tóm tắt luận án PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Nguyễn Duy Phƣơng



PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA
NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH
CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62420116



DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC








Hà Nội - 2015

Công trình đƣợc hoàn thành tại:
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội


Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Xuân Hội
2. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:



Luận án sẽ đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học
Quốc gia họp tại:
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
vào hồi giờ , ngày tháng năm 2015







Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hạn là yếu tố môi trƣờng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản
xuất nông nghiệp, làm giảm năng suất, sản lƣợng cây trồng và dẫn tới
tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Đặc biệt, trong bối cảnh biến đổi
khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra ngày càng thƣờng xuyên
hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, nhiều lúc vƣợt quá tầm kiểm
soát của con ngƣời. Chính vì vậy, việc nghiên cứu các gen liên quan
tới tính kháng hạn để tiến tới tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả
năng chịu hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc duy trì và
tăng sản lƣợng nông nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng
thực quốc gia.
Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các
gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Các nhà khoa học đã
chứng minh đƣợc chức năng quan trọng của nhóm gen điều khiển
trong việc tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Do đó, việc nghiên
cứu phân lậ c đặ ố phiên
mã liên quan đến chịu hạn đang trở thành xu hƣớng triển vọng và
nhận đƣợc sự quan tâm đặc biệt. Hàng loạt gen mã hóa nhân tố phiên
mã liên quan đến chịu hạn đã đƣợc xác định và chuyển vào các giống
cây trồng khác nhau. Các gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù
không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn
nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất
nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn
của thực vật. Nhiều cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã
đã đƣợc chứng minh tăng cƣờng khả năng chịu hạn so với cây không
chuyển gen
2

Ở Việt Nam, cho đến nay chúng ta vẫn chƣa có một nghiên cứu

cơ bản hoàn chỉnh nào về phân lập và nghiên cứu chức năng gen liên
quan đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen
mã hóa nhân tố phiên mã.
Xuất phát từ trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án
tiến sĩ “Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên
quan đến tính chịu hạn của thực vật” với mục tiêu xác định một
gen mã hóa nhân tố phiên mã mới có liên quan tới tăng cƣờng tính
chống chịu hạn ở thực vật.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã điều
khiển tính chịu hạn từ lúa.
- Nghiên cứu một số đặc tính của gen mã hóa nhân tố phiên mã
phân lập đƣợc trên cây lúa chuyển gen mô hình.
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài:
Gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu
stress hạn của lúa Oryza sativa L.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chống chịu
điều kiện bất lợi ở lúa.
- Nghiên cứu đặc điểm chức năng của protein OsNLI-IF.
- Thiết kế các hệ vector biểu hiện gen OsNLI-IF trong tế bào thực
vật.
- Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây chuyển gen mô hình.
4. Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện tại Bộ môn Bênh học
Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp
3

Việt Nam), e

và Phòng Thí nghiệm
Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và
Công nghệ Sinh học Quốc tế (New Delhi, Ấn Độ).
5. Đóng góp mới của đề tài
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có
hệ thống về nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng gen
OsNLI-IF chƣa đƣợc xác định chức năng. Gen OsNLI-IF đƣợc chứng
minh mã hóa một nhân tố phiên mã hoạt động cảm ứng với điều kiện
ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và có khả năng
tăng cƣờng tính chịu hạn trong các cây chuyển gen mô hình (thuốc
lá/ lúa). Ngoài ra, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF đƣợc điểu khiển
bởi các promoter hoạt động liên tục (35S và Ubiquitin) và hoạt động
trong điều kiện stress (Lip9) đã đƣợc chuyển vào cây mô hình để
nghiên cứu biểu hiện gen. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu của
luận án là hoàn toàn mới, có giá trị khoa học và ý nghĩa thực tiễn
trong công tác chọn tạo giống cây trồng chuyển gen.
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên đã chứng minh vai
trò tăng cƣờng tính chịu hạn của gen OsNLI-IF trong các dòng cây
chuyển gen. Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen
OsNLI-IF do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các
giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông… để chọn tạo
các giống cây chuyển gen kháng hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết
của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu.
7. Bố cục của luận án
Luận án gồm 179 trang bao gồm: Phần mở đầu (03 trang); Tổng
quan tài liệu (41 trang); Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (28
4

trang);

Kết

quả

nghiên

cứu

và

thảo

luận

(70

trang);

Kết

luận

(02

trang);

Kiến nghị

(01

trang); Các công trình khoa học của tác giả

liên
177 quan đến luận án (01 trang); Tài liệu

tham khảo (18

trang),

tài liệu gồm 2 thứ

tiếng tiếng Việt (17

) và tiếng Anh (160
); Phụ lục (06 trang). Luận án có 11

bảng, 45

hình.

5

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT
Hạn đối với thực vật là khái niệm đƣợc dùng để chỉ trạng thái
thiếu nƣớc do môi trƣờng gây nên trong suốt quá trình sống hay
trong từng giai đoạn sống, làm ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng
và phát triển của thực vật. Môi trƣờng khô hạn gây ra hàng loạt
những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái

tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển. Để đối phó với điều
kiện hạn hán, thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự
thiếu hụt nƣớc, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ khác
nhau. Đáp ứng chống chịu stress hạn của thực vật đƣợc thực hiện
thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp với sự tham gia của
hàng loạt các yếu tố và có thể chia thành 3 giai đoạn: nhận tín hiệu –
dẫn truyền tín hiệu – đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín
hiệu.
1.2. ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN Ở THỰC
VẬT
Thực vật thích nghi với môi trƣờng sống nhờ khả năng điều hòa
nhanh biểu hiện của các gen chức năng. Quá trình điều hòa biểu hiện
gen đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với các
điều kiện stress phi sinh học, trong đó có hạn hán. Các nghiên cứu
gần đây đã chứng minh stress hạn tác động tới tất cả các bƣớc trong
quá trình điều hòa hoạt động gen của thực vật, bao gồm: điều hòa quá
trình phiên mã, điều hòa sau phiên mã, điều hòa quá trình dịch mã,
điều hòa sau dịch mã, điều hòa hoạt động gen thông qua các phân tử
RNA không mã hóa và yếu tố di truyền ngoại sinh (ví dụ nhƣ quá
trình methyl hóa DNA hay quá trình biến đổi histone).
6

1.3. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG STRESS HẠN
Trong hệ gen thực vật có khoảng 7% gen mã hóa nhân tố phiên
mã (TF), trong số đó có rất nhiều gen liên quan đến đáp ứng chống
chịu stress. Các TF tham gia trong mạng lƣới điều hòa hoạt động gen
đáp ứng stress hạn đã biết cho tới nay đƣợc xác định thuộc hầu hết
các nhóm TF lớn của thực vật, trong đó đƣợc nghiên cứu nhiều nhất
là các nhóm AP2/ERF, NAC, WRKY, MYB/MYC, bZIP hay ZF.
1.4. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA

BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT
Việc phát triển các giống lúa chịu hạn và giảm lƣợng nƣớc tiêu
thụ trong sản xuất lúa gạo có ý nghĩa vô cùng to lớn để tăng sản
lƣợng và đảm bảo an ninh lƣơng thực. Một hƣớng nghiên cứu phổ
biến và rất đƣợc quan tâm hiện nay là tăng cƣờng biểu hiện các gen
đáp ứng hoặc liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trong cây lúa
chuyển gen. Do cơ chế chống chịu hạn phức tạp của thực vật, việc sử
dụng các gen điều hòa (mã hóa các protein tham gia vào mạng lƣới
điều hòa đáp ứng stress) trong nghiên cứu chuyển gen tạo giống lúa
chịu hạn thƣờng mang lại hiệu quả cao hơn so với các gen chức năng
(mã hóa protein/ enzyme trực tiếp tham gia vào đáp úng chống chịu
stress). Tuy nhiên, cho đến nay mới chỉ có một vài nghiên cứu chứng
minh khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen trong điều kiện
thử nghiệm trên đồng ruộng. Ở Việt Nam chƣa có một nghiên cứu
hoàn chỉnh nào về các gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress ở
thực vật, đặc biệt là nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới
đáp ứng chống chịu hạn ở lúa.

7

Chƣơng 2. VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Thƣ viện cDNA sơ cấp của lúa Oryza sativa L. xử lý điều kiện
hạn và mặn ấp bởi Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di
truyền Nông nghiệp. Hạt lúa PB1 và hạt thuốc lá Nicotiana tabacum
(L.) doTrung tâm Kỹ thuật Di truyền & Công nghệ sinh học Quốc tế
(Ấn Độ) cung cấp.
2.1.2. Chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α đƣợc mua từ hãng Fermentas

(Mỹ); chủng vi khuẩn E. coli XLOR, XL1-Blue MRF và phage “trợ
giúp” đƣợc mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ); chủng vi
khuẩn E. coli Rosetta (DE3) khả biến đƣợc mua từ Công ty Merck
Millipore (Mỹ); chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA4404 khả biến,
chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae YM4271 và AH109 đƣợc
mua từ Công ty Clontech (Mỹ).
2.1.3. Vector và oligonucleotide
Các vector pLacZi/JRC0332, pLacZi/JRC0528, pLacZi/JRC2606,
pHISi/JRC0332, pHISi/JRC0528, pHISi/JRC2606 do nhóm nghiên
cứu của Phạm Xuân Hội thiết kế và cung cấp; vector YEpGAP, pBI-
Lip9, pBI-Ubi do nhóm nghiên cứu của Kazuko Yamaguchi-
Shinozaki thiết kế và cung cấp; các vector pAD-GAL4, pGBKT7
đƣợc mua từ Công ty Clontech; vector pET28a đƣợc mua từ hãng
Novagen, vector pRT101 do nhóm nghiên cứu của Reinhard Topfer
thiết kế; vector pCAMBIA1301 đƣợc mua từ Công ty Marker Gene
Technologies; vector pGEM-T đƣợc mua của hãng Promega.
Các cặp sử dụng làm mồi oligonucleotide đầu dò
8

đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Xử lý mẫu thực vật theo phƣơng pháp của Qin (2007), Dubouzet
(2003) và Tran (2004).
- Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA
- Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T
- Thiết kế vector biểu hiện gen OsNLI-IF

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-35S/OsNLI-IF

Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế vector pBI-Lip9 và pBI-Ubi
- Sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA bằng kỹ thuật lai phân tử trong tế
bào nấm men.
- Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp
- Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsNLI-IF
9

Chƣơng 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN
ĐẾN CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN BẤT LỢI Ở LÚA
Trong nghiên cứu đƣợc công bố năm 2003, Rabbani và cộng sự
đã xác định đƣợc 72 gen biểu hiện cảm ứng với các điều kiện stress
khác nhau ở lúa. Khi phân tích trình tự promoter của các gen này, hai
motif (đoạn trình tự lặp lại) có trình tự là CCTCCTCC và CTCCAC
đƣợc tìm thấy xuất hiện lặp lại nhiều lần trong vùng promoter của
nhiều gen và đƣợc dự đoán là những yếu tố cis điều hòa biểu hiện
gen trong điều kiện stress. Chúng tôi đã sử dụng hai đoạn DNA kích
thƣớc 50 bp đƣợc tổng hợp dựa trên trình tự của hai promoter
JRC0528 và JRC0332 có chứa đồng thời cả hai motif làm “mồi câu”
trong thí nghiệm sàng lọc gen mã hoá nhân tố phiên mã từ thƣ viện
cDNA bằng kỹ thuật Y1H.
Bảng 3.2: Protein liên kết với đoạn DNA đích
Protein liên kết JRC0332
Protein liên kết JRC0528
Protein
Số KL
Protein
Số KL
OsNLI-IF
3

OsNLI-IF
5
R2R3 typical-P-type
1
Protein họ Zinc Finger
1
Protein cảm ứng lạnh
1
Protein C3HC4-type ring finger
1
Nhân tố ức chế dịch mã
EIF4D

1
Protein liên kết RNA
1
Dehydrogenase
1
Protein ribosomal 60S
1
Protein liên kết RNA
1
Protein giống methallothionein
1
Protein mang acyl
1
Carboxylase ribulose-bisphosphate
1
Protein liên kết RNA
1

Protein chuyển hóa lipid
1
Systeine synthase
1
Protein ƣu nhiệt
1
Protein ƣu nhiệt
1
Protein liên kết axit béo
1
Trình tự DNA không xác định
5
Trình tự DNA không xác định
4
Chúng tôi đã sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress hạn và mặn
của lúa và xác định đƣợc 37 dòng cDNA dƣơng tính, trong đó có 8
10

dòng mã hóa cho protein NLI-IF (Bảng 3.2). Tám dòng cDNA đều
có chiều dài ~1850 bp, trong đó vùng ORF dài 1.320 bp mã hóa cho
439 axit amin, vùng không mã hóa đầu 5’ dài 311 bp, vùng không mã
hóa đầu 3’ dài 219 bp. Gen OsNLI-IF sau đó đƣợc nhân bản bằng
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và nhân dòng vào vector pGEM-T.
3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA OsNLI-IF
3.2.1. Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện stress
Mức độ biểu hiện gen OsNLI-IF trong cây lúa đƣợc phân tích
trong các điều kiện stress giả định, bao gồm mất nƣớc, hạn, mặn,
lạnh, nhiệt độ cao và hormone ABA.

Hình 3.14: Biểu hiện của OsNLI-IF trong điều kiện bất lợi.

Ghi chú: (Hình trên) OsNLI-IF mRNA được phát hiện bằng đầu dò gắn
phóng xạ P
32
; rRNA 18S được điện di trên gel agarose. (Hình dưới) Mức
độ biểu hiện OsNLI-IF được xác định bằng Real-time RT-PCR với khuôn là
mẫu RNA tách chiết từ mô thân & lá (cột màu xám) và mô rễ (cột màu đen);
mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử lý stress có giá trị bằng 1; gen
actin được sử dụng làm gen nội chuẩn; giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả
trung bình của 3 lần thí nghiệm.
11

Kết quả phân tích bằng kỹ thuật lai RNA và Real-time RT-PCR
cho thấy OsNLI-IF tăng cƣờng biểu hiện bởi các yếu tố stress mặn,
hạn, mất nƣớc, lạnh, nhiệt độ cao trong mô rễ và không cảm ứng biểu
hiện với ABA (Hình 3.14).
3.2.2. Hoạt tính liên kết đặc hiệu DNA đích của OsNLI-IF
Để chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu DNA của protein
OsNLI-IF, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Y1H với hai đoạn DNA đích
JRC0528 và JRC0332 đột biến (Hình 3.17A). Đoạn gen OsNLI-IF
đƣợc ghép nối với trình tự mã hoá domain hoạt hoá phiên mã AD-
GAL4 trên vector biểu hiện pAD-GAL4 và biến nạp vào tế bào nấm
men chỉ thị YM4271.

Hình 3.17: Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF
Ghi chú: (A) Trình tự các đoạn DNA đích nguyên bản (WT) và đột biến
(MU). (B) Biểu hiện của gen chỉ thị trong tế bào nấm men: (i) sơ đồ bố trí
thí nghiệm các chủng nấm men mang các cấu trúc khác nhau, (ĐC+): đối
chứng dương, (ĐC-): đối chứng âm, (JRC0332-WT, JRC0528-WT,
JRC0332-MU, JRC0528-MU): chủng nấm men chỉ thị mang các đoạn DNA
đích JRC0332 hay JRC0528 được biến nạp vector pAD/OsNLI-IF; (ii) môi

trường YPD; (iii) môi trường SD/-Leu/-Ura/-His; (iv) môi trường SD/-Leu/-
Ura/-His có 3-AT 30 mM; (v) hoạt tính biến đổi cơ chất X-Gal của β-
galactosidase.
Kết quả đánh giá biểu hiện của gen chỉ thị HIS3 và lacZ cho thấy
chỉ có tế bào nấm men tái tổ hợp mang một trong hai đoạn DNA đích
12

nguyên bản có thể sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc và thể
hiện hoạt tính β-galactosidase (Hình 3.17B). Kết quả này chứng tỏ
protein dung hợp AD-OsNLI-IF đã liên kết đặc hiệu với đoạn DNA
chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC và hoạt hoá quá trình phiên
mã của gen chỉ thị.
3.2.3. Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF
Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF đƣợc phân tích bằng
kỹ thuật Y1H. Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc ghép nối vào vector biểu
hiện YEpGAP và biến nạp vào chủng tế bào nấm men chỉ thị
YM4271.

Hình 3.20: Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF
Ghi chú: (A) Sơ đồ bố trí thí nghiệm các chủng nấm men mang các cấu trúc
khác nhau. (B) Môi trường YPD. (C) Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His. (D)
Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His có 3-AT 30 mM. (E) Hoạt tính biến đổi cơ
chất X-Gal của β-galactosidase. (ĐC+): đối chứng dương; (YM4271-WT):
nấm men YM4271 nguyên bản; (OsNLI-IF): nấm men mang
YEpGAP/OsNLI-IF; (JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 +
pLac/JRC0332; (Vector + JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 +
pLac/JRC0332 + YepGAP; (OsNLI-IF + JRC0332): nấm men mang
pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332 + YepGAP/OsNLI-IF.
Kết quả thu đƣợc cho thấy chỉ có chủng nấm men mang đồng
thời YEpGAP/OsNLI-IF và vector chỉ thị chứa đoạn DNA đích

JRC0332 trong vùng điều khiển của gen HIS3 và lacZ có thể sinh
trƣởng trên môi trƣờng chọn lọc và biến đổi cơ chất X-Gal để tạo
thành màu xanh (Hình 3.20D & E). Kết quả này chứng tỏ protein
OsNLI-IF đã tƣơng tác với đoạn DNA đích JRC0332 và hoạt động
13

nhƣ một nhân tố hoạt hoá quá trình phiên mã.
3.2.4. Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF
Protein tƣơng tác với OsNLI-IF đƣợc sàng lọc từ thƣ viện cDNA
xử lý stress hạn và mặn của lúa, sử dụng kỹ thuật Y2H. Đoạn gen
OsNLI-IF đƣợc ghép nối với trình tự mã hoá domain liên kết DNA
BD-GAL4 trên vector biểu hiện pGBKT7 và biến nạp đồng thời cùng
thƣ viện cDNA vào tế bào nấm men AH109 để thực hiện thí nghiệm
sàng lọc gen. Sau khi sàng lọc các thể biến nạp, chúng tôi đã thu
đƣợc tám dòng cDNA dƣơng tính, trong đó có hai dòng mã hóa cho
protein ubiquitin, cho thấy có thể quá trình ubiquitin hóa là một trong
những bƣớc biến đổi sau phiên mã của protein OsNLI-IF (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Protein tƣơng tác OsNLI-IF sàng lọc từ thƣ viện
Protein tƣơng tác OsNLI-IF
Số khuẩn lạc
Polyubiquitin
2
Protein kép chứa domain phosphatase
1
Protein liên kết kẽm, nhóm Alcohol dehydrogenase
1
Protein chƣa đƣợc nghiên cứu
1
Protein liên kết chlorophyll a/b nhóm I, tiền chất của
chloroplast

1
Cyclophilin 2
1
U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase
1

Nhƣ vậy, các thí nghiệm in vivo đã cho thấy OsNLI-IF là một
nhân tố phiên mã đƣợc biểu hiện ở rễ dƣới điều kiện stress hạn, mặn,
lạnh, nhiệt độ cao, mất nƣớc, có thể tƣơng tác với các vùng promoter
chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC, điều hòa quá trình phiên
mã của gen đích và có thể liên quan tới quá trình ubiquitin hóa.
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT
3.3.1. Thiết kế hệ vector chuyển gen pCAMBIA1301
Vector pCAMBIA1301 mang cấu trúc biểu hiện gen 35S:OsNLI-
14

IF:Nos đƣợc thiết kế theo sơ đồ trong hình 2.2, sử dụng vector
pGEM/OsNLI-IF và vector trung gian pRT101 mang promoter 35S.

Hình 3.28:
Kiểm tra

pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS

Ghi chú: (A) Vector pCAM/OsNLI-IF-S; (B) Vector pCAM/OsNLI-IF-AS.
Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI-
Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2: PCR với cặp mồi 35S-Fw/GUS-Rv; giếng 3(A):
PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 3(B): PCR với cặp mồi 35S-
Fw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 4: đối chứng âm (không có DNA khuôn); giếng
5: sản phẩm cắt giới hạn bằng HindIII; giếng 6: vector nguyên bản; giếng

7: sản phẩm cắt giới hạn bằng EcoRI.
Để khẳng định kết quả thu đƣợc, plasmid tái tổ hợp đƣợc tinh sạch
từ các khuẩn lạc dƣơng tính và kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi đặc
hiệu khác nhau và bằng enzyme cắt giới hạn HindIII và EcoRI. Kết
quả điện di sản phẩm PCR và cắt giới hạn cho thấy các băng DNA thu
đƣợc phù hợp với kich thƣớc tính toán lý thuyết (Hình 3.28), chứng tỏ
chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện pCAMBIA1301
mang trình tự có nghĩa (sense) hay đối nghĩa (antisense) của gen
OsNLI-IF, đặt dƣới sự điều khiển của promoter 35S.
3.3.2. Thiết kế hệ vector chuyển gen pBI101
Để thiết kế hệ vector biểu hiện pBI101, gen OsNLI-IF đƣợc nhân
bản bằng phản ứng PCR và ghép nối lần lƣợt vào hai vector pBI-Lip9
và pBI-Ubi đã đƣợc xử lý bằng enzyme cắt đầu bằng SmaI (Hình 2.3).
15


Hình 3.31: Kiểm tra
pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF

Ghi chú: (A) Giếng 1 – 3: khuôn là pBI-Ubi/OsNLI-IF; giếng 4 – 6: khuôn
là pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 1: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Fw;
giếng 2 & 5: PCR với cặp mồi SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 3: PCR
với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/
SmaI-NLI-Fw; giếng 6: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/SmaI-NLI-Rv. (B) Giếng
1 & 2: pBI-Ubi/OsNLI-IF; giếng 3 & 4: pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 1 & 3:
sản phẩm cắt giới hạn bằng SmaI; giếng 2 & 4: vector nguyên bản. Giếng
M: thang chuẩn DNA 1 kb.
Để khẳng định kết quả thu đƣợc, plasmid tái tổ hợp cũng đƣợc
tinh sạch từ các khuẩn lạc dƣơng tính và kiểm tra lần lƣợt bằng PCR
với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau, cắt giới hạn bằng enzyme SmaI

và giải trình tự gen. Kết quả kiểm tra cho thấy trình tự mã hóa cho
nhân tố phiên mã OsNLI-IF đã đƣợc ghép nối thành công vào hệ
vector biểu hiện pBI101, đặt dƣới sự điều khiển của 2 promoter Lip9
và Ubiquitin (Hình 3.31).
3.4. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN
3.4.1. Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây thuốc lá
Thí nghiệm biến nạp cấu trúc 35S:OsNLI-IF và vector
pCAMBIA1301 không mang gen đích vào cây thuốc lá đã đƣợc tiến
hành dựa trên phƣơng pháp chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium. Dựa vào kết quả phân tích các dòng thuốc lá T
1
bằng
phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng có hygromycin và phƣơng
16

pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu của cấu trúc biểu hiện gen, năm dòng
(TL1, TL3, TL4, TL7, TL8) mang cấu trúc 35S:OsNLI-IF và bốn
dòng (ĐC2, ĐC3, ĐC8, ĐC9) mang cấu trúc pCAMBIA1301 đã
đƣợc chọn để tiếp tục phân tích (Bảng 3.7).
Bảng 3.7: Kết quả phân tích PCR các dòng thuốc lá T
1
.
Dòng
cây
Số cây
kiểm tra
Số cây có kết quả PCR dƣơng tính
Mồi Actin
Mồi Hygromycin
Mồi GUS

Mồi OsNLI-IF
TL1
20
20/20
18/20
18/20
18/20
TL3
20
20/20
15/20
15/20
15/20
TL4
20
20/20
20/20
20/20
20/20
TL7
20
20/20
17/20
17/20
17/20
TL8
20
20/20
12/20
12/20

12/20
TL10
20
20/20
18/20
18/20
18/20
ĐC2
10
10/10
8/10
8/10
0/10
ĐC3
10
10/10
6/10
6/10
0/10
ĐC8
10
10/10
8/10
8/10
0/10
ĐC9
10
10/10
10/10
10/10

0/10
TL: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF.
ĐC: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301.
Sự có mặt của protein OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá chuyển
gen T
1
đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch, sử dụng
kháng thể đa dòng của chuột kháng OsNLI-IF (tạo từ protein OsNLI-
IF tái tổ hợp). Kết quả thu đƣợc cho thấy dòng TL1 và TL8 biểu hiện
OsNLI-IF mạnh nhất; dòng TL3 và TL7 biểu hiện vừa phải, dòng
TL10 biểu hiện thấp nhất, dòng TL4 và các dòng thuốc lá đối chứng
hoàn toàn không biểu hiện protein đích (Hình 3.39). Nhƣ vậy, chúng
tôi đã chuyển thành công cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào thuốc lá và thu
đƣợc các dòng cây T
1
có biểu hiện protein đích OsNLI-IF.
Ba dòng thuốc lá TL1, TL4 và TL10 đại diện cho ba mức độ biểu
hiện gen đích OsNLI-IF đƣợc chọn để phân tích khả năng sinh trƣởng
17

và chống chịu stress hạn. Kết quả quan sát các cây thuốc lá ở giai
đoạn bốn tuần tuổi cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về hình
thái và tốc độ sinh trƣởng giữa các cây thuốc lá đối chứng và cây
thuốc lá chuyển gen đích, tuy nhiên tốc độ sinh trƣởng của cây
chuyển gen tỉ lệ nghịch với mức độ biểu hiện của gen OsNLI-IF
(Hình 3.40).

Hình 3.39: Biểu hiện của OsNLI-IF trong cây thuốc lá T
1

Ghi chú: (A) Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1 – 3 & 5 – 7: dịch chiết
protein tổng số của các dòng thuốc lá TL1, TL3, TL4, TL7, TL8, TL10;
giếng 4: protein OsNLI-IF tái tổ hợp (P); giếng 8: dịch chiết protein tổng số
của dòng thuốc lá ĐC8 (V); giếng 9: dịch chiết protein tổng số của cây
thuốc lá không chuyển gen (WT). (B) Đồ thị so sánh hàm lượng protein
OsNLI-IF tương quan giữa các dòng cây; hàm lượng OsNLI-IF trong dịch
chiết protein tổng số của dòng TL10 có giá trị bằng 1.

Hình 3.40: Khả năng sinh trƣởng của các cây thuốc lá T
1

Ghi chú: Hình thái của các dòng thuốc lá sinh trưởng ở giai đoạn 4 tuần
tuổi. (WT) cây thuốc lá dại; (V) dòng thuốc lá mang cấu trúc
pCAMBIA1301; (TL1, TL4, TL10) dòng thuốc lá mang cấu trúc 35S:OsNLI-
IF:Nos.
18

Để đánh giá khả năng chống chịu stress hạn của các dòng thuốc
lá chuyển gen, các cây thuốc chuyển gen T
1
đƣợc trồng trong điều
kiện stress hạn giả định (không tƣới nƣớc) trong một tháng, sau đó
tƣới nƣớc trở lại và quan sát khả năng phục hồi. Kết quả trình bày
trong bảng 3.8 cho thấy dòng TL10 biểu hiện protein OsNLI-IF ở
mức độ thấp có khả năng chống chịu hạn cao nhất (75% cây phục
hồi). Khả năng chịu hạn của dòng thuốc lá TL1 (có gen OsNLI-IF
biểu hiện mạnh) thấp hơn so với dòng thuốc lá TL10 (56% cây phục
hồi). Đặc biệt, tỉ lệ sống sót của các cây thuốc lá có biểu hiện OsNLI-
IF cao hơn rõ rệt so với dòng thuốc lá đối chứng không chuyển gen
(16%) và dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc vector pCAMBIA1301

không mang gen (dòng ĐC2) hay dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu
trúc 35S:OsNLI-IF nhƣng không biểu hiện gen đích.

Bảng 3.8:
Tỉ lệ phục hồi sau xử lý hạn của các dòng thuốc lá.

Dòng thuốc lá
Cấu trúc biểu
hiện gen
Số cây sống sót/Số cây kiểm tra
Tƣới nƣớc
1

Không tƣới
nƣớc
2

Đối chứng
Không chuyển gen
35/35
(100%)
6/36
(16%)
ĐC2
pCAMBIA1301
36/36
(100%)
3/36
(8%)
TL1

35S:OsNLI-IF
35/36
(97%)
20/36
`(56%)
TL4
35S:OsNLI-IF
36/36
(100%)
8/36
(22%)
TL10
35S:OsNLI-IF
36/36
(100%)
27/36
(75%)
Ghi chú:
(1)
Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và tưới nước hàng
ngày;
(2)
Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và không tưới nước
liên tục trong 1 tháng, sau đó tưới nước trở lại liên tục trong 3 ngày.
19

3.4.2. Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong lúa chuyển gen
Để nghiên cứu vai trò của nhân tố phiên mã OsNLI-IF, thí
nghiệm chuyển các vector biểu hiện mang gen OsNLI-IF và không
mang gen vào giống lúa Indica đã đƣợc thực hiện. Trong điều kiện

nhà kính, chỉ có 16 dòng lúa chuyển gen mang cấu trúc Ubi:OsNLI-
IF kết hạt và cho cây T
1
. Dựa trên kết quả phân tích cây chuyển gen,
một số cây lúa chuyển gen T
1
có mang cấu trúc Ubi:OsNLI-IF và
biểu hiện gen kháng hygromycin đã đƣợc xác định (Bảng 3.10).
Bảng 3.10: Kết quả sàng lọc các dòng lúa chuyển gen T
1
.
Tên
dòng
Số hạt
kiểm
tra
Số hạt nảy
mầm trên
Hygromycin
Số cây có kết quả PCR dƣơng tính
Mồi Actin
Mồi Hygromycin
Mồi OsNLI-IF
L1
10
7
7/7
7/7
7/7
L2

10
5
5/5
5/5
5/5
L3
10
8
8/8
6/8
6/8
L4
7
3
3/3
3/3
3/3
L5
10
9
9/9
7/9
7/9
L6
10
4
4/4
3/4
3/4
L7

10
7
7/7
7/7
7/7
L8
10
7
7/7
6/7
6/7
L9
10
5
5/5
5/5
5/5
L10
10
5
5/5
5/5
5/5
L11
8
6
6/6
4/6
4/6
L12

10
3
3/3
3/3
3/3
L13
10
8
8/8
7/8
7/8
L14
10
8
8/8
8/8
8/8
L15
4
3
3/3
3/3
3/3
L16
10
7
7/7
7/7
7/7
Kết quả Real-time PCR xác định mức độ tích luỹ mRNA OsNLI-

IF trong mô của cây lúa chuyển gen T
1
cho thấy OsNLI-IF đã biểu
hiện ở tất cả 16 dòng lúa chuyển gen, chia thành 3 nhóm: biểu hiện
yếu (L1, L3, L5, L6, L7, L8, L10, L11), biểu hiện trung bình (L4, L9,
L 13, L16) và biểu hiện mạnh (L2, L12, L14 và L15 ) (Hình 3.43).
20


Hình 3.43: Mức độ biểu hiện OsNLI-IF trong cây lúa T
1

Ghi chú: Mức độ biểu hiện gen chuyển trong các dòng lúa chuyển gen (L 1 –
L16) và dòng lúa không chuyển gen đối chứng (WT). Mức độ biểu hiện gen
của cây lúa dại có giá trị bằng 1. Gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn.
Giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm.
Trong thí nghiệm không xử lý stress hạn, các cây lúa chuyển gen
T
1
sinh trƣởng bình thƣờng và không thể hiện đặc điểm hình thái
khác biệt rõ rệt nào so với cây không chuyển gen ở giai đoạn 3 lá
mầm, mặc dù tốc độ sinh trƣởng chậm hơn (Hình 3.44). Đặc biệt, thí
nghiệm xử lý điều kiện hạn bằng cách ngừng tƣới nƣớc trong 2 tuần
đã cho thấy tất cả các dòng lúa chuyển gen mang cấu trúc
Ubi:OsNLI-IF đƣợc kiểm tra đều thể hiện tính chịu hạn tốt hơn so
với dòng đối chứng không chuyển gen. Trong thí nghiệm xử lý stress
hạn bằng cách ngừng tƣới nƣớc ba tuần liên tục đối với ba dòng lúa
chuyển gen đại diện cho ba nhóm biểu hiện gen OsNLI-IF ở các mức
độ khác nhau (L1 – biểu hiện gen yếu, L13 – biểu hiện gen trung
bình, L14 – biểu hiện gen mạnh), chỉ có duy nhất dòng L1 phục hồi

và sinh trƣởng trở lại sau stress (Bảng 3.11, Hình 3.45).
Nhƣ vậy, các kết quả nghiên cứu biểu hiện gen OsNLI-IF trong
cây chuyển gen mô hình (thuốc lá và lúa) đã chứng tỏ sự biểu hiện
liên tục của gen OsNLI-IF dƣới sự điều khiển của một promoter hoạt
21

động mạnh (35S hay Ubiquitin) có thể tăng cƣờng khả năng chịu hạn
của các dòng cây chuyển gen và mức độ chống chịu hạn của các
dòng cây chuyển gen tỉ lệ nghịch với mức độ biểu hiện của gen đích.

Hình 3.44: Hình thái cây lúa chuyển gen giai đoạn 3 lá mầm
Ghi chú: (WT) Cây lúa dại không chuyển gen sau 3 tuần gieo hạt. (L1 –
L16) Các dòng lúa chuyển gen T
1
sau 4 – 5 tuần gieo hạt.

Bảng 3.11: Tỉ lệ cây lúa chuyển gen phục hồi sau xử lý hạn.
Tên dòng
Tỉ lệ cây phục hồi
*
Ngừng tƣới nƣớc 2 tuần
Ngừng tƣới nƣớc 3 tuần
WT
0/5
0/5
L1
5/5
3/5
L4
4/5

-
L6
5/5
-
L7
5/5
-
L8
5/5
-
L12
3/5
-
L13
4/5
0/5
L14
4/5
0/5
Ghi chú: (WT) Dòng lúa không chuyển gen; (L1-14) Các dòng lúa
chuyển gen; (*) Số cây phục hồi sau xử lý stress hạn trên tổng số cây
kiểm tra; (-) Không tiến hành thí nghiệm.
22




Hình 3.1: Phục hồi sau stress hạn của cây lúa chuyển gen
Ghi chú: (A) Cây lúa non 3 lá mầm được trồng trong điều kiện không tưới
nước liên tục 2 tuần và tưới nước trở lại trong 3 ngày. (B) Cây lúa non 3 lá

mầm được trồng trong điều kiện không tưới nước liên tục 3 tuần và tưới
nước trở lại trong 3 ngày. WT: cây lúa dại (không chuyển gen); L1, L6 và
L7: các dòng lúa chuyển gen T
1
biểu hiện OsNLI-IF ở mức thấp; L4, L8 và
L13: các dòng lúa chuyển gen T
1
biểu hiện OsNLI-IF ở mức thấp trung
bình; L12 và L14: các dòng lúa chuyển gen T
1
biểu hiện OsNLI-IF ở mức
cao. Hình trái: vị trí sắp xếp các dòng lúa; hình phải: ảnh chụp cây lúa sau
3 ngày tưới nước phục hồi.

23

KẾT LUẬN
- hân lập đƣợc gen OsNLI-IF (mã số NM_001050330.1) từ
thƣ viện cDNA xử lý hạn và mặn của lúa bằng phƣơng pháp lai
phân tử trong tế bào nấm men và nhân dòng thành công vào
vector pGEM-T. Trình tự gen OsNLI-IF phân lập đƣợc có kích
thƣớc 1850 bp, mang vùng không mã hóa đầu 5’ dài 311 bp,
vùng không mã hóa đầu 3’ dài 219 bp và vùng ORF dài 1320 bp
mã hóa cho một chuỗi polypeptide gồm 439 axit amin.
- Nghiên cứu biểu hiện gen trong điều kiện môi trƣờng bất lợi cho
thấy OsNLI-IF cảm ứng với các yếu tố stress hạn, mặn, lạnh và
nhiệt độ cao theo con đƣờng điều hòa không phụ thuộc ABA.
Các nghiên cứu tƣơng tác phân tử trong tế bào nấm men chứng tỏ
OsNLI-IF là một nhân tố phiên mã có khả năng liên kết đặc hiệu
với đoạn DNA chứa hai motif CCTCCTCC & CTCCAC, hoạt

hóa quá trình phiên mã của gen đích và tƣơng tác với protein
ubiquitin.
- Đã thiết kế thành công các cấu trúc biểu hiện gen OsNLI-IF trong
tế bào thực vật, đƣợc điều khiển bởi promoter hoạt động liên tục
35S Ubiquitin và promoter hoạt động cảm ứng điều kiện stress
Lip9. Các vector biểu hiện gen OsNLI-IF đã đƣợc biến nạp vào
vi khuẩn Agrobacterium chủng LBA4404 để phục vụ cho nghiên
cứu chuyển gen thực vật.
- Đã chuyển thành công cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào thuốc lá, cấu
trúc Ubi:OsNLI-IF vào lúa và đã xác định đƣợc sự có mặt của
cấu trúc biểu hiện gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen T
0

và T
1
bằng phƣơng pháp PCR và sàng lọc trên môi trƣờng nuôi
cấy có Hygromycin. Biểu hiện của gen chuyển OsNLI-IF trong