tên thuốc
Giai đoạn

phát triển
Sử dụng trong y học
AM-Pharma
(Phn Lan)
hLF-1-11 (petide nh 
ngun gc t lactoferrin
i)
Phase II
   
 n c  y

Ceragenix
(Denver)
CSA-13 ( 

peptide thuc h thng
bo v )
Tin th nghim

Chng nhim khun
Helix
Biomedix
(USA)
HB-50 (peptide tng hp
t   c
cecropin)
HB-107 (  
axit amin ca cecropin B)
Tin th nghim


Tin th nghim

Chng nhim khun


Ch
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
18
Inimex
(Canada)
IMX942 (peptide  5
axit amin)
  
t
iu chnh h min
dch; u tr sm
bch cu t  
b liu
Lytix
Biopharma
(Na Uy)


Chng nhim khu 

Novacta
Biosystems
Ltd.

(Anh)
Mersaxitin (bacteriocin)
Tin th nghim

  n Gram

Novozymes
A/S
(ch)
Plectasin
(defensin ca nm)
Tin th nghim

i vi khun
  c bit
 ng hp nhim
ph cu khu  khun
u
Pacgen
(Canada)
PAC113 (d  n
ho ng ca histatin 5-
protein c  thy
c bt ca i)
n
 i thuc mi
u
Thuc u u tr
ch  y do nm
   o, rut,

ming hoc da

1.2.2. Peptide kháng khuẩn tích điện dƣơng (CAMPs) và cecropin
1.2.2.1. Giới thiệu chung về CAMPs
 -50 axit amin 
 amin 11, 38]. 
peptide kh   do 
: (1)  
  
 [14, 28, 63
 [38]. 
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
19
, (Plymouth
Meeting, PA), XOMA (Santa Monica, CA), Demegen (Durham, NC), IntraBiotics
Pharmaceutica            
  [7].
Bảng 2.   
 [7].
Công ty sản xuất
Sản phẩm
Giai
đoạn
phát
triển
Magainin
Pharmaceuticals (Plymouth
Meeting, PA)
Pexiganan, 1 lo   n

gc t da ch


phase III
Micrologix Biotech
(Vancouver, BC, Canada)
n 12 axit amin 1 loi CAMPs ca
ng v  ng
nhim khu
Phase II
XOMA Corporation
(Santa Monica, CA)
 Neisseria
meningitidis
Phase III
  
                 , -defensin,
 -37, cecropin, magainin

22].
1.2.2.2. Peptide kháng khuẩn cecropin
C
]. Cecropin    Hyalophora
cecropia  [55]
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
20
     
 [14, 55]. 
  

   


Sarcophaga
peregrina              Drosophila
melanogaster
 [13] 3.
Bảng 3. 13].
Loài
Trình tự axit amin
Drosophila
melanogaster
Cecropin A
GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATA
R
Sarcophaga peregrina
Sarcotoxin IA
GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATA
R
Aedes aegypti
Cecropin A
GGLKKLGKKLEGAGKRVFNAAEKALPVVAGAKALRK
Aedes albopictus
Cecropin A1
GGLKKLGKKLEGVGKRVFKASEKALPVAVGIKALGK
Hyalophora cecropia
Cecropin A
KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK
Bombyx mori
Cecropin D

GNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQ
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
21
 -64 axit amin. Trong
20- 
            
 k-5
- 2ng
  28].  cecropin
A  -terminal
 
--Pro
[23]cropin A  2.

Hình 2. Hyalophora cecropia ch 
23].
1.2.2.2.2a cecropin


Cecropin có phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng: 
  k
 14, 26, 32, 36, 60, 61, 66]. , 

-Pro
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
22
57]. 


 
 so 13].
Cấu trúc phù hợp với hoạt tính kháng khuẩn: 
                 

 - 
 ,
-helix     
[35]. 
100
0
  41]. , do 
  
 35].
 
     9, 39  , trong khi      
 
cecropin   [4, 10]. Do
cecropin Lipopolysacharite (LPS
 .
 , cecropin 

 [19, 30, 70].   
 .
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
23
Đích tác động của cecropin làm vi sinh vật khó hình thành tính kháng: 

. 

[12]. ,

  3 [28].

Hình 3.  in  
  
   ; ; 
;   [28].
Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011
 
24
  (A), 
   mixen             (B),
cecropin   

(C), cecropin                
 (D), cecropin 
Do   
m.

 .    
 Pennsylvania 
 .
 mang 
 [24]  
  A. 
              
HIV-1
 virus HIV [61]. 
  cecropin . Cecropin 

  

 [28].