Nghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm của Wedelolaction từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin -

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***



THÂN VĂN MINH




NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐIỀU HOÀ ĐÁP ỨNG VIÊM
CỦA WEDELOLACTON TỪ CÂY NHỌ NỒI TRONG
ĐIỀU TRỊ BỆNH NHIỄM TRÙNG NẶNG VÀ CHOÁNG
NHIỄM TRÙNG THÔNG QUA THỤ THỂ DECTIN - 1

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 30


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TrÞnh TÊt C-êng


HÀ NỘI - 2011


MC LC
M U 1

 TU 4
A H THNG MIN DI VI BO V  4
2. K 4
3. NHI 5
4. MIN DCH BM SINH CA VT CH M
VI KHUN 6
4.1 th nhn dng mm bnh (PRRs) 6
4.2. Th th Toll- like (TLR) 7
4.3.Th th Dectin- 1 8
4.4. Th th Dectin-1 ho nhn di t 
ngun gc t vi sinh vt 9
4.5. Glucocorticoid 11
 11
4.6.1.G 11
a p47phox trong  12
4.7. i th 14
5. 











 15
U C 16

c 16
6.1.1. (NSAID) 16
6.1.2. 17
6.1.3.  17
c 17
   N       
 19
7 ni 19
7.2. Wedelolactone 20

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

ii
: U 22
U 22
2.1.1. ng vm 22
2.1.2. t 22
2.1.3. Thit b u 22
U 22
t macrophage t ta chut 22
 c t ca Wedelolactone ti kh ng ca
BMDM b-8 23
 n xut cytokine bng ELISA Kit 23
2.2.3.1. Gii thiu v  23
c 23
m 23
2.1.3.4. Pha dung dch chun 24
c ch co phn ng oxy
 26

2.2.5.          chut b 
zymosan 26
u qu sa chut b nhi
nhit bng Wedelolactone 26
u qu c ch t thanh
ca Chut b nhi     m   
Wedelolactone 27
   u qu     u tr
chut b nhi 27
ng k 27
 KT QU O LUN 28
1. Kh ng ca t  ng bi Wedelolactone 28
   29
3. Wedelolactone c ch c
i zymosan30

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

iii
 th
Dectin-1 31
u khi     
qua th th Dectin-1 32
6. Wedelolactone bo v chut b nhi
ra bi zymosan 34
m kh n xut cytokine trong chut b nhim
 35
8. Hiu qu c   t b nhig
n 36

KT LUN NGH 38
U THAM KHO 39


Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

iv
DANH M

:  th i vi n nhn dng ra phn cacsbon. Th th
Mannose nhn d-1 nhn dng
-glucans. 7
2: -
 to ra ROS (g 13
4: 







 th  15
 5 ni 20
6: Cc ca Wedelolactone 21
7: ng chun ca cytokine IL-6 25
 i vi t  27
  n xut cytokine ti
 28

  Wedelolactone c ch        
ng zymosan 30
 Wedolactone hong
 th dectin-1. 31
 Wedelolactone hoc Dex c ch 
b-1 32
  Wedelolactone bo v chut nhi    m
 33
14: c ch ut b
nhi 34
 Hiu qu u tr ci Dexamethasone 36





Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

v

BNG CH C VIT TT

1.
AP -1
Activation Protein- 1
2.
BMDM
Bone Marrow-Derived Macrophage
3.

DHE
Fluorescent Dyes (dihydroethidium)
4.
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
5.
GR
Glucocorticoid receptor
6.
IL
Interleukin
7.
LPS
Lipopolysaccharides
8.
LT
Leukotrienes
9.
NSAID/ NSAIDs
Nonsteroidal anti-inflammatory drugs
10.
NF-
Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of
activated B cells
11.
ICU
Intensive-care unit
12.
PG
Prostaglandins

13.
ROS
Reactive oxygen species
14.
TLR
Toll-like receptor
15.
TNF
Tumor necrosis factor
16.
PRR
Pattern recognition receptor
17.
PAMP
Pathogenic associated molecules pattern
18.
NADPH
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
19.
ERK
Extracellular signal-regulated kinase
20.
Bcl-10
B-cell lymphoma-10
21.
OD
Optical density
22.
RNS
Reactive nitrogen species

23.
TX
Thromboxane




Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

1
M U
Nhii chi
 thng do nhi u tr t l t vong do nhi
nn 40%. Tn sut ca nhing 
nhi        i M      
 ng gp. M
n t 
kh  vong rt cao. Do vy, vic cha bnh
t v cn thi u tr hiu qu  th
s h tr ci thic kh u tr ca b nhi

 nEclipta prostrata hoc Eclipta albac vt
thuc h c  nht loi c  khp th gii.
 ni mc nhiu  , Trung Qut Nam [2]

t
c hc ca Wedelolactone t nh ni c chng minh  in vitro in
vivo [31].
n nay, nhi

a nhng ca t vong  c bit
ng hn tip tng khp  gii.

Ti Vit
   u chit xut tinh ch   nh ho   c ca
Wedelolactone t  ni Vic tim
Tr i hc Khoa hc T 
Nicho thng ca ch
Vi hoa Wedelolactone, 
mu ch u tr
bnh nhi m 
s  u khoa hc th nghim ti 
nha tr 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

2
nhic binh nhi
vio v sc khe cho cng. Xu c thc
ti “Nghiên cứu khả năng điều hòa đáp ứng viêm
của Wedelolacton từ cây nhọ nồi trong điều trị bệnh nhiễm trùng nặng và
choáng nhiễm trùng thông qua thụ thể Dectin – 1”.

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

3
M 
M:
1. c cha Wedelolactone
trong t th th Dectin-1
2. c hiu qu cu tr chut b nhi
n
Nu:
 n xut cytokine
tiu t c hiu ca Dectin-1,  
dng zymosan.
2 c ch co phn ng oxy
u t c hiu ca Dectin-1,   dng
zymosan

3u qu u tr ca Wedelolactone trong chut b nhi
i zymosan.









Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

4
TU

A H THNG MIN DI VI BO V 
Min dch bn dng min dch bo
v quan tri vng vng. Min dng b
o v  n dng lp li
m b ng min dc hiu. Min dng nhn
dng mm bnh dn lc m th nh   
mang rt nhiu th th c hi thng min d
th nhn dng bt k . H thng min
dch bm sinh s d  th  nhn dng ti nhng mm
bu cn dng mm bnh c
th th u ti nhng
n xut nhng t u qu mi c
b u nhng cn d  th

nhn dng mm bnh mu (PRR) bao gm th th Toll-like (TLR), lectin, Dectin-1
 th scavenger quynh ti kh a vt ch b
tn dng nhng m  m bn, virut, n
c       th   c g   
n dng mm bnh bc
 
u ca min dng.
2. K
   t ph  ng sinh hc phc tp c  
mch v  

 do b m bnh hay
ng t  hm bo v i b hay sa
cha nhng v   li. 





 , 
 











(migrating cells) :  , ,  , 

, 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

5
  











 an, 


 rostagla 
-1. 

, , yu t hoi t khi u (TNF-), , H
+
,



 , 













 
t ra cy ci nhng
 n ti hing b  p




 n ti b . 



  dn ti hiu qu



  
k chi   t
n mch, thic b t u
qu tip sau dn tt ch
 vong [23].
3. NHI
Nhi t ph ca nhu king
ng min dch ca bc
 th [6,7,8]b c nhim
ng min dch [7]

.
Thi k u s biu hin nh t tu
h        TNF, interleukine (IL)-1, IL-6, IL-12 
     s    
bng sn xut nh-10)t c ch ca th th TNF,
th th IL-1 lo-1RA (mt dng bt hot ca IL-1) [12]ng
 thng ca vt ch c bu bng mt s sn phm vi khun. Nhng sn
phm vi khun (vi khum nc t: lipopolysaccharide (LPS),
formyl peptides, ngoc t c
t     ngo c t A ca streptococcal pyrogenic (SpeA),

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

6
t s cht ca v t c
 Saccharomyces cerevisiae th a
vt ch t nhyu t  [12].
Chng hn, th th Toll like 4 (TLR4) nhn d th Dectin-1 nhn

di vi zymosan [8,15] th chuy u
qu a nhng l thn ti trng t
v     
chi n mch, thiu
c b t u qu tip sau dn ti nhim tng
t ch vong [23].
4. MIN DCH BM SINH CA VT CH M
VI KHUN
H thng min dch bm sinh bao g 
chng lp ca vi sinh vt. Th nh
biu   cn tr m ca mm bnh. Th hai,
  kim b trn
i lo v bi p ti 
ng nht ca h thng bo v min dch ba
t truyn tin hiu bo v t   thng
b th ca protein truyu ca h thng min dch bm sinh i dng dch
nm gia khon dng bng h thng min
dch s loi b m b  hiu qu 
H thng min dch b ng nh
m.
 th nhn dng mm bnh (PRRs)
Th th nhn dng mm bnh (PRR, pathogen recognition receptor) c chia
t ngun t v   th huyt thanh hoc
phn dch c  hay nc trong dch

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

7
t th th nhn dng mm bnh [19]. M th 

i t c hiu c  nhn dng mt loi vi sinh vt nht
nh [19].  th  nhn dng mm bnh mc ti
[19]. i vi In vivo, nhiu
th th   nhn dng vi khun ng   
n gc t nm hay mm lc nhn bng PRR gi
th TLR, th th mannose, b th -1 [20]. n dng
mm bnh cn xun ti
 i v 
 m. T n ti nhng phn ng ca min dng [12].






1: 
-1
 -glucans.

4.2. Th th Toll- like (TLR)
Th th Toll- n d
n  m bnh (PAMP) [20]. ng v th th 
gt 10 lo n ti nhn di
t n gc t mm bnh [20]. TLR2  nhn dng lipoprotc
n lipid-(lipoarabinomannan) t  a vi khum [13].
TLR4 nhn dng lipopolysaccharide (LPS) t  a vi khu
Fungi
TLR2
TLR6
Mannose

receptor
Dectin-1
CD11b
CD18
CR3
Fungi
Fungi

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

8
[15]. TLR9  nhn dng deoxycytidylate-phosphate-deoxyguanylate (CpG) 
trong deoxyribonucleic acid (DNA) ca vi khun [13]. Mt vi sinh v c
nhn bi rt nhiu TLR. Thc t, t hp c ng
o BMDM hoc t  b nhim mm
bnh [20]. TLR bao gm m n n     c g   th
Toll/IL-1   v
ch tip ni ging u t  
ni tin TIR (TIRAP), mt a phn interferon-
 tip ni vi TRIF (TRAM) [20]. n dng mm bnh ca TLR2
s      ng ca yu t hot      -kB
(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), n xu
cytokine ti TNF- n MyD88, 
n dng ca TLR4 lng ca NF-TIRAP,
MyD88 ng cn phia interferon (IFN) gi
n xut IFN kiu 1 [27].
4.3.Th th Dectin- 1
m nu c
ng min dch bng vt c m i

v16]. Cht -n quan trng trong
v ca t a nm. T  nh
 v s hong ca th th Dectin-1. Th th n 
m n kiu C lectin gn vi lo         
cytoplasma ca t   i mt phn ho ng d   th min dch
tyrosine [8].
Dectin-c biu hi i thc
  [16n nay th th Dectin-c hiu
rt th th biu hin mnh nhi th

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

9
ca n c bit th th  nhn dc hi i vi -glucan hoc
zymosan (mt ch  a m  ng ln -    t t
ng thi vn dng vi sinh vt s sn
xut mm bnh bng sn
xut, phn 16].
4.4. Th th Dectin-1 ho nhn di t 
ngun gc t vi sinh vt
Zymosan  t hp ch  ng -glucan     ca
Saccharomyces cerevisiae chim ph[8,16]. n ca zymosan có -
glucan, mannan, v c nhn dng bng mt s th th
chng hTLR2, TLR6, Dectin-1, th th  CR3 [16]. Ch
c chi th   in vivo
 in vitro [16].
Dectin-1 hoi mt s  nhn dng ra nm [16]. Th th
i TLR2, Dectin-1 nhn dng ra zymosan hoc nm Candida albicans
truyng ca yu t t t 

n xut interleukin (IL)-2, IL-10, v IL-12 p70 trong t [16,
26]. Dectin-1 ng ca yu t t 
  extracellular signal-regulated kinase),    sn xu 
cytokine ti nhn dng ra Mycobacterium abscessus [16].
a, Dectin-1 ng min dch bm
sinh ti nhn Mycobacterium ulcerans  ROS) 
sn xu  IL-37 trong kerainocyte c i. Do vy, Dectin-1
thc hin mng git th th n d
nhim nmycobacterium [16].



Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

10


Dectin-1 nhận dạng ra nấm để sinh ra enzyme kinsase của tyrosine ở lách (Syk) và
một đoạn protein caspase 9 (CARD9). CARD9 tác động cùng với B-cell lymphoma-10
(Bcl-10) và vùng phiên mã gen 1 của lympho (MALT1) để kích thích tạo ra ROS và quá
trình hoạt động của NF-κB. Quá trình biểu hiện của Dectin-1 tăng cường quá trình sản
xuất cytokine trong sự có mặt của TLR2 và TLR6.
-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

11

4.5. Glucocorticoid
c s dt cht chi rt nhiu
 ng c[17]. Rt nhing minh
 c ch c bi
[11]a, g c
ch n xuTNF-, IL-6, IL-1, m
t gc nito u t  
[22]. Do v   c s d  u tr mt s b 
nhinh mn cm min d ti
n trong hon di
 [9,17, 21].
 thng mt kic
a nhia triu chp. Mt chc
bi    t glucocorticoid  h      mc
plasma ca protein C, phospholipase A2, i b b 
 nhi[22]. Nhu
g ra ch u hi [11],
bao gm c ch ng trong min dch b
nhi]. Hiu qu cc chnh
nhi    m vi khun meningitis, pneumocystis pneumonia,
typhoid feverng hp nhim H5N1 [11].
4.6 ROS  p47phox
4.6.1.G ROS
ROS (reactive oxygen species) i din nh ca phn 
bao gm superoxide (O
2
-
) anion, hydrogen peroxide (H
2
O

2
), peroxyl (ROO
-
) radical,
acid (HOCl), ozone (O
3
)[14]. ROS c tt lon 
bu bo ra superoxide [14]. 
n phm ph xy ra trong mitochondria, cytochrome P-450, 
yu t t [23]. ROS h t  , bao gm

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

12
nh h [14]. 
qua nhROS  m ha hoi cha
 [14]. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidases
(Nox) o ra ROS. Thc ra, ROS  truyu
i kh n d[14]. ROS 
hong ca NF-n xut ca TNF-ing con
ng NF-t bi ROS trong t  trong gan
[25]. , ROS  ng activator protein-1 (AP-1) (mt yu
t   [28].
4.6.2a 
Nox sn xut nhiu ti c
phRac, p67phox, p47phox, p40phox 
flavocytochrome b
558
, bao gm ti   gp91phox (Nox2)  p22 phox [28].

p47phox i vi hong ca Nox [28].  trt hot,
p47phox chuy ng t         p67phox v
p40phox.  tr          kt hp l  n
 c bit 
-
) [10]. Nhiu
  ra p47phox i v
c biu hi  
non thn kinh bao gan, phi [14].









Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

13

 3:  to ra ROS (g
Ở trạng thái bất hoạt của tế bào, các prtotein thuộc cytoplasma bao gồm phức hệ
p40phox, p47phox, và p67phox, và guanosine diphosphate (GDP), không liên kết với dạng
cytochrome b
558
bao gồm gp91phox (Nox2) và protein p22phox. Khi ở trạng thái hoạt động,
có sự thay đổi của GDP đối với guanosine-5'-triphosphate (GTP) trên Ras được xem như
là độc tố C3 botulinum dẫn tới kích hoạt. Lúc này, p47phox được phospho hóa và truyền
tín hiệu tới và làm cho phức hệ p67phox, p40phox được chuyển tới trên màng tế bào
plasma. Quá trình phospho hóa của p47phox sẽ làm thay đổi cấu trúc dẫn tới tương tác
với p22phox. Quá trình chuyển tới màng của phức hệ p67phox, p40phox sẽ làm cho
p67phox tương tác với Nox2. Cuối cùng enzym GTP trên Rac tương tác cùng với Nox2.
Phức hệ được hoạt động và tạo ra superoxide (O2
-
) bằng chuyển electron từ NADPH
trong cytoplasma thành oxy hóa ra ngoài tế bào [14].
O
2
-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh

Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

14
4.7. i th
i thng t bch cuth
ng trong h min dch c hi min dc
hiu  ng vn
ca t  nh. , 

 
ing min dc hiu c. Do
i th
 t s ng bn d i th
    h u h        u
hi ch thng nhim
ti th

cytokine 
tr    nh l c  i ch     c
i thm: interleukin-1 (IL-1), yu t hai t khi u TNF-,
IL-6, IL-8, IL-12, IFN-, nitric oxide (NO) 
 . 

, 



















 . 



































 . , 

















 (4) 

in vitro




Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

15

4: 







 th 
5. 








in vivo 




 , 





 



 in
vitro, 


.  ,  





















(85%) [18]. , 






 . 













  in vivo
 . 
 : i) 



 , 









, 




 (caageenan-induced hind paw edema ) 
































 [33]; ii) 

 (peritroneal inflammation ) 





 


. 




















Macrophage
Granulocyte

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

16
















ch [15]; iii) 




 (chronic inflammation ) 

























 . Sau















 [29]. 

,


















 





 (endotoxin shock model ) 

  m
(





 )  










Dectin-1 

. , 









 . 
 




,  cytokine, chemokine ti(TNF-a; IL-6, IL-8) 
(IL-10)       u t t   
kinase (MAPKs), hay phn . 









 




. 



 in vivo , 

















, .
6C
6c
3 :
6.1.1.  (NSAID)











 , 

. 




















 . 



















 (COX), 
 (PG)  (TX). 

























 .


































 .  , salysilate, 
































 . 

















[31].

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

17
6.1.2.
t hp cht h4 cycloalkane. 










 .  enzyme
phospholipases A2,  2
 . 

, 








 




 , TX  .  
phospholipase A2 























, 










 15, 30  40 kDa. 









 




, 
















[31] 

















.
6.1.3. 










 

 . 





 ,










































enzyme lysosom. 





























 8400 Da. 






















 







th[31].
6.2. c
Viu nhikh c
nh nhin nay, 
nt trong ca nhng ca t
vong  c bing hn tip tc gia
ng khp c  git Nam. 



 , 
































, 



, 


Vit rc bit v
thc vt. Theo tha Vic li gn

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

18
c vng vc  
m  n nhio bing vt bi
th c[2] liy ti n ca
nguc liu Vi s d





nhng chc ht chi
u qu n ng ph. Tuy v 
cu khoa hc m tht v 
d dt hoc t nguc
 n phm thuc mi, phc v cho bo v c
khe ct hn ch.
ng d ng
 th
u hii v ng ca cht ch
  phn phm thu  ng
Vic tu v c thc hin ch yu  Vic
lii hi hc vin
u  

 i ch dng  mc t
c nghim in vivo 












 . 








  dng ch
tth
bng chu dng cht
 to u h chut. Vic
thc hin b   d bng
ng khi u hm s ng bch cu so vi mi chng, t 
t ng
 yc thc hin va thc vn



















 rong
 [1]. 











Luận văn Thạc sĩ Khoa học Thân Văn Minh
Lớp Cao học K18 Khoá 2009-2011

19









 Sargassum swartzii Ulva reticulata 














  [1]. 






















 . 
  ng s    ng ca r   ng n (Clerodendrum
chinense) [4] Th ng s (2010) 

ng (Sapium sebiferum)
[3] hay Nguyn Th          Premna
corymbosa) [5]  
 Vit Nam hin n, 



, 




 . 

u hii v


t chun quc t  

  ng ca ch    c th th      gii
c ti
hic hic bic in
vitro u qu  ch

 i t

7.   N A  

7 ni
Thc v  i vi nhng sn phc h  gii,
nhng thc vc hc s dng truyn thn xut ra mt lot
nhng hp cht nhiu tia bnh. Vic
hn xut nhiu sn phn gc t thc vt mang nh
mi. Thc vt phn quan tru tr mt s bnh
 [2]
 n mc, o (c: Eclipta alba
Hassk, hoc Eclipta prostrata c H .