Tạo khối cầu đa bào ung thư biểu mô tuyến vú dòng MCF-7115224.PDF

I HC QUC GIA HÀ NI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




Nguyc Tú




TẠO KHỐI CẦU ĐA BÀO UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ
DÒNG MCF-7



LU THC S KHOA HC






Hà Ni - 2014

I HC QUC GIA HÀ NI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyc Tú




TẠO KHỐI CẦU ĐA BÀO UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ
DÒNG MCF-7
Chuyên ngành : Sinh hc Thc nghim
Mã s : 60420114


LUC S KHOA HC

NG DN: TS. Hoàng Th M Nhung



Hà Ni - 2014
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
1

MỞ ĐẦU
S i ca mt loi thuc mi có kh n s phát trin
ca t bào ác tính và ng thi không hoc c tính thp vi các mô lành s m 
hi cu sng hàng chc trii trên th gii chng chi vnh ung
m nghèo. Vi mquy trình sàng lc phm ti tt c các phòng thí
ngim, vin nghiên cu, công ty sn xu c phm trên th gi u phi tuân theo

nhnh và tiêu chun nghiêm ngt c chc kim nghic
phm.
Mt quy trình kim ngim thuc ch loi thuc khác
nói chung có th kéo dài t 10- m nhi n khác nhau, t phát hin
thuc, sàng lc tivi s ng chtng, m
nghim khác nhau nhm bo các loi thu     m s t
c hiu qu u tr cao và có ít tác dng ph nhi bnh.
Sàng lc tin lâm sàng trên các dòng t bào nuôi cp in vitro 
mt vai trò không th thay th u tiên ca kim nghim thuc. Vi s
ng cht có th lên ti hàng vn, mô hình nuôi cy t p cho phép nhanh
chóng tìm ra nhóm cht có hiu qu u tr tt nht. Tuy nhiên, thc t cho thy rt
nhiu chp li không có tác dng khi th nghim trên
ng v tip tc phát trin thành thuu tr. V này
bt ngun t vic các t p thiu hu hm ca các kh
in vivo  
Chính vì vy, vic phát trin mt mô hình in vitro mi mô phc chính xác
c tính ca các kh s  hiu qu
sàng lc, hn ch s ng thuc phi th nghing vt thí nghi
i tình nguyn, t m ti thiu thi gian và chi phí cho vic phát trin mt loi
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
2

thuc mc nhng tr ngi liên quan tc khoa hc vi các t
chc bo v ng vt, t chc nhân quyn, t chc y khoa.
 góp phn thc hic nhng m ti Vit Nam, chúng tôi tin hành
thc hi tài:
“Tạo khối cầu đa bào ung thư biểu mô tuyến vú dòng MCF-7”
Vi các mc tiêu:

 To khi c dòng t u mô tuyn vú MCF-7.
 Nghiên cm v hình thái, cng hng ca các khi
c-o.
 S dng mô hình khi c  - kic tính ca h
thuc nano (Ptx-Cur)-Co.
 Nghiên cu s xâm nhp và phân b ca h thuc (Ptx-Cur)-Co vào bên trong
khi c-7.







Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
3

1.TỔNG QUAN
1.1.Sàng lọc thuốc
1.1.1.Quy trình sàng lọc thuốc
1.1.1.1.Quy trình sàng lọc thuốc tiêu chuẩn
Tt c các loi thuc t phòng thí nghin khi tr thành mt sn ph
mi u phi trt ca các t chc kim nghic
phm vi m m bo s an toàn và hiu qu u trng duy
nht và có th kéo dài qua nhin vi thi gian t vài i vài chm.
c chung nht theo quy chun cm nghim
c phm uy tín th gii (Hình 1) [72-74].
       c hay các vin nghiên cu phát trin mt loi

thuc là tin hành sàng lc các hp cht có ti hàng vn các hp chu trên
các mô hình in vitro (drug discovery). Ti   p cht này s c   th
nghim tin lâm sàng (pre-clinical) trên ng vt vi các c n. Trong
n này, các t chc kim nghim da trên các kt qu kim tra tin 
quynh các cht trên   nghii hay không. Toàn
b n này din ra trong khong 6-
Khi mt loi thu tin hành sàng li bnh hay còn
gi là sàng lc lâm sàng (clinical), nó s phi trn th nghim vi quy mô
n trong thi gian kho
 n I: c tin hành  nhi khe mnh nhm kim tra các tác dng
ph ca thu chuyn hóa và bài tit ca thu.
 c tin hành vi mm tra hiu qu và thu thp s li
b v hong ca thui bnh. Bu tr vi loi thu
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
4

th nghim s c so sánh vi các bu tr hou tr vi
mt loi thuc khác song song vng ph.
 n III: các kim tra v tính an u qu s c tip tc tin
i bnh khác nhau, liu ng thu
khi kt hu tr cùng vi các thuc khác.
 t yêu cu ca c n trên, các loi thuc th nghim s phi
hoàn thành mt s th tc pháp lý và khoa hc trong khong thi gian mi
 có th chính thc tr thành mt sn phi.

Hình 1. Thời gian trung bình cho một quy trình phát triển thuốc. Quá trình sàng lc
c phm có th dii vài ch hàng vn chu tuyn
chn ra mt hoc vài cht yêu cu kinh[74].

1.1.1.2.Quy trình sàng lọc thuốc tiền lâm sàng
Sàng lc tin lâm sàng là mn quan trng trong toàn quy trình, vi mc
nh hiu qu u trc tính, các d ling hc tin hành trên
ng chính là các dòng t y in vitro và trên chut mang khi
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
5

u hình thành t các dòng t i. Quá trình sàng lc tii vi
các cht có hot tính chm các n sau [72]:
 n 1: Các loi thuc tiên s c th nghim vi ba dòng t bào ung
 i vi n th nghim duy nht trong 48h. Nhng cht có kh c
ch s ng ca mt hay nhiu dòng t bào s c la chn
tip theo.
  n 2:   n này, các thuc th nghim s c tip xúc vi
khong 60 dòng t i vi ph rt rng bao gi
tràng, tuyn tin lit, bung trng, vú, thn v cách bit. Nu thuc
có kh t chn lc mt dòng t nh hoc nhiu dòng
t bào khác nhau vi cùng mt c ch ng hay có hiu qu c  nng
c rt thp thì s c chuyn tip theo.
 n 3:  pha cui cùng ca sàng lc tin lâm sàng, các cht có ti
c s d u tr cho chut mang các khi u ri da. Nhng loi thuc
có kh t hoc làm chm quá trình phát trin ca các khi u vc
tính và tác dng ph thp nhng thí nghim s c
i bnh (lâm sàng).
1.1.2.Các mô hình sàng lọc thuốc tiền lâm sàng
Cáng trong vic sàng lc phm. Tùy
vào tn ca quá trình sàng lc thuc, các mô hình này s c la chn mt
cách thích hp nhm bo các th nghic tin hành nhanh chóng, hiu qu nht

mà vm bc các v c trong khoa hc. Vi s ng cht phi sàng
lc tu tiên có th lên ti hàng vn thì vic s dng các mô hình in vitro 
trên t y là rt cn thit  có th c
các nhóm cht có hiu qu thu thp các s li v c tính, các tác dng
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
6

không mong mun c c  T nhng
kt qu thu u, các kim tra ting vt  mô hình in vivo
s tit kim tht nhiu thông qua gim thic s ng cht, s
ng vt tham gia các th nghim.
1.1.2.1.Mô hình in vitro
Mô hình nuôi cấy cơ quan
i mô hình nuôi cy c n nht c s dng t nh
c tách ra khy in vitro, 
vi các hp cht cn thm cc tính nguyên vn ca
i quan h gia t bào vi t bào, nh v
vu kin in vivo. Tuy nhiên, do nht v mu vt mà vi
giá hiu qu ca thuc có nhiu sai s, do vy vic s dng mô hình này b hn ch, và
 áp dng vào sàng lc thuc quy mô ln [4].

Hình 2. Nuôi cấy tinh hoàn chuột để sản xuất tinh trùng in vitro.
(A) Các mnh tinh hoàn nuôi trên giá th    ng nuôi cy có b sung
KBR. (B) Mô tinh hoàn nuôi cy sau 7 ngày. Bar=20µm [38].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
7

Mô hình nuôi cấy tế bào đơn lớp (2D)
y ph bin nht ti tt c các phòng thí nghim trên thi
gii trong nhiu thp k qua. Do các th nghic tin hành trên
sinh thit khi u nuôi cy nhân tng có thành phnh khin
ng rt k s phát trin ca công ngh nuôi cy
t bào thành detri thy tinh hoc nha, kt hp vi s phát
trin cng có thành phnh v mt hóa hc nên quy trình sàng lc thuc
c ti bào nuôi cy 2D này. S dng các loi thuc
nhum protein s c mi quan h ng liu gia các
dòng t bào khác nhau vi các n thuc th khác nhau [48].
Các t c phân ly in vitro ng phát trin thành dng
trôi ni hoc bám dính hoc hn hp c hai loi. Các loi t  sng trôi n
t bào u lympho, t  t sarcoma.  các
dòng t bào sng  di, các dòng t u mô.
t s t bào sng  dng hn hp c bám dính, c trôi n bào
u mô phi 3LL [12, 30, 48].


Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
8


Hình 3. Hai dạng tế bào nuôi cấy.
(A) Dòng t  t cung i p trên b mt giá th. (B)
Dòng t bào nuôi cy dng trôi ni Sp2 [71].
S dng mô hình t bào 2D trong sàng lc có nhii gian sàng
lc ngn, cho phép thao tác vi nhiu dòng t bào, nhiu hp cht khác nhau vi di nng

 rng cùng mt thma t
bào  vi hp cht ch theo mt chiu, thiu s a t  vi
h min da h min dch vi hp chy, mô hình này không mô
phu kin in vivo c [48].
Mô hình nuôi cấy ba chiều (3D)
Mô hình nuôi cy 3D là mô hình mà  c t chc trong không
gian ba chiu vi s h tr ca các giá th sinh hc nhm mô phng mt cách chính xác
u trúc ca mt khi mô thc s  sinh hc. Trong mô hình 3D, các t
bào không ch th hia chúng vi các t bào xung quanh
i giá th sinh hc, cht nn ngoi bào mà còn th hin khá chính xác các
phn ng vu king, thuc th nghim.
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
9

Mt mô hình th nghim th him c
sinh hc rõ ràng s cho các kt qu th nghii các t bào nuôi cy
ng. Tuy nhiên, mô hình nuôi cy ba chih mô phng
a h min dch lên các th nghim [18, 48, 51].
1.1.2.2.Mô hình động vật - in vivo
Thc nghim cho thy rng các t bào ca khi u ác tính có th cy truyn cho các
các th khác thuc cùng dòng, chúng có kh n và git cht vt ch mi. Tt
c các t ng cng vng thành và các t bào  khi
u ca thc vng vt da gai và các dng sng thp khác không có kh 
này. Ch có các dng sng t chng vt có vú
mi có kh  khi u ác tính. U là mnh c y
bng chng v  ng long t c.
c s dng v thay th i trong vic nghiên cu
c thuu hoàn  khoa hc [48].

Có nhing vc s d xây dng mô hình in vivo , mèo,
chu c s dng r do s ng v
mt di truyn v      tin li khi nuôi,   
nghim và c bit có s  gây to khi u thc nghim [52].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
10


(A)

(B)
Hình 4. Mô hình gây u trên chuột hủy miễn dịch.
(A) Khi da gây trên chut bng cách tiêm truyn t i
hay phân lp t bnh nhân. (B) Th nghi u tr trên chut (1) Chu  u tr
khi u tiêu gim (2) Chui chu tr khc [39].
Mô hình in vivo m ni bng ca thuc
lên kh do s a c ba yu t: h min dch, khi u và
thuc quynh. Tuy nhiên, quá trình sàng lc trên mô hình này tn nhiu th
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
11

so vi các mô hình khác và cn có s theo dõi cht chng xuyên ci làm thí
nghim [49].
1.2.Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư
1.2.1.Nuôi cấy ba chiều (3D)
Nuôi cy t c tin hành rng xuyên ti hàng nghìn

phòng thí nghim trên th gii trong 40 . Tuy nhiên nuôi cy 2D không phn ánh
c cng thái sinh lí c. Chính vì vy, gây dng
mô hình nuôi cy 3D rõ ràng là hu ích và phù hc thit k các b khung có
vai trò h tr cho s t chc các t  kim soát s i các cht dinh
ng và cht thy h thng nuôi cy 3D tin b và phc chính xác
m sinh lý khi mô cng vng thi, mô hình nuôi cy
kh t k các h thng ng nuôi cy gia nhiu loi t bào.
Mc tiêu ch yu là gây to các h thng nuôi c phát trin các mô hình
sàng lc thuc. Ma tng quan này là cung cp c
thu thit k mt mô hình 3D [13, 30].
Mô hình nuôi cy 3D có th c chia thành các nhóm  ki
gm c phôi), mô hình khi cy microcarrier, mô hình thit k
mô. Mô hình nuôi cy c s dng trong các nghiên ci s chính xác
tuyi các thông tin cho mt loi i
vi mô não và thn  c duy trì trên gel hoc trên màng bán thm
trong ng nuôi cm ca mô hình này c cu
trúc và s hin din ca các loi t bào khác nhau trong mô p nhi
trong duy trì mu  thi gian dài và cn các thit b c bi có th chp nh sâu trong
mu [13, 35, 38].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
12


Hình 5. Các mô hình nuôi cấy ba chiều -3D.
(A) Mô hình nuôi cquan nuôi cc ct nh thành các m
t trên giá th xp có h tr b i kim lo  c nuôi c   ng
chuyên dng. H thng nuôi c  c gi  mt phân cách gia pha khí và pha
lng. (B) Mô hình nuôi cy khi c bt treo. Các t bào t tp

li và liên kt vi nhau to thành mt khi t bào trong cu trúc 3 chiu. (C) Mô hình nuôi
cy mô phng da nhân to. Các nguyên bào s   c nuôi c    y
c khi chuyn lên nuôi cy trên mi si nhân to có kh  phân hy. Sau vài
tun, các t bào sc tách t    u) s c ph lên trên các lp nguyên
bào si m    to thành lp biu bì. (D) Mô hình nuôi cy microcarrier. S
dng các vt li            t
x to các giá th dng cu rng nhm h tr cho nuôi cy ba chiu các dòng t bào
ng vt ph thuc neo phát trin bên trong túi r [35].
Mô hình nuôi cy khi cn nht, có th gây to t
nhiu loi t bào, hình thành do toàn b các t bào liên kt, t tp li vi nhau. Chúng
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
13

ng to thành t t nuôi cy dòng t c t kì thung nuôi c
nuôi cy git treo (hanging drop), nuôi cy xoay tròn (rotating culture), ging lõm
(concave plate). Khi cn khung, có th quan sát bng kính hin vi
quang hc, kính hin vi hung t. Chính vì vy mô hình khi cc la
chn  dùng trong các th nghim và nghiên cu khi u rn, s 
nhiu các nghiên cu tr liu, sàng lc thuc trên quy mô ln [2, 15, 51, 64].

Hình 6. Khối cầu đa bào ung thư vú MCF-7.
Khi c        ng phn pha ca kính hin vi quang hc,
bar=100µm (A), T chc các t bào trong khi quan sái kính hin t  phóng
i 1600 ln, bar=100µm (B) và s liên kt ca các t bào trong khi cu quan sát i
kính hin t  i 4000 ln, bar=5µm (C) [20].
1.2.2.Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư
1.2.2.1.Lịch sử phát triển của mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư
Khi c      ng khi c c to thành t

nhng t bào t tp vi nhau trong quá trình nuôi cy in vitro. c tính ca mt s
dng t   ng vt. Nhng t bào ca khi cu 
 m bo phát trin trong không gian ba chi 
bào - t bào, t bào - cht nn ngoi bào, t bào - chng ca ng nuôi
cy và chúng vn gi c nh  u ki.
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
14

Trong nghiên cmô hình c gi vi mt tên riêng là khi c
t tt là MCTS hay spheroid. Nhng khi c
bào  i nhng khi u rn nh  vì chúng có
nh ng khi u in vivo [58]. Nhng t bào phát trin
bên trong nhng khi c vm bc nh
n  u kin in vivo. Nhng thí nghim trên nhng khi cu này cho kt
qu  khi làm thí nghim trên nhng khi u rn in vivo.
Khong 
lp nhng t bào mô phôi gà và phát hin chúng có kh p hp li vi nhau
u kic bit. T  ra mt thi k mi cho nghiên c
phát trin ca nuôi cy 3D.
- ng s c kht khi ung
 và có nhng nghiên cu v s phát trin ca nhng t  [45].
- ng s tin hành các thí nghim nghiên cu s 
ng ca nhng t u x [43].
- Tháng 10/1977, Robert Sutherland công b trên tp chí Cancer Research v 
pháp to khi spheroid t tám dòng t i và sáu ca chut) trên
giá th agar [44].
- Trên tp chí Cancer Research s  mt
cách chính thc mô hình mi s dng khi c trong nghiên c

qua bài báo"Spheroids in Cancer Reasearch" [43].
- ng dng chuyên sâu vic dùng khi spheroid trong s
sinh mch máu khi u [53].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
15

- u s xâm ln ca khi u khi nuôi cùng vi nhng t
bào lành [9].
- Tháng 4/2001, Wartenberg và cng s  thí nghim nuôi cy chung gia t
bào gi khi cn tin li nghiên cu s 
sinh mch máu khi u [55].
Ngoài ra còn có các nhà khoa hc tên tui ln vi nhng công trình nghiên cu
n khi c  hóa sinh ca t n in
vitro (Michael E.Berens), s dng khi spheroid trong nghiên cu s xâm ln (Marc
Bracke, Hans Romijin, Luc Vakaet, ), s ng t bào trong khi c
(Helmut Acker & Jorgen Calson), s dng khi spheroid trong nghiên cu tr min
dch (Carlsson) [6], hiu qu tác dng ca thuc (Jorgen Carlssol & Thore Nederman),
phóng x (James P.Freyer), chng thân nhit cao (Baard - Christian Schem and Olav
Dahl) [2, 63], Ermis và cng s (n ca bnh thp
khng vic s dng công ngh này. T nh v 
trin nhng nuôi cy gia khi cng t chc t bào
 nghiên c n, hay s a t bào lành và khi u,
ho hóa tr dùng thuc tác d tr  phân t, ng dng
công ngh nano trong nghiên cu ung [2, 8, 41].
1.2.2.2.Đặc điểm của mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư
Các nghiên cu gy các t c nuôi cy trong mô hình 3D biu
hic tính khác so vi các t c nuôi cy 2D. Nhng s khác bic
u t giúp mô hình 3D phn ánh t a các t 

vng in vivo [13, 43, 49].
Cấu trúc: Khi c có cu trúc vi ba lp i tách bit vi
ng và t ch
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
16

 Lp vòng ngoài: Gm khong t 2-3 lp t bào sng, phân chia mnh xp khít
 dày mng ca lp này tùy thuc tng dòng t u kin
ng và ngun t  to spheroid. Trong nuôi cy khi
co thành t nhng mnh mô sinh thit, có th quan sát thy các liên
kt t bào-t bào  li kính hin t.
 Lp trung gian: Gm nhng t bào vn sng phân chia. Các t
bào ca vùng này có th hòa nh  thành nhng t bào ca vòng ngoài hoc
vòng trong tùy thu u kin nuôi cy (có mch máu hoc không, n 

 Lp trong cùng: còn gi là lõi hoi t, bao gm nhng t t, có nhân kt
c li nên ánh sáng quang hc không th c, vì vy lp này có màu
i kính hi dày mng ca lp này tùy thuc vào tng
n khác nhau ca quá trình ng khi spheroid [2, 43, 57].

Hình 7. Sự tương đồng trong cấu trúc các lớp tế bào và sự tương tác với các điều kiện
môi trường của mô hình khối cầu đa bào ung thư (phải) khối u in vivo (trái) [36]
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
17

Hình thái tế bào: Các t y 2D có hình thái tri rng không t

nhiên còn các t y 3D có s liên kt cht ch ba chiu, co cm ging
vi khi u in vivo. Trong khi spheroid, các t i nhau ch yu
qua các liên kt t bào-t bào,  bào liên kt
cht ch vi nhau to thành dng kh bào-cht nn ngo
xut hihiu và ch có khi khsau mt khong
thi gian nhnh [31, 43].
Trao đổi chất: Các t u hing
phân-lên men nhi khác bit trong biu hin  các gen chu trách nhim
            
chemokine, IL-8 và các gene chu trách nhim cho quá trình xâm ln và  ca t bào
bao gm Rho GTPase và FAK (focal adhesion kinase). Không gic t bào ung
p vi cht din ra theo chu trình Kreb nh ngun
c cung c, hu ht các t bào tn ti trong khi c
 nhng t bào nm  các lp ngoài cùng) có s i cht din ra theo con
ng  u kin k khí. Càng vào sâu bên trong lõi ca khi cu
 l các t bào thc hii ch
t trong nhm v i chc ta các khi u rn in vivo
ng hp kích thuc kh    i l   
mch máu vào kh là gii pháp tình th vì
hiu sut chuyng ca quá trình lên men là rt thp, không th cung c
ngun sng cho các t ch máu vn không sy ra, các t bào
này s cht. Chính vì vy, các khi cin vitro sau mt thi gian nuôi cy
c nhnh thì s xut hin lõi hoi t do các t bào  vùng trung tâm b
cht và kt li [31, 43].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
18

Tốc độ tăng trưởng: Các t  nuôi cy 3D phát trin chi

khi nuôi cy 2D. T phát trin  mô hình 3D phn ánh các mô hình toán hng
hc ca khi u in vivo ti mô hình 2D. m cu trúc
ca khi spheroid khin cho ch mt vài lp t bào bên ngoài cùng ca khi mu
kin tip xúc và thu nh các yu t ng nuôi cy, o
 i các sn phm không cn thit hay bt li. c li, các t
bào nuôi cc cung c u king thi
không b gii hn b t nhiu [31, 43].
Chu trình tế bào: nhng d liu so sánh gia t l các pha trong chu trình t bào
ca khi spheroid vi nhng t bào trong khi u in vivo và nuôi cy có s
ging nhau v s ng t bào  n khác nhau (pha G, M,  các t bào
 pha G1, mt t l nh  t bào  pha S và G2, rt ít các t bào  pha M [11, 66].
Đường cong sinh trưởng: Nhng hóa
sinh gia khi cng khi u in vivo dn s ng v kích
c, t l nhng vùng cu trúc và c ng gia khi cu 
nhng kh. S ng ca các khi c tuân theo ng
thng cc mt, bc hai. Có th da trên ng
ca khi c   u tr  nhng thm có li
nht [2, 43].
Sự di cư của các tế bào: Nhiu kt qu thc nghim trên các khi c
các dòng t bào biu mô vú chui chun
i) cho thy, các t p ngoài có kh i
b mt khi. T l a các t bào có th b ng rõ rt c x lý vi các
c EDTA. Nghiên cu s u t n s di
ca các t bào trong khi ccó th hu ích cho s hiu bit s  di
a khi u in vivo [43, 68].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
19

Phản ứng thuốc: Các t c nuôi cy 3D th hin tính kháng mnh
c nhy ci mt s liu pháp hóa tr so vi khi nuôi cy 2D, tùy thuc
vào loi t bào và loi thuc. S khác bi nhy này  mô hình 3D có th c
c các t ng vc hóa tr liu 
m in vivo. Mt thc nghim c thc hi chng minh v nêu
trên. i ta tin hành th nghic tính ca 5-FU (5-fluorouracil)-mt thuc chng
ng có kh c ch a t bào và TPZ (tirapazamine)-có
kh t trng thái hypoxia (thiu oxy) và có th dn s sai hng DNA
trên dòng t bào A431 vi c hai mô hình 2D và 3D. Các kt qu c cho thy giá
tr IC50 (Inhibitory Concentration 50%) ca 5-FU trên mô hình nuôi cy 2D th-
1000 ln so vi trên mô hình c li, TPZ lc tính rt mnh lên các t bào
i yn trên mô hình 2D [16, 32, 51].
Bên c nghim ng nuôi cy 3D các t i các t bào
ng ca khi u  ng
ca thuc lên các t bào lành xung quanh khi u [13, 51, 59].
Vi nhm trên, mô hình khi cy có s 
ng cao vi khi u in vivo n so vi các t bào nuôi cp.
1.2.3.Các vấn đề kĩ thuật liên quan tới nuôi cấy khối cầu đa bào
1.2.3.1.Các phương pháp gây tạo khối cầu đa bào
Mc dù có nhi to ra mt quy mô ln các
khi c (spheroid) nhm phc v cho th nghim và sàng lc hiu quy mô ln.
Cho ti thm này, có rt nhiu o khi spheroid c s dng
vi nhng nguyên lý và m riêng nuôi cy d sng b mt chng bám dính,
nuôi cy git treo
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
20

Phương pháp sử dụng bề mặt chống bám dính

Mt trong nho khi c n nht là s dng các loi
y có b mt chng bám dính. c công b t nh
1977 bi Robert Sutherland và cng sc s dng và ci tin bi nhiu nhóm
tác gi khác (Landry J. et al., 1985; Haminton GA et al.,2001). Nguyên lý c
pháp này là to mt b my c bit nhn s bám dính xung nn
ca t u kin cho các t ng liên kt li vi
nhau to thành khi t n nht là s dng dung dch aga hoc
agarose m hong nuôi cy ph mt lp mng lên trên b mt
cy nhn s tip xúc ca t bào vi b m [26, 44, 62].
Cho t dng b mt chu ci
tic kia. Nhiu loi nchng bám dính c sn xut
chuyên cho vic gây to khi cc phi ph b mt nhng lo
n hóa các thao tác thc nghim. Gt hic
ng dng là s dng các bc thit k c bit, Các bc
làm t các hp kim và polymer mi vi b mn khin t bào hoàn toàn
mt kh ng thc to sn các khuôn/ging nh bên trên giúp
cho s to thành khi t c l so v [51,
62].
t trong nhc s dng ti nhiu phòng thí nghim
nuôi cy t ng vt trên th gii do có p, d thc hin, thao
tác, theo dõi       n. Tuy nhiên, m  m rt ln mà
p ph khng ch c hình dc ca
các khi co thành. u này s dn nhnh trong các
th nghim sàng lc và kim nghim thuc [26, 44].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
21

Phương pháp tạo giọt treo

Nuôi cy git treo (hanging drop) là mo khi spheroid c s
dng rng rãi nht trong nhiu thp k qua. c nghiên cu và phát
trin bi nhiu nhóm tác gi (Lin RZ, et al 2006; Kelm JM 2003; Wartenberg M, et al
2001). Nguyên lý ca nó là mt ging nuôi cy có cha mt s ng t bào
nhnh s c trên mt giá th t trong mt bu m phù hp.
i tác dng ca trng lc, các t c trong ging s tp trung ti
m thp nht ca git treo và ti liên kt vi nhau to thành các
khi c Th các t bào liên kt li vi nhau thành khi t i
cht ch ph thuc nhim ca dòng t c s d to git treo.
Các dòng t bào có ngun gc biu mô có kh hình thành khi trong thi gian khá
ngn, khong 24 - 36 gi [19, 22, 28, 54] nh kh t t bào-t bào tt.

Hình 8. Phương pháp giọt treo (hanging drop). (A) Các git treo trên ny.
(B) S hình thành khi cu trong git treo do các t bào t tp và liên kt vi nhau [51].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
22

Có th no khi spheroid vi rt nhim
 chi phí thc hin thp, theo dõi c n, có th ng dng 
nhiu phòng thí nghim nuôi cy t bào. c bit, khng ch c
s c các khi cng cao. Vi
mi git treo gây to, g có mt khi cc to thành. Du
chnh s ng t bào ging nhau  các git treo thì s c các khi t bào có th
tích . Vic tc nhng khi cu v u cao v m
này s u qu ca các th nghim nói chung và sàng lc
c phm nói riêng [13, 19, 28].
Tuy nhiên, khó có th tc mt s ng ln khi cu vt
treo truyn thng do tn khá nhiu thi gian và công sc. Chính vì vy mà t i

cho ty gic ci thin nhiu nhm to thun li
v mt thao tác k thui thc hin.  nht là vic ch to thành công giá
th to spheroid 384 chuyên dng cho gây to khi cu bt treo phc
v cho th nghim thuc. Giá th c làm t polestyrene và ch to bng cách ép
phun vnh dng 16 hàng, 24 ct, bao gm 384 ging (v trí) to git treo. Mi v trí
to gic thit k vi phn g gii hn  i hn và nh
c ca các git treo, tng. Các rãnh cha
c  phn vin  n ch s 
cng nuôi cy các git treo. Các thao tác trên giá th 384 t gây to git treo
ti thay th ng, b sung thuc th nghic h tr bi cánh tay robot vi
phn mm chuyên dn và chính xác hóa các th nghim [51].
Các phương pháp tạo khối cầu đa bào khác
t nhiu cách thc gây to khi spheroid
c phát trin và s dng vi nhm riêng. Mt nhóm l
pháp phát tring s dng các yu t  làm t bào t tp và liên kt
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
23

vi nhau. Có th k  ng, âm thanh. Tuy nhiên nhng ng này
ng là không ti vi t bào,  cn s dng nhin thit b chuyên dng.
Mt k các vi khuôn hay giàn r vi m
va tu kin cho s bám và hình thành khi da vào các khung sinh hc này, va
u khic hình dng và cu trúc không gian ca các khi t bào to thành theo mc
a th nghim. Cháp này rt tn kém và phc tp do cn nhiu máy
móc và k thuc bit [28, 47, 67, 70].
1.2.3.2.Các phương pháp nuôi cấy khối cầu đa bào
Nuôi cấy động
K thut nuôi cy khi cc v cho kim nghim thuc cm bo

s  n và nhanh chóng trong c hai khía cnh nuôi cy và phân tích. Rt nhiu
y khi cc mô t và s dng trong các phòng nuôi
cy t ng vp k va qua, ph bin nhs
dng nuôi cy trc xoay (spinner flask), nuôi cy quay tròn (roller tube), nuôi cy rung
hi chuyn (gyratory shaker) (Mueller K 1987; Lund J, et al 1992; Kunz S, et al 2000)[3,
17, 24].
Nhng k thut nêu trên c gi là k thut nuôi cy khi spheroid ng, áp
dng cho nuôi cy và theo dõi các khi cu trên s ng lc mô
t chi tit trong Hình 9. Các k thut nuôi cy t ng cho phép cung cu kin
nuôi cy tt nht cho khi c kh c cung cp ngun s
u kin cho s i sn phm tha hoc
hi ci cht do liên tc to ra dòng chy dinh dng nh vào s khuy,
quay hay rung ca h thng nuôi cy. Bên c thut nuôi cn
s tip xúc ca khi ca chai/bình nuôi cgi cho