Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở Vườn Quốc gia Cúc Phương tt

Công trình được hoàn thành tại:
- Bảo tàng giống Vi sinh vật Nhật Bản –JCM, RIKEN, Nhật Bản.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
……………………

Đào Thị Lương






NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
VÀ PHÂN LOẠI CỦA NẤM MEN
SINH BÀO TỬ BẮN PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY
Ở VƯỜN QUỐC GIA CÚC PHƯƠNG



Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62.42.40.01



TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2008









- Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội


Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Phạm Văn Ty
2. GS.TS. Nguyễn Lân Dũng


Phản biện 1: GS. TS. Nguyễn Đình Quyến
Phản biện 2: PGS. TS. Lê Gia Hy
Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Xuân Thành


Luận án được bảo vệ trước Hội đồng cấp Nhà nước chấm luận án tiến
sĩ họp tại Phòng 418, nhà T1, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Vào hồi 9 giờ 00 ngày 24 tháng 5 năm 2008

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin- Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội.



ix
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
i
Lời cảm ơn
ii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
iii
Danh mục các bảng
iv
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
vi
Mục lục
viii
MỞ ĐẦU
1
Chương 1. Tổng quan tài liệu
3
1.1. Đa dạng sinh học và đa dạng vi sinh vật
3
1.1.1. Đa dạng sinh học

3
1.1.2. Đa dạng vi sinh vật
4
1.1.3. Nghiên cứu đa dạng nấm men và nấm men sinh bào tử bắn
5
1.1.3. 1. Nghiên cứu nấm men ở Thái Lan
6
1.1.3.2. Nghiên cứu nấm men Indonesia
7
1.1.3.3. Nấm men trong rừng ở Đài Loan
8
1.1.3.4. Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Trung Quốc
8
1.1.3.5. Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Nhật Bản
8
1.1.3.6. Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở một số nước khác
9
1.1.3.7. Nghiên cứu nấm men ở Việt Nam
9
1.2. Đại cương về nấm men
10
1.2.1. Định nghĩa về nấm men
10
1.2.2. Hình thái và cấu trúc của nấm men
10
1.2.2.1. Hình thái tế bào nấm men
10
1.2.2.2. Cấu trúc tế bào
12
1.2.3. Phương thức sinh sản ở nấm men

15
1.2.3.1. Sinh sản vô tính
15
1.2.3.2. Sinh sản hữu tính
18
1.2.4. Phân loại nấm men
22
1.2.4.1. Các nấm men túi
22
1.2.4.2. Các nấm men đảm
23


x
1.3. ứng dụng của nấm men trong đời sống
24
1.3.1. Nấm men trong lên men etylic
24
1.3.2. Các nấm men là các nhà sản xuất protein đơn bào
25
1.3.3. Các nấm men như nguồn sản xuất các sản phẩm công nghiệp
khác
25
1.3.4. Nấm men dùng làm tác nhân probiotic và các liệu pháp sinh
học trị liệu
27
1.3.5. Sử dụng nấm men để hạn chế bệnh sau thu hoạch ở trái cây và
ngũ
27
1.3.6. Nấm men là các tác nhân phục hồi sinh học

27
1.3.7. Cải biến nấm men bằng đột biến, lai thể nguyên sinh và kĩ
thuật ADN tái tổ hợp
28
1.3.8. Dùng nấm men làm sinh vật biểu hiện ADN tái tổ hợp
28
1.4. Các chỉ tiêu được sử dụng trong phân loại nấm men
29
1.4.1. Các nghiên cứu được dùng trong phân loại nấm men
29
1.4.1.1. Các đặc điểm hình thái và nuôi cấy
29
1.4.1.2. Các đặc điểm sinh lý sinh hoá
29
1.4.1.3. Các đặc điểm hoá phân loại và sinh học phân tử
30
1.4.2. Các bước định danh
30
1.4.2.1. Phương pháp phân loại thông thường
31
1.4.2.2. Phương pháp sử dụng số liệu về trình tự ADNr
31
1.4.3. Các chỉ tiêu dùng trong phân loại hiện đại
32
1.4.3.1. Hoá phân loại
32
1.4.3.2. Sinh học phân tử
33
1.5. Nấm men sinh bào tử bắn
39

1.5.1. Đặc điểm nấm men sinh bào tử bắn
39
1.5.2. Lịch sử nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn
40
1.5.3. Vị trí nấm men sinh bào tử bắn trong cây phả hệ
42
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
48
2.1. Nguyên liệu
48
2.1.1. Mẫu thu thập
48
2.1.2. Vi sinh vật
48


xi
2.1.2.1. Các vi sinh vật kiểm định
48
2.1.2.2. Các chủng nấm men chuẩn dùng trong lai ADN genom
48
2.1.3. Thiết bị và máy móc
48
2.1.4. Các loại môi trường
49
2.1.4.1. Môi trường phân lập và nuôi nấm men sinh bào tử bắn
49
2.1.4.2. Môi trường phân loại
49
2.1.4.3. Môi trường nuôi vi sinh vật kiểm định

51
2.1.4.4. Môi trường xác định hoạt tính enzym
51
2.1.4.5. Môi trường cho sinh tổng hợp enzym
51
2.2. Phương pháp
51
2.2.1. Phương pháp phân lập
51
2.2.2. Phương pháp phân loại nấm men
52
2.2.2.1. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái
52
2.2.2.2. Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hoá
52
2.2.2.3. Hoá phân loại
55
2.2.2.4. Phân loại dựa vào sinh học phân tử
59
2.2.3. Xác định hoạt tính enzym
65
2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh
65
2.2.5. Xác định sinh khối
65
2.2.6. Xác định pH
66
2.2.7. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình
sinh tổng hợp enzym của dịch nuôi nấm men
66

2.2.7.1. Lựa chọn môi trường thích hợp
66
2.2.7.2. Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp
66
2.2.7.3. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp
66
2.2.7.4. Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp
66
Chương 3. Kết quả và thảo luận
67
3.1. Phân lập nấm men
67
3.1.1. Địa điểm thu thập mẫu
67
3.1.2. Phân lập
67
3.2. Phân loại nấm men sinh bào tử bắn
69
3.2.1. Phân loại đến chi
69
3.2.1.1. Hệ thống ubiquinon chủ yếu
69


xii
3.2.1.2. Xác định xyloza trong tế bào
70
3.2.1.3. Phân loại đến cấp độ chi
70
3.2.2. Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc

chi Bullera
72
3.2.2.1. Xác định và phân tích trình tự ADNr 18S
72
3.2.2.2. Xác định và phân tích trình tự ADNr ITS
74
3.2.2.3. Xác định và phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2
76
3.2.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm men
sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera
84
3.2.2.5. Phân loại các chủng nấm men thuộc chi Bullera đến loài
90
3.2.2.6. Mô tả loài mới
96
3.2.3. Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc
chi Kockovaella
97
3.2.3.1. Xác định và phân tích trình tự ADNr 18S
97
3.2.3.2. Xác định và phân tích trình tự ADNr các vùng ITS
98
3.2.3.3. Xác định và phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2
100
3.2.3.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm men sinh
bào tử bắn thuộc chi Kockovaella.
102
3.2.3.5. Phân loại các chủng nấm men thuộc chi Kockovaella đến
loài
105

3.2.3.6. Mô tả loài mới
106
3.3. Sự đa dạng của nấm men sinh bào tử bắn ở Vườn quốc gia Cúc
Phương

107
3.4. Hoạt tính sinh học của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc
chi Bullera

115
3.4.1. Khả năng sinh enzym ngoại bào
115
3.4.2. Khả năng đối kháng với các vi sinh vật khiểm định của các
chủng nấm men
116
3.4.3. Các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp enzym ngoại
bào
117
3.4.3.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
117
3.4.3.2. Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp
118
3.4.3.3. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp
119


xiii
3.4.3.4. Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp
119
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

121
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
123
TÀI LIỆU THAM KHẢO
125
PHẦN PHỤ LỤC
137

Phụ lục 1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử của các chủng
nấm men phân lập
137

Phô lôc 2. HÖ thèng ubiquinon cña c¸c chñng nÊm
men nghiªn cøu
148

Phụ lục 3. Mô tả các loài mới của chi Bullera
151

Phô lôc 4. M« t¶ c¸c loµi míi cña chi
Kockovaella
189

Phụ lục 5. Một số hình ảnh minh họa
201

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án
Nấm men sinh bào tử bắn là một nhóm nấm men lớn, tồn tại
trong tự nhiên, chiếm 14/90 chi nấm men với số lượng loài chiếm hơn
1/10 tổng số loài nấm men đã biết (khoảng 80 loài). Đây là nhóm vi
sinh vật rất phong phú, hiện hữu trong thiên nhiên nhưng từ trước đến
nay ít được biết đến. Là nhóm nấm men có tiềm năng sinh hàng loạt
enzym nên cần phải được nghiên cứu để phát hiện các enzym có tính
năng mới. Đây là miền đất trống, nếu nghiên cứu sẽ có khả năng phát
hiện nhiều loài mới cho khoa học, góp phần bổ sung vào danh mục loài
của thế giới.
Việt Nam nằm trong khu vực có khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện
thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển. Việt Nam được đánh giá là
một trong các quốc gia có đa dạng sinh học phong phú. Ở Việt Nam,
sự nghiên cứu đa dạng vi sinh vật mới thực sự bắt đầu, để góp phần
vào công cuộc tìm kiếm các nguồn gen mới, tiến hành thẩm định, tìm
cách ứng dụng và lưu giữ chúng cho các thế hệ sau, chúng tôi thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm
men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở Vườn Quốc gia Cúc
Phương”.
Mục đích của đề tài
- Tìm hiểu nấm men sinh bào tử bắn- một nhóm vi sinh vật
phong phú cư trú trên nhiều loại lá cây mà từ trước đến nay chưa hề
biết đến ở Việt Nam- khởi nguồn cho một nhánh nghiên cứu mới về
đa dạng sinh học.

- Tìm kiếm và phát hiện các loài mới cho khoa học, bổ sung vào
danh mục loài của thế giới.
- Bước đầu tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt động sinh học
(các loại enzym ngoại bào) của nhóm nấm men này.
Những đóng góp mới của luận án:
- Là công trình nghiên cứu đầu tiên về đa dạng sinh học của nấm men
sinh bào tử bắn ở Việt Nam.
- Đã phát hiện được 16 loài mới được quốc tế công nhận: 12 loài
thuộc chi Bullera và 4 loài thuộc chi Kockovaella. Đưa địa danh Việt
Nam vào danh mục loài của thế giới.
- Công trình đầu tiên tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt động sinh
học của nhóm nấm men này.
Bố cục luận án:
Luận án bao gồm phần mở đầu, tổng quan, đối tượng và phương
pháp nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết luận và kiến nghị, danh mục
công trình, tài liệu tham khảo, phụ lục. Luận án có 25 bảng, 46 hình, 108
tài liệu tham khảo.
NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Đa dạng sinh học và đa dạng vi sinh vật
1.2. Đại cương về nấm men
1.3. Ứng dụng của nấm men trong đời sống
1.4. Các chỉ tiêu được sử dụng trong phân loại nấm men
1.5. Nấm men sinh bào tử bắn




Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Chủng nấm men: Các chủng nấm men sinh bào tử bắn được phân
lập theo phương pháp của Nakase và Takashima (1993).
2. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá: Chủ yếu theo mô tả của
Yarrow (1998). Khả năng đồng hoá nitơ được xác định theo phương
pháp của Nakase và Suzuki(1986). Vitamin đòi hỏi bắt buộc được xác
định theo Komagata và Nakase (1967).
3. Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách chiết, tinh
sạch và xác định ubiquinon theo phương pháp của Nakase và Suzuki
(1986). Xyloza trong tế bào được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng hoặc
sắc ký lỏng cao áp theo Nakase và cộng sự (1976).
4. Phân tích trật tự và xây dựng cây phát sinh: Trình tự của ADNr
18S, ITS bao gồm 5,8S và D1/D2 của 26S được xác định theo
Takashima và Nakase (1999), Kurtzman và Robnnet (1997). Sử dụng
chương trình computer CLUSTAL X ver 1.83 của Thompson và cộng
sự (1994). Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát
sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL và Gen Bank.
Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương
pháp của Saitou và Nei (1987).
5. Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập và tinh sạch ADN thực hiện theo
phương pháp của Takashima và Nakase (2000). Các thí nghiệm lai
ADN-ADN genom được thực hiện theo phương pháp huỳnh quang của
Ezaki và cộng sự (1989).