tóm tắt luận án tiến sĩ Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Trần Thị Sao Mai

NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH
CÁC ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN
TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62420107

(DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN
TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2014


Cơng trình đƣợc hồn thành tại:
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ KHÁNH TRÂM
2. TS. LÊ QUANG HÒA

Phản biện : .........................................................................
Phản biện : .........................................................................
Phản biện : .........................................................................

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia

chấm Luận án Tiến sĩ họp tại...................................................
vào hồi giờ ngày
tháng
năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm thông tin Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Ngộ độc thực phẩm đã có từ lâu và hiện vẫn xảy ra ở nhiều nơi trên thế
giới cũng nhƣ ở Việt Nam làm ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe con ngƣời và
kinh tế xã hội. Theo cơ quan Quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ
(FDA), hiện tại mỗi năm trên thế giới vẫn có khoảng 76 triệu ca ngộ độc
thực phẩm (NĐTP) với 325 nghìn ngƣời phải nhập viện và khoảng 5 nghìn
ngƣời chết vì NĐTP. Nguyên nhân gây ra NĐTP có thể từ hóa chất, vi sinh
vật, độc tố tự nhiên hoặc không rõ nguyên nhân nhƣng ghi nhận từ thực tế
các vụ NĐTP đã xảy ra cho thấy nguyên nhân chính là do thực phẩm bị
nhiễm vi sinh vật. Trong số các tác nhân từ vi sinh vật gây NĐTP thì
Staphylococcus aureus (S.areus) là một trong những vi khuẩn gây ngộ độc
phổ biến nhất. S. aureus là vi khuẩn hình cầu, Gram dƣơng, phân bố rải rác
trong tự nhiên nhƣng chủ yếu đƣợc phân lập từ da, tóc, màng nhày, mũi của
ngƣời và gia súc. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu đƣợc định nghĩa là sự tiêu
thụ các độc tố đƣờng ruột, vốn đã tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng
tụ cầu có coagulase dƣơng tính, đặc biệt là S. aureus tổng hợp nên.
Các phƣơng pháp phân tích độc tố ruột tụ cầu (Staphylococcus
Enterotoxin – SE) trong thực phẩm hiện nay còn nhiều bất cập do tính phức
tạp trong sử dụng, giá thành cũng nhƣ yêu cầu về trang thiết bị. Phƣơng pháp

tiêu chuẩn để phát hiện SE trong thực phẩm hiện nay là phƣơng pháp
ELISA. Trên thị trƣờng thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện
các SE trong thực phẩm nhƣ TRANSIA, RIDASCREEN, TECRA và
VIDAS. Nguyên tắc của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên kỹ thuật ELISA
kẹp đơi. Tồn bộ quy trình phân tích này thƣờng kéo dài từ 90 phút đến 4
giờ. Ngƣỡng phát hiện của các bộ sinh phẩm này thƣờng dao động từ 0,1-5
ng/g hoặc ml mẫu tùy thuộc vào loại thực phẩm phân tích. Tuy nhiên, một
trong những nhƣợc điểm cơ bản của các bộ sinh phẩm này là cần một máy
đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết quả. Yêu cầu này hạn chế đáng kể
khả năng phân tích hiện trƣờng của các bộ sinh phẩm. Mặt khác, giá thành
của các bộ sinh phẩm nhập ngoại rất đắt, quy trình phân tích khá phức tạp.
Xu hƣớng trên thế giới hiện nay là phát triển các phƣơng pháp phân tích
1


nhanh, dễ sử dụng để phân tích sàng lọc một số lƣợng lớn mẫu ngay tại hiện
trƣờng. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới đã thành công trong việc
phát triển que thử phát hiện SE dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch nhằm đơn
giản hóa và rút gọn thời gian phân tích xuống cịn 30 phút. Hơn nữa, tại Việt
Nam việc kiểm định an toàn thực phẩm phần lớn mới chỉ dừng lại ở việc
phát hiện vi khuẩn tụ cầu mà chƣa phân tích tới SE, nguyên nhân chính gây
NĐTP do tụ cầu. Từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu
tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong
thực phẩm”.
Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài luận án là phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ
thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện nhanh các SE từ SEA đến SEE trong
thực phẩm.
Nội dung nghiên cứu của đề tài
- Sản xuất và tinh sạch SE tái tổ hợp SEA, SEC1 và ứng dụng để phát

triển que thử;
- Sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng: IgY kháng BSA và
IgY kháng các SE (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE), ứng dụng để
tạo que thử ;
- Nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình cố định kháng thể lên que thử;
- Nghiên cứu xác định độ nhạy của que thử.
Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
Đến nay, ở nƣớc ta việc đánh giá rủi ro vi sinh vật đối với S. aureus
chỉ dựa vào việc xác định và định lƣợng tụ cầu có phản ứng coagulase dƣơng
tính đƣợc phân lập trong các sản phẩm thực phẩm, phƣơng pháp này cần
nuôi cấy vi khuẩn trong phịng thí nghiệm và thời gian để trả lời kết quả
khoảng 1 tuần. Tuy vậy, kết quả phân tích chỉ cho thấy trong mẫu thực phẩm
có vi khuẩn tụ cầu vàng hay khơng mà khơng tìm ra có độc tố do vi khuẩn
tiết ra, là nguyên nhân thực sự gây NĐTP do tụ cầu. Kết quả nghiên cứu của
đề tài luận án đã giải quyết hạn chế này. Việc tạo ra que thử đã phát hiện
đƣợc các SE với thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ sử dụng, thích hợp
với các phân tích hiện trƣờng khơng cần các thiết bị phức tạp, đắt tiền. Các
nguyên liệu chính để sản suất que thử (các kháng nguyên và kháng thể) đều
2


đƣợc chúng tôi chủ động tạo ra. Kết quả của đề tài luận án góp phần vào việc
kiểm sốt tốt hơn các độc tố ruột tụ cầu, qua đó giảm thiểu các vụ NĐTP và
số ngƣời bị NĐTP do tụ cầu vàng gây ra, nâng cao sức khỏe cộng đồng.
Điểm mới của luận án
Kết quả nghiên cứu nổi bật của đề tài luận án là đã tạo ra que thử phát
hiện đƣợc các SE từ SEA đến SEE qua việc sản xuất đƣợc kháng nguyên tái
tổ hợp SEA, SEC1 và việc sản xuất, tinh sạch đƣợc kháng thể lòng đỏ trứng
gà (IgY) kháng BSA, kháng thể IgY kháng các đƣợc tố ruột tụ cầu (SEA,
SEB, SEC1, SED, SEE).

Cấu trúc của luận án
Ngoài phần mở đầu và kết luận, kiến nghị, luận án gồm 3 chƣơng:
- Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu
- Chƣơng 2: Đối tƣợng, vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
- Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận
- Phần phụ lục: Một số kết quả và hình ảnh nghiên cứu
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỤ CẦU KHUẨN
1.1.1. Đặc điểm sinh học của tụ cầu khuẩn
Tụ cầu khuẩn còn gọi là tụ cầu vàng - Staphylococcus aureus là những
cầu khuẩn có đƣờng kính từ 0,8-1,0 μm và xếp lại với nhau thành hình chùm
nho, bắt màu Gram dƣơng, coagulase và catalase dƣơng tính, khơng có lơng,
khơng có vỏ, khơng sinh nha bào [1].
1.1.2. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu vàng
Ở các điều kiện thông thƣờng, tụ cầu vàng phát triển đạt số lƣợng khoảng
6
10 cfu/g là đã có thể tạo ra độc tố. Tụ cầu cần có những axit amin khác nhau
cho quá trình sinh trƣởng và sản sinh độc tố [82]. Nhiệt độ tối thiểu cho sản
sinh độc tố ruột tụ cầu là 100C và nhiệt độ tối đa là 480C, khoảng tối ƣu là từ
40 đến 450C [97]. Nồng độ muối tối đa cho sự sản xuất độc tố là dƣới 12%,
nhƣ vậy nếu nồng độ muối từ 12% trở lên thì sự sản xuất độc tố tụ cầu sẽ bị
ức chế [82]. Điều kiện thích hợp nhất cho q trình hình thành độc tố là pH
trung tính, q trình này bị giảm hay bị ức chế ở pH axit.
3


1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU VÀNG
1.2.1. Đặc điểm sinh hóa, lý hóa và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu
Cho đến nay, ngƣời ta đã thống kê đƣợc ít nhất có 21 loại SE, có bản
chất là những chuỗi protein đơn có khối lƣợng phân tử thấp (khoảng từ 22

đến 29 kDa), mỗi chuỗi có những vị trí kháng nguyên chuyên biệt. Các độc
tố này dễ tan trong nƣớc và trong các dung dịch muối. Đặc biệt, các SE đƣợc
mơ tả hầu hết là có tính ổn định cao, chúng có tính chịu nhiệt và khơng bị
protease thông thƣờng nhƣ pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain, … thủy
phân vì thế chúng giữ nguyên đƣợc cấu trúc trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời
[82].
1.2.2. Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu
Hoạt tính sinh học của SE bao gồm hoạt tính siêu kháng nguyên
(superantigen) và hoạt tính gây nơn. Hoạt tính siêu kháng ngun: gây sốt,
kích hoạt hệ miễn dịch và tăng nhanh số lƣợng tế bào T khơng chun biệt.
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU
1.3.1 Phép thử sinh học
Nguyên tắc của các phép thử sinh học dựa trên việc phân tích khả năng
gây các triệu chứng điển hình nhƣ nơn, tiêu chảy trên các động vật thí
nghiệm hoặc hoạt động siêu kháng nguyên trong nuôi cấy tế bào. Liều lƣợng
SE tối thiểu cần sử dụng là khoảng 200 ng [80].
1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
Các phản ứng PCR thƣờng dùng là uniplex và multiplex PCR và gần
đây là real-time PCR [24, 40, 85].
1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch
Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất hiện nay để phát hiện SE
trong thực phẩm là các phƣơng pháp miễn dịch. Những phƣơng pháp này
bao gồm: phƣơng pháp khuếch tán trên gel, phƣơng pháp ngƣng kết hạt latex
– RPLA sử dụng các bộ kit RPLA và phƣơng pháp ELISA [40].
1.4. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG
4


1.4.1. Cấu trúc và phân loại của hệ thống sắc ký miễn dịch
Cấu trúc của hệ thống sắc ký miễn dịch (HTSKMD) thƣờng gồm các

hợp phần đƣợc biểu diễn trong Hình 1.1 dƣới đây [69]:

Hình 1.1. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch
Kỹ thuật sắc ký miễn dịch thƣờng đƣợc chia làm hai loại chính là sắc
ký miễn dịch kẹp đôi và sắc ký miễn dịch cạnh tranh.

- Sắc ký miễn dịch kẹp đơi: tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể
thứ hai (khác với kháng thể cộng hợp có màu) có khả năng bắt cặp với kháng
nguyên cần phân tích đƣợc cố định. Nếu các độc tố có mặt trong mẫu phân
tích, chúng sẽ tƣơng tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng
nguyên-kháng thể cộng hợp có màu. Dƣới tác dụng của lực mao quản, dung
dịch sẽ chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể và
kháng nguyên cố định. Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp khi
chuyển động đến vị trí vạch thử nghiệm sẽ bị giữ lại nhờ liên kết của kháng
thể vạch thử nghiệm với kháng nguyên. Sự xuất hiện của vạch thử nghiệm
đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố ruột tụ cầu. Nhƣ vậy, trong trƣờng
hợp dƣơng tính (có độc tố trong mẫu phân tích) sẽ xuất hiện hai vạch màu.
Ngƣợc lại trƣờng hợp âm tính chỉ có một vạch màu. Ƣu điểm của sắc ký
miễn dịch kẹp đôi là độ nhạy và độ đặc hiệu cao do sử dụng tới hai kháng
thể có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng ngun ở những vị trí khác nhau
mà khơng gây cản trở về mặt khơng gian. Nhƣợc điểm của nó là khó có khả
năng phát hiện đƣợc cả 5 loại độc tố tụ cầu phổ biến hiện nay: SEA, SEB,

5


SEC, SED, SEE do trên thị trƣờng chƣa có một cặp kháng thể nào có thể bắt
cặp với cả 5 loại kháng nguyên trên.
- Sắc ký miễn dịch cạnh tranh:
+ Dạng 1: tại vị trí vạch thử nghiệm, kháng nguyên (hoặc một biến thể

của kháng nguyên) đƣợc cố định. Nếu độc tố có mặt trong mẫu phân tích,
chúng sẽ tƣơng tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng
nguyên-kháng thể cộng hợp. Dƣới tác dụng của lực mao quản, dung dịch sẽ
chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa kháng nguyên cố định.
Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp khi chuyển động đến vị trí vạch
thử nghiệm sẽ không bị giữ lại do các vị trí liên kết đặc hiệu của kháng thể
đã bị bão hịa bởi kháng ngun trong mẫu phân tích. Do đó, sự không xuất
hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố đƣờng
ruột tụ cầu. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp dƣơng tính, có độc tố trong mẫu phân
tích, thì sẽ xuất hiện một vạch màu ở vị trí vạch kiểm chứng. Ngƣợc lại, mẫu
âm tính sẽ có hai vạch màu ở cả vị trí vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng.
+ Dạng 2: Tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể có khả năng bắt
cặp với kháng nguyên cần phân tích đƣợc cố định. Trong trƣờng hợp này,
cộng hợp sẽ là kháng nguyên gắn với hạt nano vàng hoặc nano carbon. Nếu
độc tố khơng có mặt trong mẫu phân tích thì khi dung dịch chuyển động lên
trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể cố định, kháng nguyên cộng
hợp sẽ tƣơng tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng
ngun cộng hợp có màu ở vị trí vạch thử nghiệm. Sự xuất hiện vạch thử
nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không chứa độc tố ruột của tụ cầu.
Ngƣợc lại, nếu trong mẫu phân tích có độc tố ruột tụ cầu thì chúng cạnh
tranh với kháng nguyên cộng hợp về việc bị giữ lại ở vị trí vạch thử nghiệm.
Chính vì vậy, sự khơng xuất hiện vạch màu đồng nghĩa với việc mẫu thử có
chứa độc tố ruột tụ cầu.
Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký miễn
dịch cạnh tranh dạng 2 để ứng dụng sản xuất que thử phát hiện 5 loại độc tố
(SEA-SEE) trong thực phẩm. Các ƣu điểm của phƣơng pháp sắc ký miễn
6


dịch cạnh tranh để phát hiện 5 loại độc tố SEA, SEB, SEC1, SED, SEE bao

gồm: đơn giản hóa quy trình phát triển que thử do chỉ cần sử dụng một
kháng thể.
1.4.2. Một số nghiên cứu chế tạo que thử để phát hiện độc tố ruột tụ cầu
trong thực phẩm
Năm 2009, trong nghiên cứu của Boyle và các cộng sự tạo que thử
phát hiện SEB trong sữa với ngƣỡng phát hiện nằm trong khoảng từ 500
ng/ml đến 5 µg/ml [19]. Khi sử dụng máy đo từ để phát hiện tín hiệu, que
thử có thể phát hiện đƣợc nồng độ độc tố SEB trong các sản phẩm sữa thấp
từ 5 đến 0,25 ng/ml. Năm 2013, Keiko Yamada tạo que thử phát hiện SEA
với độ nhạy cao, phát hiện đƣợc nồng độ thấp đến 0,2 ng/ml [83].
1.5. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY) VÀ ỨNG DỤNG
CỦA IgY
Kháng thể lòng đỏ trứng IgY đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp gây
miễn dịch cho gà mái để thu kháng thể đặc hiệu từ trứng gà.
Hiện nay, một số phƣơng pháp tách chiết và tinh chế IgY gà đã đƣợc
mơ tả và có thể đƣợc chia thành hai nhóm chính: Phƣơng pháp kết tủa: liên
quan đến amoni, natri sulfat, natriclorua [65, 71], polyetylenglycol (PEG),
axit caprylic và caragenean [71]; Phƣơng pháp sắc ký: sắc ký ái lực, sắc ký
trao đổi ion, sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc, sắc ký tƣơng tác thiophylic, và sắc ký
gel lọc [71].
1.6. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU
1.6.1. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu từ S. aureus và từ phƣơng pháp tái tổ
hợp
Việc sản xuất độc tố tái tổ hợp biểu hiện trên E. Coli các độc tố ruột tụ
cầu ở dạng dung hợp với đi His hoặc đi GST nên có thể giúp đơn giản
hóa quy trình tinh sạch. Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng đã
sản xuất thành công độc tố SEA tái tổ hợp với đuôi GST. Vector đƣợc sử
dụng là pGEX-6P-1 và chủng E. Coli BL21 để biểu hiện protein. Sau khi
7

tinh sạch bằng bộ kit GST SpinTrap, protein tƣơng ứng có kích thƣớc 53
kDa ở dạng dung hợp với GST đã đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di
SDS-PAGE [3].
1.6.2. Phƣơng pháp tinh sạch độc tố ruột tụ cầu
Đã có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong việc tinh sạch SE nuôi
trực tiếp từ tụ cầu vàng: tinh sạch bằng trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, điện
phân, sắc ký Dye ligand, HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) và FPLC (sắc
ký lỏng nhanh protein). Phƣơng pháp sắc ký ái lực có thể cho phép thu
protein đích bằng một bƣớc duy nhất, với độ tinh sạch lên tới hơn 90%. Đi
His có ái lực cao với Ni2+ do có vịng thơm imidazole, vì thế protein dung
hợp với đi His đƣợc giữ lại trên cột sắc ký chứa các hạt resin có gắn Ni2+,
cịn những protein khơng mong muốn sẽ ra khỏi cột này.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Các SE (SEA, SEB, SEC, SED và SEE) của Toxin Technology, Mỹ.
- Gà Leghorn trắng, 1 ngày tuổi, cân nặng 35-40g, có nguồn gốc từ
Cơng ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì.
- Kháng thể lòng đỏ trứng IgY thu đƣợc từ trứng gà Leghorn trắng tự
nuôi và đƣợc gây miễn dịch bằng các độc tố ruột tụ cầu và BSA.
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1. Vi sinh vật và plasmid
- Tế bào S.aureus mang gen sec1 đƣợc cung cấp bởi phòng Vi sinh,
Viện Dinh dƣỡng Quốc gia.
- Tế bào vi khuẩn E. coli khả biến BL21 mua của Biolab.
- Plasmid pGEX-6P-1-sea, mang gen mã hóa SEA ở dạng dung hợp
với đi GST (glutathione-S-transferase) đƣợc cung cấp bởi phịng cơng
nghệ gen, Viện Cơng nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học
Bách Khoa Hà Nội.

8


- Plasmid pGS-21a (Genescript), dùng làm vector biểu hiện cho nhân
dịng và biểu hiện gen sec1
2.2.2. Hóa chất và sinh phẩm
Các mơi trƣờng, sinh phẩm, các hóa chất, dung mơi, các dụng cụ, vật
tƣ tiêu hao chuyên biệt của phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử nhƣ
các mơi trƣờng ni cấy, các kháng thể đơn dịng, các hóa chất nhập khẩu từ
nƣớc ngồi, màng lọc, các dãy giếng ELISA,….
2.2.3. Máy, thiết bị:
Các máy và thiết bị chuyên dụng nhƣ máy ly tâm, tủ ổn nhiệt, bộ điện
di,… có ngồn gốc từ Mỹ, Đức và Trung Quốc.
2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S.aureus
Sử dụng các chất tẩy rửa (SDS, CTAB) và chloroform làm biến tính
thành tế bào, protein dạng Histon và polysaccharide của S. aureus. Sau đó bổ
sung lysozyme, protease K phá vỡ thành tế bào và liên kết peptid . Bổ sung
EDTA ức chế hoạt động của Dnase và nồng độ muối CH3COONa cao hỗ trợ
cho việc kết tủa DNA. Sau khi ly tâm, hút lớp dung môi phân cực phía trên
chứa DNA và thêm ethanol 1000, 1 giờ, nhiệt độ phòng. DNA kết tủa thu
đƣợc sau khi ly tâm tiếp tục đƣợc rửa trong ethanol 700 trƣớc khi hòa tan
trong đệm TE (Tris-EDTA).
2.3.2. Kỹ thuật PCR
Gen sec1 đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc
hiệu (SEC-F và SEC-R) có gắn vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn BamHI và
HindIII. Trong đó, các thành phần của phản ứng PCR đã đƣợc chuẩn hóa với
tổng thể tích là 50 µl và chu trình nhiệt nhƣ sau: biến tính ở 950C, 4 phút và
q trình nhân bản với 35 chu kỳ, kéo dài thêm ở 720C, 5 phút và bảo quản
ở 100C. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: biến tính ở 950C, 30 giây, gắn mồi ở 550C,

30 giây và kéo dài chuỗi ở 720C, 1 phút. Sản phẩm PCR sau khi tổng hợp
đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose.
2.3.3. Thu nhận DNA từ gel agarose
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch GeneJET Gel Extraction
Kit (Fermentas) theo phƣơng pháp của nhà sản xuất.

9


2.3.4. Phƣơng pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn và nối với vector tạo
dòng
Gen sec1 (sản phẩm PCR sau khi tinh sạch) đƣợc cắt bằng enzyme
giới hạn là BamHI và HindIII và kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel
agarose 0,8%.
Sau khi làm tan các hóa chất (trừ T4 DNA ligase) ở nhiệt độ thƣờng,
tiến hành đảo trộn bằng máy vortex và ly tâm góp mẫu.
2.3.5. Phƣơng pháp biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.Coli
BL21
Phƣơng pháp này làm theo hƣớng dẫn của nhà cung cấp tế bào khả
biến E.Coli BL21.
2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào E. coli và chuẩn bị dịch protein thô
Các dịng tế bào chuyển gen đƣợc ni cấy trong mơi trƣờng LB lỏng
có bổ sung thêm 100 mg/L ampicillin. Canh trƣờng đƣợc ni ở 370C trong
điều kiện lắc 150 vịng/phút cho đến khi OD600nm đạt khoảng 0,8 thì bổ sung
chất cảm ứng IPTG và tiếp tục nuôi cấy ở các điều kiện thí nghiệm về nhiệt
độ (160C, 300, 370), thời gian (từ 2h, 5h, 7h, 8h) và chất cảm ứng từ 0,05 đến
1mM IPTG.
2.3.7. Phƣơng pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực GST
Trong nghiên cứu này, bộ kit GST SpinTrap (GE Healthcare) đã đƣợc
sử dụng để tinh sạch SEA ở dạng dung hợp với GST.

2.3.8. Phƣơng pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực His
Tiến hành tinh sạch protein theo kit His Mag SepharoseTM Ni để thu
đƣợc protein tinh sạch cho độ tinh khiết cao theo hƣớng dẫn của nhà sản
xuất.
2.3.9. Phƣơng pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE)
Điện di biến tính protein bằng SDS-PAGE (12,5%) đƣợc tiến hành
theo các phƣơng pháp của Laemmli.
2.3.10. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
Để đánh giá lƣợng SEA trong dịch chiết protein thô, phƣơng pháp
ELISA kẹp đôi đã đƣợc sử dụng.
2.3.11. Phƣơng pháp định lƣợng protein bằng OD
10


Nguyên tắc của phƣơng pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím
cực đại ở bƣớc sóng 280nm.
2.3.12. Phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà
Gây miễn dịch cho gà để sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và
kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE)
theo quy trình sản xuất kháng thể IgY đặc hiệu của Agro-Bio 2011.
2.3.13. Phƣơng pháp tinh sạch kháng thể IgY gây kết tủa phân đoạn
bằng PEG
Tinh sạch kháng thể bằng phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn bằng
PEG 6000 theo mô tả của Polson 1980.
2.3.14. Phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng pha loãng trong nƣớc, chỉnh
pH và gây kết tủa bằng Natri clorua
Tinh sạch theo phƣơng pháp pha loãng trong nƣớc chỉnh pH và gây
kết tủa bằng Natri clorua đƣợc Petr Hokder tối ƣu hóa năm 2013.
2.3.15. Phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng cột “ Hi Trap IgY Purification
HP”

Tinh sạch IgY theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất GE Healthcare BioSciences AB.
2.3.16. Cố định IgY kháng BSA và IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE
(A+B+C1+D+E) lên màng nitrocelullose
Màng nitrocelullose AE99 (Whatman) đƣợc cố định lên các lá vinyl
Mylar AD back 79373 (Whatman). Kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể
IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) đƣợc phun lên trên
màng nitrocellulose lần lƣợt ở vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm bằng
thiết bị Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ). Sau khi gắn thêm giấy thấm, màng
đƣợc cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm bằng máy cắt Cutter 4000
(Biodot, Anh).
2.3.17. Chuẩn bị phức hợp phát hiện kháng nguyên - nanocarbon
Kháng nguyên tinh sạch SEC1 ở dạng dung hợp đƣợc gắn với hạt
nanocarbon ở trạng thái huyền phù theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi nhà
sản xuất Maiia Diagnostics.
11


2.3.18. Phân tích mẫu bằng que thử
Mỗi mẫu phân tích có từng loại độc tố SEA, SEB, SEC1, SED, SEE
với nồng độ khác nhau đƣợc pha trong 100 µl dung dịch đệm chạy và đƣợc
đƣa vào giếng. Tiếp đó, cắm que thử vào giếng và ủ trong 15 phút. Sau đó,
bổ sung kháng ngun cộng hợp. Kết quả âm tính sẽ ứng với việc xuất hiện
vạch, kết quả dƣơng tính ứng với việc khơng xuất hiện vạch tại vị trí vạch in
kháng thể.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU
3.1.1. Sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp SEA
3.1.1.1. Biến nạp plasmid mang gen mã hóa SEA vào tế bào E.Coli
Plasmid pGEX-6P-1-sea mang gen mã hóa SEA đƣợc biến nạp vào tế bào E.

coli khả biến bằng phƣơng pháp sốc nhiệt trên mơi trƣờng LB có bổ sung
ampicillin
3.1.1.2.Chọn dịng các chủng mang gen mã hóa SEA
Sau khi tiến hành biến nạp và thu nhận các dòng tế bào E. coli đƣợc
chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc các dòng tế bào E. coli để chọn
ra những dòng tạo độc tố ruột SEA nhiều nhất bằng việc sử dụng kỹ thuật
ELISA kẹp đôi để đánh giá lƣợng SEA đƣợc tạo ra trong canh trƣờng nuôi
cấy. Sau khi chọn đƣợc 5 dòng khuẩn lạc cho khả năng sinh SEA cao nhất,
chúng tơi tiến hành lặp lại quy trình trên có tính đến nồng độ protein trong
mỗi mẫu để tìm ra khuẩn lạc có khả năng sinh SEA cao nhất là dịng tế bào
số 2.
3.1.1.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA
Tiến hành khảo sát trên ba yếu tố là nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng và
thời gian cảm ứng, lựa chọn nuôi ở hai nhiệt độ là 300C và 160C. Quy trình
ni cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ trong q trình sàng lọc, ni tế bào
trong môi trƣờng LB lỏng tới khi đạt OD600 = 0.8 thì thêm chất cảm ứng
IPTG với các nồng độ tƣơng ứng là 0,25mM, 0,5mM và 1mM, sau đó tiến
hành lấy mẫu ở các mốc thời gian: với nhiệt độ 300C, thời gian lấy mẫu là
2h, 5h, 7h; với nhiệt độ là 160C, thời gian lấy mẫu là 12h, 16h,19h.

12


Hình 3.1. Đồ thị tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA
Trong các điều kiện nuôi cấy đã đƣợc thử nghiệm, điều kiện tốt nhất
cho sinh tổng hợp protein tái tổ hợp là ở 300C, nồng độ chất cảm ứng là
1mM và thời gian cảm ứng là 5h.
3.1.1.4. Tinh sạch SEA từ dịch chiết protein thô
Tinh sạch theo phƣơng pháp sắc ký ái lực để thu đƣợc SEA ở dạng
tinh khiết. Để kiểm tra về kích thƣớc của protein thu đƣợc trong dịch rửa

giải, chúng tôi tiến hành điện di theo phƣơng pháp điện di biến tính protein
SDS-PAGE. Kết quả điện di đã thể hiện rõ: trong dịch rửa giải có sự xuất
hiện một vạch protein với khối lƣợng trong khoảng từ 50-60 kDa khi so sánh
với thang protein chuẩn, kết quả này là phù hợp với protein mà chúng tôi
mong đợi là SEA trong trạng thái dung hợp với GST có khối lƣợng là 53
kDa.
Hình 3.2. Điện di đồ protein SEA
tái tổ hợp sau tinh sạch
Ghi chú: 1: Dịch chiết protein
thô, tế bào E. coli không qua biến
nạp; 2: Dịch chiết protein thô, tế
bào E. coli đã qua biến nạp; 3:
Dịch rửa giải thu được từ quá
trình tinh sạch; 4: Thang chuẩn
protein.

13


3.1.2. Sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp SEC1
3.1.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ Staphylococcus aureus
Hình ảnh điện di kiểm tra kích thƣớc DNA tổng số của chủng
Staphylococcus aureus cho thấy có 1 băng sáng rõ có kích thƣớc lớn ở trên
cao chính là DNA tổng số của S. aureus. Điều này chứng tỏ DNA tổng số
sau khi tách chiết khơng bị đứt gãy, cịn nguyên vẹn nên đƣợc chúng tôi
dùng làm khuôn trong phản ứng PCR khuếch đại gen sec1.
Hình 3.3. Điện di đồ DNA tổng số
của chủng Staphylococcus aureus
Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn 1kb;
1-5: DNA tổng số S.aureus

3.1.2.2. Kết quả khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR
Từ cơ sở nguồn DNA tổng số tách từ chủng S.aureus, chúng tôi tiến
hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R để
khuếch đại gen sec1 khoảng 801 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra
trên gel agarose 1,2%.
Hình 3.4.Điện di đồ sản phẩm PCR
trên gel agarose 1,2%
Ghi chú: Kênh M: Thang DNA
chuẩn 1kb; 1, 2: Đoạn gen sec1

Kết quả điện di cho thấy với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đã
thu đƣợc đoạn DNA đặc hiệu, rõ nét khơng có vạch phụ k m theo, có kích
thƣớc khoảng 801 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi. Do
vậy, sản phẩm PCR này đƣợc chúng tôi sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pGS-21amang gen sec1
14


Sản phẩm PCR sau khi đƣợc xử lý bằng hai enzymegiới hạn BamHI
và HindIII đƣợc tinh sạch theo quy trình bộ kit GeneJET PCR Purification
Kit (Fermentas) và sản phẩm sẽ là nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu
hiện.
Tiến hành cắt mở vòng plasmid pGS-21a bằng hai enzym giới hạn
BamHI và HindIII trong 3 giờ ở 370C để tạo vết cắt giống với đoạn gen sec1
sẽ đƣợc cài vào. Vector sau khi mở vòng bằng hai enzyme là một băng duy
nhất có kích thƣớc khoảng 6169 bp tƣơng ứng với kích thƣớc của vector
pGS-21a nhƣ trong lý thuyết.
Hình 3.5. Điện di đồ plasmid
pGS-21asau khi cắt bằng enzym
cắt giới hạn

Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn
1kb; 1, 2: vector pGM-1 mở vòng

Sau khi mở vịng và tinh sạch vector pGS-21a, chúng tơi ghép nối
vector này với gen sec1 nhờ xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối
là Plasmid pGM-1-sec1 sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli BL21.
3.1.2.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein tái tổ hợp SEC1
Plasmid pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu SEC1
đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli khả biến bằng phƣơng pháp sốc nhiệt, sau
đó, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên mơi trƣờng có ampicillin. Để nghiên
cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành
công đƣợc nuôi cấy trong mơi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin,
lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 370C cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8 thì bổ
sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và nuôi tiếp ở 300C trong
5 giờ. Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã đƣợc phân tích trên gel
polacrylamide và cho thấy sự xuất hiện của một băng protein với cƣờng độ
đậm, có trọng lƣợng phân tử trong khoảng từ 42,7– 66,2 kDa khi so sánh
với thang protein chuẩn, kết quả này là phù hợp với protein SEC1 mà chúng
tơi đã tính tốn trên lý thuyết.
15


Hình 3.6. Điện di đồ biểu hiện gen
SEC1 trong protein tổng số của các
tế bào E.coli BL21
Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1:
Đối chứng âm (protein tổng số trong
dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli
BL21); 2: Protein trong dịch chiết
dòng E. coli đã biến nạp được cảm

ứng IPTG.

3.1.2.5. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen sec1
Để xác định đƣợc điều kiện tối ƣu, chúng tôi đã tiến hành thử biểu
hiện gen ở các điều kiện nồng độ chất cảm ứng IPTG, nhiệt độ, thời gian
cảm ứng khác nhau. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein
SEC1 tái tổ hợp ở các điều kiệnnồng độ chất cảm ứng IPTG (0,05 -1 mM),
nhiệt độ (300C và 370C) và thời gian (2 giờ, 5 giờ và 8 giờ). Dịch chiết thu
đƣợc sau khi phá tế bào đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel acrylamide
12%. Hình ảnh điện di trên gel polyacrylamide cho thấy điều kiện tốt nhất
cho sinh tổng hợp protein tái tổ hợp SEC1 là ở 300C, nồng độ chất cảm ứng
IPTG là 0,3mM và thời gian cảm ứng là 8h.
Hình 3.7. Điện di đồ protein SEC1 biểu hiện
ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian với nồng
độ IPTG 0,3mM.

Ghi chú: 1: Thang protein chuẩn, 2-8:
điều kiện nhiệt độ và thời gian lần lượt
là: 8h, 370C; 8h300C; 5h,370C; 5h,300C;
2h, 370C; 2h,300C, 0h

3.1.2.6. Tinh chế protein tái tổ hợp SEC1

Chúng tôi tinh sạch protein tái tổ hợp theo phƣơng pháp sắc ký ái lực
sử dụng bi từ HisMag SepharoseTM Ni để thu đƣợc SEC1 ở dạng tinh khiết.
16


Kết quả phân tích SDS-PAGE cho thấy protein SEC1 thu nhận đƣợc có độ
tinh sạch cao, khơng tạp nhiễm các protein của vi khuẩn.

Hình 3.8. Điện di đồ protein SEC1 tái
tổ hợp sau tinh sạch
Ghi chú:
Kênh 1,4 : Protein trước khi tinh sạch;
Kênh 2,3: Protein sau khi tinh sạch;
M: Marker.

3.2. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IGY
3.2.1. Kết quả tinh sạch kháng thể IgY
Chúng tôi lựa chọn tách chiết IgY bằng hai phƣơng pháp sau: phƣơng
pháp tách phân đoạn bằng nƣớc và muối natri clorua đã đƣợc tối ƣu hóa
năm 2013 [ 6 5 ] và phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn bởi PEG [27].
Đây là những phƣơng pháp có quy trình đơn giản, hiệu quả, dễ thực hiện,
xử lý mẫu đơn giản, sản lƣợng tách chiết và độ tinh sạch IgY c a o , đang
đƣợc áp dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu [77]. Chúng tôi so sánh hai
phƣơng pháp tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng này để lựa chọn phƣơng pháp
phù hợp cho tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà. Kết quả điện di của cả hai
phƣơng pháp đều cho thấy hình ảnh IgY gồm hai băng đậm, rõ nét có khối
lƣợng phân tử tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử của chuỗi nặng (khoảng
67kDa) và chuỗi nhẹ (khoảng 25 kDa), ngoài ra trên các đƣờng điện di vẫn
còn các vạch khác rất mờ. Do vậy, có thể kết luận rằng đã tách chiết thành
cơng kháng thể IgY từ lịng đỏ trứng gà với độ tinh sạch khá cao. Tuy
nhiên, khi so sánh hình ảnh điện di IgY của đƣờng số 1 và đƣờng số 2 cho
thấy vạch protein tạp không phải kháng thể ở đƣờng số 1 ít hơn so với
đƣờng số 2, điều này chứng tỏ phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng tách phân
đoạn nƣớc và NaCl có độ tinh sạch cao hơn so với phƣơng pháp pháp kết
tủa phân đoạn bởi PEG.
17

Hình 3.9. Điện di đồ kháng thể IgY
sau tinh sạch
Ghi chú: 1: IgY tinh sạch theo
phương pháp tách phân đoạn bằng
nước và muối natri clorua; 2: IgY
tinh sạch theo phương pháp kết tủa
phân đoạn bởi PEG.

Để tạo ra kháng thể IgY có độ tinh sạch cao, hoạt tính kháng thể
mạnh hơn làm nguyên liệu cho que thử phát hiện các độc tố ruột tụ cầu,
kháng thể IgY đƣợc tạo ra từ phƣơng pháp tinh sạch bằng tách phân đoạn
nƣớc và NaCl đƣợc tinh sạch trên cột sắc ký tƣơng tác thiophylic (Hi Trap
IgY Purification HP).

Hình 3.10. Điện di đồ các giai đoạn tinh sạch kháng thể IgY qua cột
sắc ký
Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1: IgY sau tinh sạch bằng tối ưu hóa
kết tủa NaCl; 2, 3: Dịch rửa cột sau khi cho mẫu vào; 4: IgY thu được
sau tinh sạch; 5:Dịch rửa cột của đệm làm sạch.
3.3. ỨNG DỤNG SEC1 TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ
TRỨNG IGY ĐỂ TẠO QUE THỬ
3.3.1. Xác định lƣợng kháng thể lên vạch kiểm chứng
18


Kháng thể gắn lên vạch kiểm chứng là kháng thể đa dòng kháng BSA
đƣợc tách chiết và tinh sạch từ lịng đỏ trứng gà. Tiến hành pha lỗng IgY tới
các nồng độ 0,1; 0,3; 1 µg/µl và in lên màng nitrocellulose với liều lƣợng
1µl/cm. Chúng tơi sử dụng nồng độ kháng thể đơn dòng là 0,3 μg/μl để in
màng với liều lƣợng là 1 μl/cm.

Hình 3.11. Lựa chọn lượng kháng
thể đa dòng kháng BSA để cố định lên vạch
kiểm chứng.
1. Nồng độ kháng thể là 400 ng /que thử
2. Nồng độ kháng thể là 120 ng /que thử
3. Nồng độ kháng thể là 40 ng /que thử

1

2

3

3.3.2. Xác định lƣợng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm
Chúng tôi đã sử dụng kháng thể lòng đỏ trứng IgY từ lô gà tiêm 5 loại
độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+ D+E), sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp
tách phân đoạn nƣớc và NaCl, đƣợc tinh sạch tiếp bằng cột sắc ký in lên
vạch thử nghiệm của que thử. Pha loãng kháng thể tới các nồng độ 5; 1,5;
0,5μg/μl và in các dung dịch này lên màng nitrocellulose với liều lƣợng 1
μl/cm. Sau đó sử dụng các que thử này để phân tích mẫu âm tính với liều
lƣợng kháng nguyên cộng hợp là 5 μl/100 μl đệm chạy. Dựa vào kết quả của
các thí nghiệm, chúng tơi tiến hành sử dụng nồng độ kháng thể đơn dòng là
1,5 μg/μl để in màng với liều lƣợng là 1 μl/cm.
Hình 3.12. Lựa chọn lượng kháng thể cố định
lên vạch thử nghiệm
1. Nồng độ kháng thể là 2 µg/que thử
2. Nồng độ kháng thể là 0,6 µg /que thử
3. Nồng độ kháng thể là 0,2 µg /que thử

3.3.3. Xác định lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng

Vì sử dụng phƣơng pháp cạnh tranh để phát hiện SEA – SEE nên
lƣợng kháng nguyên cộng hợp cần dùng phải có liều lƣợng ít nhất nhƣng vẫn
19


phải đảm bảo mẫu âm tính phải xuất hiện vạch. Chúng tôi tiến hành sử dụng
1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 và 10 µl kháng nguyên cộng hợp cho mẫu âm tính.
Các kết quả chỉ ra rằng lƣợng kháng nguyên cộng hợp nhỏ nhất vẫn cho các
tín hiệu vạch khá rõ ràng là 2µl. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo,
chúng tơi sử dụng 2µl kháng nguyên cộng hợp cho một que thử.

Hình 3.13. Lựa chọn lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng
Ghi chú: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 và 10: Lượng kháng nguyên cộng hợp sử dụng
cho 1 phản ứng là 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 và 1 µl.
3.3.4. Xác định độ nhạy phát hiện của que thử với 5 loại độc tố
Chúng tôi đã chuẩn bị các mẫu kháng nguyên SEA, SEB, SEC1,
SED và SEE với nồng độ ban đầu là: 1000ng/ml rồi tiến hành pha loãng đến
các nồng độ 300 ng/ml, 100 ng/ml, 30 ng/ml, 10 ng/ml, 3 ng/ml và 1 ng/ml.
Các kết quả thí nghiệm với từng độc tố cho thấy:
Với SEA, SEB và SED khi phân tích bằng mắt thƣờng, độ nhạy phát
hiện của que thử là khoảng 30-100 ng/ml.

Hình 3.14. Thử độ nhạy của que thử với SEA, SEB, SED trong đệm
Ghi chú: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1
ng/ml và mẫu âm tính khơng chứa SEA.
20


Với SEC1, SEE độ nhạy phát hiện của que thử là khoảng 10-30 ng/ml.

Hình 3.15. Thử độ nhạy của que thử với SEC1
Ghi chú: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1
ng/ml và mẫu âm tính khơng chứa SEC1.
Ứng dụng que thử phát hiện SEA-SEE trong sữa
Chúng tôi áp dụng kết quả của lƣợng kháng nguyên cộng hợp cho mẫu
âm tính là 3 µl để thử nghiệm với các nồng độ sữa pha lỗng khác nhau
nhằm tìm ra nồng độ sữa pha loãng thấp nhất mà vẫn đảm bảo mẫu âm tính
xuất hiện vạch.

Hình3.16. Lựa chọn nồng độ sữa pha lỗng cho que thử
Ghi chú: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 và 10: Độ pha loãng sữa sử dụng cho 1 phản ứng
là 1; 2; 3; 4; 5; 6 ; 7; 8; và 10 lần
Để tối ƣu hóa đƣợc độ pha lỗng sữa dùng cho thử nghiệm, chúng tơi
tiến hành pha loãng ở các mức độ: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 và 10 lần trong
dung dịch đệm chạy. Các kết quả đã chỉ ra rằng mức độ pha lỗng sữa thích
hợp cho thử nghiệm là 3 lần.
Xác định độ nhạy phát hiện của toàn bộ q trình phân tích
Từ các kết quả sau khi phân tích bằng que thử với 5 loại độc tố ruột
của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) khi phân tích trong đệm chạy và

21


khi sử dụng chất nền là sữa, chúng tơi có thể kết luận rằng độ nhạy phát hiện
của toàn bộ q trình phân tích nhƣ sau :
- Với SEA và SEB, SED: trong dung dịch đệm chạy thì độ nhạy phát
hiện của que thử khoảng 30-100 ng/ml; trong sữa thì độ nhạy phát hiện
khoảng 30-90 ng/ml.

Hình 3.17. Thử độ nhạy của que thử với SEA, SEB, SED trong sữa

Ghi chú: 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9;
3 ng/ml, mẫu âm tính sữa khơng chứa SEA và mẫu âm tính đệm không
chứa SEA.
- Với SEC1, SEE trong dung dịch đệm chạy thì độ nhạy phát hiện của
que thử khoảng 10-30 ng/ml; trong sữa thì độ nhạy phát hiện khoảng 9-30
ng/ml.

Hình 3.18. Thử độ nhạy của que thử với SEC1 trong sữa
Ghi chú: 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30;
9; 3 ng/ml, mẫu âm tính sữa khơng chứa SEC1.

22


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Nghiên cứu của đề tài luận án đã đã đạt đƣợc các kết quả sau:
1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa
cho độc tố ruột tụ cầu SEC1.
2. Đã biến nạp thành cơng plasmid pGEX-6P-1-sea mang gen mã hóa SEA
và plasmid pGS-21a- sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu vào tế bào
E. coli BL21. Đã sàng lọc đƣợc dịng tế bào E. coli có khả năng sinh SEA
và SEC1 cao.
3. Đã xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy phù hợp cho sinh tổng hợp SEA và
SEC1: nhiệt độ 30oC; nồng độ chất cảm ứng IPTG với SEA là 1 mM,
còn với SEC1 là 0,3 mM; thời gian cảm ứnglần lƣợt là 5 giờ và 8 giờ. Đã
tinh sạch SEA tinh khiết ở dạng dung hợp với GST, SEC1 ở dạng dung
hợp với đuôi GST và 2 vùng đuôi His.
4. Đã sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng IgY kháng BSA và
kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+ C2+ D+E) từ

gà Leghorn trắng với độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi cao.
5. Đã tạo thành công que thử phát hiện các độc tố ruột tụ cầu với độ nhạy
phát hiện với SEA và SEB, SED trong đệm chạy khoảng 30-100 ng/ml,
trong sữa thì độ nhạy phát hiện khoảng 30-90 ng/ml; với SEC1, SEE
trong đệm chạy khoảng 10-30 ng/ml, trong sữa thì độ nhạy phát hiện
khoảng 9-30 ng/ml.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu nhằm tối ƣu hóa que thử để tăng độ nhạy phát hiện
với 5 loại độc tố ruột của tụ cầu (SEA-SEE), đơn giản hóa quy trình phân
tích để có thể đi vào sản xuất, ứng dụng để phát hiện các loại độc tố này
trong nhiều loại thực phẩm trên hiện trƣờng.
|

23