Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim170030

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN








Lê Thị Thu Huyền





PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH
KERATINAZA VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA
ENZIM



Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS NGUYỄN ĐÌNH QUYẾN









Hà Nội - Năm 2012
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………… 4
1.1. Cấu trúc và tính chất của keratin…………………………………………….4
1.1.1. Cấu trúc của keratin……………………………………………………… 4
1.1.2. Tính chất của keratin………………………………………………………7
1.1.3. Các nguồn keratin …………………………………………………………8
1.2. Tình hình khai thác và sử dụng keratin hiện nay…………………………….8
1.2.1. Tình hình khai thác và sử dụng keratin trên thế giới………………………9
1.2.2. Tình hình khai thác và sử dụng keratin ở Việt Nam………………………11
1.3. Sự phân huỷ keratin trong tự nhiên………………………………………….11
1.4. Các phƣơng pháp phân huỷ keratin…………………………………………13
1.4.1. Phƣơng pháp lý hoá……………………………………………………….13
1.4.2. Phƣơng pháp sinh học…………………………………………………….14
1.5. Đặc điểm của enzim keratinaza ở vi sinh vật……………………………….14
1.6. Một số ứng dụng của keratinaza…………………………………………….16

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………… 21
2.1. Vật liệu, hoá chất và các thiết bị…………………………………………… 21
2.1.1. Vật liệu…………………………………………………………………… 21
2.1.2. Hoá chất……………………………………………………………………21
2.1.3 Thiết bị, máy móc thí nghiệm………………………………………………24
2.2. Phƣơng pháp…………………………………………………………………24
2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ đất……… …… 24
2.2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khả
năng sinh bào tử của các chủng sinh keratinaza …………………………………25
2.2.3. So sánh hoạt tính keratinaza của các chủng vi khuẩn sinh keratinaza…….26
2.2.4. Xác định một số điều kiện tối ƣu hoá môi trƣờng nuôi cấy …………… 27
2.2.4.1. Xác định ảnh hƣởng của lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy…… 27
2.2.4.2. Xác định ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu……….…… 28
2.2.4.3. Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy ban đầu….…… 28
2.2.5. Xác định ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt tính
keratinaza……………………………………………………………………… 28
2.2.5.1. Xác định hoạt tính keratinaza……………………………………………28
2.2.5.2. Xác định ảnh hƣởng của pH .………… ……………………………… 29
2.2.5.3. Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ .………….……………………………29
2.2.5.4. Xác định ảnh hƣởng của một số ion kim loại.………………………… 30
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………….31
3.1. Sự phân rã của lông gà khi đƣợc sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất
để nuôi cấy vi khuẩn có hoạt tính keratinaza…………………………………….31
3.2. Một số đặc điểm của các chủng có hoạt tính keratinaza … ……………….32
3.3. Xác định chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza mạnh nhất …………… 34
3.4. Một số điều kiện tối ƣu hoá môi trƣờng nuôi cấy………………………… 36
3.4.1. Ảnh hƣởng của lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy……………… 36
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu……….……………… 37
3.4.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy ban đầu….……………… 38
3.5. Một số đặc tính của keratinaza…………………………………………… 38

3.5.1. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính keratinaza………………………………38
3.5.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza…………………………40
3.5.3. Ảnh hƣởng của một số ion kim loại……………………………………….42
KẾT LUẬN………………………………………………………………………44
KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………… 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………… 46


MỞ ĐẦU

Trong những năm qua, proteaza là nhóm enzim thuỷ phân đƣợc nghiên cứu
nhiều nhất trong ngành công nghiệp enzim. Hiện nay, proteaza chiếm khoảng 60 -
65% thị trƣờng enzim công nghiệp trên thế giới; trong đó bao gồm 28% proteaza
kiềm, 10% renin và 21% là các loại proteaza khác (1). Proteaza kiềm đang đƣợc
ứng dụng trong nhiều ngành: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm, chăn
nuôi, may mặc, thuộc da, xử lý môi trƣờng, thu hồi bạc từ các bản phim,
Keratinaza thuộc nhóm proteaza kiềm, hoạt động trên cơ chất là keratin, trong
những năm gần đây cũng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu bởi tiềm năng ứng dụng
của chúng.
Keratin là nhóm các protein tự nhiên, là thành phần chính cấu tạo nên các loại
lông, tóc, móng, sừng,… Lông gà trƣởng thành chiếm 5 - 7% trọng lƣợng sống.
Trên thế giới, mỗi năm có tới 24 tỉ con gà và khoảng 8,4 triệu tấn lông vũ đƣợc thải
ra từ ngành công nghiệp gia cầm (31), mức tăng hàng năm cũng lên tới khoảng
4.5% (18). Hàm lƣợng protein trong lông vũ rất cao, chiếm tới trên 90%, nên có
thể coi đây là một nguồn protein tiềm năng lớn có thể khai thác làm thức ăn cho
chăn nuôi và nhiều ứng dụng khác.
Tuy nhiên, keratin lại là loại protein rất bền nhờ có các liên kết disulfua trong
phân tử. Vì vậy, chúng có tính ổn định cơ học cao, có khả năng chống chịu tốt với
tác động vật lý, hoá học và sinh học, không bị phân huỷ bởi nƣớc và các proteaza
thông thƣờng nhƣ: trypsin, papain và pepsin .

Các nhà máy thuộc da, lông thú và các lò giết mổ gia súc, gia cầm vứt bỏ một
lƣợng đáng kể các vật liệu chứa keratin: lông, len, sừng, móng,…. Ở Việt Nam, chỉ
một phần rất nhỏ trong số chúng đƣợc sử dụng chủ yếu trong sản xuất một số sản
phẩm thủ công, may mặc; phần lớn còn lại chỉ đƣợc loại bỏ và xử lý đơn giản nhƣ
đốt, chôn hoặc chỉ là chất thành các đống rác lớn chƣa có phƣơng pháp xử lý gây ô
nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng.
Trên thế giới, trƣớc đây ngƣời ta áp dụng phƣơng pháp xử lý lông vũ bằng cách
thuỷ phân trong môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao. Tuy nhiên, phƣơng
pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin ( nhƣ: metionin, lysin, histidin) mà
còn tiêu thụ một lƣợng lớn năng lƣợng . Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có
hoạt tính keratinaza là một phƣơng pháp thay thế đƣợc lựa chọn đem lại hiệu quả
cao, khắc phục đƣợc những hạn chế của các phƣơng pháp cũ. Ngoài ra, bên cạnh
việc tạo ra nguồn protein bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi, xử lý đƣợc nguồn
rác khó phân giải góp phần chống ô nhiễm môi trƣờng thì keratinaza đƣợc phân lập
từ vi sinh vật cũng có thể đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng công nghệ
sinh học khác nhƣ: loại bỏ lông trong ngành công nghiệp thuộc da , làm sạch các
vật cản lông vũ trong các hệ thống nƣớc thải, phòng chống bệnh bò điên (21),…
Tuy nhiên, một trong những hạn chế lớn ảnh hƣởng đến sự ổn định độ pH
kiềm tính của các enzym này là có sự ổn định trong một phạm vi pH rộng nhƣng
thƣờng không ổn nhiệt. Vì vậy, ngƣời ta mong muốn tìm kiếm các protease mới
với những đặc tính mới lạ từ nhiều nguồn khác nhau (34).
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên
cứu về các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza, đặc điểm và ứng dụng của chúng,
bƣớc đầu phục vụ cho phân huỷ lông vũ dùng làm thức ăn cho gia súc đã đem lại
hiệu quả tốt (4, 10, 11, 14, 16, 23, 26, 27, 42). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những
nghiên cứu về lĩnh vực này chƣa có nhiều và việc ứng dụng chúng còn rất hạn chế,
hầu hết lông vũ từ các lò giết mổ chỉ đƣợc coi là rác thải; cùng với đó, việc xử lý
rác thải chƣa đƣợc quan tâm nhiều. Đề tài "Phân lập vi khuẩn có hoạt tính
keratinaza và một số đặc tính của enzim" đƣợc thực hiện nhằm:
- Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ các mẫu đất khác nhau

và xác định đƣợc chủng có hoạt tính tốt nhất.
- Một số điều kiện tối ƣu về hàm lƣợng lông, nhiệt độ và pH môi trƣờng nuôi
cấy ban đầu cho nuôi chủng sinh keratinaza.
- Một số đặc tính của enzim, nhƣ hoạt động tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ,
pH và sự có mặt của những ion nào.
Từ đó có thể ứng dụng vào thực tiễn góp phần xử lý rác thải lông vũ một cách
hiệu quả, tận dụng một nguồn protein đang bị bỏ phí làm thức ăn bổ sung trong
chăn nuôi và có thể mở rộng sang nhiều ứng dụng khác nếu đƣợc tiếp tục nghiên
cứu.



















Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA KERATIN
1.1.1. Cấu trúc của keratin
Trong lịch sử, thuật ngữ keratin dùng cho tất cả các protein chiết xuất từ sự
biến đổi của da, chẳng hạn nhƣ lông, sừng, móng vuốt và móng guốc. Sau đó,
ngƣời ta đã nhận ra rằng keratin thực sự là một hỗn hợp của keratin, keratin liên
quan đến các protein và các protein khác, chẳng hạn nhƣ enzim. Keratin sau đó
đƣợc định nghĩa là một số protein hình thành sợi với các đặc tính hóa lý cụ thể và
chiết xuất từ lớp hoá sừng của biểu bì, trong khi những protein hình thành lông, tóc
đƣợc chiết xuất từ các lớp của biểu bì đã đƣợc nhóm lại là ''prekeratin'' hoặc
''cytokeratin'' .
Nhƣ vậy, keratin là nhóm các protein có cấu trúc dạng sợi với các đặc tính hoá
lý cụ thể, là thành phần chính cấu tạo nên lông, tóc, móng, sừng, trong biểu mô của
tế bào động vật có xƣơng sống…
Trọng lƣợng phân tử keratin ở động vật có vú từ 40 đến 70 kDa.
Trong số các loại axit amin tạo nên các phân tử keratin thì cystein là phổ biến
nhất (có thể chiếm tới 24%), ngoài ra, keratin từ lông gia cầm còn chứa hàm lƣợng
cao các axit amin nhƣ: glycin, alanin, serin và valin.
Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử, keratin có hàm lƣợng lớn
lƣu huỳnh có chứa trong cystein, tạo ra các cầu disunfua cho keratin.
Keratin đƣợc tạo ra bởi các tế bào sừng - các tế bào sống tạo nên phần lớn của
lông, tóc, móng, da,…Sau đó, các tế bào này chết và bao phủ bên ngoài có tác
dụng bảo vệ.
Các α-keratin -cuộn sợi protein duy nhất (thƣờng có các liên kết hiđro trong
chuỗi ), sau đó tiếp tục xoắn vào các dây siêu xoắn để có thể tiếp tục cuộn. β -
keratin có các tấm β xoắn lại với nhau, sau đó đƣợc ổn định và làm cứng bằng các
cầu disunfua.
Keratin đƣợc phân loại cụ thể theo cấu trúc phân tử của chúng, đặc điểm hóa lý
, các tế bào biểu mô sản xuất và loại biểu mô có chứa các tế bào sản xuất keratin.
Theo cấu tạo, keratin có 2 loại chính:
-keratin: Trong tóc, lông cừu, sừng, móng tay, móng chân, móng và guốc của

động vật có vú. Cấu tạo là các sợi đơn protein liên kết với nhau bằng các liên kết
hiđro.
Xoắn alpha của keratin không phải là một chuỗi xoắn alpha đúng, vì nó chỉ có
3,5 dƣ lƣợng / lƣợt; trong khi xoắn alpha bình thƣờng có 3,6 dƣ lƣợng / lƣợt. Điều
này quan trọng để tạo thành liên kết disunfua chặt chẽ. Ngoài ra, khoảng cuối mỗi
dƣ lƣợng thứ bảy là một axit amin lơxin, để chúng có thể sắp xếp và giúp các sợi
liên kết lại với nhau thông qua tƣơng tác kỵ nƣớc.
-keratin: Trong móng tay, móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ testudines (ba ba,
rùa), trong lông, mỏ, móng vuốt của các loài chim và lông của nhím, đƣợc hình
thành chủ yếu trong các tấm beta, cứng chắc hơn các tấm anpha do các tấm beta
đƣợc nối với nhau bằng các cầu disulfua.



Hình 1.1. Cấu trúc của keratin

Các monome của keratin lắp ráp lại thành bó để tạo thành các sợi trung gian từ
đó tạo thành các mô không khoáng hoá bền vững gặp ở các loài bò sát, chim,
lƣỡng cƣ và động vật có vú.


Hình 1.2. Các dạng cấu trúc của keratin
a. Cấu trúc miền phụ của chuỗi keratin biểu bì hiển thị cơ bản cuối vùng E1 và E2
ngắn, glycin / serin ở vùng giàu V1 và V2, và các khu vực tương đồng H1 và H2
(Steinert 1993).
b. Cấu trúc miền phụ của các chuỗi a-keratin cứng cơ bản (NB) và axit (NA) khu
vực của miền N-thiết bị đầu cuối. Miền thiết bị đầu cuối của các loại chuỗi được
đặc trưng bởi một motif proline-cysteine-X lặp đi lặp lại.Miền C-thiết bị đầu cuối
của loại dây chuyền II có chứa một phân bố định kỳ dư lượng kỵ nước (Parry và
North,1998).

c. Mô hình cấu trúc của keratin cuộn cuộn dây dimer, chiều dài 45 nm.Các axit
amin kỵ nước của hai xoắn-khớp với nhau trong một mô hình lồng vào nhau
thường xuyên (Cohlberg,1993).
d. Tổ chức microfibrils keratin, đầu hình cầu, đuôi (màu đen). Các thiết bị đầu
cuối có thể tương tác với các phân đoạn trong sợi và với tên miền C khác trong
một phân tử lân cận phản song song (Parry và North,1998).

1.1.2. Tính chất của keratin
Keratin là protein rất bền. Do có axit amin cystein chứa lƣu huỳnh có khả năng
tạo liên kết với nhau bằng các cầu disunfua, tạo ra một dạng xoắn cực kì chặt chẽ,
khiến keratin khá cứng chắc, bền nhiệt và rất khó hoà tan. Keratin cũng khó bị
phân giải bởi các proteaza thông thƣờng nhƣ: trypsin, papain và pepsin. Keratin
không bị hòa tan trong dung dịch muối nhƣng những protein này có thể hoà tan
trong các dung dịch có chứa các chất biến tính, chẳng hạn nhƣ urê. Keratin trong
dung dịch có thể lắp ráp lại sợi trung gian.
Do có chứa hàm lƣợng lƣu huỳnh cao nên khi đốt keratin trong lông, tóc,
móng,… gây ra mùi khét đặc trƣng.
Tuỳ thuộc vào hàm lƣợng cystein và các cầu disunfua mà tạo ra các tế bào chứa
keratin rất cứng nhƣ trong móng, guốc hoặc có thể linh hoạt hơn nhƣ trong da. Hầu
hết các tế bào chứa nhiều keratin mà ta gặp là các tế bào đã chết và có thể đƣợc
rụng ra hoặc bị các tế bào mới đẩy lên. Nếu các tế bào đã chết này đƣợc lƣu giữ
trong tình trạng tốt, chúng sẽ có tác dụng nhƣ 1 lớp cách điện, cách nhiệt, không
thấm nƣớc,… bảo vệ các tế bào phía dƣới.

1.1.3. Các nguồn keratin
Keratin chỉ đƣợc tìm thấy trong các tế bào biểu mô. Keratin tự nhiên đƣợc tạo
ra từ các tế bào sừng của cơ thể. Trong tự nhiên, keratin là thành phần chính cấu
tạo nên các cấu trúc nhƣ lông, tóc, móng guốc, sừng, da,… của động vật. Ở gà
trƣởng thành, lông chiếm 5 - 7 % khối lƣợng cơ thể; trong đó, keratin lại là thành
phần chủ yếu. Trên thế giới có tới vài triệu tấn lông vũ đƣợc tạo ra hàng năm từ

ngành chế biến gia cầm và tỉ lệ tăng hàng năm là khoảng 4,5% (18). Ở Việt Nam,
cùng với sự phát triển của các ngành chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm đã tạo
ra một lƣợng lớn keratin thô cần đƣợc xử lý.

1.2. TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ SỬ DỤNG KERATIN HIỆN NAY
1.2.1. Tình hình khai thác và sử dụng keratin trên thế giới
Mặc dù nguồn keratin tự nhiên khá dồi dào, hàm lƣợng protein trong lông, tóc,
móng,… rất cao; tuy nhiên, do tính bền vững mà keratin hầu nhƣ chƣa đƣợc khai
thác và sử dụng nhiều. Chỉ một phần rất nhỏ lông, tóc, móng,… đƣợc sử dụng để
làm các sản phẩm thủ công mĩ nghệ, làm chăn ga gối, áo,
Ngành công nghệ sinh vi sinh trên thế giới đã và đang tìm kiếm các môi
trƣờng nuôi cấy vi sinh vật với chất lƣợng cao và giá rẻ. Việc sử dụng lông từ công
nghiệp gia cầm làm cơ chất lên men là lựa chọn không tốn kém để sản xuất
enzyme, protein…bằng công nghệ vi sinh nếu áp dụng hiệu quả.
Lông gia cầm giàu protein (chủ yếu là keratin), là phế phẩm đƣợc tạo ra rất
nhiều từ công nghiệp gia cầm. Trong một vài năm, chúng là chủ thể của các nghiên
cứu dinh dƣỡng nhằm sử dụng làm nguồn nitơ bổ sung trong thức ăn gia cầm. Điều
này tạo ra một số lợi thế cho công nghiệp gia cầm nhƣ loại trừ vấn đề môi trƣờng,
giảm chi phí nguyên liệu. Tuy nhiên, lông có hai giới hạn dinh dƣỡng là làm mất
cân bằng axit amin và khó tiêu hoá.
Trong công nghiệp, ngƣời ta nấu phần lớn lông thải ra dƣới nhiệt độ và áp suất
cao, sau đó sử dụng làm nguồn protein bổ sung trong thức ăn gia cầm. Rất nhiều
đánh giá hiệu quả của sản phẩm này đã cho thấy chúng không dễ tiêu hoá và do
quá trình xử lý nhiệt độ và áp suất phá huỷ một số axit amin, làm tăng sự mất cân
bằng các axit amin thiết yếu.
Do đó, cần có các phƣơng pháp xử lý lông khác, tăng cƣờng chất lƣợng dinh
dƣỡng của lông và phát triển các phụ phẩm hữu dụng. Một trong các phƣơng pháp
hiệu quả cao sử dụng vi sinh vật. Vi sinh vật làm biến đổi cấu trúc keratin, thay đổi
tính kháng các enzyme trong bộ máy tiêu hoá.
Một số nơi trên thế giới đã nghiên cứu và sử dụng sản phẩm phân huỷ lông gà

làm thức ăn bổ sung protein cho chăn nuôi gia súc. Sử dụng cách thuỷ phân bột
lông bằng vi khuẩn có thể tạo ra sản phẩm thay thế đến 15% protein trong thức ăn
gia cầm.
Keratinaza và các sản phẩm liên quan có nhiều ứng dụng (18). Ví dụ, lông
thủy phân bởi Bacillus licheniformis PWD-1 và Vibrio sp Bacillus licheniformis
chủng kr2 (16, 42) có thể đƣợc sử dụng nhƣ phụ gia thức ăn, trong khi keratinaza
từ Bacillus subtilis 168M tái tổ hợp có khả năng cạo lông đáng kể (1). Hơn nữa,
keratinaza từ B. licheniformis PWD-1 có thể làm giảm hình thức lây nhiễm của
prion, PrP
SC
, trong sự có mặt của chất tẩy rửa và xử lý nhiệt (21). Tuy nhiên trong
thực tế, những ứng dụng này còn ít. Phần lớn lông gia cầm từ các lò giết mổ bị coi
là rác thải và chƣa đƣợc xử lý triệt để, gây ô nhiễm môi trƣờng và lãng phí một
nguồn protein tốt.
Ví dụ thành phần axit amin và chất khoáng từ lông gà mái:

Thành phần axit amin (%)
Lysin 1,80
Methionin 0,48
Cystein 3,65
Methionin + cystein 4,13
Threonin 3,87
Tryptophan 0,43
Arginin 0,43
Glyxin 6,55
Serin 8,35
Histidin 0,64
Leucin 6,80
Isoleucin 4,20
Phenylalanin 3,90

Tirosin 2,34
Valin 7,15

Thành phần khoáng (%)
Canxi 0,20
Photpho 0,75
Muối 0,70
Kali 0,30
Chlorine 0,14
Magnesium 0,20
Sau khi thủy phân, lông cũng có thể đƣợc chuyển đổi sang các loại keo, phim
và là nguồn cung cấp một số protein hiếm , chẳng hạn nhƣ serine, cystein và
proline (8, 9, 17).

1.2.2. Tình hình khai thác và sử dụng keratin ở Việt Nam
Ở nƣớc ta, cũng nhƣ trên thế giới, nguồn keratin thô vẫn chƣa đƣợc khai thác và
sử dụng đáng kể; đặc biệt là lông gia cầm; phần lớn thải ra từ các lò giết mổ đều
chƣa đƣợc khai thác và xử lý hiệu quả. Chúng thƣờng bị tập trung lại thành các
đống lớn; một số đƣợc chôn lấp, một số bị đốt, còn lại chƣa đƣợc xử lý, gây ô
nhiễm nghiêm trọng môi trƣờng xung quanh các lò giết mổ. Hiện nay, ở nƣớc ta
cũng chƣa có nhiều nghiên cứu nhằm sử dụng sản phẩm phân huỷ sinh học lông
gia cầm làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi; vì vậy hầu nhƣ chƣa có ứng
dụng nào trong thực tiễn nhằm xử lý theo hƣớng này.

1.3. SỰ PHÂN HUỶ KERATIN TRONG TỰ NHIÊN
Thời gian cần thiết để lông gà thực sự bị phân huỷ tự nhiên là 5 - 7 năm. Trong
tự nhiên, những vi sinh vật có enzim keratinaza có khả năng phân huỷ keratin gồm
nhiều nhóm: nấm ( Aspergillus, Onygena, Absidia, Rhyzomucor, Alternaria
radicina, Trichurus spiralis, Stachybotrys atra,…), xạ khuẩn, vi khuẩn (7, 10, 13,
20, 22, 24, 25, 29, 30, 31, 35, 39, 43, 44, 45). Nhiều chủng vi khuẩn đã đƣợc phân

lập (6) nhƣ thống kê bảng sau:


Vi khuẩn phân lập đƣợc Nguồn gốc

Gram dƣơng
Bacillus licheniformis PWD-1 Chất thải gia cầm
B. subtilis S14 Đất
B. pumilus, Chất thải gia cầm
B. licheniformis và
B. cereus
B. pseudofirmus Hồ kiềm xút
B. maccoides và Đất bãi cỏ khô
Bacillus cereus
Streptomyces pactum DSM 40530 Môi trƣờng sƣu tầm
Streptomyces albidoflavus K
1-02
Đất dƣới chuồng gà
Streptomyces themoviolaceus Đất
Fervidobacterium pennavorans Đất
Microbacterium sp. kr10 Lông vũ bị phân huỷ
Microbispora aerate và Đất cực nam
Streptomyces flavus
Terrabacter terrae Đất
Kocuria rosea Đất
Gram âm
Vibrio sp. kr2 Chất thải lò mổ
Lysobacter sp. NCIMB 9497 Môi trƣờng sƣu tầm
Stenotrophomonas sp Lông hƣơu
Chryseobacterium sp. kr6 Lông phân huỷ

Alcaligenes faecalis, Đất bãi cỏ khô
Janthinobacterium lividum,
Stenotrophomonas maltophilia


1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN HUỶ KERATIN
1.4.1. Phƣơng pháp lý hoá
Keratin có thể bị phân huỷ bởi các phƣơng pháp lý hoá nhƣ thuỷ phân trong
môi trƣờng axit, môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao.
Nghiên cứu đầu tiên của việc sử dụng nhiệt để cải thiện giá trị dinh dƣỡng từ
thức ăn phân huỷ lông vũ là của Draper (1944). Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã
đƣợc thực hiện nhằm bổ sung thông tin nhằm nâng cao giá trị dinh dƣỡng từ thức
ăn lông vũ thuỷ phân (23).
Điều kiện chế biến có ảnh hƣởng rõ rệt đến giá trị dinh dƣỡng của thức ăn từ
lông thuỷ phân. Ở áp suất thấp và thời gian thuỷ phân dài có thể nâng giá trị dinh
dƣỡng và cải thiện khả năng tiêu hoá của động vật sử dụng thức ăn đó; tuy nhiên
hiệu quả phân giải thấp.
Thông thƣờng, lông đƣợc thuỷ phân bằng cách đun trong một nồi áp lực từ 30
đến 45 pounds/square/inch trong 30 đến 60 phút. Hiệu quả thuỷ phân có thể đạt 80
đến 85%. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin
(methionin, lysin, histidin), sản sinh một số chất độc, nên khó sử dụng sản phẩm
phân huỷ theo cách này để làm thức ăn cho chăn nuôi hay tận dụng nguồn protein
cho các mục đích khác. Bên cạnh đó, phân huỷ lông vũ theo phƣơng pháp này còn
tiêu thụ một lƣợng lớn năng lƣợng.
Nhiều nơi, keratin thô bị xử lý bằng cách đốt. Phƣơng pháp này tạo ra một số
khí gây ô nhiễm môi trƣờng đồng thời lãng phí nguồn protein từ keratin.

1.4.2. Phƣơng pháp sinh học
Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phƣơng
pháp thay thế đƣợc lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục đƣợc những hạn chế

của các phƣơng pháp lý hoá. Ngƣời ta đã tiến hành phân lập đƣợc các vi sinh vật
bao gồm cả nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn với nhiều chủng có hoạt tính keratinaza cao
đƣợc sử dụng trong việc phân huỷ lông vũ và sử dụng sản phẩm phân huỷ đó làm
nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi. Chúng là loài chung của nấm, xạ khuẩn và
vi khuẩn
nhƣ: Doratomyces microsporus, Aspergillus sp, Alternaria radicina, Trichurus
spiralis, Stachybotrys atra, Onygena sp, Absidia sp, Rhizomucor sp , Streptomyces
pactum, S. albs, S. thermoviolaceus, S. fradiae , S.thermonitrificans ,
Flavobacterium pennavorans, Bacillus sp , Stenotrophomonas sp , Bacillus
licheniformis và B. pumilus và Vibrio sp.

Phân huỷ lông vũ trong quá trình lên men của các nhóm vi khuẩn ƣa nhiệt nhƣ
Bacillus, Streptomyces, Vibrio, Chryseobacterium đã đƣợc ứng dụng rộng rãi hơn
cả.
Những vi sinh vật này tiết keratinaza ngoại bào khi môi trƣờng có keratin -
phân huỷ keratin thành các axit amin hoặc các peptit ngắn, những chất này đƣợc vi
sinh vật sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ.

1.5. ĐẶC ĐIỂM CỦA KERATINAZA
Keratinaza là enzim thuỷ phân protein ngoại bào trong tự nhiên. Keratinaza có
tên IUB là EC 3.4.99, có trọng lƣợng phân tử từ hàng chục đến vài trăm kDa.
Keratinaza chủ yếu đƣợc xếp vào nhóm proteaza serin do có đến 97% cấu trúc
giống với cấu trúc của proteaza serin và cũng bị ức chế bởi các chất ức chế
proteaza serin (7, 40).
Hầu hết các keratinaza đã phát hiện đƣợc cho đến nay là serin proteaza (5, 7,
12, 22), và một vài Metallo proteaza (6).
Theo Brandelli, A. (2008), đặc điểm của keratinaza ở một số chủng vi sinh vật
nhƣ sau:

Vi sinh vật Nhóm Trọng lƣợng pH

tạo ra enzim phân tử (kDa) tối thích

B. licheniformis PWD-1 Serine 33 7.5
B. subtilis KS-1 Serine 25.4 7.5
B. pseudofimus FA 30-10 Serine 27.5 9-10
S. pactum DSM 40530 Serine 30 7-10
S. albidoflavus K
1-02
Serine 18 6-9.5
F. pennavorans Serine 130 10
X. mantophilia POA-1 Serine 36 8.0
Vibrio sp. kr2 Serine 30 8.0
Chryseobacterium sp. kr6 Metallo 64 7.5
Microbacterium sp. kr10 Metallo 42 7.5
Kocuria rosea LPB-3 Serine 240 10


Hầu nhƣ tất cả các keratinaza là enzim cảm ứng và các vật liệu có chứa keratin
khác nhau nhƣ lông, tóc và lông cừu có thể đƣợc sử dụng làm chất nền cho
keratinaza sản xuất (17). Trong đó, lông là chất nền chủ yếu đƣợc sử dụng.
Keratinaza ở vi sinh vật chỉ đƣợc tạo thành khi môi trƣờng có mặt keratin. Các
keratinaza của vi sinh vật có vai trò sinh học rất quan trọng đối với mục tiêu thuỷ
phân các liên kết ngang disulfua bền vững của các hợp chất keratin. Nó chủ yếu tấn
công vào các liên kết -S-S- của phân tử keratin. Cơ chế phân giải phức tạp của
chúng liên quan đến sự hoạt động đồng thời của hệ thống phân giải sunfua và phân
giải protein. Keratinaza hoạt động ở khoảng nhiệt độ và pH tƣơng đối rộng nhƣng
tốt hơn điều kiện môi trƣờng hơi kiềm và là loại enzim ƣa nhiệt.
Keratinaza là enzim ngoại bào do nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn sản sinh. Các
enzim này có nhiều đặc trƣng với chất nền vì có thể phân giải nhiều protein sợi
nhƣ: fibrin, elastin, collagen và protein không có xơ nhƣ casein, albumin huyết

thanh bò gelatin (7, 24, 25).

1.6. MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA KERATINAZA
Hiện nay, keratinaza của vi sinh vật đƣợc quan tâm nhiều trong việc phân giải
lông gia cầm làm thức ăn chăn nuôi và phân bón. Bên cạnh đó, chúng cũng đƣợc
biết đến với ứng dụng làm sạch lông cừu, làm sạch lụa, trong ngành công nghiệp
da, cạo lông tóc, các sản phẩm chăm sóc cá nhân,…Hơn nữa, ứng dụng tiềm năng
của chúng trong lĩnh vực phân giải prion sẽ rất có ý nghĩa.






Thức ăn thuỷ phân

Sản xuất thuốc Phân bón


Chất tẩy rửa KERATINAZA Công nghiệp da


Sản xuất khí Công nghiệp dệt
sinh học may

Thuỷ phân prion


* Ứng dụng làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi
Thí nghiệm trên gà, ngƣời ta nhận thấy rằng lông thuỷ phân đƣợc cân bằng về

một số axit amin, có thể thay thế đậu nành nhƣ là một nguồn protein chiếm tới
70% trong khẩu phần. Trong các nghiên cứu khác (Cater, 1998), bột lông thƣơng
mại đƣợc ủ qua đêm với Keratinaza để tạo ra một phần bột lông thuỷ phân. Khả
năng tiêu hoá axit amin từ bột lông thuỷ phân ở gà trƣởng thành là 82%, cao hơn
so với bột lông thƣơng mại, 60%. Thí nghiệm trên gà, bột lông thuỷ phân đƣợc
coi là có thể thay thế đậu nành ở mức 70% protein trong khẩu phần. Có thể kết
luận rằng Keratinaza có thể thuỷ phân và biến đổi bột lông thành nguồn protein có
thể tiêu hoá ở mức tối đa là 70% protein trong khẩu phần ăn.
Gần đây hơn, sản phẩm Keratinaza đƣợc thử nghiệm nhƣ là một enzim cho ăn
trực tiếp trong thức ăn của gà. Khi gà thiếu nhiều protein trong khẩu phần (80%
nhu cầu) thì Keratinaza trong khẩu phần có thể cải thiện sinh trƣởng của gà. Trong
3 tuần đầu tiên, tỷ lệ biến đổi thức ăn là 2,03 đối với khẩu phần đƣợc bổ sung
Keratinase. Tỉ lệ biến đổi thức ăn đối với khầu phần đối chứng đủ protein là 1,83.
Nhiều thí nghiệm đang đƣợc nghiên cứu để thiết lập giá trị dinh dƣỡng của
Keratinaza (23).
* Ứng dụng trong điều trị bệnh bò điên
Bệnh bò điên (BSE), Scrapie ở cừu và Creusfldt - Jakob (CJD) ở ngƣời là
thành viên của nhóm bệnh thoái hoá thần kinh. Chúng gây nên bởi protein truyền
nhiễm (PrP
CS
) (21). Chúng là bệnh gây tử vong và rất khó kiểm soát, bởi vì
PrP
SC
có sức đề kháng với các quá trình vô trùng thông thƣờng. Về hoá học,
PrP
SC
là một protein ổn định, giàu cấu trúc B, có sức đề kháng với nhiệt và
proteaza. Sự bùng nổ BSE , tiếp theo là bệnh CJD trên ngƣời ở Anh đã trở thành
một làn sóng hoảng loạn trên thế giới. Một phƣơng pháp phòng chống để kiểm soát
bệnh này là một nhu cầu cấp bách để đàn gia súc của chúng ta và sức khỏe cộng

đồng.
Keratinaza phân huỷ lông và PrP
SC
có cấu trúc tƣơng tự nhau, cả hai đều có
cấu trúc protein B và có sức đề kháng với hầu hết proteaza. Một thí nghiệm gần
đây đã đƣợc tiến hành ở ID-Lelystad, Hà Lan. Tế bào não BSE đƣợc xử lý và chẩn
đoán bằng phƣơng pháp chuẩn, ngoại trừ là các mô đồng nhất đƣợc nấu trƣớc và
đƣợc tiêu hoá bởi PWD-1 Keratinase. Rất là thú vị, PrP
SC
đƣợc coi là hoàn toàn tự
phân huỷ hay tự thuỷ phân bởi enzyme . Khám phá đầu tiên này cho thấy có thể
phát triển một quá trình enzim, sử dụng keratinaza từ chủng Bacillus subtilis PWD-
1, để khử các dụng cụ y tế truyền nhiễm và các sản phẩm gia súc.
* Ứng dụng trong công nghệ thuộc da
Công nghệ thuộc da gồm nhiều khâu: khâu chuẩn bị thuộc (làm sạch da và
chuẩn bị điều kiện để thuộc); khâu thuộc (tạo cho da không bị phân hủy trong
không khí); khâu hoàn thành (Tạo các tính chất sử dụng cho da). Mỗi khâu đều sử
dụng nhiều hóa chất và đƣa ra chất thải với lƣợng lớn . Sử dụng chế phẩm enzym
là ví dụ điển hình của xu hƣớng công nghệ mới trên ngƣỡng cửa thế kỷ 21, đó là sự
kết hợp giữa các ngành hóa học và sinh học, mà kết quả là những sản phẩm đƣợc
ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Sử dụng chế phẩm enzyme thay thế hóa chất
là hƣớng nghiên cứu quan trọng cho nhiều công đoạn thuộc da.
Công nghệ tẩy lông thông thƣờng sử dụng vôi và natri sulphua, đây là nguồn ô
nhiễm lớn. Sử dụng keratinaza để tẩy lông trong thuộc da rút ngắn thời gian xử lý,
giảm chi phí sản xuất, nâng cao chất lƣợng sản phẩm. Proteaza kiềm có trong chế
phẩm đã thuỷ phân các protein không phải là colagen nhƣ albumin, glubulin và
keratin mềm, không tác động lên colagen ở lớp cật. Với chế phẩm enzim có hoạt
độ proteaza 3000 U/g (hoạt độ keratinaza 700 U/g), lƣợng enzim bổ sung với nồng
độ 2% (khối lƣợng da), thời gian ngâm là 6 - 7 giờ, hiệu quả tẩy lông đạt 90 - 93%
(1).

* Ứng dụng trong công nghiệp dệt
Keratinza đƣợc sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo
đƣợc tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi đƣợc bóng, dễ nhuộm.
Keratinaza có tác dụng thủy phân lớp protein serin đã làm dính bết các sợi tơ tự
nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lƣợng hoá chất để tẩy
trắng.

* Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa
Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn đƣợc sản xuất vào năm 1956
với tên BIO-40 đƣợc thu nhận từ Bacillus subtilis. Đến năm 1963, Novo Industry
A/S đã giới thiệu alcalase dƣới tên thƣơng mại là BIOTEX đƣợc chiết xuất từ
Bacillus licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các proteaza bổ sung vào chất tẩy
dùng trên thị trƣờng đều là proteaza serine đƣợc sản xuất từ các chủng Bacillus ,
và chủ yếu là từ Bacillus subtilis (1). Trên thế giới, mỗi năm ngƣời ta đã sử dụng
89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo
Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95%
lƣợng enzim proteaza (17).

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ
2.1.1. Vật liệu
- Các mẫu đất chôn lông gà từ 1 đến 6 tháng thu thập từ các vị trí khác nhau tại
các huyện Thanh Hà, Ninh Giang tỉnh Hải Dƣơng; quận Hà Đông thành phố Hà
Nội. Các mẫu đất này đƣợc sử dụng để phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza.
Các mẫu đất được sử dụng trong nghiên cứu:
Mẫu A: Đất vƣờn, đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại
xã Thanh Hồng, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dƣơng.
Mẫu B : Đất vƣờn, đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại
xã Hợp Đức, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dƣơng.
Mẫu C: Đất ở nơi thải lông của cơ sở giết mổ gia cầm tƣ nhân, thị trấn Thanh
Hà, huyện Thanh Hà, Hải Dƣơng.
Mẫu D: Đất vƣờn, đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại
huyện Ninh Giang, tỉnh Hải Dƣơng.
Mẫu E: Đất đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại quận Hà
Đông, Hà Nội.
- Lông gà, tóc,

2.1.2. Hoá chất
Các hoá chất đƣợc sử dụng nghiên cứu hầu hết là các hoá chất đƣợc nhập ngoại

của các hãng Sigma, Merc, Aldrich,…
Các loại dung dịch đệm đƣợc sử dụng:
- Các dung dịch đệm có pH 5,8 -9,2 ( đệm photphat borat )

pH
Dung dịch KH
2
PO
4
0.1M , ml
Dung dịch borat 0.05M , ml
6.0
87.7
12.3
7.0
61
39
8.0
45
55
9.0
13.2
86.8

- Các dung dịch đệm có pH 7,8 -11,0 ( đệm borat )
pH
Dung dịch borat 0,05 M , ml
Dung dịch natri hiđroxit 0,1 N ,ml
10
59.5

40.5
11
50.1
49.8

- Đệm Tris - HCl.

* Môi trường nuôi cấy
- Môi trường Nutrient Agar (NA, g/l) để phân lập vi khuẩn:
Cao thịt bò 3
Pepton 10
Agar 18
Nƣớc cất 1000ml
pH = 7
Khử trùng ở 121
0
C, 1 atm, 30 phút.

- Môi trường LB (g/l) để giữ giống:
Cao nấm men 5
Pepton 10
NaCl 5
Agar 18