Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và
một số đặc tính của enzim
Lê Thị Thu Huyền
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40
Ngƣời hƣớng dẫn: GS.TS. Nguyễn Đình Quyến
Năm bảo vệ: 2012
Abstract. Tổng quan về cấu trúc và tính chất của keratin, tình hình khai thác và sử
dụng keratin hiện nay. Tiến hành nghiên cứu phân lập vi khuẩn có hoạt tính
keratinaza và một số đặc tính của enzim. Trình bày các kết quả nghiên cứu đạt đƣợc:
Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza; Các
chủng này đều có khả năng sử dụng lông gà nhƣ là nguồn cacbon và nitơ duy nhất;
Cả 6 chủng này đều có một số đặc điểm giống chi Bacillus; Keratinaza từ 6 chủng
phân lập đƣợc đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11 và trong khoảng nhiệt độ 30 -
600C; Chủng Kr2 có hoạt tính keratinaza cao nhất; pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt
động của keratinaza của chủng này là pH = 9 và nhiệt độ 500C; Hoạt tính của
keratinaza tăng khi trong môi trƣờng phản ứng có mặt của một số ion : Na+, Ca2+,
K+, Mg2+, đặc biệt là ion Ca2+ , ở nồng độ 1 mM và 5 mM; và giảm hoạt tính khi
trong môi trƣờng phản ứng có mặt một số ion nhƣ: Fe3+, Cu2+ ; Điều kiện nuôi tốt
nhất cho khả năng sinh keratinaza của chủng Kr2 là môi trƣờng ban đầu có hàm
lƣợng lông là 20 g/l, pH = 7-8, nhiệt độ khoảng 350C.
Keywords. Vi sinh vật học; Vi khuẩn; Enzim; Hoạt tính Keratinaza
Content
MỞ ĐẦU
Keratin là nhóm các protein tự nhiên, là thành phần chính cấu tạo nên các loại lông, tóc,
móng, sừng,… Lông gà trƣởng thành chiếm 5 - 7% trọng lƣợng sống. Trên thế giới, mỗi năm
có tới 24 tỉ con gà và khoảng 8,4 triệu tấn lông vũ đƣợc thải ra từ ngành công nghiệp gia cầm
(31), mức tăng hàng năm cũng lên tới khoảng 4.5% (18). Hàm lƣợng protein trong lông vũ rất
cao, chiếm tới trên 90%, nên có thể coi đây là một nguồn protein tiềm năng lớn có thể khai
thác làm thức ăn cho chăn nuôi và nhiều ứng dụng khác.
Tuy nhiên, keratin lại là loại protein rất bền nhờ có các liên kết disulfua trong phân tử. Vì
vậy, chúng có tính ổn định cơ học cao, có khả năng chống chịu tốt với tác động vật lý, hoá
học và sinh học, không bị phân huỷ bởi nƣớc và các proteaza thông thƣờng nhƣ: trypsin,
papain và pepsin .
Các nhà máy thuộc da, lông thú và các lò giết mổ gia súc, gia cầm vứt bỏ một lƣợng đáng
kể các vật liệu chứa keratin: lông, len, sừng, móng,…. Ở Việt Nam, chỉ một phần rất nhỏ
trong số chúng đƣợc sử dụng chủ yếu trong sản xuất một số sản phẩm thủ công, may mặc;
phần lớn còn lại chỉ đƣợc loại bỏ và xử lý đơn giản nhƣ đốt, chôn hoặc chỉ là chất thành các
đống rác lớn chƣa có phƣơng pháp xử lý gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng.
Trên thế giới, trƣớc đây ngƣời ta áp dụng phƣơng pháp xử lý lông vũ bằng cách thuỷ phân
trong môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không chỉ phá
huỷ một số axit amin ( nhƣ: metionin, lysin, histidin) mà còn tiêu thụ một lƣợng lớn năng
lƣợng . Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phƣơng pháp
thay thế đƣợc lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục đƣợc những hạn chế của các phƣơng
pháp cũ. Ngoài ra, bên cạnh việc tạo ra nguồn protein bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi,
xử lý đƣợc nguồn rác khó phân giải góp phần chống ô nhiễm môi trƣờng thì keratinaza đƣợc
phân lập từ vi sinh vật cũng có thể đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng công nghệ
sinh học khác nhƣ: loại bỏ lông trong ngành công nghiệp thuộc da , làm sạch các vật cản lông
vũ trong các hệ thống nƣớc thải, phòng chống bệnh bò điên (21),…
Tuy nhiên, một trong những hạn chế lớn ảnh hƣởng đến sự ổn định độ pH kiềm tính của
các enzym này là có sự ổn định trong một phạm vi pH rộng nhƣng thƣờng không ổn nhiệt. Vì
vậy, ngƣời ta mong muốn tìm kiếm các protease mới với những đặc tính mới lạ từ nhiều
nguồn khác nhau (34).
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các
vi sinh vật có hoạt tính keratinaza, đặc điểm và ứng dụng của chúng, bƣớc đầu phục vụ cho
phân huỷ lông vũ dùng làm thức ăn cho gia súc đã đem lại hiệu quả tốt (4, 10, 11, 14, 16, 23,
26, 27, 42). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực này chƣa có nhiều và việc
ứng dụng chúng còn rất hạn chế, hầu hết lông vũ từ các lò giết mổ chỉ đƣợc coi là rác thải;
cùng với đó, việc xử lý rác thải chƣa đƣợc quan tâm nhiều. Đề tài "Phân lập vi khuẩn có
hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim" đƣợc thực hiện nhằm:
- Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ các mẫu đất khác nhau và xác
định đƣợc chủng có hoạt tính tốt nhất.
- Một số điều kiện tối ƣu về hàm lƣợng lông, nhiệt độ và pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
cho nuôi chủng sinh keratinaza.
- Một số đặc tính của enzim, nhƣ hoạt động tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ, pH và sự có
mặt của những ion nào.
Từ đó có thể ứng dụng vào thực tiễn góp phần xử lý rác thải lông vũ một cách hiệu quả,
tận dụng một nguồn protein đang bị bỏ phí làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và có thể mở
rộng sang nhiều ứng dụng khác nếu đƣợc tiếp tục nghiên cứu.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA KERATIN
1.1.1. Cấu trúc của keratin
Keratin là nhóm các protein có cấu trúc dạng sợi với các đặc tính hoá lý cụ thể, là thành
phần chính cấu tạo nên lông, tóc, móng, sừng, trong biểu mô của tế bào động vật có xƣơng
sống…
Trong số các loại axit amin tạo nên các phân tử keratin thì cystein là phổ biến nhất (có thể
chiếm tới 24%), ngoài ra, keratin từ lông gia cầm còn chứa hàm lƣợng cao các axit amin nhƣ:
glycin, alanin, serin và valin.
Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử, keratin có hàm lƣợng lớn lƣu huỳnh
có chứa trong cystein, tạo ra các cầu disunfua cho keratin.
Keratin đƣợc tạo ra bởi các tế bào sừng - các tế bào sống tạo nên phần lớn của lông, tóc,
móng, da,…Sau đó, các tế bào này chết và bao phủ bên ngoài có tác dụng bảo vệ.
Keratin đƣợc phân loại cụ thể theo cấu trúc phân tử của chúng, đặc điểm hóa lý , các tế
bào biểu mô sản xuất và loại biểu mô có chứa các tế bào sản xuất keratin.
Theo cấu tạo, keratin có 2 loại chính:
-keratin
-keratin
1.1.2. Tính chất của keratin
Keratin là protein rất bền. Do có axit amin cystein chứa lƣu huỳnh có khả năng tạo liên kết
với nhau bằng các cầu disunfua, tạo ra một dạng xoắn cực kì chặt chẽ, khiến keratin khá cứng
chắc, bền nhiệt và rất khó hoà tan. Keratin cũng khó bị phân giải bởi các proteaza thông
thƣờng nhƣ: trypsin, papain và pepsin. Keratin không bị hòa tan trong dung dịch muối nhƣng
những protein này có thể hoà tan trong các dung dịch có chứa các chất biến tính, chẳng hạn
nhƣ urê. Keratin trong dung dịch có thể lắp ráp lại sợi trung gian.
Tuỳ thuộc vào hàm lƣợng cystein và các cầu disunfua mà tạo ra các tế bào chứa keratin rất
cứng nhƣ trong móng, guốc hoặc có thể linh hoạt hơn nhƣ trong da. Hầu hết các tế bào chứa
nhiều keratin mà ta gặp là các tế bào đã chết và có thể đƣợc rụng ra hoặc bị các tế bào mới
đẩy lên. Nếu các tế bào đã chết này đƣợc lƣu giữ trong tình trạng tốt, chúng sẽ có tác dụng
nhƣ 1 lớp cách điện, cách nhiệt, không thấm nƣớc,… bảo vệ các tế bào phía dƣới.
1.1.3. Các nguồn keratin
Keratin tự nhiên đƣợc tạo ra từ các tế bào sừng của cơ thể. Trong tự nhiên, keratin là
thành phần chính cấu tạo nên các cấu trúc nhƣ lông, tóc, móng guốc, sừng, da,… của động
vật. Ở gà trƣởng thành, lông chiếm 5 - 7 % khối lƣợng cơ thể; trong đó, keratin lại là thành
phần chủ yếu. Trên thế giới có tới vài triệu tấn lông vũ đƣợc tạo ra hàng năm từ ngành chế
biến gia cầm và tỉ lệ tăng hàng năm là khoảng 4,5% (18). Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển
của các ngành chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm đã tạo ra một lƣợng lớn keratin thô cần
đƣợc xử lý.
1.2. TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ SỬ DỤNG KERATIN HIỆN NAY
1.2.1. Tình hình khai thác và sử dụng keratin trên thế giới
Mặc dù nguồn keratin tự nhiên khá dồi dào, hàm lƣợng protein trong lông, tóc, móng,…
rất cao; tuy nhiên, do tính bền vững mà keratin hầu nhƣ chƣa đƣợc khai thác và sử dụng
nhiều. Chỉ một phần rất nhỏ lông, tóc, móng,… đƣợc sử dụng để làm các sản phẩm thủ công
mĩ nghệ, làm chăn ga gối, áo,
Ngành công nghệ sinh vi sinh trên thế giới đã và đang tìm kiếm các môi trƣờng nuôi cấy
vi sinh vật với chất lƣợng cao và giá rẻ. Việc sử dụng lông từ công nghiệp gia cầm làm cơ
chất lên men là lựa chọn không tốn kém để sản xuất enzyme, protein…bằng công nghệ vi
sinh nếu áp dụng hiệu quả.
Trong công nghiệp, ngƣời ta nấu phần lớn lông thải ra dƣới nhiệt độ và áp suất cao, sau
đó sử dụng làm nguồn protein bổ sung trong thức ăn gia cầm. Rất nhiều đánh giá hiệu quả
của sản phẩm này đã cho thấy chúng không dễ tiêu hoá và do quá trình xử lý nhiệt độ và áp
suất phá huỷ một số axit amin, làm tăng sự mất cân bằng các axit amin thiết yếu.
Do đó, cần có các phƣơng pháp xử lý lông khác, tăng cƣờng chất lƣợng dinh dƣỡng của
lông và phát triển các phụ phẩm hữu dụng. Một trong các phƣơng pháp hiệu quả cao sử dụng
vi sinh vật. Vi sinh vật làm biến đổi cấu trúc keratin, thay đổi tính kháng các enzyme trong bộ
máy tiêu hoá.
Một số nơi trên thế giới đã nghiên cứu và sử dụng sản phẩm phân huỷ lông gà làm thức
ăn bổ sung protein cho chăn nuôi gia súc. Sử dụng cách thuỷ phân bột lông bằng vi khuẩn có
thể tạo ra sản phẩm thay thế đến 15% protein trong thức ăn gia cầm.
Keratinaza và các sản phẩm liên quan có nhiều ứng dụng (18). Ví dụ, lông thủy phân bởi
Bacillus licheniformis PWD-1 và Vibrio sp Bacillus licheniformis chủng kr2 (16, 42) có thể
đƣợc sử dụng nhƣ phụ gia thức ăn, trong khi keratinaza từ Bacillus subtilis 168M tái tổ hợp
có khả năng cạo lông đáng kể (1). Hơn nữa, keratinaza từ B. licheniformis PWD-1 có thể làm
giảm hình thức lây nhiễm của prion, PrP
SC
, trong sự có mặt của chất tẩy rửa và xử lý nhiệt
(21). Tuy nhiên trong thực tế, những ứng dụng này còn ít. Phần lớn lông gia cầm từ các lò
giết mổ bị coi là rác thải và chƣa đƣợc xử lý triệt để, gây ô nhiễm môi trƣờng và lãng phí một
nguồn protein tốt.
1.2.2. Tình hình khai thác và sử dụng keratin ở Việt Nam
Ở nƣớc ta, cũng nhƣ trên thế giới, nguồn keratin thô vẫn chƣa đƣợc khai thác và sử dụng
đáng kể; đặc biệt là lông gia cầm; phần lớn thải ra từ các lò giết mổ đều chƣa đƣợc khai thác
và xử lý hiệu quả. Chúng thƣờng bị tập trung lại thành các đống lớn; một số đƣợc chôn lấp,
một số bị đốt, còn lại chƣa đƣợc xử lý, gây ô nhiễm nghiêm trọng môi trƣờng xung quanh
các lò giết mổ. Hiện nay, ở nƣớc ta cũng chƣa có nhiều nghiên cứu nhằm sử dụng sản phẩm
phân huỷ sinh học lông gia cầm làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi; vì vậy hầu nhƣ
chƣa có ứng dụng nào trong thực tiễn nhằm xử lý theo hƣớng này.
1.3. SỰ PHÂN HUỶ KERATIN TRONG TỰ NHIÊN
Thời gian cần thiết để lông gà thực sự bị phân huỷ tự nhiên là 5 - 7 năm. Trong tự nhiên,
những vi sinh vật có enzim keratinaza có khả năng phân huỷ keratin gồm nhiều nhóm: nấm (
Aspergillus, Onygena, Absidia, Rhyzomucor, Alternaria radicina, Trichurus spiralis,
Stachybotrys atra,…), xạ khuẩn, vi khuẩn (7, 10, 13, 20, 22, 24, 25, 29, 30, 31, 35, 39, 43,
44, 45).
1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN HUỶ KERATIN
1.4.1. Phƣơng pháp lý hoá
Keratin có thể bị phân huỷ bởi các phƣơng pháp lý hoá nhƣ thuỷ phân trong môi trƣờng
axit, môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao.
Nghiên cứu đầu tiên của việc sử dụng nhiệt để cải thiện giá trị dinh dƣỡng từ thức ăn phân
huỷ lông vũ là của Draper (1944). Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện nhằm bổ
sung thông tin nhằm nâng cao giá trị dinh dƣỡng từ thức ăn lông vũ thuỷ phân (23).
Điều kiện chế biến có ảnh hƣởng rõ rệt đến giá trị dinh dƣỡng của thức ăn từ lông thuỷ
phân. Ở áp suất thấp và thời gian thuỷ phân dài có thể nâng giá trị dinh dƣỡng và cải thiện
khả năng tiêu hoá của động vật sử dụng thức ăn đó; tuy nhiên hiệu quả phân giải thấp.
Thông thƣờng, lông đƣợc thuỷ phân bằng cách đun trong một nồi áp lực từ 30 đến 45
pounds/square/inch trong 30 đến 60 phút. Hiệu quả thuỷ phân có thể đạt 80 đến 85%. Tuy
nhiên, phƣơng pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin (methionin, lysin, histidin), sản
sinh một số chất độc, nên khó sử dụng sản phẩm phân huỷ theo cách này để làm thức ăn cho
chăn nuôi hay tận dụng nguồn protein cho các mục đích khác. Bên cạnh đó, phân huỷ lông vũ
theo phƣơng pháp này còn tiêu thụ một lƣợng lớn năng lƣợng.
Nhiều nơi, keratin thô bị xử lý bằng cách đốt. Phƣơng pháp này tạo ra một số khí gây ô
nhiễm môi trƣờng đồng thời lãng phí nguồn protein từ keratin.
1.4.2. Phƣơng pháp sinh học
Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phƣơng pháp thay
thế đƣợc lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục đƣợc những hạn chế của các phƣơng pháp
lý hoá. Ngƣời ta đã tiến hành phân lập đƣợc các vi sinh vật bao gồm cả nấm, xạ khuẩn, vi
khuẩn với nhiều chủng có hoạt tính keratinaza cao đƣợc sử dụng trong việc phân huỷ lông vũ
và sử dụng sản phẩm phân huỷ đó làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi. Chúng là loài
chung của nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn
nhƣ: Doratomyces microsporus, Aspergillus sp, Alternaria radicina, Trichurus spiralis,
Stachybotrys atra, Onygena sp, Absidia sp, Rhizomucor sp , Streptomyces pactum, S. albs, S.
thermoviolaceus, S. fradiae , S.thermonitrificans , Flavobacterium pennavorans, Bacillus sp ,
Stenotrophomonas sp , Bacillus licheniformis và B. pumilus và Vibrio sp.
Những vi sinh vật này tiết keratinaza ngoại bào khi môi trƣờng có keratin - phân huỷ
keratin thành các axit amin hoặc các peptit ngắn, những chất này đƣợc vi sinh vật sử dụng
làm nguồn cacbon và nitơ.
1.5. ĐẶC ĐIỂM CỦA KERATINAZA
Keratinaza là enzim thuỷ phân protein ngoại bào trong tự nhiên. Keratinaza có tên IUB là
EC 3.4.99, có trọng lƣợng phân tử từ hàng chục đến vài trăm kDa. Keratinaza chủ yếu đƣợc
xếp vào nhóm proteaza serin do có đến 97% cấu trúc giống với cấu trúc của proteaza serin và
cũng bị ức chế bởi các chất ức chế proteaza serin (7, 40).
Hầu hết các keratinaza đã phát hiện đƣợc cho đến nay là serin proteaza (5, 7, 12, 22), và
một vài Metallo proteaza (6).
Hầu nhƣ tất cả các keratinaza là enzim cảm ứng và các vật liệu có chứa keratin khác nhau
nhƣ lông, tóc và lông cừu có thể đƣợc sử dụng làm chất nền cho keratinaza sản xuất (17).
Trong đó, lông là chất nền chủ yếu đƣợc sử dụng. Keratinaza ở vi sinh vật chỉ đƣợc tạo thành
khi môi trƣờng có mặt keratin. Các keratinaza của vi sinh vật có vai trò sinh học rất quan
trọng đối với mục tiêu thuỷ phân các liên kết ngang disulfua bền vững của các hợp chất
keratin. Nó chủ yếu tấn công vào các liên kết -S-S- của phân tử keratin. Cơ chế phân giải
phức tạp của chúng liên quan đến sự hoạt động đồng thời của hệ thống phân giải sunfua và
phân giải protein. Keratinaza hoạt động ở khoảng nhiệt độ và pH tƣơng đối rộng nhƣng tốt
hơn điều kiện môi trƣờng hơi kiềm và là loại enzim ƣa nhiệt.
Thức ăn thuỷ phân
Sản xuất thuốc Phân bón
Chất tẩy rửa KERATINAZA Công nghiệp da
Sản xuất khí Công nghiệp dệt
sinh học may
Thuỷ phân prion
* Ứng dụng làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi
Thí nghiệm trên gà, ngƣời ta nhận thấy rằng lông thuỷ phân đƣợc cân bằng về một số axit
amin, có thể thay thế đậu nành nhƣ là một nguồn protein chiếm tới 70% trong khẩu phần.
Gần đây hơn, sản phẩm Keratinaza đƣợc thử nghiệm nhƣ là một enzim cho ăn trực tiếp trong
thức ăn của gà. Khi gà thiếu nhiều protein trong khẩu phần (80% nhu cầu) thì Keratinaza
trong khẩu phần có thể cải thiện sinh trƣởng của gà. Trong 3 tuần đầu tiên, tỷ lệ biến đổi thức
ăn là 2,03 đối với khẩu phần đƣợc bổ sung Keratinase. Tỉ lệ biến đổi thức ăn đối với khầu
phần đối chứng đủ protein là 1,83. Nhiều thí nghiệm đang đƣợc nghiên cứu để thiết lập giá trị
dinh dƣỡng của Keratinaza (23).
* Ứng dụng trong điều trị bệnh bò điên
Keratinaza phân huỷ lông và PrP
SC
có cấu trúc tƣơng tự nhau, cả hai đều có cấu trúc
protein B và có sức đề kháng với hầu hết proteaza. Một thí nghiệm gần đây đã đƣợc tiến hành
ở ID-Lelystad, Hà Lan. Tế bào não BSE đƣợc xử lý và chẩn đoán bằng phƣơng pháp chuẩn,
ngoại trừ là các mô đồng nhất đƣợc nấu trƣớc và đƣợc tiêu hoá bởi PWD-1 Keratinase. Rất là
thú vị, PrP
SC
đƣợc coi là hoàn toàn tự phân huỷ hay tự thuỷ phân bởi enzyme . Khám phá đầu
tiên này cho thấy có thể phát triển một quá trình enzim, sử dụng keratinaza từ chủng Bacillus
subtilis PWD-1, để khử các dụng cụ y tế truyền nhiễm và các sản phẩm gia súc.
* Ứng dụng trong công nghệ thuộc da
Công nghệ tẩy lông thông thƣờng sử dụng vôi và natri sulphua, đây là nguồn ô nhiễm lớn.
Sử dụng keratinaza để tẩy lông trong thuộc da rút ngắn thời gian xử lý, giảm chi phí sản xuất,
nâng cao chất lƣợng sản phẩm. Proteaza kiềm có trong chế phẩm đã thuỷ phân các protein
không phải là colagen nhƣ albumin, glubulin và keratin mềm, không tác động lên colagen ở
lớp cật. Với chế phẩm enzim có hoạt độ proteaza 3000 U/g (hoạt độ keratinaza 700 U/g),
lƣợng enzim bổ sung với nồng độ 2% (khối lƣợng da), thời gian ngâm là 6 - 7 giờ, hiệu quả
tẩy lông đạt 90 - 93% (1).
* Ứng dụng trong công nghiệp dệt
Keratinza đƣợc sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo đƣợc tạo ra
bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi đƣợc bóng, dễ nhuộm. Keratinaza có tác dụng thủy
phân lớp protein serin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ
tằm, do đó làm giảm lƣợng hoá chất để tẩy trắng.
* Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa
Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn đƣợc sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-
40 đƣợc thu nhận từ Bacillus subtilis. Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu
alcalase dƣới tên thƣơng mại là BIOTEX đƣợc chiết xuất từ Bacillus licheniformis. Và đến
gần đây, tất cả các proteaza bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trƣờng đều là proteaza serine
đƣợc sản xuất từ các chủng Bacillus , và chủ yếu là từ Bacillus subtilis (1). Trên thế giới, mỗi
năm ngƣời ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công
ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95%
lƣợng enzim proteaza (17).
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ
2.1.1. Vật liệu
- Các mẫu đất chôn lông gà từ 1 đến 6 tháng thu thập từ các vị trí khác nhau tại các huyện
Thanh Hà, Ninh Giang tỉnh Hải Dƣơng; quận Hà Đông thành phố Hà Nội. Các mẫu đất này
đƣợc sử dụng để phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza.
Các mẫu đất được sử dụng trong nghiên cứu:
Mẫu A: Đất vƣờn, đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Thanh
Hồng, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dƣơng.
Mẫu B : Đất vƣờn, đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Hợp
Đức, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dƣơng.
Mẫu C: Đất ở nơi thải lông của cơ sở giết mổ gia cầm tƣ nhân, thị trấn Thanh Hà, huyện
Thanh Hà, Hải Dƣơng.
Mẫu D: Đất vƣờn, đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại huyện Ninh
Giang, tỉnh Hải Dƣơng.
Mẫu E: Đất đã đƣợc chôn lông gà trƣớc đó để lông gà bị phân huỷ, tại quận Hà Đông, Hà
Nội.
- Lông gà, tóc,
2.1.2. Hoá chất
Các hoá chất đƣợc sử dụng nghiên cứu hầu hết là các hoá chất đƣợc nhập ngoại của các hãng
Sigma, Merc, Aldrich,…
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ đất
2.2.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khả năng sinh bào tử của các
chủng sinh keratinaza để phân loại chúng
2.2.3. So sánh khả năng sinh keratinaza của các chủng vi khuẩn
2.2.4. Xác định một số điều kiện tối ƣu hoá môi trƣờng nuôi cấy
2.2.4.1. Xác định ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy
2.2.4.2. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu
2.2.4.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu
2.2.5. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt tính keratinaza
2.2.5.1. Xác định hoạt tính keratinaza
2.2.5.2. Xác định ảnh hưởng của pH
2.2.5.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ
2.2.5.4. Xác định ảnh hưởng của một số ion kim loại
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. SỰ PHÂN RÃ CỦA LÔNG GÀ KHI ĐƢỢC SỬ DỤNG LÀM NGUỒN CACBON VÀ
NITƠ DUY NHẤT ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA
Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 13 chủng vi khuẩn dựa trên sự khác nhau về
hình thái khuẩn lạc (phụ lục 1). Các chủng sau khi đƣợc kiểm tra hoạt tính keratinaza bằng
cách nuôi lắc trong môi trƣờng phân lập, tuyển chọn giống vi khuẩn có hoạt tính keratinaza
nói trên ở 37
0
C, 150 vòng / phút trong 6 ngày, chủng có hoạt tính keratinaza đã làm phân rã
lông gà có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng.
Trong nghiên cứu này đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza. Những chủng
này có thể sinh trƣởng, phát triển trên môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và
nitơ duy nhất.
3.2. PHÂN LOẠI CÁC CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA
Sau khi nhuộm Gram, quan sát dƣới kính hiển vi, hình dạng tế bào các chủng đƣợc mô
tả nhƣ bảng 3.1:
Bảng 3.1: Hình thái tế bào các chủng sinh keratinaza
Chủng
Hình thái tế bào
Kr 1
Gram dƣơng, tế bào hình que, tạo thành chuỗi.
Kr2
Gram dƣơng, tế bào hình que tƣơng đối đồng đều, ở 2 đầu
vuông, tạo thành chuỗi 2 - 4 tế bào.
Kr3
Gram dƣơng, tế bào xếp thành từng đôi hay từng chuỗi , số ít
phân tán hoặc tập trung thành đám.
Kr4
Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, các tế bào dạng đơn hoặc
xếp đôi, 2 đầu hơi tròn. Tế bào già tròn và hơi nhẵn hơn, đôi
khi có hình thoi tù 2 đầu.
Kr5
Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, tạo thành chuỗi.
Kr6
Gram dƣơng, tế bào hình que ngắn, đơn lẻ hoặc xếp đôi, ít khi
dạng chuỗi.
Tiến hành đun dịch nuôi pha loãng của chúng ở 80
0
C trong thời gian 15 phút, để nguội
rồi cấy trải trên môi trƣờng NA, ủ ở 37
0
C trong 24h thấy đều mọc thành các khuẩn lạc; chứng
tỏ đây là các chủng sinh nội bào tử.
Hình thái khuẩn lạc quan sát đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc các chủng có hoạt tính keratinaza
Chủng
Đặc điểm khuẩn lạc
Kr1
Tạo khóm lớn màu trắng sữa, bề mặt nhăn nheo, xù xì
Kr2
Tròn, to, ở giữa có núm lồi lên có màu trắng ngả vàng nhạt, hơi bóng, nhớt.
Kr3
Tròn, bờ riềm không đều, có màu vàng nhạt chuyển dần sang xám, xù xì,
khô, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn và có núm lồi ở giữa.
Kr4
Khuẩn lạc hình tròn đều, hơi lƣợn sóng, nhẵn, thƣờng có các vòng tròn đồng
tâm trên bề mặt, màu trắng sữa chuyển sang màu kem, có khi nâu nhạt có ánh
mờ đục.
Kr5
Khô, hình tròn, màu trắng, có vòng tròn màu trắng trên bề mặt, không nhăn.
Kr6
Tròn, rất bóng và nhớt, ngả vàng
Từ các thí nghiệm trên có thể khẳng định các chủng sinh keratinaza trên đều thuộc chi
Bacillus.
3.3. XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA MẠNH NHẤT
Từ 6 chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza đã phân lập đƣợc, tiến hành mức độ hoạt
động của enzim bằng 2 cách sau:
- Nuôi lắc trong môi trƣờng chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, 150
vòng / phút ở 37
0
C trong 10 ngày. Sau đó, so sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng
sinh keratinaza theo phƣơng pháp Saville (1958)
Bảng 3.3: Hoạt tính keratinaza của 6 chủng sinh keratinaza
Chủng
Phần trăm lông gà bị phân huỷ
Kr1
58,5
Kr2
70
Kr3
60,5
Kr4
55,5
Kr5
60
Kr6
50
- Đánh giá hoạt tính keratinaza của các chủng bằng cách: Đục giếng thạch có đƣờng kính
10 mm trên các đĩa thạch có cơ chất là sữa gầy; nhỏ 0,15 ml dịch enzim thô vào các giếng
thạch; giữ ở 4
0
C trong tủ lạnh 12h rồi mang ra ngoài khoảng 15 phút sau đó đƣa vào tủ ấm
37
0
C ủ trong 24h. Hoạt tính của keratinaza đƣợc xác định bằng đƣờng kính vòng phân huỷ
trong suốt xung quanh giếng thạch, tính bằng mm. Kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.4: Hoạt tính keratinaza của dịch nuôi 6 chủng sinh keratinaza
Chủng
Đƣờng kính vòng phân huỷ (cm)
Kr1
1,8
Kr2
2,2
Kr3
2,0
Kr4
1,7
Kr5
1,9
Kr6
1,5
Kết quả ở bảng 2 cho thấy chủng Kr2 thể hiện hoạt tính keratinaza mạnh nhất. Chủng
này đƣợc tìm thấy ở mẫu đất A.
3.4. MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU HOÁ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY
3.4.1. Ảnh hƣởng của lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy
Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất là Kr2 đƣợc nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút,
nhiệt độ 30
0
C, pH = 7 trong các môi trƣờng có hàm lƣợng lông khác nhau, cụ thể là 5, 10,
15, 20, 25 g / l trong môi trƣờng cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải nhƣ sau:
Bảng 5: Ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy
Hàm lƣợng lông (g/l)
Tỉ lệ lông bị phân giải (%)
5
20,5
10
34
15
41
20
50
25
32
Nhƣ vậy, khả năng sinh keratinaza phụ thuộc vào hàm lƣợng lông đƣa vào môi trƣờng
nuôi cấy. Kết quả cho thấy, ở nồng độ lông vũ là 20 g/l cho hiệu quả phân giải cao nhất. Ở
hàm lƣợng thấp hơn, hiệu quả phân giải lông vũ cũng thấp hơn. Tuy nhiên, ở hàm lƣợng cao
hơn, hiệu quả phân giải cũng giảm. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Cheng et
al. (1995) cho rằng hàm lƣợng lông cao làm tăng độ nhớt của môi trƣờng, có thể dẫn đến hạn
chế oxy cho vi khuẩn phát triển.
3.4.2. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
Chủng Kr2 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng /
phút, nhiệt độ 30
0
C trong các môi trƣờng có pH khác nhau, cụ thể là pH 6, 7, 8, 9, 10 trong
môi trƣờng cơ bản, tỉ lệ lông bị phân giải nhƣ sau:
Bảng 6: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu đến khả năng sinh keratinaza
pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
Tỉ lệ lông bị phân giải (%)
6
27,5
7
34
8
33
9
28
10
18,5
Nhƣ vậy, pH tối ƣu cho nuôi cấy chủng Kr2 để cho hiệu quả sinh keratinaza phân giải
lông vũ là khoảng 7 - 8. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với một số báo cáo trƣớc đây về
keratinaza mà thuộc về proteaza kiềm (Altalo và Gashe, 1993; Cheng et al, 1995), cho rằng
keratinaza sản xuất bởi các loài vi khuẩn Bacillus hoạt động tích cực nhất trong môi trƣờng
trung tính hoặc hơi kiềm.
3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
Chủng Kr2 đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng cơ bản với 10% lông trong 6 ngày, 150 vòng /
phút, pH = 8 trong các môi trƣờng có nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 25
0
C, 30
0
C, 35
0
C, 40
0
C,
45
0
C trong môi trƣờng cơ bản, dựa vào tỉ lệ lông bị phân giải cho thấy nhiệt độ tốt nhất cho
nuôi cấy chủng Kr2 là 35
0
C.
3.5. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KERATINAZA
3.5.1. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính keratinaza
Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên ở các pH khác
nhau kết quả nhƣ sau:
Hình 3.1: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính keratinaza
Kết quả ở hình 3.1 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11.
Ở vùng pH nhỏ hơn 7, hoạt tính keratinaza bị giảm còn dƣới 60%.
Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có pH tối ƣu cho
hoạt động của keratinaza là 9.
Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
pH
U/ml
6
26,9
7
33,9
8
36,5
9
44,0
10
37,4
11
34,3
3.5.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza
Tiến hành thí nghiệm so sánh hoạt tính keratinaza của 6 chủng nói trên, kết quả thu đƣợc
nhƣ sau:
Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza
Kết quả ở hình 2 cho thấy keratinaza từ 6 chủng đều hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ
từ 30 - 60
0
C.
Trong 6 chủng nói trên, chủng có hoạt tính keratinaza tốt nhất là Kr2 có nhiệt độ tối ƣu
cho hoạt động của keratinaza là 50
0
C.
Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Nhiệt độ (
0
C)
U/ml
30
38,0
40
44,5
50
54,3
60
48,8
3.5.3. Ảnh hƣởng của một số ion kim loại
Keratinaza thu đƣợc từ các chủng sẽ chịu ảnh hƣởng của các ion kim loại lên hoạt tính ở
các mức độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của một số ion kim loại lên hoạt tính
keratinaza từ chủng Kr2 nhƣ sau:
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính keratinaza từ chủng Kr2
Ion
Hoạt độ tƣơng đối (%)
1mM
5mM
Enzim ban đầu
100
100
Na
+
110
118
Ca
2+
132,5
122
K
+
102,5
105
Mg
2+
105
104
Fe
3+
45,5
42
Cu
2+
17,5
14,5
Hoạt tính keratinaza tăng khi có mặt của một số ion nhƣ: Na
+
, Ca
2+
, K
+
, Mg
2+
, đặc biệt là
ion Ca
2+
, do trong cấu tạo của phân tử keratinaza có mặt của 2 ion Ca
2+
; do vậy, khi có mặt
trong môi trƣờng phản ứng, ở nồng độ thấp, chúng có tác dụng hoạt hoá keratinaza (1). Một
số ion nhƣ: Fe
3+
, Cu
2+
lại làm giảm hoạt tính của keratinaza.
KẾT LUẬN
1. Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập đƣợc 6 chủng có hoạt tính keratinaza. Các chủng
này đều có khả năng sử dụng lông gà nhƣ là nguồn cacbon và nitơ duy nhất.
2. Cả 6 chủng này đều thuộc chi Bacillus.
3. Keratinaza từ 6 chủng phân lập đƣợc đều hoạt động tốt trong dải pH 7 - 11 và trong
khoảng nhiệt độ 30 - 60
0
C.
4. Chủng Kr2 có hoạt tính keratinaza cao nhất. pH và nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của
keratinaza của chủng này là pH = 9 và nhiệt độ 50
0
C.
5. Hoạt tính của keratinaza tăng khi trong môi trƣờng phản ứng có mặt của một số ion : Na
+
,
Ca
2+
, K
+
, Mg
2+
, đặc biệt là ion Ca
2+
, ở nồng độ 5 mM; và giảm hoạt tính khi trong môi
trƣờng phản ứng có mặt một số ion nhƣ: Fe
3+
, Cu
2+
.
6. Điều kiện nuôi tốt nhất cho khả năng sinh keratinaza của chủng Kr2 là môi trƣờng ban đầu
có hàm lƣợng lông là 20 g/l, pH = 7-8, nhiệt độ khoảng 35
0
C.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn sinh keratinaza ứng dụng vào phân huỷ lông
gia cầm làm thức ăn bổ sung cho chăn nuôi và một số ứng dụng khác.
2. Ngoài các chủng sinh keratinaza tự nhiên, có thể tiếp tục nghiên cứu tạo các chủng tái tổ
hợp sinh keratinaza cao hơn.
3. Nghiên cứu các thông số kĩ thuật cho lên men sinh tổng hợp keratinaza của chủng có khả
năng sinh keratinaza cao nhất, tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp: nhiệt độ lên men, pH
môi trƣờng, mật độ tế bào tại thời điểm cảm ứng, thời điểm thu hồi keratinaza.
4. Thu nhận và tinh chế keratinaza có độ tinh khiết cao.
References
Tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Hiếu (2012), Nghiên cứu thu nhận protease kiềm tái tổ hợp có hoạt
tính keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng trong công nghiệp thuộc da, Luận án tiến
sĩ kỹ thuật, Đại học Bách khoa Hà Nội.
2. Ngô Tự Thành (2001), Sự phân bố, sinh trƣởng và sinh tổng hợp proteaza ngoại
bào của Bacillus ở vùng Hà Nội, Tạp chí Sinh học, số 23 (3a), tr.153-157.
3. Võ Thị Thứ (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của một
số chủng thuộc chi Bacillus, Luận án Tiến sĩ Khoa học, Viện CNSH, Trung tâm
KHTN và CNQG, Hà Nội.
Tài liệu nƣớc ngoài
4. Bertsch, A.; Coello, N; (2005). A biotechnological process for treatment and recycling
poultry feathers as a feed ingredient. Biores. Technol., 96, 1703-1708.
5. Bockle, B.; Muller, R. (1997). Reduction of disulphide bonds by Streptomyces pactum
during growth on chicken feathers. Appl Environ Microbiol., 63, 7990-7992.
6. Brandelli, A. (2008). Bacterial Keratinases: Useful Enzymes for bioprocessing
agroindustrial wastes and beyond. Food Bioprocess Technol., 1, 105-116.
7. Bressolier, P., Letourneau, F., Urdaci, M., & Verneuil, B. (1999). Purification and
characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces albidoflavus. Applied
and Environmental Microbiology, 65, 2570–2576.
8. Cai C-G, Lou B-G, Zheng X-D (2008). Keratinase production and keratin degradation by a
mutant strain of Bacillus subtilis. J. Zhejiang University, Science B. 9: 60-67.
9. Cao ZJ, Zhang Q, Wei DK, Chen L, Wang J, Zhang XQ, Zhou MH (2009).
Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and
purification of the enzyme. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36:181-188.
10. Cheng SW, Hu HM, Shen SW, Takagi H, Asano M, Tsai YC (1995). Production and
characterization of a feather degrading Bacillus licheniformis PWD-1. Biosci. Biotechnol.
Biochem. 59:2239-2243.
11. Draper, C. I., 1944. The nutritive value of corn oil meal and feather proteins. Iowa Agr.
Exp. Sta. Res. Bul. 326, Iowa State College, Ames, IA.
12. Friedrich, J.; Gradisar, H.; Mandin. D; Chaumount, J.P. (1994). Screening fungi for
synthesis of keratinolytic enzymes. Lett Appl Microbiol., 28, 127-130.
13. El-Refai, H.A.; AbdelNaby, M.A.; Gaballa, A.; El-Araby, M.H.; Fatah, A.F.A. (2005).
Improvement of the newly isolated Bacillus pumilus FH9 Keratinolytic activity. Process
Biochem., 40, 2325-2332.
14. Geessess, A.; Kaul, R.H.; Gashe, B.A.; Mattiasson, B. (2003). Novel alkaline proteases
from alkaliphilic bacteria grown on chicken feather. Enzyme and Microbial Technol., 32,
519-524.
15. Gordon, Ruth E.; William, C.; Haynes, Hor-Nay Pang, C. (1973). The Genus Bacillus:
Agriculture Handbook No. 427. ARS-USDA, Washington, D.C
16. Grazziotin, A., Pimentel, F. A., de Jong, E. V., & Brandelli, A. (2006). Nutritional
improvement of feather protein by treatment with microbial keratinase. Animal Feed Science
and Technology, 126, 135–144.
17. Gupta, R., & Ramnani, P. (2006). Microbial keratinases and their prospective applications:
An overview. Applied Microbiology and Biotechnology, 70,21–33
18. Guvin Govinden , Daneshwar Puchooa. (2012). Isolation and characterization of feather
degrading bacteria from Mauritian soil. African Journal of Biotechnology Vol. 11(71), pp.
13591-13600.
19. Hui Ni, Qi - he Chen, Feng Chen, Ming - liang Fu, Ya - chen Dong, Hui - nong Cai
(2011). Improved keratinase production for feather degradation by Bacillus lichenifomis
ZJUEL 31410 in submerged cultivation. African Journal of Biotechnology vol. 10 (37), pp.
7236 - 7244, 20 July, 2011.
20. Kim, J.M.; Lim, W.J.; Suh, H.J. (2001). Feather-degrading Bacillus species from poultry
waste. Process Biochem., 37, 287-291.
21. Langeveld, J. P. M., Wang, J. J., van de Wiel, D. F. M., Shih, G. C.,Garssen, G. J.,
Bossers, A., et al. (2003). Enzymatic degradation of prion protein in brain stem from infected
cattle and sheep. Journal of Infectious Diseases, 188, 1782–1789.
22. Lin, X.; Lee, C.G.; Casale, E.S.; Shih, J.C.H. (1992). Purification and characterization of
a keratinase from a feather - degrading Bacillus licheniformis strain. Appl Environ
Microbiol., 58, 3271- 3275.
23. Moritz, J.S.; Latshaw, J.D. Indicators of nutritional value of hydrolyzed feather
meal. Poultry Sci., 80, 79-86, 2001.
24. Mukhopadhyay, R. P., & Chandra, A. L. (1990). Keratinase of a Streptomycete. Indian.
Journal of Experimental Biology, 28,575–577.
25. Noval, J. J., & Nickerson, W. J. (1959). Decomposition of native keratin by Streptomyces
fradiae. Journal of Bacteriology, 77,251–263.
26. Onifade, A.A.; Al-Sane, N.A.; Al-Musallam, A.A.; Al-Zarban, S. (1998). Potentials for
biotechnological applications of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for
nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources. Biores.
Technol., 66, 1-11.
27. Papadopoulos, M.C.; El Boushy, A.R.; Roodbeen, A.E.; Ketelaars, E.H. (1986). Effects
of processing time and moisture content on amino acid composition and nitrogen
characteristics of feather meal. Animal Feed Sci. Technol., 14, 279-290.
28. Parry DAT, North ACT (1998). Hard-keratin intermediate filament chains: substructure
of the N and C-terminal domains and the predicted structure and function of the C-terminal
domains of type and type II chains. J. Struct. Biol. 122:67-75.
29. Ramnani P., Singh R., Gupta R, 2005. Keratinolytic potential of Bacillus licheniformis
RG1: structural and biochemical mechanism of feather degradation, Can. J. Microbiol. 51,
191.
30. Rodziewicz, A.; Laba, W. (2008). Biodegradation of feather keratin by Bacillus cereus in
pure culture and compost. EJPAU 11(2) #03[ISSN1505-0297].
31. Sangali, S.; Brandelli, A. (2000). Feather keratin hydrolysis by a Vibrio sp. kr2 strain. J.
Appl. Microbiol., 89,735-743.
32. Sarita Agrahari , Neeraj Wadhwa (2010). Degradation of Chicken Feather a Poultry
Waste Product by Keratinolytic Bacteria.
Isolated from Dumping Site at Ghazipur Poultry Processing Plant. Department of
Biotechnology, 62, 482 - 492.
33. Saville, B. (1958). A scheme for colorimetric determination of microgram amount of
thiols. Analyst, 83, 670-72.
34. Sidra Aftab, Samia Ahmed , Sadia Saeed , Sheikh Ajaz Rasool (2006). Screening,
Isolation and Characterization of Alkaline Protease Producing Bacteria from Soil. Pakistan
Journal of Biological Sciences , 9 , 2122 - 2126.
35. Suntornsuk, W.; Suntornsuk, L. (2003). Feather degradation by Bacillus sp. FK 46 in
submerged cultivation. Bioresour Technol., 86, 239-243.
36. Steinert, PM, Parry, DAD (1993 ) The conserved H1 domain of the type II keratin 1 chain
plays an essential role in the alignment of nearest neighbor molecules in mouse and human
keratin 1/keratin 10 intermediate filaments at the two- to four-molecule level of structure. J
Biol Chem. 2878–2887
37. Steinert, P. M. (1993). Structure, function, and dynamics of keratin intermediate filaments.
Journal of Investigative Dermatology, 100, 729–734.
38. Takami, H.; Nogi, Y.; Horikoshi, K. (1999). Reidentification of the keratinase-producing
facultatively alkaliphilic Bacillus sp no AH-101 as Bacillus halodurans. Extremophiles, 3,
293-296.
39. Takiuchi, I.; Higuchi, D.; Sei, Y.; Koga, M. (1982). Isolation of an extracellular
proteinase (keratinase) from Microsporum canis. Sabouraudia, 20, 281-288.
40. Wang J.J., Shih J.C.H.(1999). Fermentation production of keratinase from Bacillus
licheniformis PWD-1 and a recombinant B. subtilis FSB-29, J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
22,608 .
41. Wawrzkiewicz, K.; Wolski, T.; Lobarzawski, J. (1991). Screening the keratinolytic
activity of dermatophytes in vitro. Mycopathologia, 114, 1-8.
42. Williams, C.M.; Lee, C.G.; Garlich, J.D.; Shih, J.C.H. (1991). Evaluation of a bacterial
feather fermentation product, feather lysate, as a feed protein. Poultry Science, 70, 85-94.
43 .Wojciech Łaba, Anna Rodziewicz. (2010). Keratinolytic Potential of Feather-Degrading
Bacillus polymyxa and Bacillus cereus.Polish J. of Environ. Stud. Vol. 19, No. 2 (2010), 371-
378.
44. Yamamura, S., Morita, Y., Hasan, Q., Yokoyama, K., & Tamiya, E. (2002). Keratin
degradation: A cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp. Biochemical
and Biophysical Research Communications, 294, 1138–1143.
45. Yu, R.J.; Harmon, S.R.; Grappel, S.F.; Blank, F. (1971). Two cell-bound keratinases
of Trichophyton mentagrophytes. J. Invest. Dermatol., 55, 27-32.