Nuôi cấy in -vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 2

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2
DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU 5
DANH SÁCH CÁC HÌNH 6
LỜI MỞ ĐẦU 7
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8
1.1. GIỚI THIỆU CÂY SÂM NGỌC LINH 8
1.1.1. Vị trí phân loại: 8
1.1.2. Đặc điểm hình thái: 9
1.1.3. Đặc điểm sinh thái: 10
1.1.4. Đặc tính dược liệu của Sâm Ngọc Linh: 12
1.2. Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. 23
1.2.1. Cơ sở khoa học: 24
1.2.2. Các kỹ thuật nuôi cấy 26
1.2.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 31
1.2.5. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 35
1.2.6. Các ứng dụng: 38
1.2.7. Các bước trong nhân giống in – vitro: 39
1.2.8. Ưu – nhược điểm của phương pháp nhân giống in – vitro: 42
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 44
2.1. Nuôi cấy mô sẹo và rễ bất định sâm Ngọc Linh 44
2.1.1. Vật liệu: 44
2.1.1. Môi trường: 44
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 3

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ: 44
2.1.3. Hóa chất: 44
2.1.4. Qui trình thực hiện 45
2.1.5. Điều kiện nuôi cấy: 45
2.2. Nuôi cấy sinh khối và tạo vi củ sâm Ngọc Linh. 46
2.2.1. Nguyên liệu: 46
2.2.2 Môi trường: 46
2.2.3 Thiết bị và dụng cụ: 46
2.2.4 Hóa chất: 46
2.2.5 Qui trình thực hiện: 46
2.2.6 Điều kiện nuôi cấy: 47
2.3 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh 48
2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 D lên sự hình thành mô sẹo và rễ bất định của mẫu cấy 49
2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ bất định in vitro của sâm Ngọc Linh trên
các môi trường MS, SH và Gamborg (B5) 52
2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ bất định in vitro của sâm Ngọc Linh trên
các môi trường MS, SH, B5 55
CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57
3.1 Kết luận 57
3.2 Kiến nghị: 58
PHỤ LỤC 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62


Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BA 6-benzylaminopurine

NAA α-naphthaleneacetic acid
MS Murashige và Skoog
SH Schenk và Hildebrandt
G5 Gamborg
MT Môi trường
TDZ N – phenyl – 1,2,3 – thidiazol – 5 yl urea
2,4D Dichlophenolxyl acetic acid









Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 5

DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm ( Đã trừ độ ẩm) Error! Bookmark
not defined.
Bảng 2: Hàm lượng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các loài Panax spp. trồng
trọt: Error! Bookmark not defined.
Bảng 3: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol:
Error! Bookmark not defined.
Bảng 4: Acid Oleanolic: Error! Bookmark not defined.
Bảng 5: Ocotillol: Error! Bookmark not defined.
Bảng 6: Các axid béo được tìm thấy: Error! Bookmark not defined.

Bảng 7: Thành phần acid amin chủ yếu: Error! Bookmark not defined.
Bảng 8: Các nguyên tố vi lượng: Error! Bookmark not defined.
Bảng 9: Tác dụng dược lý của nhân sâm Ngọc Linh Error! Bookmark not defined.
Bảng 10: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 121
0
C. Error!
Bookmark not defined.
Bảng 11: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật: Error!
Bookmark not defined.
Bảng 12: Ảnh hường của auxin2,4 - D lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh:
Error! Bookmark not defined.
Bảng 13: ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ bất định invitro của Sâm Ngọc Linh
trên các môi trường MS, SH và B5 Error! Bookmark not defined.
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 6

Bảng 14: ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ bất định invitro của sâm Ngọc Linh
trên các môi trường MS, SH, B5 Error! Bookmark not defined.



DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1: Hình thái Sâm Ngọc Linh Error! Bookmark not defined.
Hình 2: cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên Error! Bookmark not defined.
Hình 3: Củ nhân sâm Ngọc Linh trên 50 năm tuổi Error! Bookmark not defined.
Hình 4: Củ nhân sâm Ngọc Linh lâu năm Error! Bookmark not defined.
Hình 5: Cây nhân sâm Ngọc Linh hoang dại Error! Bookmark not defined.
Hình 6: Nuôi cấy trong Bioreactor Error! Bookmark not defined.
Hình 7:Rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy trong Bioreactor Error! Bookmark not defined.

Hình 8: Quá trình hình thành mô sẹo và rễ bất định của sâm Ngọc Linh (P.vietnamensis)
sau 2 tháng nuôi cấy. Error! Bookmark not defined.
Hình 9: Sâm Ngọc Linh trên môi trường B5 có bổ sung 7 mg/l NAA sau 30 ngày nuôi
cấy. Error! Bookmark not defined.
Hình 10: rễ bất định hình thành sau 1 tháng nuôi cấy Error! Bookmark not defined.



Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 7





LỜI MỞ ĐẦU
Là một vị thuốc bổ đứng hàng đầu trong các vị thuốc bổ, từ xa xưa sâm chỉ được
dùng cho các ông hoàng bà chúa, những người lắm tiền nhiều của bởi sự quý hiếm, khó
trồng, lâu thu hoạch. Nhưng ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học, từ một số tế bào gốc
bằng công nghệ sinh khối tế bào, đã thành công trong việc nuối cấy tế bào sâm Ngọc
Linh với số lượng lớn. Cây sâm Ngọc Linh (có tên khoa học là Panax vietnamensis, hay
sâm K5, sâm Việt Nam) được Đoàn điều tra dược liệu Khu V do Dược sĩ Đào Kim Long
phát hiện lần đầu vào năm 1973 tại huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum). Đây cũng là loài nhân
sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới. Sâm Ngọc Linh trong tự nhiên phân bố chủ yếu
chung quanh vùng núi Ngọc Linh (thuộc huyện Trà My, Quảng Nam và Đăk Tô, Kon
Tum) ở độ cao 1.500m trở lên. Loại cây này sinh trưởng chậm, phải từ 6 năm trở lên mới
có thể sử dụng. Hiện nay, sâm Ngọc Linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam.
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sâm Ngọc Linh có tác dụng bổ dưỡng toàn
thân, tăng sức lực. Khi dùng cho bệnh nhân, phục hồi sức khỏe, bệnh nhân ăn ngon, tăng

sức đề kháng đối với những yếu tố độc hại (tăng khả năng chịu các tác nhân stress vật lý,
hóa học, sinh học).
Để cung cấp nguồn sâm Ngọc Linh cho ngành công nghiệp dược phẩm, bên cạnh
việc đầu tư quy hoạch, trồng và bảo tồn sâm Ngọc Linh, đã có nhiều nghiên cứu cho thấy
sự ứng dụng của công nghệ sinh học được coi như là một phương pháp tối ưu giúp cải
thiện việc nhân giống sâm và tạo ra nguồn vật liệu thô dùng trong y học và các lĩnh vực
khác của đời sống. Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu trong nuôi trồng sâm in vitro bao
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 8

gồm nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan, tái sinh cây và chuyển gen. Phương pháp này có nhiều
ưu điểm so với phương pháp truyền thống như quá trình nuôi cấy để thu cây con và sản
phẩm thứ cấp không phụ thuộc điều kiện ngoại cảnh (khí hậu, sâu bệnh,…), có thể điều
chỉnh được quá trình sản xuất, sản phẩm thu được có hiệu suất cao và chất lượng ổn định
hơn.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CÂY SÂM NGỌC LINH
1.1.1. Vị trí phân loại:
Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm. Nhưng chỉ có bốn loài Sâm thuộc
họ Nhân Sâm (Araliaceae). Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax gingseng C. A.
Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây
thuốc quý.
Năm 1968, KS. Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc
Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5. Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của Ban dân y
Khu 5 do DS. Đào Kim Long dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc hoang thành
quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên là Sâm Đốt Trúc với
tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae) (Nguyễn Minh Đức, 2003).
Tên khoa học của cây được công nhận là Panax vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm

Araliaceae, công bố tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị
Dung và I. V. Grushvistky đặt tên
Phân loại sâm Ngọc Linh.
- Giới: Plantae
- Ngành: Magnoliophyta
- Bộ: Apiales
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 9

- Họ: Cam Tùng (Araliaceae)
- Chi: Panax
- Loài: Panax
- Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush
- Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng).
- Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng.







Hình 1: Hình thái Sâm Ngọc Linh
1.1.2. Đặc điểm hình thái:
Cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1 m.
Thân rễ nạc, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30
- 40 cm, có thể hơn, mang nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng
năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ
hình cầu. Thân rễ còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển

mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất. Hình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang dại
rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những
vàm ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, chúng
có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay và dạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến.
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 10

Sâm Ngọc Linh trồng thường cao đến 1 m mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn
bình thường.
Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2 - 4 lá kép
chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 10 - 14
cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ.
Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 20 cm có thể
kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Hoa nhiều màu lục vàng,
hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân. Mỗi tán 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1
- 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Đài có 5 răng dài,
nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy.
Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá chét
phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt.
Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hình thận
màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân, quả mọc tập trung ở trung tâm của
tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt, một số quả
chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả.
Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9.

Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 11

Hình 2: cây sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên

1.1.3. Đặc điểm sinh thái:
Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao từ
1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán
rừng. Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù, nhiệt độ
khoảng 15-18
0
C, lượng mưa khoảng 3000 mm/ năm. Đất rừng ở đây được tạo thành do
lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước.
Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Mùa hoa quả từ tháng 5-
tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn
tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau, Sâm có khả
năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt.
Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ. Mỗi năm từ đầu
mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá. Căn cứ vào
vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của Sâm.
Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở Việt
Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Ngọc Linh được phát
hiện sau cùng vào 1973. Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa
học. Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh
thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum.
Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107
o

50’ –
108
o
7’ kinh tuyến Đông và từ 15
o
0’ – 15
o
10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh
cao 2598 m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao
khoảng 1500 m đến 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn của hai
huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng như phân
bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi.
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 12





1.1.4. Đặc tính dược liệu của Sâm Ngọc Linh:
1.1.4.1. Hợp chất saponin:
Tên gọi saponin hay saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực
vật. Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm Việt Nam
cũng như của các loài Sâm khác trên thế giới. Các saponin dammaran được xem là hoạt
chất quyết định cho các tác dụng sinh học.
Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) chứa 49 hợp chất saponin, gồm 25 saponin đã
biết và 24 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosid-R1-R24.
Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin đã
biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8.

Bảng 1: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm ( Đã trừ độ ẩm)
Nguyên liệu
Hàm lư
ợ
ng saponin chính (%)

G
-
Rb
1

GRd

G
-
Ry
1

R
2

T
ổ
ng c
ộ
ng

Đầu mầm 0.943 0.898 1.359 2.859 6.059
Sâm 2 tuổi 0.979 0.426 1.235 1.868 4.236
Sâm 3 tuổi 0.846 0.678 1.419 2.409 5.352

Rễ củ 4 tuổi 0.818 0.396 1.696 3.141 6.051
Rễ củ 5 tuổi 1.721 0.518 2.219 3.816 8.674
Rễ củ 6 tuổi 1.824 0.632 2.285 4.166 9.474
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 13

Thân rễ 4 tuổi 1.518 1.778 2.432 2.946 8.674
Thân rễ 5 tuổi 1.565 0.981 1.652 4.276 8.494
Thân rễ 6 tuổi 2.716 0.840 3.648 5.342 12.546

Bảng 2: Hàm lượng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các loài Panax spp.
trồng trọt:
Loại aglycon
Panax
ginseng
Panax
notoginseng

Panax
quinquefolius
Panax
vietnamensis
20(S)–ppd 2.9 2.1 2.7 3.1
20(S)–ppt 0.6 2.4 1.2 2.0
Ocotillol
– –
0.04 5.6
Oleanolic acid 0.02
–

0.07 0.09
Hiệu suất toàn phần (%) 3.5 4.5 4.0 10.8
( Ghi chú: 20(S)-ppd: 20(S)-protopanaxadiol; 20(S)-ppt: 20(S)-protopanaxatriol)
Bảng 3: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol:
Tên

Ki
ể
u

R
1

R
2

R
3

Hi
ệ
u su
ấ
t (%)

G-Re
I
(I) -H- -Glc
2
-Rha -Glc- 0.17

20-glc-G-Rf (I) -H- -Glc
2
-Glc -Glc- 0.01
G-Rg
1
* (I) -H- -Glc
2
-Glc -Glc- 1.37
G-Rh
1
(I) -H- -Glc- -H- 0.008
N-R
1
* (I) -H- -Glc
2
-Xyl -Glc- 0.36
N-R
6
(I) -H- -Glc- -Glc
6
- 0.01
G-R
4
(I) -Glc
2
-Glc

-H- -Glc- 0.004
G-R
12

(K) -H- -Glc- -H- 0.005
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 14

G-R
15
(J) -H- -Glc- -Glc- 0.003
G-R
17
(K) -H- -Glc- -Glc- 0.002
G-R
18
(K) -H- -Glc- -Glc- 0.002
G-R
19
(L) -Glc
2
-Glc

-H- -Glc- 0.006

Bảng 4: Acid Oleanolic:
Tên Kiểu R
1
R2
Hiệu suất
(%)
G-R
0

(O)

-Glc
2
-Glc

-Glc-

0.038
H-Ma
(O)

-Glc
2
-Glc-Ara(p) -Glc- 0.05

Bảng 5: Ocotillol:
Tên Kiểu R
1
R2
Hiệu suất
(%)
PG-RT
4
(M) -Glc-

-CH
3
0.065

24(s)-PG-F
11
(M) -Glc
2
-Rha

-CH
3

0.005
M-R
1
* (M) -Glc
2
-Glc

-CH
3

0.14
M-R
2
* (M) -Glc
2
-Xyl

-CH
3

5.29

G-R
1
(M) -Glc
2
-Rha-Ac
6

-CH
3

0.033
G-R
2
(M) -Glc
2
-Xyl-Ac
4

-CH
3

0.014
G-R
6
(M) Glc

-CH
3

0.006

G-R
14
(M) -Glc
2
-Xyl

-CH
2
OH 0.02
G-R
10
(N) -Glc-

-CH
3

0.007

1.1.4.2. Hợp chất polyacetylen
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 15

Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với
panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chính yếu. Hai
hợp chất mới là 10 acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E),10(E)-
trien-4-6-diyn-3,10-diol.

1.1.4.3. Thành phần acid béo
Bảng 6: Các axid béo được tìm thấy:

STT Số Carbon của hợp chất % Tên
1 8 C Vết
2 10 C Vết
3 11 C Vết
4 12 C 0.22
5 13 C 0.31
6 14 C 1.33
7 15 C 0.40
8 15 C
1=
0.31
9 16 C 29.12 Acid palmitic
10 16 C
1=
Vết
11 17 C 1.13
12 17 C
1=
Vết
13 18 C 4.48 Acid stearic
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 16

14 18 C
1=
13.26 Acid oleic
15 18 C
2=
40.04 Acid linoleic

16 18 C
3=
2.61 Acid linolenic
17 20 C 1.51
1.1.4.4. Thành phần acid amin
Bảng 7: Thành phần acid amin chủ yếu:
STT

Acid amin

Acid amin (%)

Acid amin th
ủ
y gi
ả
i (%)

1 Tryptophan 10.20 -
2 Lysin 17.90 5.29
3 Histidin 1.02 2.59
4 Arginin 46.66 12.90
5 Acic aspartic 7.60 10.38
6 Threonin 1.20 5.19
7 Serin 5.12 5.19
8 Acid glutamic 2.05 6.49
9 Prolin 3.07 15.58
10 Glycin 4.10 5.19
11 Alanin - 5.19
12 Cystin 1.53 Vết

13 Valin 0.51 1.29
14 Methionin 0.51 Vết
15 Isoleucin 1.02 2.59
16 Leucin 1.02 5.19
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 17

17 Tyrosin 0.51 6.49
18 Phenylanin 0.51 6.49



1.1.4.5. Các nguyên tố vi lượng
Bảng 8: Các nguyên tố vi lượng:
STT

Nguyên t
ố

vi lư
ợ
ng

Hàm lư
ợ
ng (ppm)

1 K 9349.19
2 Ca 2844.74

3 Mg 1950.19
4 Fe 491.21
5 Sr 169.87
6 Ti 120.65
7 B 140.00
8 Rb 91.62
9 Mn 68.10
10 Zn 26.11
11 Br 17.27
12 Ni 10.61
13 Cu 6.23
14 Cr 4.10
15 Y 1.51
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 18

16 I 0.24
17 Co 0.15
18 As 0.10
19 Se 0.05
20 Hg 0.04
1.1.4.6. Các thành phần khác
Hợp chất Sterol:β-Sitosterol và daucosterin (β- Sitosteryl-3-o- β-D-glucopyranosid).
Hợp chất glucid:
- Đường tự do: 6.19%
- Đường toàn phần: 26.77%
Tinh dầu: 0.05- 0.10%
Sinh tố C: 0.059%

1.1.4.7. Tác dụng dược lý- Lâm sàng
Vì cơ cấu hóa học đặc biệt của nhân sâm Ngọc Linh nên tác dụng chữa bệnh rất đa dạng.
Bảng 9: Tác dụng dược lý của nhân sâm Ngọc Linh
STT

Tác dụng dược lý Chủ trị
1 Tăng thể lực, chống nhược sức Suy nhược cơ thể
2 Kích thích các hoạt động não bộ Suy nhược tinh thần
3 Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục Suy nhược sinh dục
4 Tăng tạo hồng cầu, tiểu cầu Chữa thiếu máu, suy tiểu cầu
5 Đặc hiều với vi khuẩn Streptococi Chữa viêm họng hạt
6 Antistress giải lo âu và chống trầm cảm Các bệnh lý gây ra bởi stress
7 Tăng cường chức năng gan và bảo vệ tế bào gan Chống xơ gan và giải độc gan

8 Giảm cholesterol huyết, giảm lipit, tăng HDL Xơ vữa động mạch
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 19

STT

Tác dụng dược lý Chủ trị
9 Giảm đường huyết hiệp lực với thuốc hạ đường huyết

Bệnh tiểu đường
10 Điều hòa hoạt động tim mạch Loạn nhịp tim và hạ huyết áp
11 Chống ôxy hóa (Antioxidant) Chống lão hóa
12 Phòng chống các loại ung thư Hỗ trợ thuốc chữa ung thư
13 Gia tăng sức đề kháng không đặc hiệu Suy giảm miễn dịch
Ngoài những tác dụng trên do các cơ sở khoa học tín nhiệm đã nghiên cứu và tổng

kết, nhân sâm Ngọc Linh còn có những đặc tính ưu việt mà các loại nhân sâm khác không
có được đó là nó không có độc tính khi sử dụng liên tục dài ngày, có thể dùng chữa bệnh
cho trẻ sơ sinh đến người già với liều dùng từ 50mg đến 200mg cho 1kg thể trọng, nghĩa
là người cân nặng 50kg có thể dùng 10gr một ngày. Nếu dùng 20gr một ngày có tác gây
ngủ. Nếu dùng với liều 30gr đến 40gr thì có tác dụng như một thuốc giảm đau rất kỳ
diệu. Trong vòng hơn 30 năm theo dõi lâm sàng đối với những bệnh nhân K giai đoạn
cuối, nếu dùng 30gr-40gr ngày không còn thấy đau đớn.

Hình 3: Củ nhân sâm Ngọc Linh trên 50
năm tuổi

Hình 4: Củ nhân sâm Ngọc Linh lâu

Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 20

năm
Những nghiên cứu về dược lý lâm sàng của nhân sâm Ngọc Linh được thực hiện
tại những đơn vị dưới đây:
- Viện nghiên cứu sức khỏe người cao tuổi, Giáo sư Phạm Khuê và cộng sự.
- Quân y viện 175 Thành phố Hồ Chí Minh, Giáo sư Đỗ Đình Luận và cộng sự.
- Viện điều dưỡng TP Hồ Chí Minh.
Chương trình theo dõi trên các bệnh nhân tình nguyện do bộ phận Dược lý Trung
tâm Sâm Việt Nam thực hiện 1982 – 1986 đã kết luận:
- Bệnh nhân cảm thấy ăn ngon hơn, ngủ tốt hơn, tăng thể trọng, tăng thị lực, trí lực
và thể lực được cải thiện tốt.
- Giảm mệt mỏi, chống nhược sức do lao động liên tục kéo dài.
- Gia tăng sức đề kháng của cơ thể trong các bệnh nhiễm trùng, khi phối hợp với
các loại kháng sinh thông dụng.

- Cải thiện các chỉ số sinh hóa của cơ thể như: tăng dung tích sống, tăng chỉ số
Tiffeneau, giảm cholesterol huyết. Tăng tỷ số A/G, tăng số lượng hồng cầu hemogolobin
và hematocrit.
- Cải thiện suy nhược thần kinh, suy nhược sinh dục.
- Tăng huyết áp cho người suy nhược, huyết áp thấp.
- Nâng cao thể trọng giúp hồi phục nhanh chóng sau phẫu thuật dạ dày.
- Tác dụng giảm chữa và giảm đau khi viêm họng, giúp bệnh nhân dễ thở và ho có
đờm trong các bệnh lý về phổi và phế quản. Ngăn chặn các cơn hen tái phát.
- Hiệp lực với thuốc điều trị tiểu đường.
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 21

Đã 37 năm liên tục theo dõi nghiên cứu tổng kết và ứng dụng nhân sâm Ngọc Linh
vào điều trị bệnh, chúng tôi thấy hiếm có vị thuốc nào trên thế giới có được tác dụng đa
dạng trong phòng bệnh và chữa bệnh, hỗ trợ sức khỏe như nhân sâm Ngọc Linh, nhất là
dùng trong các trường hợp bệnh nhân bị ung thư, bị các bệnh về máu, bị suy thận, viêm
cầu thận mãn, bệnh co thắt phế quản, viêm họng và họng hạt…


1.1.5. Hiện trạng cây Sâm Ngọc Linh ở Việt Nam:
Cây có vùng phân bố rất hẹp và mọc rất rải rác. Do là loài Sâm quí hiếm nên số
lượng cá thể giảm sút nhanh chóng, hiện đang nằm trong 250 loài quí hiếm đang có nguy
cơ tuyệt chủng do bị khai thác quá mức và buôn bán bất hợp pháp, hiện Sâm Ngọc Linh
đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ.
Để bảo vệ và phát triển cây dược liệu quí hiếm, hiện đã có những dự án để duy trì
và bảo tồn giống tại hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum:
- Năm 1979: Uỷ Ban Nhân Dân Tỉnh Quảng Nam đã cho thành lập Trại dược
liệu Trà Linh. Bằng cách nhân giống hữu tính và vô tính, Trại dược liệu đã có 223.000
cây con. Trại đã xây dựng quy trình trồng cây Sâm Ngọc Linh và phổ biến cho nhân dân

trong vùng thực hiện.
- Năm 1995: Sở Khoa học, Công nghệ và Môi trường tỉnh Quảng Nam đã
đầu tư nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhằm bảo vệ và phát triển cây Sâm Ngọc Linh.
Nhằm hình thành vùng nguyên liệu Sâm Ngọc Linh và đưa cây Sâm trở thành loại cây
trồng mang lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân trong vùng dự án, Sở đã chủ trì
thực hiện dự án “Ứng dụng kỹ thuật tiến bộ xây dựng mô hình phát triển vùng nguyên
liệu sâm khu Năm tại xã Trà Linh”.
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 22

- Năm 2003: Viện Dược liệu Hà Nội phối hợp với Sở Khoa Học Công Nghệ
và Môi Trường Kon Tum thực hiện dự án vùng trồng cây Sâm Ngọc Linh. Cây Sâm đã
được nhân giống trong năm 2003 và trồng tập trung ở xã Ngọc Lay, huyện Đắk Tô. Năng
suất hàng năm ước tính khoảng 50.000 cây. Mục đích của dự án là quy hoạch vùng có
điều kiện thích hợp cho cây sâm Ngọc Linh phát triển và tìm ra phương pháp canh tác
thích hợp nhất nhằm bảo tồn loài cây đặc hữu của vùng và giúp xóa đói giảm nghèo ở
Kon Tum.
Sâm Ngọc Linh là một dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao, cần thiết ứng dụng
những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng thương hiệu
sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới. Trong đó bước đầu tiên là hiện đại hóa việc canh
tác. Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy mô là một kỹ thuật tiên tiến có thể ứng dụng tốt cho
sản xuất sản phẩm Sâm Ngọc Linh.
Ngày nay, nhân sâm Ngọc Linh đang được bảo tồn và phát triển ở vùng núi Ngọc
Linh. Nhân dân cư trú trên núi Ngọc Linh đã quen với việc trồng bán tự nhiên, thu hái tự
nhiên và kiêm việc bảo tồn nhân sâm Ngọc Linh tự nhiên. Có gia đình đã có hàng chục
nghìn cây nhân sâm trồng bán tự nhiên trên các độ cao trên 2000m so với mặt biển.

hình 6: Cây nhân sâm Ngọc Linh hoang dại
Người ta đã nghiên cứu việc đưa cây nhân sâm Ngọc Linh về Đà Lạt, về Sapa

nhưng sản phẩm cây mọc ở đây hầu như không còn đủ hoạt chất chữa bệnh. Việc di thực
nhân sâm Ngọc Linh đến các vùng núi lân cận có thấy cây mọc bình thường nhưng sau 2
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 23

năm theo dõi thì hầu hết không đủ hoạt chất so với mẫu đối chứng. Vì vậy nơi cung cấp
sâm hoang dại chủ yếu hiện nay vẫn là ở núi Ngọc Linh.
Gần đây, do nhân sâm Ngọc Linh có uy tín cao trong việc hỗ trợ điều trị bệnh nên
nhiều người đã tìm cách giả mạo. Họ mang sâm giả mạo nhân sâm Ngọc Linh đến bán ở
ngay vùng quê của Ngọc Linh nên khá nhiều người bị nhầm lẫn. Nguồn gốc của nhân
sâm giả này đã được báo chí đưa tin, nhưng hàng ngày thì việc giả mạo vẫn cứ diễn ra
càng ngày càng tinh vi và phức tạp.

1.2. Sơ lược kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo,
trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là
một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Bao gồm:
+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành
+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
+ Nuôi cấy mô sẹo (callus)
+ Nuôi cấy tế bào đơn
+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi đã tách vỏ
còn gọi là nuôi cấy tế bào trần. Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện
trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm (in
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 24

vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm
(in vivo).
Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc
ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể
tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương
pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này không phụ
thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là hướng đang được
ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều
trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống
có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm
nghiệp.
1.2.1. Cơ sở khoa học:
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô
tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân
hoá.
Tính toàn năng của tế bào:
Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của mộtcơ
thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa một lượng
thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể
trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều có thể phát triển
thành cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào. Qua đó
người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh
khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho
tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản phân hoá.
- Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 25

+ Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có
khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô
bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn
phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt.
+ Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành các
mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có
thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào. Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ
quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về
trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ
quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó.
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một
thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và một
số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong
cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế
lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các gen được
hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể
mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.
Lịch sử phát triển:
- 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái
niệm tế bào.
- 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào.
- 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải.
- 1934: Kogl xác định vai trò của IAA.
- 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh
cơ quan.
- 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công.

Nuôi cấy in-vitro rễ bất định và vi củ sâm Ngọc Linh

Page 26

- 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.
- 1964: Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ
nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt.
- 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của
Hapopappus gracilis.
- 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas.
- 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần.
- 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp
trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp. Mitsui
.0Petrochemicals.
- 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen.
- 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr.

1.2.2. Các kỹ thuật nuôi cấy
1.2.2.1. Nuôi cấy phôi
Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng cần
có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển.
Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng, đường sucrose cho nhiều
kết quả tốt hơn. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt, casein thủy
phân là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Đối với các chất điều hòa sinh trưởng,
auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi.
Nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, thường phôi nuôi
cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên. Nhiệt độ 25 ± 2
o
C thích hợp
cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi. Các phôi thứ cấp rất khó sinh trưởng đã hoạt động

khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux hoặc hơn trong 4 giờ
chiếu sáng suốt 4 ngày nuôi đầu tiên.
 Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu quả như: