Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định đa dạng sinh học quần thể vi sinh vật

SVTH: Lê Tuấn Dũng, Sầm Minh Hải,
Cao Xuân Bách , Lê Khắc Thắng
Lê Tiến Hòa
Ứng dụng sinh học phân tử trong xác định đa
dạng sinh học quần thể vi sinh vật
Đặt vấn đề
Vi sinh vật quanh ta
Xử lý nước thải
=>Cần phải có sự hiểu biết về đa dạng vi sinh vật
Nội dung

Các phương pháp

Phương pháp enzyme giới hạn

Phương pháp giải trình tự đặc hiệu

DNA microarray

Các phương pháp lai

Ứng dụng thực tiễn
Các phương pháp

Phương pháp truyền thống:

Dựa vào hình thái: nhuộm,
nuôi khuẩn lạc

Phản ứng sinh hóa


Thực khuẩn thể - vi khuẩn

Kháng nguyên bề mặt

Hoạt chất kháng khuẩn
Phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử

Dựa trên sự khác biệt về cấu
trúc DNA: kích thước, trình
tự, sắp xếp

Giải trình tự DNA

Phân tích plasmid, DNA

Lai DNA trên màng
DNA(đánh dấu bằng: huỳnh
quang,phóng xạ, )
So sánh đặc điểm

Trong thực tế, thường kết hợp cả hai
phương pháp
Phương pháp truyền
thống
Phương pháp kỹ thuật
sinh học phân tử
•
Thời gian lâu
•

Thiếu chính xác
•
Hạn chế với các vi sinh
vật gần nhau
•
Đơn giản, dễ tiến hành
•
Kết quả nhanh
•
Chính xác cao
•
Độ phân biệt lớn
•
Thiết bị máy móc phức
tạp, hóa chất đắt tiền
• Giảm rủi ro khi tiến hành
trên các vi sinh vật độc
hại
Phương pháp sử dụng enzym giới hạn
Nguyên tắc
Dựa trên độ đặc hiệu của
các enzyme cắt giới hạn
(restriction enzym-RE)
Tên gọi enzym: EcoRI, RcoRV,
VD : Escherichia coli Ry13
giống loài chủng
EcoRI: enzym đầu tiên tìm thấy
EcoRV: enzym thứ 5 tìm thấy
Các kiểu cắt của enzyme giới hạn
Phương pháp sử dụng enzym giới hạn

Các bước thực hiện
Trích AND
Cắt bằng các enzym giới hạn

Tách ADN trên gel agarose
Southern blotting
Phân loại đa dạng vi sinh vật
Các bước
Các ứng dụng
•
Xác định quan hệ huyết thống
•
Xác định tình trạng bệnh
•
Lập bản đồ gen
•
Phân tích đa dạng di truyền
•
Xác định đa dạng vi sinh vật
đã định danh(dựa trên dữ liệu
vạch điện di có sẵn) hoặc
nhận biết đa dạng vi sinh vật
trong môi trường dựa trên sự
khác biệt về các vạch điện di.
Ưu nhược điểm
•
Có độ đặc hiệu và độ nhậy cao cho phép
xác định nhanh chóng và chính xác có
mặt của không chỉ một loài vi khuẩn mà
còn cho phép xác định và phân biệt nhiều

loài vi khuẩn
•
Tốn thiết bị và hóa chất, không thể hiện
kết quả tại chỗ.
PHƯƠNG PHÁP GiẢI TRÌNH TỰ
•
Ứng dụng:
–
Xác định các chủng, loài Vi khuẩn
•
Nguyên tắc
–
Các chủng vi khuẩn đều mang đoạn gen 16S
–
Đoạn gen 16S có độ bảo thủ cao
–
Không có sự trao đổi giữa các loài
–
Mang tính đặc trưng cho loài
Các bước thực hiện
Các bước thực hiện
DGGE
(Denaturing Gradient Gel Electrophorensis)
Giải trình tự
•
Giải trình tự mỗi sản phẩm thu được
sau điện di
•
So sánh với ngân hàng gen
(database) xác định chính xác loài.

Giải trình tự
Hạn chế của phương pháp
•
Độ chính xác của taq DNA
polymerase không cao.
•
Không phân biệt được DNA của tế
bào sống và chết trong mẫu ban
đầu.
Hạn chế của phương pháp
Kết quả
•
Phân loại, xác
định loài chính
xác hơn.
•
Cơ sở phát triển
nghiên cứu về sự
tiến hóa của
giống, loài.
Kết quả
DNA Microarray
DNA Microarray là gì?
Kỹ Thuật DNA array
C
h
u
ẩ
n

b
ị

đ
í
c
h
C
h
u
ẩ
n

b
ị

m
ả
n
g
Mẫu
Tách DNA
Đánh dấu
Cơ sở dữ liệu trình tự
Thiết kế tập hợp mẫu dò
In lên mảng
Tiến hành lai
Xác định tín hiệu lai
Giải thích dữ liệu
Xác

định
VSV
Định lượng thành phần quần xã vi
khuẩn
Xác nhận lại mẫu dò
đã thiết kế, tiên
đoán in silico
•
Về kỹ thuật
–
Điều kiện lai không bao giờ tối ưu
–
Tính đa dạng rất lớn của môi trường
•
Về vấn đề phân tích
–
Giải thích dữ liệu khó
–
Cần có dữ liệu trước đó về các loài vi
sinh vật
Các vấn đề khi áp dụng kỹ thuật DNA
microarray trong lĩnh vực môi trường
Khả năng phát triển kỹ thuật DNA
microarray trong quản lý môi trường
•
DNA microarray thỏa mãn các yêu cầu
–
Xác định đồng thời nhiều loại VSV
–
Sử dụng phương pháp phân tích có thể

tự động hóa
–
Giám sát RNA như chỉ thị định tính hoạt
tính VSV
–
Định lượng mức độ RNA hoặc hoạt tính
VSV
Các kĩ thuật lai phân tử
•
Khái niệm phương pháp lai phân tử
•
Cơ sở của phương pháp lai phân tử
•
Các yếu tố ảnh hưởng
•
Các phương pháp lai phân tử