Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-RFLP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




PHẠM MINH HUỆ




PHÁT HIỆN MỘT LOẠI ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ Ở
NGƢỜI VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC





Hà Nội-2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




PHẠM MINH HUỆ



PHÁT HIỆN MỘT LOẠI ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ Ở
NGƢỜI VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP


Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. PHAN TUẤN NGHĨA


Hà Nội-2011

Mục lục
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
 3
1.1.1. Cấu trúc của ty thể người 3
1.1.2. Chức năng của ty thể người 5
1.1.3. Hệ gen ty thể người 9
 12
1.2.1. Đột biến điểm 12
1.2.1.1 Các loại đột biến điểm phổ biến trên tRNA và rRNA 13
1.2.1.2 Các loại đột biến điểm phổ biến trên mRNA 14
1.2.2. Đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA 15
1.2.3. Các loại đột biến khác của hệ gen ty thể 19
  20
1.3.1. Lai DNA 20
1.3.2. PCR kết hợp RFLP (PCR-RFLP) 21
1.3.3. Xác định trình tự nucleotide 22
1.3.4. PCR định lượng 23
1.3.5. Một số phương pháp khác 25
CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

 27
2 28
2.2.1. Tách DNA tổng số từ máu theo kit của Qiagen 28
2.2.2. Tách plasmid theo phương pháp của Sambrook và Russell 28
2.2.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại 29
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose 29
2.2.5. Điện di DNA trên gel polyacrylamide 30
2.2.6. Nhân bản đoạn gen bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 30
2.2.7. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn
(PCR-RFLP) 31
2.2.8 .Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 32
2.2.9. Giải trình tự nucleotide bằng máy tự động theo phương pháp của Sanger 34
2.2.10. Phân tích số liệu bằng phần mềm Genetyx 35
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
 36
3.1.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích 36
3.1.2. Tách chiết DNA của các mẫu 36
9 bp -RFLP 37
3.2.1. Nhân đoạn gen từ 8155-8366 bằng PCR 37
3.2.2. Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP 38
3.2.3. Phân tích trình tự mất đoạn 9 bp trên gen ty thể 41
 46
3.3.1. Nhân đoạn gen mang đột biến A3243G 47
3.3.2. Phát hiện đột biến A3243G bằng PCR-RFLP 48
Kết luận và kiến nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
 59
 62

Bảng các chữ viết tắt
Chữ viết
tắt

Tên tiếng Việt

Tên tiếng Anh
AID
B

Amino-glycoside-induced
nonsyndronic deafness
Amp
Ampicillin
Ampicillin
APS
Amonium persulphate
Amonium persulphate
bp

Base pair
CMV

Cytomegalovirus
CoE
Coenzyme
Coenzyme
COII
Cytochrome c oxidase II
Cytochrome c oxidase II
CoQ
Coenzyme Q
Coenzyme Q
CPEO


Chronic progressive external
ophthalmoplegia
CSF

Cerebrospinal fluid
CytC
Cytochrome c
Cytochrome c
dd H
2
O

Deionnized distilled H
2
O
D-loop


Displacement loop
dNTP
Deoxynucleoside triphosphate
Deoxynucleoside triphosphate
EBV

Epstein-Barr virus
EDTA
Axit ethylen Diamine Tetraacetic
Ethylen Diamine Tetraacetic Acid
EtBr
Ethidium Bromide
Ethidium Bromide
ETC

Electron transport chain
EtOH
Ethanol
Ethanol
EV

Enterovirus
HVS

Hypervariable segment
HVS1

Herpes simplex virus type 1
IPTG
Isopropylthio--D

Galactopyranoside
Isopropylthio--D
Galactopyranoside
kb
Kilo base
Kilo base
LB
etani
Luria Betani
LHON

Leber
Leber herteditary optic neuropathy
MCS

Multiple Cloning Sequence

MELAS


Mitochondrial Encephalopathy,
Lactic acidosis, Stroke-like episodes
MERRF


Myoclonic epolepsy associated
with ragged-red fibres
MIDD



Maternally inherited diabetes and
deafness
mtDNA

Mitochondrial DNA
MT-TL

leucine
Mitochondrially encoded tRNA
leucine
NAD
+
Nicotinamide-adenine

Nicotinamide-adenine
dinucleotide
NADH

Nicotinamide-adenine

(Reduced) Nicotinamide-adenine
dinucleotide

NARP


Neuropathy, ataxia and retinitis
pigmentos
NCR
Vùng không mã hóa

Non coding region
Ng


OD

Optical Density
PCR
Ph
Polymerase Chain Reaction
RFLP
i

Restriction Fragment Length
Polymorphism
RLCH


ROS

Reactive oxygen species
SSCP
Stranded Conformational
Polymorphism

T


TAE
-Acetate-EDTA

Tris-Acetate-EDTA
TBE
- Borate-EDTA
Tris- Borate-EDTA
TEMED
N,N,N’,N’-tetramethylethylene-
diamine
N,N,N’,N’-tetramethylethylene-
diamine
Th


Ub
Ubiquinon
Ubiquinon
v/p
Vòng/phút

X-gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D
galactopyranoside
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D
galactopyranoside

Danh mục các hình
Hình 1: Các hình dng khác nhau ca ty th 3
Hình 2: Cu trúc màng trong ty th 4
 minh ho  ca s lão hoá theo hc thuyt ty th 6
 minh h sn sinh các ROS trong ty th 7
Hình 5: Cu trúc h gen ty th i 10

Hình 6: Các lot bim ph bin trên mtDNA 13
Hình 7: V trí trình t lp li 9 bp trên mtDNA 16
Hình 8: Chu k nhit c nhân bn mtDNA (8155-8366) 31
9:Kt qu n di sn phm DNA tng s trên gel agarose 36
Hình 10: Kt qu n di sn phm PCR trên gel agarose 38
Hình 11: Kt qu n di sn phm PCR trên gel polyacrylamide 38
Hình 12: Kt qu n di sn phm PCR ct bng BanII trên gel polyacrylamide 39
Hình 13: Kt qu n di sn phm PCR  mt s   nh nhân ct bng
BanII trên gel polyacrylamide 40
Hình 14: Kt qu n di sn phnh nhân trên gel polyacrylamide 41
Hình 15: Kt qu bin np hn hp gn gia sn phm PCR và vector pGEM-T 41
vào E. coli ch 41
Hình 16: Kt qu n di sn phm PCR trc tip t khun lc 42
Hình 17: Kt qu n di sn phm tinh sch plasmid trên gel agarose 43
Hình 18: Kt qu so sánh trình t n gen bnh nhân, m bnh nhân và b bnh
nhân gi trình t chun h gen ty th công b trên GenBank 44
Hình 19: Kt qu nh trình t c 45
20: Kt qu n di sn phm PCR trên gel agarose 47
Hình 21: Kt qu n di sn phm PCR ct bng HaeIII trên gel polyacrylamide 48
Hình 22: Kt qu n di sn phm PCR ct bng HaeIII trên gel polyacrylamide 50
Danh mục các bảng

Bng 1: Mt s mã di truyn ca DNA ty th khác DNA nhân 11
Bng 2: Mt s hi chng bnh kèm theo s mn 9 bp 18
Bng 3: Trình t các cp mi dùng trong PCR 27
Bng 4: Thành phn bn di polyacrylamide 30
Bng 5: Thành phn phn ng PCR khun mtDNA (8155-8366) 31
Bng 6: Thành phn phn ng ct enzyme gii hn BanII 32
Bng 7: Thành phn phn ng ct enzyme gii hn HeaIII 32
Bng 8: Thành phn phn ng gn trc tip sn phm PCR vào vector pGEM-T 33

Bng 9 : Thành phn phn ng PCR ln 2 34
Bng 10: Danh sách bnh nhân b t bin mn 9 bp 46
Bng axit lactic trong máu bnh nhân b mn 9 bp 51







1
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011
MỞ ĐẦU


T



 ,  kb, 


37 gen mã hóa cho 13 protein,  
.
  ong



















.

















 








.  

(reactive oxygen species)
.

 .  
cho phép chúng ta 

.
ung
  

n, 
  



 mtDNA  

. 
  
               


, 
-


2
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011
i là
 cho ngu9 bp
  c oxidase (COII) và tARN
Lys
. Tuy





       
“Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-
RFLP”,              9 bp
CCCCCTCTA trong vùng không mã hóa (vùng V)     
cytoch              
 (tRNA

Lys
). Ngoài ra, c
 và 
MELAS và MERRF, qua  






9 bp các 

 




3
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ty thể và hệ gen của ty thể ngƣời
1.1.1. Cấu trúc của ty thể người


H
  1890)          


[46].
-2 
dài 7-10 
 




A B C
Hình 1: Các hình dạng khác nhau của ty thể [46]


 
 
.



4
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011

màng ngoài và màng trongchất nền  trong, còn
xoang gian màng
mào răng lƣợc.
           
cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase.
 

lipid. Màng trong 
               
 
Na
+
, K
+
, Ca
2+
và H
+

                
[27].


Hình 2: Cấu trúc màng trong ty thể [27]


+

 [27].
T
chu trình Krebs, protein, ribosom, tRNA 
mtDNA). 



5
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011
 
  trong

 (autophagy).

1.1.2. Chức năng của ty thể người
Ty thể được xem là nhà máy sản xuất năng lượng của tế bào [27]. 




quá trình phosphoryl hóa oxy hóa  


               


n thành pyruvate và ATP  và NADH 
+

 


-
nh CO
2



+

2
qua chu trình Krebs.
NADH và FADH
2


+
và
FAD [27].
m 4 
e coenzyme Q (Ub CoQ)
và cytochrome 
NADH và succinate

 (hình 2).  


6
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011

+

     
+

         
 

+


 [27].





gây ra  mô


 
 .
 hóa là quá
 



Hình 3: Sơ đồ minh hoạ cơ chế của sự lão hoá theo học thuyết ty thể





7
Luận văn Thạc sĩ Khoa học

Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011




 [23].

 
 -
4% O
2
  




O
2
O
*
2

, nó khôn




Hình 4: Sơ đồ minh họa cơ chế sản sinh các ROS trong ty thể

Trong 
*

 


8
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011


ng
ROS 

ROS , tinh 
ROS gây ra các  
  

  


nguyên n



i DNA 

 

DNA


             
              


                  



   

Ty t



9
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011

 màng

bào . Tuy








 [25].
Ngoài ra,             

-
nhân h


quá tr

1.1.3. Hệ gen ty thể người

  [11] 
Anderson  
 6].                 
16.569 bp              
              
-6 và ND4L),  cytochrome b),
-3), và enzyme ATP synthase (A8 và A6). NCR là vùng không

mt
làm cho mt



10
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ

Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011

DNA 
 
mt-




 

mtDNA 
-
 và
16S rRNA, mRNA . 
 poly(A) [6]

n,

 6].


Hình 5: Cấu trúc hệ gen ty thể người



11
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ

Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011
Bảng 1: Một số mã di truyền của DNA ty thể khác DNA nhân [6]



TGA

Trp
AGA, AGG
Arg

ATA, ATT
Ile

Gen COI và URF6  ATP6 có mã
 [6]. 
 

[20]. 
men, 





[24].
 mtDNA  qua 




cho chúng.
               

100-1.500 
bào tinh    


thành hoàn toàn c
 [47].  DNA ty

DNA     bào



12
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011
n sao có

[46].


e 
 chépe   

nhân.  ntrong gây ra
 ,  

.
1.2. Các loại đột biến trong hệ gen ty thể ngƣời và các bệnh liên quan


e do gen nhân mã hóa. 



-

e e).

 
y

 

1.2.1. Đột biến điểm
Đột biến điểm 

trong mt



13
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011

Hình 6: Các loại đột biến điểm phổ biến trên mtDNA
1.2.1.1 Các loại đột biến điểm phổ biến trên tRNA và rRNA
 
MERRF, CPEO.
Hội chứng MELAS (Mitochondrial Encephalopathy, Lactic acidosis and
Stroke-xit 
               
em 

MT-TL1; MT-ND5. 

Leu(UUR)
  
    
 [45]. 
             
(tRNA
Leu(UUR)
), gen MT-
tRNA
Leu(UUR)
.
Hội chứng MERRF (Myoclonic epolepsy associated with ragged-red fibres)
. 

Lys

 ,  , , 



kinh, 

, 

, . 


14
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011
-[13].
Hội chứng CPEO (Chronic progressive external ophthalmoplegia)  
, do A3243G, T4274C, hai gen
           tRNA
Leu(UUR)
và tRNA
Ile


Ngoài ra, 
       (myopathy       14709C,
A12320G     (cardiomyopathy     A4269G, A3243G,
G8363A (MIDD) C12258A,
 (encephalomyopathy
G1606A.
   mã hóa rRNA    A1555G gây ra các b 
 aminoglycoside (AID).
1.2.1.2 Các loại đột biến điểm phổ biến trên mRNA

Hội chứng Leigh  và bệnh NARP (neuropathy, ataxia
and retinitis pigmentos) 
  
axit 


T12706C ND5, Phe 
124 (F124L). ND5  
DNAND5 
NADH-ubiquinon oxidoreductase. ND5 


ND5   LHON, Leigh và MELAS.
Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy-
 )  



 , 








,  2 
G3460A,
g ND1, ND4 và ND6




15
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011

ptide ND5 (G465E). Các

gen ND6 ND6 
DNA 
    [6]. ND6          
-
gen ND6: T14484C, T14459C là các gây ra  64V,
A72V
G14453A 
ELAS.
Hội chứng MELAS A12770G ND5
Glu  Gly  (E145G).
Bệnh không chịu đƣợc vận động do các đột biến gen CYTB: gen CYTB
, 
không c intron [6]. axit amin do
gen CYTB mã hóa 
 e  
cytoc


[10 

 

[7]. 
  G15242A [19], G15150A [21], G14985A và T15572C [30],T14849C
[34] , A15579G [41CYTB.
1.2.2. Đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA
9 bp CCCCCTCTA 
COII) và gen mã

Lys
)

(hình

7).


-8289 trên genome ty
. 


16
Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Phạm Minh Huệ
Lớp Cao học K18
Khóa 2009-2011
               
[16].

Hình 7: Vị trí trình tự lặp lại 9 bp trên mtDNA
 9 bp này 

 
Tây sang 
   




              mt  

. Do mt
và phát tán theo 
mt   
nhau



Lys
 
9 bp
9 bp C
 [42],  quan tìm
31]
[8]. L
9 bp   Nepal. L

9 bp.
Bệnh nhân