Luận án tiến sĩ Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu
của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là
trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.

Tác giả luận án


Vương Bảo Thy
LỜI CẢM ƠN
Ngành công nghiệp enzyme phát triển ngày càng mạnh, mở ra những cơ hội và
thách thức lớn, đặc biệt là enzyme từ nguồn phế liệu nội tạng ngành chế biến cá tra ở
nước ta. Trước hiện trạng đó, vấn đề nghiên cứu cấp thiết được đặt ra và sau không ít
những khó khăn, trở ngại nhưng với sự nỗ lực của bản thân cùng sự hỗ trợ của Thầy
Cô, gia đình, đồng nghiệp và bạn bè, luận án đã hoàn thành.
Tôi xin gửi lời tri ân sấu sắc đến Thầy, Cô hướng dẫn khoa học là TS. Trần Bích
Lam và GS.TSKH.VS. Lưu Duẩn – những người đã tận tình hướng dẫn, định hướng và
hỗ trợ tôi rất nhiều từ những ngày đầu tiên thực hiện đề tài cho đến tận ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cửu Long- nơi tôi
đang công tác giảng dạy- đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Tôi xin gửi lòng biết ơn đến quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm,
Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM- Quý Thầy, Cô
trong Bộ môn Sinh hóa, phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, phòng thí nghiệm Công
nghệ sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM- Quý Thầy, Cô Bộ môn

Công nghệ thực phẩm trường Đại Học Cần Thơ luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
làm thí nghiệm với điều kiện tốt nhất.
Tôi sẽ luôn nhớ ơn Ban Giám Đốc Công ty TNHH Thủy Sản Hùng Vương- Vĩnh
Long, các anh chị phòng KCS – đã nhiệt tình hỗ trợ tôi toàn bộ nguyên liệu thí nghiệm
trong suốt quá trình thực hiện luận án cũng như tinh thần hợp tác triển khai nghiên
cứu ứng dụng tại nhà máy.
Xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp- Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm
Trường Đại học Cửu Long, Đại học Công nghệ Sài Gòn cùng bạn bè đã hỗ trợ tôi rất
nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến gia đình và ba mẹ - chính gia
đình là nguồn động lực giúp tôi kiên trì vượt qua mọi khó khăn, quyết tâm hoàn thành
luận án.
Luận án này là món quà vô giá tôi xin trân trọng dành tặng cho Gia đình, Thầy
Cô – những người luôn yêu thương, bên cạnh tôi trong cuộc sống cũng như trong sự
nghiệp.
TPHCM, ngày 12 tháng 12 năm 2014
VƯƠNG BẢO THY
TOM TAẫT LUAN AN
Cỏ tra (Pangasius hypophthalmus) l mt trong nhng sn phm thy sn xut
khu ch lc ca nc ta. Theo d bỏo ca VASEP (Hip hi Ch bin v Xut
khu Thy sn Vit Nam) n nm 2015 sn lng cỏ tra nguyờn liu khong 1,8
triu tn thỡ riờng phn ni tng cỏ tra c tớnh khong 100.000 tn/nm, õy l
ngun nguyờn liu di do, nhiu tim nng thu nhn cỏc enzyme tiờu húa. Do
ú, lun ỏn Nghiờn cu thu nhn enzyme tiờu húa t ni tng cỏ tra (Pangasius
hypophthalmus) ó c thc hin nhm xỏc nh c im phõn b, tớnh cht ca
cỏc enzyme tiờu húa t ni tng cỏ tra v xut phng phỏp chit tỏch, tinh sch,
to ch phm enzyme cú giỏ tr s dng cao t ph liu. Nghiờn cu ó ỳc kt
c nhng kt qu mi nh sau:
1- Phõn tớch enzyme trong cỏc c quan ni tng ca cỏ tra xỏc nh rng cỏc
enzyme tiờu húa tp trung nhiu nht gan ty vi hot tớnh lipase 674,02

U/g cht khụ, protease 84,28 U/g cht khụ v amylase 419,69 U/g cht khụ.
2- iu kin tt nht trớch ly enzyme tiờu húa t gan ty cỏ tra: t l nguyờn
liu/dung mụi 1/2(w/v) vi dung mụi trớch ly l dung dch m Tris-HCl
0,05N, pH8, nhit 5
0
C, thi gian 1 gi.
3- S dng phng phỏp lc mng cú th thu nhn ch phm lipase t gan ty
cỏ tra theo qui trỡnh: ln lt lc dch trớch enzyme qua mng MF 1àm v
0,1àm, lc mng UF 10 kDa thu enzyme vi t l pha loóng dch enzyme
thụ 1/3, ỏp sut lc 6 psi, thi gian lc 120 phỳt. Hiu sut thu hi lipase sau
lc UF 90,6%, tinh sch 2,07 ln. Ch phm cú hot tớnh lipase: 22,22
U/ml, hot tớnh riờng lipase: 52,70 U/mg protein.
4- sn xut ch phm enzyme, tt nht l s dng phng phỏp kt ta bng
ethanol theo t l vi dch trớch enzyme l 3/1 (v/v). Ch phm cú hot tớnh
lipase: 587,85 U/g, hot tớnh riờng lipase: 16,91 U/mg protein, hot tớnh
protease: 49,26 U/g, hot tớnh riờng protease 1,42 U/mg protein. Hiu sut
thu nhn ch phm 8,3% so vi nguyờn liu ban u (w/w).
5- ó xut phng phỏp tinh sch protease v lipase t gan ty cỏ tra: t dch
trớch ly enzyme thụ, kt ta enzyme bng mui amoni sunfate 60% bóo hũa,
thẩm tích bằng màng cellophane 12 kDa loại muối. Dùng cột sắc ký trao đổi
ion DEAE-cellulose thu phân đoạn chứa hai enzyme protease và lipase. Tách
riêng protease và lipase qua sắc ký lọc gel Sephadex G-75.
Protease tinh sạch có hoạt tính riêng 28,59 U/mg protein, độ tinh sạch 22,41
lần, hiệu suất thu hồi 23,67%. Lipase tinh sạch có hoạt tính riêng 509,71
U/mg protein, độ tinh sạch 37,95 lần, hiệu suất thu hồi 40,08%.
6- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease từ gan tụy cá
tra: là một serine protease có phân tử lượng 31 kDa, có tỷ lệ cao của serine,
aspartic và glutamic, pH tối ưu 8,5, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 55
0
C, kích

thích khi có mặt ion Ca
2+
và bị kìm hãm bởi các ion Cu
2+
, Zn
2+
, với cơ chất
BSA có K
m
= 897mg/L và V
max
= 15,7 mg/L.phút.
7- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của lipase từ gan tụy cá tra:
là một lipase có hoạt tính cao và ổn định, phân tử lượng 57 kDa, có tỷ lệ cao
nhất là aspartic và glutamic, pH tối ưu 8, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 50
0
C,
tăng hoạt tính khi có mặt ion Ca
2+
và bị kìm hãm bởi các ion Cd
2+
,

Zn
2+
, hoạt
động tốt nhất ở nồng độ muối mật NaTC 0,015M, thủy phân liên kết ester vị
trí 1,3 của glyceride, với cơ chất triolein có K
m
= 1,381mg/L và V

max
= 0,063
mg/L.phút.
8- Chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra có khả năng ứng dụng sản xuất
pepton trên cơ chất thịt bò và cá thác lác, đạt tỷ lệ N
amin
/ N
tổng
lần lượt là
22,15% và 20,97%, đạt yêu cầu của loại pepton-pancreatic (theo Dược điển
Việt Nam); chế phẩm enzyme từ gan tụy cá có đặc tính thủy phân các loại
protein và chất béo tương đương pancreatin từ tụy lợn nên có thể sử dụng
làm dược liệu bào chế thuốc hoặc ứng dụng trong phòng chống suy dinh
dưỡng ở trẻ em.
Nghiên cứu đã đóng góp dẫn liệu khoa học về hệ enzyme tuyến tụy cá tra
(Pangasius hypophthalmus) đồng thời góp phần giải quyết thực tế sản xuất của
ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu cá. Kết quả nghiên
cứu là đóng góp lý thuyết và thực tiễn cho ngành công nghiệp thủy sản của Việt
Nam.
I


I
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT IV
DANH MỤC BẢNG V
DANH MỤC HÌNH VI
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 4
1.1 Các enzym tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn 4
1.1.1 Protease 4

1.1.2 Lipase 6
1.1.3 Tình hình nghiên cứu về enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn 15
1.1.4 Nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng từ cá tra 18
1.1.4.1 Cá tra 18
1.1.4.2 Phế liệu nội tạng- nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng 19
1.2 Phƣơng pháp thu nhận và tinh sạch enzyme tiêu hóa 21
1.2.1 Phương pháp thu nhận enzyme bằng kỹ thuật kết tủa 21
1.2.2 Phương pháp thu nhận protein, enzyme bằng công nghệ lọc màng 21
1.2.3 Phương pháp trích ly và tinh sạch enzym tiêu hóa từ nội tạng cá 23
1.3 Ứng dụng của các enzyme tiêu hóa 26
1.3.1 Ứng dụng chế phẩm hỗn hợp đa enzyme 26
1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá 27
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1 Đối tượng nghiên cứu 32
2.2 Phương pháp nghiên cứu 33
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm phân bố các enzyme trong nội tạng
cá tra (Pangasius hypophthamus) 33
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu trích ly enzyme từ nội tạng cá tra 34
2.2.3 Phương pháp nghiên cứu thu nhận enzyme bằng kỹ thuật lọc màng 35
2.2.4 Phương pháp nghiên cứu thu nhận enzyme bằng kỹ thuật kết tủa 37
2.5.5 Phương pháp nghiên cứu tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật sắc ký 38
2.2.6 Phương pháp xác định một số tính chất của protease gan tụy 41
2.2.7 Phương pháp xác định một số tính chất của lipase gan tụy 42
2.2.8 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme 43
II
2.3 Các phương pháp phân tích 43
2.4 Công thức tính toán 45
2.5 Phương pháp xử lý số liệu 45
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46
3.1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra 46

3.1.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phần trong nội tạng cá tra 46
3.1.2 Sự phân bố của lipase, protease và amylase trong các cơ quan nội tạng
47
3.2 Khảo sát quá trình trích ly thu nhận dịch enzyme thô 51
3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly 51
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 54
3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 56
3.3 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc màng 59
3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu hồi và
độ tinh sạch lipase sau lọc UF 64
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase sau lọc UF 66
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lọc đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase sau lọc UF 68
3.4 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp kết tủa 71
3.4.1 Kết tủa bằng amoni sunfate 71
3.4.2 Kết tủa bằng ethanol 74
3.4.3 Kết tủa bằng aceton 76
3.4.4 Kết tủa bằng isopropanol 78
3.4.5 So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzym từ các tác nhân kết tủa
79
3.5 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra 84
3.5.1 Thử nghiệm quá trình tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel Sephadex
84
3.5.2 Tinh sạch protease bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose kết hợp sắc
ký lọc gel Sephadex 85
3.5.2.1 Tinh sạch protease bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose 85
3.5.2.2 Kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex -G75 hoặc Sephadex-G100 87
3.5.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng protease 90

III
3.5.3 Xác định một số tính chất của protease gan tụy tinh sạch 91
3.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt theo thời gian của
protease 91
3.5.3.2 Ảnh hưởng của pH độ bền pH theo thời gian của protease 93
3.5.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ của protease 95
3.5.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của protease 96
3.5.3.5 Thành phần acid amin của protease gan tụy 96
3.6 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra 98
3.6.1 Tinh sạch lipase gan tụy bằng sắc ký lọc gel Sephadex 98
3.6.2 Khảo sát quá trình tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-
cellulose kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex 99
3.6.2.1 Sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose 99
3.6.2.2 Kết hợp với sắc ký lọc gel Sephadex -G75/ Sephadex-G100 102
3.6.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng lipase 104
3.6.3 Xác định một số tính chất của lipase gan tụy tinh sạch 106
3.6.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt theo thời gian của lipase
106
3.6.3.2 Ảnh hưởng của pH độ bền pH theo thời gian của lipase 108
3.6.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ lipase 109
3.6.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của lipase 110
3.6.3.5 Xác định thành phần acid amin của lipase gan tụy 111
3.6.3.6 Ảnh hưởng của muối mật đến hoạt độ lipase gan tụy 112
3.6.3.7 Ảnh hưởng của loại cơ chất đến hoạt độ lipase gan tụy 113
3.7 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme từ gan tụy cá tra 114
3.7.1 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất pepton 114
3.7.2 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong hỗ trợ tiêu hóa 116
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 119
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC
IV
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

ck Chất khô
cknl Chất khô nguyên liệu
cp Chế phẩm
ĐTS Độ tinh sạch
EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid
HĐ Hoạt độ
HTR Hoạt độ riêng
HĐL Hoạt độ lipase
HĐRL Hoạt độ riêng lipase
HĐP Hoạt độ protease
HĐRP Hoạt độ riêng protease
HĐA Hoạt độ amylase
HĐRA Hoạt độ riêng amylase
HSTH Hiệu suất thu hồi
MF Micro filtration (vi lọc)
nl ướt Nguyên liệuhoạt độ ướt
nl khô Nguyên liệu khô
mg pr mg protein
S.A Amoni sunfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfat- Polyacryamide gel
THĐ Tổng hoạt độ
THĐL Tổng hoạt độ lipase
UF Ultra filtration (siêu lọc)
V Thể tích
v/v Tỷ lệ tính theo thể tích
w/v Tỷ lệ tính theo khối lượng/thể tích

V
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tính đặc hiệu cơ chất của lipase 13
Bảng 1.2: Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ lipase 14
Bảng 1.3: Phân tích khả năng thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra 20
Bảng 3.1: Tỷ lệ khối lượng các thành phần nội tạng cá tra(Pangasius hypophthamus) 46
Bảng 3.2: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong nội tạng cá tra 47
Bảng 3.3: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong gan tụy cá tra 48
Bảng 3.4: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong ruột cá tra 48
Bảng 3.5: Hoạt độ enzym lipase, protease và amylase tại pH trích ly tối ưu 50
Bảng 3.6: Kết quả thu được sau quá trình ly tâm 61
Bảng 3.7: Kết quả thu được sau quá trình lọc MF 61
Bảng 3.8: Kết quả thu lipase trong dòng retentate sau lọc UF thay đổi theo tỷ lệ
pha loãng 65
Bảng 3.9: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo áp suất vận hành 66
Bảng 3.10: Kết quả thu được trong dòng retentate theo thời gian lọc 68
Bảng 3.11: Thất thoát lipase theo dòng permeate ở các chế độ khảo sát 69
Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme lipase sau lọc UF 70
Bảng 3.13: Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra 82
Bảng 3.14: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy cá tra 89
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của một số tác nhân đến hoạt độ protease gan tụy cá tra 95
Bảng 3.16: Kết quả phân tích thành phần acid amin protease tinh sạch 96
Bảng 3.17: Tóm tắt quá trình tinh sạch lipase gan tụy cá tra 104
Bảng 3.18: Ảnh hưởng của một số tác nhân đến hoạt độ lipase gan tụy cá tra 110
Bảng 3.19: Kết quả phân tích thành phần acid amin lipase tinh sạch 111
Bảng 3.20: Hàm lượng nitơ tổng và nitơ amin của các pepton 115
Bảng 3.21: So sánh hoạt độ protease, lipase của chế phẩm enzyme và Enzyplex 116

VI
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc không gian của trypsin crayfish khi liên kết với chất kháng
trypsin Schistocerca gregaria (SGTI) 5
Hình 1.2: Cấu trúc không gian lipase tụy của cá hồi (Salmo Salar) 8
Hình 1.3: Hình tiếp xúc của lipase dạng mở và đóng 9
Hình 1.4: Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất 10
Hình 1.5: Cơ chế thủy phân của enzyme lipase 11
Hình 1.6: Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí của enzyme lipase 13
Hình 1.7: Cá tra (Pangasius hypophthamus) 19
Hình 2.1: Nội tạng cá tra 32
Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng protein trích ly 50
Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ protease 51
Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ lipase 51
Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein trích ly 53
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt độ protease 53
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt độ lipase 54
Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng protein trích ly 55
Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt độ protease 56
Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt độ lipase 56
Hình 3.10: Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hiệu suất thu hồi lipase sau lọc MF 63
Hình 3.11: Ảnh hưởng của áp suất đến độ phân riêng protein trong dịch enzyme 65
Hình 3.12: Ảnh hưởng của độ bảo hòa amoni sunfate đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch protease 70
Hình 3.13: Ảnh hưởng của độ bảo hòa amoni sunfate đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase 71
Hình 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch protease 73
Hình 3.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase 73
Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch protease 75

Hình 3.17: Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase 75
Hình 3.18: Ảnh hưởng của tỷ lệ isopropanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch protease 76
VII
Hình 3.19: Ảnh hưởng của tỷ lệ isopropanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase 77
Hình 3.20: So sánh khả năng kết tủa của các tác nhân khác nhau đến hiệu suất thu
hồi và độ tinh sạch protease 78
Hình 3.21: So sánh khả năng kết tủa của các tác nhân khác nhau đến hiệu suất thu
hồi và độ tinh sạch lipase 78
Hình 3.22: Chế phẩm enzyme tiêu hóa thu nhận theo phương pháp kết tủa 80
Hình 3.23: Qui trình công nghệ thu nhận chế phẩm enzyme từ gan tụy cá tra…… 83
Hình 3.24: Sắc ký đồ lọc gel Sephadex G-75 dung dịch enzym sau thẩm tích 84
Hình 3.25: Kết quả điện di sau sắc ký lọc gel Sephadex G-75 85
Hình 3.26: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột DEAE-
cellulose với dãy nồng độ NaCl 85
Hình 3.27: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột DEAE-
cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 86
Hình 3.28: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên gel Sephadex-100 87
Hình 3.29: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên gel Sephadex-75 88
Hình 3.30: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE 90
Hình 3.31: Qui trình tinh sạch protease gan tụy cá tra từ dịch trích ly enzyme……. . 91
Hình 3.32: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease 92
Hình 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease tinh sạch theo thời
gian 92
Hình 3.34: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease 93
Hình 3.35: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease tinh sạch theo thời gian 94
Hình 3.36: Đồ thị Lineweaver- Burk của protease tinh sạch trên cơ chất BSA 96
Hình 3.37: Sắc ký đồ lọc gel Sephadex G-75 từ enzym sau thẩm tích 98

Hình 3.38: Kết quả điện di sau sắc ký lọc gel Sephadex G-75 99
Hình 3.39: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose
với dãy nồng độ NaCl 100
Hình 3.40: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose
với gradient nồng độ dung dịch NaCl 101
Hình 3.41: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy cá tra trên gel Sephadex-100 102
Hình 3.42: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy cá tra trên gel Sephadex-75 103
Hình 3.43: Kết quả điện di trên gel SDS- (PAGE) 105
Hình 3.44: Qui trình tinh sạch protease/ lipase gan tụy cá tra từ dịch trích ly enzyme
106
Hình 3.45: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase 106
Hình 3.46: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase tinh sạch theo thời gian 107
VIII
Hình 3.47: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ lipase 108
Hình 3.48: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ lipase tinh sạch theo thời gian 109
Hình 3.49: Đồ thị Lineweaver- Burk của lipase tinh sạch trên cơ chất triolein 111
Hình 3.50: Ảnh hưởng của muối mật (NaTC) đến hoạt độ lipase tinh sạch 112
Hình 3.51: Ảnh hưởng của cơ chất đến hoạt độ lipase tinh sạch 113
Hình 3.52: Sự tương quan giữa hàm lượng nitơ amin và thời gian thủy phân 115
Hình 3.53: So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme với Enzyplex trên
một số protein thực phẩm 117
Hình 3.54: So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme so với Enzyplex đối
với một số loại dầu thực vật 117

1

MỞ ĐẦU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cùng với sự tiến bộ của khoa học, công nghệ enzyme trở thành ngành mũi nhọn
được phát triển nhanh trên thế giới. Trong đó, nghiên cứu enzyme tiêu hóa của các

loài cá được đặc biệt quan tâm trong vài thập kỷ vừa qua. Do cá sống trong môi
trường nhiệt độ thấp nên để duy trì sự sống, chúng cần phải có hệ enzyme tương đối
mạnh. Ưu điểm của các enzyme cá là có hoạt độ cao hơn tại các giá trị nhiệt độ thấp
hơn so với enzyme tương ứng từ động vật máu nóng.
Trong các enzyme nội tạng cá, lipase ngày càng được quan tâm do có khả năng
ứng dụng cao trong y học và công nghệ thực phẩm. Một số lipase từ nội tạng cá đã
được thế giới nghiên cứu như lipase cá mập, cá tuyết, cá mòi, cá hồi, cá tráp, cá ngừ
vây xanh, cá đối, cá rô Riêng lipase cá tra (Pangasius hypophthalmus), hiện nay
chưa có nghiên cứu nào được công bố. Trong khi đó, về lý thuyết, ở cá tra có mô mỡ
rất phát triển so với các loại cá da trơn khác, như vậy ở loài cá này enzyme lipase
phải đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất. Vì vậy việc nghiên cứu
tính chất của lipase gan tụy cá tra có giá trị khoa học và cần đặc biệt quan tâm. So
với lipase thì protease nội tạng cá đã được nghiên cứu ở nhiều loài như protease cá
mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết, cá hồi trứng, cá hồi bạc, cá trồng, cá thu…Tuy nhiên,
về cá da trơn ở Việt Nam cho đến nay, ngoài một số khảo sát chung về protease nội
tạng, chưa có công bố nào phân tích riêng tính chất protease gan tụy cá tra. Vì thế,
cần thiết phải có những công trình nghiên cứu chuyên sâu, cung cấp đầy đủ dẫn liệu
khoa học về hệ enzyme tiêu hóa ở cá tra.
Mặt khác, trong ngành công nghiệp chế biến cá tra tại Việt Nam, phi lê cá chiếm
khoảng 30%, phần còn lại là phế phụ phẩm, trong đó, phần nội tạng chiếm khoảng
5-6% trọng lượng cơ thể cá. Theo dự báo của VASEP (Hiệp hội Chế biến và Xuất
khẩu Thủy sản Việt Nam) đến năm 2015 sản lượng cá tra nguyên liệu khoảng 1,8
triệu tấn thì riêng phần nội tạng ước tính khoảng 100.000 tấn, đây là nguồn nguyên
liệu dồi dào, nhiều tiềm năng để thu nhận các enzyme tiêu hóa ứng dụng trong y học,
công nghệ thực phẩm.
2

Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (Pangasius
hypophthalmus)” nhằm góp phần giải quyết các vấn đề trên.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định đặc tính phân bố, phân lập và xác định tính chất của các enzyme tiêu
hóa trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus).
Xác định phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ nguồn nội tạng cá
tra sẵn có để đưa vào ứng dụng.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là các enzyme tiêu hóa có trong cơ quan nội
tạng của cá tra (Pangasius hypophthalmus) nhưng chủ yếu tập trung vào enzyme
lipase và protease.
Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu của luận án là nghiên cứu đặc điểm phân bố của các enzyme
protease, lipase và amylase trong các cơ quan nội tạng; thu nhận, tinh sạch và xác
định tính chất của lipase và protease từ nội tạng của cá tra (Pangasius
hypophthalmus).
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu để thực hiện luận án là phương pháp nghiên cứu thực
nghiệm hóa sinh học kết hợp với phương pháp phân tích lý thuyết và tổng hợp tài
liệu.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong các cơ quan nội tạng cá tra
2. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra
3. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra
4. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra
5. Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme tiêu hóa
3

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
Ý nghĩa khoa học
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống, phân tích
chuyên sâu về hệ enzyme protease, lipase từ gan tụy cá tra (Pangasius

hypophthalmus), đóng góp những dẫn liệu khoa học quan trọng về hệ enzyme tiêu
hóa từ nội tạng cá tra.
Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease và lipase từ gan tụy
cá tra; đưa ra điều kiện trích ly và phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme gan tụy
cá tra bằng phương pháp lọc màng và phương pháp kết tủa; đề xuất phương pháp
tinh sạch protease và lipase từ gan tụy cá tra.
Ý nghĩa thực tiễn
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu thu nhận, tinh sạch các enzyme
tiêu hóa từ nguồn phế liệu nội tạng của ngành chế biến cá tra, góp phần làm phong
phú thêm nguồn thu các chế phẩm enzyme nói chung và protease, lipase nói riêng.
Chế phẩm enzyme từ nội tạng cá tra bước đầu khảo sát ứng dụng có hiệu quả cao
trong sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa. Kết quả nghiên cứu là giải pháp thiết thực từ
thực tế sản xuất của ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm có giá trị gia tăng từ nguồn
phế liệu cá, góp phần phát triển bền vững công nghiệp cá tra của Việt Nam.
BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 120 trang bao gồm: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan 28
trang; Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 14 trang; Chương 3: Kết
quả và bàn luận 73 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang, 150 tài liệu tham khảo.
Trong luận án có 24 bảng, 62 hình và đồ thị.
4

CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN
1.1 Các enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn
Trong số các enzym tiêu hóa từ nội tạng cá thì ngoại trừ enzym pepsin từ dạ dày
cá đã được các tác giả trên thế giới nghiên cứu thu nhận, tinh sạch, xác định tính
chất và đưa vào ứng dụng, các hiểu biết cho đến nay về hệ enzyme tiêu hóa từ tụy
tạng cá vẫn còn khá hạn chế [1]. Trong khi đó, nguồn nguyên liệu nội tạng cá tra
cần nghiên cứu thu nhận enzyme không bao gồm dạ dày cá nên trong phạm vi đề tài
này chúng tôi sẽ không đề cập đến pepsin. Các enzym tiêu hóa khác chủ yếu được
sản xuất ở tuyến tụy.

Ở động vật bậc cao các enzyme tiêu hóa của tuyến tụy (pancreatin) được tiết ra
từ các tế bào ngoại tiết của tuyến tụy, gồm chủ yếu là lipase, protease và amylase.
Đến nay, chỉ có enzyme tuyến tụy của lợn, bò được sản xuất dưới dạng chế phẩm để
đưa vào ứng dụng. Các dạng chế phẩm hỗn hợp đa enzyme rất phổ biến, ngoài ra
cũng có các chế phẩm mặc dù gồm vài enzyme nhưng hoạt động ưu thế trên một
loại cơ chất. Điển hình như: pancreatic protease là chế phẩm hỗn hợp giữa trypsin
và chymotrypsin. Pancreatic lipase là chế phẩm hỗn hợp có chứa cả esterase,
protease, amylase và các zymogen [1].
Ngoài chế phẩm hỗn hợp, một số enzyme tuyến tụy cũng đã được thu nhận dưới
dạng tinh sạch như trypsin, chymotrypsin, lipase tụy.
1.1.1 Protease
Protease tuyến tụy bao gồm chủ yếu là trypsin và chymotrypsin, chúng thuộc
nhóm serine-protease, có nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động, có
vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các protease
tuyến tụy thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ
chất tương đối rộng [2].
Trypsin [E.C.3.4.21.4]
Nghiên cứu trypsin của lợn cho thấy đây là một chuỗi polypeptide có 249 acid
amin, trọng lượng phân tử 22.680 - 23.400 Da. Trypsin thủy phân liên kết peptide
giữa gốc carboxyl của lysine và arginine với nhóm amine của các acid amin khác.
pH tối ưu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp là 7,8 - 9,5. Nhiệt độ thích
5

hợp cho hoạt động của trypsin trong khoảng 30 - 40
0
C, ở nhiệt độ này và pH 8,5 - 9
trypsin có khả năng thủy phân mạnh các cơ chất như casein, hemoglobin hay
gelatin. Ion Ca
2+
được xem như là chất bảo vệ cho enzyme khỏi bị biến tính và bảo

vệ chống lại sự tự phân protein. Ngược lại, Cu
2+
, Ag
2+
, Hg
2+
có tác dụng ức chế
enzyme. Ngoài ra trypsin còn bị ức chế bởi các chất kháng-trypsin tự nhiên có trong
tuyến tụy, đậu tương, đậu ván, các cây họ đậu, mướp đắng. Trung tâm hoạt động
của trypsin có thứ tự các acid amin -Gly-Asp-Ser-Gly-Pro- [2].

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của trypsin crayfish khi liên kết với chất kháng
trypsin Schistocerca gregaria (SGTI) [3]
Chymotrypsin [E.C.3.4.21.1]
Chymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi trường có pH kiềm
nên được xếp vào nhóm protease kiềm tính tương tự như trypsin. Chymotrypsin
hoạt động trong điều kiện pH 7 - 9 và pH tối ưu là 8 - 9, điểm đẳng điện pI = 5,4;
pH 5 không thuận tiện cho hoạt động của chymotrypsin nhưng ở pH này
chymotrypsin lại bền vững hơn trong môi trường pH 8. Chymotrypsin là một chuỗi
polypeptide có 245 acid amin, trọng lượng phân tử 22.500 Da. Chymotrypsin hoạt
động như một endopeptidase phân cắt mạch polypeptide thành các peptide ngắn và
tác dụng trên những liên kết mà trypsin không phân cắt. Những liên kết này được
6

tạo thành bởi nhóm carboxyl của acid amin có nhân thơm như tyrosine, tryptophan,
phenylalanine với nhóm amine của acid amin khác [2].
Sự khác nhau giữa trung tâm liên kết của trypsin và chymotrypsin
Trypsin và chymotrypsin thuộc nhóm serine protease, trung tâm hoạt động của
chúng giống nhau, trung tâm liên kết tương tự nhau ngoại trừ khác nhau ở một acid
amin. Ở trypsin có một gốc lysine ở đáy túi liên kết, ở chymotrypsin có gốc tyrosine

ở đáy túi liên kết thay vào vị trí của lysine. Do sự khác nhau này, cơ chất protein
hoặc chuỗi peptide có các gốc acid amin là arginyl và lysyl mới có thể kết hợp với
trung tâm hoạt động của trypsin để thủy phân liên kết peptide. Ở chymotrypsin, cơ
chất protein hoặc chuỗi peptide có các gốc acid amin là tyrosyl, phenylalanyl và
tryptophanyl mới có thể kết hợp với trung tâm hoạt động của chymotrypsin [2].
Sự tƣơng đồng về cấu trúc của trypsin và lipase tuyến tụy
Trung tâm hoạt động của trypsin là chuỗi pentapeptide Gly-Asp-Ser-Gly-Gly,
tương đồng với trung tâm hoạt động của lipase tụy với chuỗi pentapeptide Gly-X-
Ser-X-Gly. Mặt khác, lipase tụy sẽ bị mất hoạt độ khi có mặt các chất kìm hãm
serine-protease như diisopropylphosphofluoridate và diethyl-p-nitrophenyl
phosphate. Từ minh chứng trên, lipase tụy được xem như thuộc nhóm serine-
protease. Các phân tích cấu trúc gần đây cho thấy ở lipase tụy hiện diện cấu trúc
Ser…His…Asp, cấu trúc này có mặt ở tất cả các serine protease mặc dù các thành
phần acid amin còn lại khác nhau. Cấu trúc tương đồng ở trung tâm hoạt động của
serine protease và lipase tụy như sau [4].
SERINE PROTEASE
Trypsin chuột QGDSGGPVVC
Chymotrypsin chuột MGDSGGPLVC
LIPASE
Lipase tụy lợn VHVIGHSLGSHAA
Lipase tụy chó VQLIGHSLGAHVA
Lipase tụy ngựa VHIIGHSLGSHAA
Lipase tụy người VHVIGHSLGAHAA
1.1.2 Lipase tụy [E.C.3.1.1.3]
7

Các enzyme lipase hay các acylglycerol acylhydrolase (E.C. 3.1.1.3) được định
nghĩa như là các enzyme thuỷ phân các liên kết ester giữa các acid béo mạch dài và
glycerol trong dầu béo tại bề mặt phân pha dầu-nước. Các enzyme lipase thủy phân
triacylglycerol (TAG) không tan trong nước thành các diacylglycerol, các

monoacylglycerol phân cực hơn cũng như các acid béo và glycerol hỗ trợ cho quá
trình hấp thu và chuyển hoá qua màng. Trừ các trường hợp ngoại lệ, pH hoạt động
tối thích cho hầu hết các lipase nằm trong khoảng 7 – 9, các lipase hoạt động trong
khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 20 – 65
o
C, nhưng thông dụng nhất là từ 30 – 45
o
C [5].
Nhiều chuỗi acid amin của lipase tụy đã được tìm ra như: lipase tụy của người,
bò (Bos tauru), chuột (Rattus norvegi-cus), chó (Canis familiaris), lợn (Cavia
orcellus), thỏ (Oryctolagus cuniculus), ngựa (Equus caballus). Cấu trúc tinh thể của
một số lipase cũng đã được nghiên cứu như: lipase tụy của người, bò (Bos Taurus),
lợn (Sus scrofa), chuột (Rattus norvegicus) [4].
Tính chất của lipase tụy
Cấu trúc
Trong những lipase đã biết, không có trình tự acid amin đặc trưng nào cho mọi
lipase. Trái lại, trình tự của chúng rất khác biệt. Điểm giống nhau của tất cả các
lipase là một đoạn nhỏ gồm 5 acid amin Gly-X-Ser-X-Gly (trong rất hiếm trường
hợp, glycine bị thay thế bằng những acid amin khác). Trình tự này nằm gần trung
tâm hoạt động và sau này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng chuỗi pentapeptide này để
định danh những protein là lipase [6].
Mặc dù có sự khác biệt lớn trong trình tự acid amin, tất cả lipase đều có một
kiểu cấu trúc tương tự nhau gọi là gấp nếp β có liên quan đến cơ chế xúc tác của nó.
Cấu trúc này lần đầu tiên được giới thiệu khi so sánh cấu trúc 3 chiều của enzyme
có trình tự acid amin khác nhau và so sánh khi chúng gắn với cơ chất. Cấu trúc gấp
nếp này có phần trung tâm là 8 chuỗi xếp song song cùng chiều, chỉ có chuỗi β2
ngược chiều. Các chuỗi β3 đến β8 nối lại với nhau bằng các đoạn xoắn . Sự khác
biệt giữa các cấu trúc này là số chuỗi trên gấp nếp β, sự hiện diện của nhóm phụ và
cấu trúc của tiểu phần sẽ liên kết với cơ chất [7].
8

Cấu trúc lập thể của lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990, các nghiên cứu cho
thấy vùng hoạt động của enzyme lipase bị che chắn khỏi dung môi bằng một cấu
trúc di động [8]. Theo Winkler, F.K. và cộng sự, cấu trúc di động cần di chuyển trên
bề mặt liên pha cơ chất và nước để tạo ra cấu trúc hoạt động của enzyme với trung
tâm xúc tác có thể tiếp xúc với cơ chất. Cấu trúc tinh thể của lipase hay cấu trúc
dạng phức đã tạo điều kiện cho việc làm sáng tỏ sự thay đổi cấu trúc của lipase.
Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt động khi cấu trúc di
động chuyển từ đóng sang mở [9]. Cơ chế đóng mở nắp có thể khác nhau giữa các
lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho trung tâm hoạt động của lipase thông suốt
để có thể liên kết với lipid [10].

Hình 1.2: Cấu trúc không gian lipase tụy của cá hồi (Salmo Salar) [11]
Cấu trúc di động
Lipase sẽ có sự thay đổi hình dạng để ổn định hoạt độ khi tương tác với bề mặt
liên pha nước và cơ chất. Ở trạng thái đóng, cái nắp sẽ che phủ trung tâm hoạt động
của enzyme, làm cho phân tử cơ chất không gắn kết được vào đó. Khi chuyển sang
dạng mở, trung tâm này trở thành con đường hầm để cơ chất đi vào và tham gia
phản ứng. Trong những năm gần đây, chức năng của cấu trúc nắp đã được làm sáng
tỏ nhiều hơn. Nó không chỉ đơn thuần là cái cổng đi vào trung tâm hoạt động. Nắp
có cấu trúc của một phân tử vừa có tính kỵ nước vừa có tính ái nước: khi đóng nắp,
phần mặt ưa nước hướng ra ngoài dung môi và mặt kỵ nước hướng vào lõi protein;
9

khi enzyme chuyển sang trạng thái mở, mặt kỵ nước sẽ lộ ra ngoài làm tăng diện
tích bề mặt kỵ nước, tăng khả năng liên kết với cơ chất. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra
rằng cấu trúc phần nắp còn ảnh hưởng đến hoạt độ và tính chọn lọc của lipase. Ví
dụ, cùng trong một nhóm lipase, lipase tụy người và lipase tụy heo, nhưng 2 lipase
lại cho thấy tính đặc hiệu khác nhau. Lipase tụy người chỉ có hoạt độ cao với
triglyceride, trong khi lipase tụy heo còn thể hiện hoạt độ của phospholipase và

galactolipase. Điểm khác nhau chính trong cấu trúc của 2 enzyme này là kích thước
rất nhỏ của nắp trên lipase tụy heo (5 acid amin). Đột biến gene gây ra những biến
đổi trên cái nắp đã cho thấy tầm ảnh hưởng của cái nắp đến tính chọn lọc đối với
triglyceride, phospholipid và galactolipid. Đột biến trên nắp của lipase này sẽ làm
thay đổi chiều dài mạch của cơ chất mà nó tương thích [12].
Phức lipase
Lipase tụy có cấu trúc phức với nhóm phụ là protein hay lipid. Lipase tụy chứa 2
phần gắn với nhau bằng một khớp linh động, đầu N của phần protein xúc tác có
kích thước lớn và đầu C của gấp nếp β có kích thước nhỏ hơn. Nó liên quan đến
hoạt độ của lipase trong những điều kiện môi trường sinh lý trong cơ thể. Trong ống
tiêu hóa, triglyceride được hòa với phospholipid, acid béo, protein và muối mật có
tác dụng như chất nhũ hóa. Muối mật sẽ ngăn cản sự hấp phụ của lipase tụy trên cơ
chất lipid nếu không có sự hỗ trợ của một protein được tiết ra cùng với dịch tụy,
colipase. Colipase là một phân tử protein vừa có tính ưa nước vừa có tính kỵ nước,
nó có thể gắn lipase vào bề mặt phân chia pha và ổn định hoạt độ của lipase trên đó.
Khi liên kết với đầu C của lipase, colipase sẽ làm lộ phần cấu trúc kỵ nước ở mặt
đối diện và giúp enzyme tiếp xúc với bề mặt liên pha [13]. Liên kết với colipase
không gây ra sự thay đổi về hình dạng của phân tử lipase nhưng một cách gián tiếp,
nó tác động đến cái nắp trên lipase, làm nó mở ra và mở ra phần kỵ nước giúp tăng
cường hoạt động trên bề mặt liên pha nước-lipid [14].
Cơ chế xúc tác của lipase
Trung tâm hoạt động
Trung tâm hoạt động của lipase gồm ba gốc acid amin: serine; aspartate hay
glutamate và một histidine.
10


Hình 1.3: Vùng tiếp xúc của lipase dạng mở và đóng.
Nhóm kỵ nước màu trắng, nhóm ưa nước màu vàng, các nhóm mang điện tích
dương màu xanh và các nhóm mang điện tích âm màu đỏ [15]

Sự hoạt hóa enzyme lipase thường xảy ra ở bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ
chất ở dạng hạt nhũ (miccelar substrates), do dịch chuyển một hoặc nhiều nắp (lid)
của enzyme. Sự tác động này tương đối khác nhau tuỳ loại cơ chất [15]
Hình 1.4 mô tả cơ chế tác động của lipase theo Jaeger và cộng sự (1999)


Hình 1.4: Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất [16]
Trong đó, phản ứng 1 mô tả quá trình chuyển từ dạng enzyme hòa tan sang dạng
enzyme hoạt hóa kết hợp cơ chất. Quá trình này bao gồm các giai đoạn: (1) kết gắn,
(2) định hướng, (3) hoạt hóa và cuối cùng (4) gắn cơ chất vào vị trí hoạt hóa. Phần
còn lại (phản ứng 2) là phản ứng xúc tác giữa enzyme và cơ chất phù hợp, tạo ra
dạng trung gian (Ea*S). Cơ chế xúc tác thủy phân cơ chất gồm hai bước: Độ ái
nhân của serine được tăng cường bằng việc chuyển proton đến histidine tạo thành
oxyanion tấn công vào carbon của nhóm carbonyl trên liên kết ester. Một hình tứ
11

diện được hình thành mang điện tích âm của nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và
nó được giữ ổn định nhờ liên kết hydro với nhóm NH của mạch chính. Proton trên
histidin sau đó được chuyển đến oxy trên liên kết ester. Liên kết ester này sau đó bị
cắt đứt và một liên kết cộng hóa trị trung gian mới được hình thành giữa acid béo
mới giải phóng với serine. Bước 2 của quá trình là việc deacyl hóa enzyme nhờ
phân tử nước đến thủy phân liên kết cộng hóa trị trên. Trong bước này, proton từ
nước sẽ chuyển đến serine trên tạo thành ion hydroxide. Ion này sẽ gắn với nguyên
tử carbon của carbonyl trên cơ chất [17].
Acyl hóa Ea*S Ea*Ac+P1 và đề acyl hóa Ea*Ac Ea*+P2
(Ea*: adsorbed and activated enzyme – enzyme hoạt hóa kết bám)
Cơ chế phân tử của phản ứng xúc tác bởi lipase được mô tả ở hình 1.5


Hình 1.5: Cơ chế thủy phân của enzyme lipase [17]

1) Sự kết gắn lipid, hoạt hoá nhóm serine ưa nhân bởi histidine lân cận và O-Ser
tấn công ưa nhân vào nguyên tố C-carbonyl của cơ chất.
2) Dạng tetrahydral chuyển tiếp hình thành, với nguyên tử O được ổn định bởi hai
nhóm NH-peptid, histidine phóng thích một proton đến phần alcohol của cơ chất.
12

3) Dạng trung gian đồng trị (“acyl enzyme”) được hình thành, trong đó thành phần
acid của cơ chất được ester hoá với serine của enzyme. Phân tử nước thu vào
được hoạt hóa nhờ histidine bên cạnh và ion hydroxyl tấn công ưa nhân nguyên tử
C của dạng đồng trị đó.
4) Histidine giải phóng 1 proton đến nguyên tử O của gốc serine hoạt hoá, liên kết
ester giữa serine và acyl bị bẻ gãy giải phóng gốc acyl.
Trung tâm liên kết với cơ chất
Trung tâm hoạt động của lipase bị bao phủ bên trong cấu trúc protein. Cơ chất đi
vào đó thông qua một trung tâm liên kết là một cái túi ở phần đầu của gấp nếp β ở
trung tâm phân tử enzyme. Mặc dù các lipase có cấu trúc gấp nếp tương tự nhau,
trung tâm liên kết với cơ chất lại khác nhau về kích thước, cấu trúc, và tính chất lý
hóa, đặc biệt là tính kỵ nước của những phần tử trong túi. Độ dài, hình dạng, tính kỵ
nước của túi có liên quan đến chiều dài mạch carbon của cơ chất [18].
Tính đặc hiệu của lipase
Khả năng sử dụng lipase làm xúc tác sinh học đều dựa vào tính chọn lọc và đặc
hiệu rất tinh tế của nó. Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc có thể là chọn lọc vị trí
không gian, ví dụ như vị trí nhóm phân tử cơ chất của liên kết ester bị thủy phân
hoặc hình thành; cũng có thể là chọn lọc hóa học , ví dụ như khả năng nhận biết cơ
chất; và chọn lọc đồng phân lập thể. Hầu hết lipase thông dụng có tính đặc hiệu vị
trí nhóm hydroxyl 1,3 trong mạch glycerol. Ngoài ra cũng có lipase có tính đặc hiệu
cho vị trí sn-2 cho phép việc thủy phân hoàn toàn triglyceride thành acid béo và
glycerol. Về tính chọn lọc đối với acid béo, lipase có thể chuyển ester với acid béo
có độ dài mạch bên trung bình đến dài (C4 đến C18, có thể lên đến C22) nhưng với
hiệu quả khác nhau. Lipase tụy thể hiện hoạt độ trên các acid béo không no nhiều

nối đôi (polyunsaturated fatty acid, PUFA) [19].
Đặc hiệu cơ chất
Dầu và mỡ động thực vật là những cơ chất thích hợp của enzyme lipase. Tuy
nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ của enzyme cũng không giống
nhau [20].
13

Bảng 1.1: Tính đặc hiệu cơ chất của lipase [20]
Cơ chất
Hoạt độ tƣơng đối (%)
Dầu dừa
142
Dầu hạt cotton
112
Dầu đậu phộng
34,5
Dầu olive
105
Dầu hướng dương
121
Triacetin
0
Tributirin
35,7
Triolein
100

Đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu vùng (sn-1,3)
Tính đặc hiệu này có thể được xác định qua quá trình transester hóa triolein
(OOO) với palmitic acid (P), xúc tác bởi enzyme lipase. Sự tạo thành tripalmitin

(PPP) cho thấy enzyme không có tính đặc hiệu vị trí và sự không tạo tripalmitin mà
chỉ tạo 1,3-dipalmitin 2-olein chứng tỏ enzyme có tính đặc hiệu vị trí -1,3.


Hình 1.6: Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí cuả enzyme lipase [21]
Enzyme đặc hiệu vị trí chỉ cắt các liên kết ester ở vị trí acylglycerol 1 và 3.
Trong trường hợp này, triacylglycerol sau khi bị thuỷ giải bởi enzyme sẽ tạo ra 1,2-