xác định một số điều kiện thích hợp để nuôi cấy tế bào thận và gan phôi vịt trong điều kiện in vitro và thử nghiệm gây nhiễm virus viêm gan vịt type 1

i
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN TH Ơ
KHOA NÔNG NGHI ỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG









VÕ QUỐC HOÀNG DÂN



XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP
ĐỂ NUÔI CẤY TẾ B ÀO THẬN VÀ GAN PHÔI V ỊT TRONG
ĐIỀU KIỆN
IN VITRO
VÀ THỬ NGHIỆM GÂY NHIỄM VIRUS
VIÊM GAN V ỊT TYPE 1



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y


Cần Thơ, 2013

i
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN TH Ơ
KHOA NÔNG NGHI ỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP
ĐỂ NUÔI CẤY TẾ B ÀO THẬN VÀ GAN PHÔI VỊT TRONG
ĐIỀU KIỆN
IN VITRO
VÀ THỬ NGHIỆM GÂY NHIỄM VIRUS
VIÊM GAN V ỊT TYPE 1

Cần Thơ, 2013
GVHD:
PGS.TS H Ồ THỊ VIỆT THU

Sinh viện thực hiện:
VÕ QU ỐC HOÀNG DÂN
MSSV: 30926 56
LỚP: THÚ Y – K 35

ii
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN TH Ơ
KHOA NÔNG NGHI ỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y



Đề tài: “Xác định một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế b ào thận
và gan phôi vịt trong điều kiện in vitro v à nuôi c ấy thử nghiệm virus viêm
gan vịt type 1” do sinh viên: Võ Qu ốc Hoàng Dân th ực hiện tại phòng Chẩn
đoán và xét nghi ệm, Khoa Nông Nghi ệp và Sinh H ọc Ứng Dụng, tr ường Đại
Học Cần Th ơ, từ 08/2013 đến 12/2013 .



Cần Thơ, Ngày tháng năm 2013 Cần Thơ, Ngày tháng năm 2013
Duyệt Bộ Môn Duyệt Giáo vi ên hướng dẫn

PGS. TS.
HỒ THỊ VIỆT THU



Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SH ƯD









iii
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công tr ình nghiên c ứu của bản thân. Các số liệu,
kết quả tr ình bày trong lu ận văn là trung th ực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công tr ình luận văn n ào trước đây.

` Tác giả luận văn

Võ Quốc Hoàng Dân

iv
LỜI CẢM TẠ

Với tất cả sự kính trọng tôi xin b ày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đối Bố
mẹ là người đã sinh thành, nuôi d ạy tôi khôn lớn v à luôn ở bên cạnh ủng hộ,
động viên khi tôi g ặp khó khăn, vấp ng ã trong cu ộc sống.
Tôi xin chân thành c ảm ơn:
Cô Hồ Thị Việt Thu đ ã dành thời gian quý báu tận t ình hướng dẫn, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian l àm luận văn tốt nghiệp.
Cảm ơn anh Lê Tr ần Hoài Khanh đ ã tận tình hướng dẫn các thao tác
trong phòng thí nghi ệm.
Cảm ơn tất cả các anh chị ph òng Chẩn đoán v à xét nghi ệm, các bạn c ùng
lớp Thú Y Khóa 35 đ ã chia sẽ cùng tôi những buồn vui trong quá tr ình học tập
cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề t ài.
Xin kính g ởi đến quý thầy, cô, ng ười than, anh, chị, bạn b è tôi lời chúc

sức khỏe th ành công và xin nh ận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc.
Cuối cùng tôi xin c ảm ơn đến Hội Đồng Giám Khảo đ ã dành th ời gian
đọc, xem xét v à đóng góp ý kiến quí báu cho đề t ài tốt nghiệp của tôi.


Võ Quốc Hoàng Dân











v
TÓM LƯỢC

Mục tiêu: Tạo môi tr ường tế b ào thận phôi v à gan phôi v ịt lớp đơn phục
vụ các nghiên cứu về tế b ào học và virus h ọc.
Để đáp ứng mục ti êu trên, chúng tôi th ực hiện đ ề tài: “Xác định một số
điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế b ào thận và gan phôi vịt trong điều kiện
in vitro và nuôi c ấy thử nghiệm virus vi êm gan v ịt type 1 ”. Từ tháng 08 /2013
đến tháng 12/2013 , thực hiện tại ph òng chẩn đoán v à xét nghi ệm, Bộ môn Thú
Y, Khoa Nông nghi ệp và Sinh h ọc Ứng dụng, Đại học Cần Th ơ.
Nội dung:
- Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi tr ường tế b ào gan phôi
vịt và thận phôi vịt một lớp qua các nồng độ nuôi cấy ban đầu và nồng độ

huyết thanh bổ sung v ào môi trư ờng nuôi cấy.
- Thử nghiệm gây nhiễm virus viêm gan v ịt type 1 trên 2 loại môi tr ường
tế bào thận phôi vịt v à gan phôi v ịt lớp đơn.
Các kết quả thu đ ược:
- Về nồng độ nuôi cấy ban đầu 2 loại tế bào: ở cùng một nồng độ nuôi
cấy ban đầu tế b ào thận phôi vịt tạo lớp nhanh h ơn tế bào gan phôi v ịt; Nồng
độ thích hợp để tạo môi tr ường tế bào là 5x10
5
tb/ml. Về nồng độ huyết thanh
thích hợp bổ sung v ào môi trư ờng nuôi cấy: ở tế b ào thận phôi vịt là 5-10%,
và tế bào gan phôi v ịt là 10%.
- Virus viêm gan v ịt type 1 đều gây bệnh lý tế b ào đặc trưng trên 2 lo ại tế
bào (co tròn, ho ại tử). Virus vi êm gan v ịt type 1 tăng sinh ở môi tr ường tế bào
gan phôi v ịt nhanh hơn môi trư ờng tế bào thận phôi vịt .

vi
MỤC LỤC

Trang ph ụ bìa i
Trang duy ệt ii
LỜI CAM ĐOAN iii
LỜI CẢM TẠ iv
TÓM LƯ ỢC v
MỤC LỤC vi
DANH M ỤC CHỮ VIẾT TẮT viii
DANH M ỤC HÌNH x
DANH M ỤC BẢNG xi
CHƯƠNG 1 Đ ẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 2 LƯ ỢC KHẢO T ÀI LIỆU 3
2.1 Lịch sử nghi ên cứu và phát tri ển kỹ thuật nuôi cấy tế bào. 3

2.2 Đặc điểm của tế b ào động vật nuôi cấy 5
2.3 Tổng quan về nuôi cấy tế b ào động vật 7
2.4 Các lo ại tế bào trong nuôi c ấy tế bào động vật 10
2.5 Những đặc điểm v à chức năng của tế b ào nuôi c ấy 10
2.6 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế b ào động vật 10
2.7 Một số môi tr ường nuôi cấy tế b ào 14
2.8 Đánh giá tình trạng tế b ào nuôi c ấy 14
2.9 Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế b ào động vật 15
2.10 Các pha trong nuôi c ấy tế bào 15
2.11 Bảo quản lạnh tế b ào nuôi c ấy 15
2.12 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế b ào 17
2.13 Duck hepatitis virus type 1 (DHV -1) 18
CHƯƠNG 3 N ỘI DUNG V À PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 20
3.1 thời gian v à địa điểm 20
3.2 Vật liệu v à hóa ch ất 20

vii
3.3 Nội dung nghi ên cứu 22
3.4 Phư ơng pháp nghiên c ứu 22
3.4.1 Thí nghi ệm 1: Xác định nồng độ tế b ào nuôi c ấy thích hợp
với điều kiện thí nghiệm. 24
3.4.2 Thí ngh iệm 2: Khảo sát ảnh h ưởng của các nồng độ huyết
thanh FBS b ổ sung v ào môi trư ờng tăng tr ưởng MEM l ên hiệu
quả tạo lớp đ ơn tế bào. 25
3.4.3 Thí nghi ệm 3: Nuôi cấy thử nghiệm Duck Hepatitis Viru s
type 1 trên 2 lo ại môi tr ường DEK, DEL. 27
CHƯƠNG 4 K ẾT QUẢ V À THẢO LUẬN 29
4.1 Thí nghi ệm 1: Xác định nồng độ tế b ào nuôi c ấy thích h ợp với
điều kiện thí nghiệm. 29
4.2 Thí nghi ệm 2: Khảo sát ảnh h ưởng của các nồng độ huyết thanh

FBS bổ sung v ào môi trư ờng tăng tr ưởng MEM l ên hiệu quả tạo lớp
đơn tế bào 35
4.3 Thí nghi ệm 3: Nuôi cấy thử nghiệm Duck Hepatitis Virus type 1
trên 2 lo ại môi tr ường DEK và DEL 41
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN V À ĐỀ NGHỊ 44
5.1 Kết luận 44
5.2 Đề nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
PHỤ CHƯƠNG 49


viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt
Nguyên ch ữ
Nghĩa tiếng Việt
CAM
Chorioallantoic membrane
Màng nhung ni ệu
CPE
Cytopathic Effect
Bệnh lý tế b ào
DEK
Duck Em bryo Kidney
Thận phôi vịt
DEL
Duck Embryo Liver
Gan phôi v ịt
DHV

Duck Hepatitis Virus
Virus viêm gan v ịt
DHV-1
Duck Hepatitis Virus type 1
Virus viêm gan v ịt type 1
D’MEM
Dulbecco`s modification of Eagle`s
medium
Môi trường MEM cải
tiến bởi Dulbecco
DMSO
Dimethylsulfoxide
(CH
3
)
2
CO
DNA
Deoxyribonucleic acid

DPBS
Dulbecco’s Phosphate Buffered
Saline Solution
Đệm sinh lý Dulbecco
EDTA
Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

E’ MEM
Eagle's minimal essential medium
Môi trường tối thiểu do

Eagle thiết lập
FBS
Foetal Bovine Serum
Huyết thanh b ào thai bò
HAT
Hypoxanthine Aminopterin
Thymidine medium
Môi trường nuôi cấy tế
bào động vật có vú.
HEPES
Hydroxy – Ethyl – Piperazine –
Ethane – Sulphonic acid
Đệm hữu c ơ
IFN
Interferon

In Vitro
In an artificial e nvironment outside
the living organism
Trong đi ều kiện ngo ài cơ
thể sống

ix
MEM
Minimum Essential Medium
Môi trường tối thiểu
MTTT

Môi trường tăng tr ưởng
NGF

Nerve Growth Factor
Yếu tố tăng tr ưởng thần
kinh
OD
Optical Density
Mật độ quang
RNA
Ribonuclei c acid

Tb

Tế bào
TCID
50

Tissue Culture Infective Dose 50
Liều gây chết 50% tế b ào
TN

Thí nghi ệm
UV
Ultraviolet light
Ánh sáng c ực tím
Vero
Verda Reno (Africa green kidney
monkey)
Tế bào thận khỉ xanh
Châu Phi

x

DANH MỤC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
Hình 2.1 Mô hình c ấu tạo của một tế b ào động vật 5
Hình 2.2 Các lo ại dụng cụ nuôi cấy tế b ào lớp đơn 9
Hình 2.3 Các lo ại dụng cụ nuôi cấy tế b ào huyền phù 9
Hình 2.4 Duck hepatitis virus type 1 18
Hình 3.1 Bu ồng đếm Neubauer 54
Hình 3.2 B ố trí thí nghiệm xác định nồng độ ban đầu thích hợp cho nuôi cấy 25
Hình 3.3 S ơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh h ưởng của các nồng độ huyết thanh
lên hiệu quả tạo lớp đ ơn tế bào 26
Hình 3.4 Hình b ố trí thí nghiệm nuôi gây nhiễm DHV-1 trên 2 lo ại tế bào 27
Hình 4.1 Bi ểu đồ thời gian trung b ình tạo lớp 2 loại tế b ào với các nồng độ
nuôi cấy ban đầu ax10
5
tb/ml 29
Hình 4.2 th ời gian tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) t ừ nồng độ
nuôi cấy ban đầu l à 3x10
5
tb/ml 30
Hình 4.3 Th ời gian tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) t ừ nồng
độ nuôi cấy ban đầu l à 5x10
5
tb/ml 31
Hình 4.4 Th ời gian tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) t ừ nồng
độ nuôi cấy ban đầu l à 7x10
5
tb/ml 32

Hình 4.5 Th ời gian tạo lớp của 2 loại t ế bào DEK (A) và DEL (B) t ừ nồng
độ nuôi cấy ban đầu l à 10x10
5
tb/ml 33
Hình 4.6 Hi ệu quả tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) trong môi
trường MEM không bổ sung huyết thanh 36
Hình 4.7 Hi ệu quả tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) trong môi
trường MEM bổ sung 2% huyết thanh 37
Hình 4.8 Hi ệu quả tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) trong môi
trường MEM bổ sung 5% huyết thanh 38
Hình 4.9 Hi ệu quả tạo lớp của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B) trong môi
trường MEM bổ sung 10% huyết thanh 39
Hình 5.0 Th ời gian biểu hiện CPE của 2 loại tế b ào DEK (A) và DEL (B)
sau gây nhi ễm DHV -1 42


xi
DANH MỤC BẢNG

Bảng
Tên Bảng
Trang
Bảng 4.1: Thời gian trung b ình tạo lớp tế b ào với các nồng độ nuôi cấy ban
đầu của 2 loại tế b ào DEK và DEL 33
Bảng 4.2 Giá trị OD
620
trung bình theo n ồng độ tế b ào nuôi c ấy ban đầu c ủa
2 loại tế bào DEK và DEL 34
Bảng 4.3 Hiệu quả thời gian tạo lớp tế b ào tương ứng với 4 nồng độ huyết
thanh qua 3 th ời điểm quan sát tr ên 2 loại tế bào 40

Bảng 4.4 Giá trị OD
620
sau đo đư ợc sau 120 giờ nuôi cấy 2 loại tế b ào theo 4
nồng độ huyết thanh 40
Bảng 4.5 Giá trị OD
620
và tỷ lệ tế bào sống trung b ình của 2 loại môi tr ường
tế bào 42



1
CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Trước kia nếu muốn nuôi cấy virus th ì người ta phải nuôi cấy tr ên cơ thể động
vật. Như vậy rất khó quan sát đ ược các hiệu ứng đặc th ù của virus ở mức độ tế b ào.
Vào những năm 30 của thế kỷ 20 các nh à virus học đã phát hiện thấy phôi gà có thể
được dùng để nuôi cấy virus herpes, virus đậu m ùa và virus cúm. M ặc dù phôi gà có
kết cấu giản đ ơn hơn nhi ều so với c ơ thể thỏ hay chuột thí nghiệm nh ưng phôi gà v ẫn
là một cơ thể phức tạp. Việc sử dụng phôi g à không th ể hiện hết những bệnh lý do
virus gây nên . Mặt khác, vi khuẩn cũng phát triển tốt tr ên phôi gà, trên các phôi nhi ễm
vi khuẩn rất khó đánh giá chính xác đ ược các hiệu ứng do virus. V ì vậy ngành virus
học đã phát tri ển chậm chạp khi ch ưa cải tiến đ ược phương pháp nuôi c ấy virus.
Có hai p hát hiện mới đã làm triển khai đ ược phương pháp nuôi c ấy tế bào giúp
cho các nhà virus h ọc và các nhà khoa h ọc khác. Một l à, việc phát hiện v à sử dụng
chất kháng sinh để ngăn ngừa sự cảm nhiễm vi khuẩn. Hai l à, các nhà sinh h ọc phát
hiện thấy các enzyme th ủy phân protein , nhất là trypsin e, có thể làm tách riêng các t ế
bào ra khỏi các mô xung quanh m à không làm t ổn hại đến các tế b ào này. R ửa các tế
bào và đếm số lượng chúng, pha lo ãng rồi chuyển v ào các bình, các ống nghiệm hay

hộp Petri bằng nhựa . Các tế bào trong d ịch huyền ph ù sẽ hấp phụ tr ên bề mặt lớp th ành
nhựa, chúng sinh sôi n ẩy nở và lan ra thành m ột tầng tế b ào gọi là tầng tế bào đơn.
Tầng tế b ào đơn này có th ể nuôi cấy truyền qua thế hệ bằng phương pháp đem các tế
bào nuôi c ấy được đi nuôi cấy tro ng các môi trư ờng nuôi cấy mới (nuôi cấy thứ cấp) .
Một lượng lớn các tế b ào truyền thế hệ đ ược tạo th ành từ một mẫu tổ chức đ ơn sẽ là
mẫu tế bào nuôi c ấy đồng nhất cần thiết cho các nghi ên cứu hiệu ứng của virus.
Thuật ngữ nuôi cấy mô đ ã được sử dụng rộng rãi nhưng nuôi c ấy tế bào cần sử
dụng chính xác h ơn. Hiện nay, phần lớn các tế b ào nuôi c ấy đều là tầng tế bào đơn
sinh trư ởng ra từ các tế b ào phân tán đ ã được xử lý nhờ enzyme. Nhờ sử dụng nhiều
loại hình nuôi c ấy tế bào vận dụng chất kháng sinh để ức ch ế nhiễm trùng mà ngành
Virus học đã bước vào thời đại vàng. Từ thập kỷ 50 đến thập kỷ 60 của thế kỷ 20 đ ã có
trên 400 virus đư ợc phân lập v à giám đ ịnh. Mặc d ù các virus m ới đã được phát hiện
nhưng trọng tâm hiện nay l à cần giám định kỹ hơn các đặc tính của virus, xác đ ịnh các
bước cảm nhiễm v à nhân lên c ủa virus.
Ngoài ra, nuôi c ấy tế bào giúp gi ảm số lượng các c ơ thể sống d ùng làm thí
nghiệm. Thay v ì thí nghi ệm ta thực hiện tr ên một cơ thể sống th ì ta thực hiện nó tr ên tế
bào. Điều này giúp cho các thí ngh iệm được thực hiện tr ên nhiều đối tượng thử
nghiệm hơn, thời gian ngắn hơn. Trong s ản xuất vaccine từ tế b ào nuôi cấy có ưu điểm


2
là độ tinh khiết v à đơn vị kháng nguy ên cao vì th ế cho đáp ứng miễn dịch sớm v à hiệu
giá kháng th ể đạt được cao. Còn nhiều các ứng dụng khác của công nghệ nuôi cấy tế
bào như nghiên c ứu ung th ư, thử nghiệm thuốc…
Xuất phát từ nhu cầu thực tế v à nhu cầu nghiên cứu về virus học và một số
nghiên cứu khác, cùng với điều kiện ph òng thí nghi ệm virus học, bộ mô Thú y, Khoa
Nông nghi ệp và Sinh học ứng dụng, chúng tôi tiến h ành thực hiện đề t ài:
“Xác định một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế b ào thận và gan phôi vịt
trong điều kiện in vitro v à nuôi c ấy thử nghiệm virus viêm gan v ịt type 1”
Mục tiêu đề tài

Xác định một số điều kiện thí ch hợp để tạo môi tr ường tế b ào thận phôi v à gan
phôi tách t ừ phôi vịt nh ư nồng độ tế bào nuôi cấy, nồng độ huyết thanh bổ sung trong
môi trường nuôi cấy .
Thử nghiệm gây nhiễm virus vi êm gan v ịt type 1 tr ên môi trư ờng 2 loại tế b ào.
Xem hiệu quả tăng sinh của virus trên 2 loại môi tr ường nhằm phục vụ cho các thí
nghiệm về virus học.


3
CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO T ÀI LIỆU

2.1 Lịch sử nghi ên cứu và phát tri ển kỹ thuật nuôi cấy tế b ào.
Thuyết tế bào của Schleiden v à Schwan (1838) là n ền tảng cho các nghiên cứu
sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế b ào gốc. Thực tế, trong sự phát triển của
khoa học và y học có nhu cầu nuôi cấy tế b ào rất lớn. Chẳng hạn, nuôi cấy tế b ào phục
vụ cho sản xuất vaccine cho ng ười và gia súc , nghiên cứu sự phát triển của tế b ào ung
thư, nghiên cứu virus học. Chính vì nhu c ầu đó từ thế 19 nhiều nh à khoa học đã tiến
hành nghiên c ứu tế b ào cũng như nuôi c ấy nó trong điều kiện in vitro.
Một số mốc thời gian ghi nhận sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế b ào và
mô:
- Năm 1838, Schleiden và S chwann công b ố thuyết tế b ào, đặt nền tảng cho
nhiều nhà khoa h ọc nghiên cứu sau về khả năng phát triển tế b ào từ một tế b ào gốc ban
đầu.
- Năm 1885 , Roux nh ận xét rằng tế b ào phôi gà có th ể giữ ở trạng thái sống trong
dung dịch mối sinh lý b ên ngoài cơ th ể, Đây là ghi nhận đầu tiên về khả năng nuôi tế
bào động vật.
- Năm 1907, Harrison l ần đầu tiên tách thành công t ế bào thần kinh ếch để l àm
thí nghiệm nuôi chúng ngo ài cơ thể. Ông đã quan sát được dưới kính hiển vi sợi thần
kinh hình thành t ừ tế bào chất của tế bào thần kinh.

- Năm 1913, một nghiên cứu có tính chất l àm nền tảng cho công nghệ n uôi cấy tế
bào động vật do Carrel thực hiện, nghi ên cứu đã chứng minh tế b ào có th ể sống lâu
ngày trong đi ều kiện in vitro nếu được thường xuyên bổ sung chất dinh d ưỡng trong
điều kiện vô tr ùng.
- Năm 1948, Earle đã thành công khi phân lập được các tế bào đơn từ dòng tế
bào và nuôi chúng trong nh ững điều kiện môi tr ường đặc biệt v à thu nhận được những
dòng tế bào biệt lập.
- Năm 1952, Gey phân lập được dòng tế bào liên tục (được gọi là dòng tế bào
HeLa) có nguồn gốc tế bào ung thư c ổ tử cung ở người.
- Năm 1954, Levi-Montalcini đã dùng các yếu tố tăng tr ưởng thần kinh (NGF -
Nerve Growth Factor ) kích thích lên sự phát triển các tế bào thần kinh trong điều kiện
in vitro .


4
- Năm 1955, Earle l ần đầu tiên nghiên c ứu có hệ th ống nhu cầu dinh d ưỡng thiết
yếu của tế b ào nuôi cấy trong điều kiện in vitro và phát hi ện rằng tế b ào động vật có
thể phân chia đ ược trong một hỗn hợp ch ứa các dinh dư ỡng có phân tử l ượng nhỏ v à
có hiện diện của một l ượng huyết thanh nhất định.
- Năm 1956, Puck nhận thấy yếu tố đột biến cũng kích thích lên sự phát triển của
các tế bào Hela trong đi ều kiện nuôi cấy in vitro.
- Năm 1958, Temin và Tubin phát tri ển phương pháp xét nghi ệm định l ượng
virus Rous s arcoma qua gây nhi ễm vào tế bào gà nuôi c ấy.
- Năm1961, Hayflick và Moorhead th ấy rằng tế bào nguyên sợi người (human
fibroblast) b ị chết sau khi phân chia đến một số l ượng giới hạn trong điều kiện nuôi
cấy.
- Năm 1964, Littlefied đ ã đưa ra môi trư ờng nuôi cấy HAT d ùng để phát triển tế
bào sinh dư ỡng lai. Bao g ồm kỹ thuật dung hợp tế b ào, để cho các tế b ào sinh dưỡng
tiếp nhận gen mới.
- Năm 1965, Ham xác đ ịnh môi tr ường nuôi cấy tế b ào không có huy ết thanh

cũng có khả năng kích thích s ự phát triển của tế bào động vật có vú. C ùng thời gian
này, Harris và Watkins lần đầu tiên gây được hiện tương dung h ợp tế bào người và tế
bào chuột bởi tác động của virus trong điều kiện in vitro .
- Năm 1975, Kohler và Milstein s ản xuất được kháng thể đ ơn dòng từ tế bào
Lympho B với một tế b ào ung thư hybridoma .
- Năm 1976, Sato đ ã chứng minh các dòng tế bào dùng để nuôi cấy đòi hỏi
những hỗn hợp hormone khác nhau v à các yếu tố tăng tr ưởng trong môi tr ường nuôi
cấy không huyết thanh.
- Năm 1977, Wigler đ ã cải tiến ph ương pháp ghi chép cấu trúc gen của động vật
có vú qua nuôi c ấy tế bào từ phương pháp c ủa Graham và Van Der Eb.
Từ các nghiên cứu trên góp ph ần: tìm ra được nhiều môi tr ường thích hợp cho sự
phát triển nhiều loại mô khác nhau của ng ười và động vật trong điều kiện in vitro,
hoàn thiện quy tr ình nuôi cấy mô động vật , tạo ra một số đột biến có ích v à có ý ngh ĩa
rất lớn trong kỹ thuật sản xuấ t vaccine cho ngư ời và động vật.
Trong tương lai không xa , hướng nghiên cứu này sẽ đem lại những th ành tựu
khoa học cũng nh ư lợi ích kinh tế rất lớn. Tr ước mắt, kỹ thuật nuôi cấy tế b ào động vật
sẽ phục vụ cho hai ng ành: ngành y và ngành chăn nuôi – thú y. Hai ngành này đang
cần những kỹ thuật hiện đại để phát triển .




5
2.2 Đặc điểm của tế b ào động vật nuôi cấy

Hình 2.1 Mô hình c ấu tạo của một tế b ào động vật
( )
Sự điều h òa trao đổi chất
Quá trình tr ảo đổi chất của c ơ thể được tập trung chủ yếu t rong từng tế bào. Sự
chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế b ào và có tính quy ết định đến sự tồn tại

của có thể sống.
Ở tế bào động vật, ngo ài tác động của enzyme và h ệ dịch quanh tế b ào, chúng
còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ
phong phú t ừ bên ngoài và bên trong t ế bào, điều khiển một cách h ài hòa toàn b ộ quá
trình trao đổi chất ở tế b ào. Sự rối loạn quá tr ình trao đổi chất ở tế b ào có liên quan r ất
chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh. Do đó, việc điều khiể n trao đổi chất của tế
bào động vật trong c ơ thể sống hết sức phức tạp.
Tuy nhiên, vi ệc điều khiển dinh d ưỡng tế bào trong nuôi c ấy in vitro khác quá
trình dinh d ưỡng tế bào trong cơ th ể. Khi nuôi cấy tế b ào in vitro, các quá trình trao
đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đ ặc điểm của một tế b ào độc lập, không
tuân theo quy lu ật của mô v à của cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tế bào động vật được
thực hiện tr ên cơ sở điều khiển quá tr ình tổng hợp enzyme v à các hoạt động của


6
enzyme, đây c ũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế b ào, khả năng tạo
ra những sản phẩm trao đổi chất của tế b ào, cũng như khả năng phân chia tế b ào.
Trong quá trình phát tri ển của tế b ào, có hai v ấn đề ảnh h ưởng quyết định đến kết
quả:
- Bản chất tự nhi ên của tế b ào, hay nói cách khác là ngu ồn gốc của tế b ào.
- Những yếu tố môi tr ường quyết định đặc tr ưng riêng bi ệt của tế b ào.
Những hiểu biết ng uồn gốc của tế b ào giúp ta định hướng sản phẩm cuối, c òn sự
hiểu biết v ề đặc trưng riêng bi ệt giúp ta điều chỉnh để tính trạn g đó được biểu hiện ra
trong quá trình nuôi c ấy.
Trong nuôi c ấy tế bào in vitro có những yếu tố ho àn toàn khác v ới sự phát triển
của chính tế b ào đó trong cơ th ể. Còn khi phát tri ển trong c ơ thể, các tế b ào này không
chỉ chịu tác động trực tiếp m à còng ch ịu những tác động gián tiếp. Do đó, mọi tác
động của môi tr ường đến tế b ào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh v à mãnh li ệt, cần tạo ra
sự hài hòa trong m ọi tác động đến sự trao đổi chất của tế b ào được nuôi cấy.
Tính ch ất cơ học

Tế bào động vật kh ông có thành t ế bào, chúng ch ỉ được bao bọc rởi một m àng tế
bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế b ào với các tế b ào khác trong mô. M ặt
khác, kích thư ớc tế bào động vật th ường rất lớn, trung b ình khoảng 10 μm, lại không
có vách nên t ế bào động vật có tính chất c ơ học yếu. Do đó, trong quá tr ình nuôi c ấy
cần nhẹ nh àng, tránh sự phá vỡ tế b ào, trong trường hợp việc nuôi cấy tế b ào cần
khuấy hay quay th ì tốc độ không đ ược quá 100 rpm (vòng/phút) (Phạm Kim Ngọc v à
Phạm Văn Phúc, 2007).
Khả năng phân chia v à tốc độ tăng trưởng chậm
Do đặc điểm di truyền ở tế b ào động vật v à thực vật, một chu kỳ tế b ào thường
kéo dài 20 – 70 giờ (Nguyễn Đức L ượng và Lê Thị Thủy Ti ên, 2002). Nếu trong một
điều kiện n ào đó, một loại tế b ào trong có th ể đa bào lại tăng số l ượng một cách bất
thường thì cơ thể đó sẽ chu yển sang trạng thái bệnh lý.
Cần giá đỡ trong quá tr ình phát tri ển, nhân đôi
Trừ tế bào máu và m ột số giai đoạn của tế b ào sinh dục, hầu hết các mô v à tế bào
động vật cần bám v ào giá đỡ để có thể sống v à phân chia. T ế bào sẽ ngừng phân chia
khi đã hình thành m ột lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vây, một số
dòng tế bào như tế bào ung thư ho ặc dòng tế bào liên tục từ mô b ình thường (sau khi
được thuần hóa) có thế sinh tr ưởng và phân chi trong tr ạng thái l ơ lửng, không cần
bám vào giá đ ỡ (Phạm Kim Ngọc v à Phạm Văn Phúc, 2007).


7
Chịu ảnh h ưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng
Đây là cơ ch ế kìm hãm ng ược (Negative feed – back), là cơ ch ế ức chế sự tổng
hợp và tiết ra ngo ài môi trư ờng của một chất n ào đó, đ ược thực hiện bởi chính sự gia
tăng của nồng độ chất n ày trong môi trư ờng. Do đó, việc thay mới môi tr ường sau một
thời gian nuôi cấy l à cần thiết. Trong ph òng thí nghiệm, cơ chế kìm hãm ng ược còn có
thể gây tổn th ương tế bào, thậm chí chết h àng loạt (Phạm Kim Ngọc và Phạm Văn
Phúc, 2007) .
Khả năng tiếp nhận gen lạ

Xét về cấu trúc tế b ào, tế bào động vật được xem nh ư một loại tế b ào trần tự
nhiên. Chúng đư ợc bao bọc chỉ bởi một lớp m àng. Do đó, trong trư ờng hợp chúng tồn
tại ở trạng thái tự do, chúng có khả năng tiếp nhận d òng thông tin di t ruyền lạ từ virus
hoặc khi những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần nhau, sẽ x ãy ra
hiện tượng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế b ào lai (như t ế bào hybridoma, đư ợc
lai giữa tế bào bình th ường có khả năng sản xuất kháng thể v à tế bào ung thư t ủy).
Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo
Khác với tế bào vi sinh v ật và tế bào thực vật, tế b ào động vật cần phải đ ược bảo
quản trong điều kiện hết sức đặt biệt mới có thế giữ đ ược những đặc tính ri êng của nó.
Bằng cách s ử dụng nitơ lỏng (-196
0
C) để trữ, tế b ào động vật vẫn duy tr ì được
đặc tính của chúng trong thời gian rất d ài. Phương pháp này đư ợc áp dụng nhiều ở các
ngân hàng gi ống động vật tr ên thế giới. Khi sử dụng, tế b ào động vật đ ược tiến hành
giải đông và được hoạt hóa để phục hồi khả năng tăng tr ưởng và phân chia như trư ớc
khi đem b ảo quản.
Ngoài ra, t ế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi tr ường, nhạy cảm
với kim loại. Trong quá tr ình phát tri ển ở môi tr ường nhân tạo, chúng rất cần huyết
thanh, hormone.
2.3 Tổng quan về nuôi cấy tế b ào động vật
Các hình th ức nuôi cấy tế b ào động vật
- Nuôi cấy tế bào sơ cấp (Primary culture)
Nuôi cấy tế bào sơ cấp là giai đo ạn nuôi cấy đầu ti ên những tế bào vừa được tách
ra từ mô hay c ơ quan (Ph an Kim Ng ọc, 2002). Việc nuôi cấy bắt đầu khi các tế b ào
được tác ra từ mô bằng ph ương pháp cơ h ọc hay bằng ph ương pháp x ử lý enzyme và
có thể tăng trưởng trong môi tr ường thích hợp.
Có nhiều loại enzyme để tách tế b ào như collagenase, elastase, hyaluronid ase,
pronase… nh ưng trypsin đ ươc dùng nhi ều nhất v ì hiệu quả tách tế b ào cao và giá

8
thành rẻ. Trypsin (v à pronase) có th ể tách ho àn toàn t ế bào từ mô bằng cách thủy phân
các protein liên k ết các tế b ào với nhau (Phan Kim Ngọc, 2002).
Dù tế bào được tách ra bằng bất kỳ ph ương pháp nào thì đây vẫn là giai đo ạn
chọn lọc đầu ti ên của quá tr ình nuôi c ấy để cuối c ùng có th ể thu các d òng tế bào tương
đối đồng dạng.
Trong giai đo ạn nuôi cấy s ơ cấp, sự chọn lọc dựa v ào đặc tính của tế b ào như dễ
tách rời nhau, sống và bám vào cơ ch ất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại đ ươc trong
dịch huyền ph ù. Những tế bào đó là đ ối tượng cơ bản của quá tr ình nuôi c ấy sơ cấp.
Các tế bào nuôi c ấy sơ cấp không đồng nhất với nhau do chúng l à thế hệ con của nhiều
loại tế bào ban đầu khác nhau. Ở giai đoạn nh ày, tế bào có hình thái g ần mô cha mẹ
nhất.
- Nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture)
Đây là hình thức cấy chuyền tế b ào sơ cấp, để có bề mặt cho sự phát triển. Qua
mỗi lần cấy chuy ền, nhằm lựa chọn những tế bào có khả năng tă ng sinh cao n hất sẽ
dần dần chiếm ưu thế và loại bỏ các tế b ào chết hoặc tăng sinh kém . Qua nhiều lần cấy
truyền, tế bào trở nên ổn định h ơn, có kh ả năng tăng sinh nhanh chóng v à mạnh mẽ.
Tiến hành cấy chuyền bằng cách tách rời các tế b ào từ bình nuôi c ấy bằng
enzyme (tương tự enzyme đ ã dùng khi tách t ế bào để nuôi cấy s ơ cấp), enzyme này
phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế b ào với bề mặt cơ chất. Ngay sau khi tế bào được
tách rời, enzyme đ ược bất hoạt nhờ môi tr ường nuôi cấy (có chứa huyết thanh), huyền
phù tế bào được chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi c ấy mới.
Các dòng t ế bào nuôi c ấy
- Dòng tế bào liên tục: là dòng t ế bào nuôi c ấy qua nhiều thế hệ trong điều kiện in
vitro và có th ể duy trì khả năng phân b ào trong m ột thời gian d ài mà không thay đ ổi
đặc tính. Ví dụ: tế bào Hela (t ế bào ung thư c ổ tử cung ng ười), tế b ào Vero (t ế bào thận
khỉ xanh Châu Phi)…
- Dòng tế bào giới hạn: là dòng t ế bào chỉ có khả năng sống trong điều kiện nuôi
cấy ở một thời gian giới hạn. Đ ây là các dòng t ế bào bình th ường (không phải tế b ào
ung thư).

Dụng cụ nuôi cấy tế b ào
- Nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture): thường sử dụng các đĩa microplate, đĩa
petri, bình Roux ( T-flask). Các d ụng cụ đ ược chọn t ùy vào số lượng tế bào, bản chất
môi trường nuôi cấy, giá th ành và thói quen ngư ời sử dụng.


9

Đĩa Bình T-flask

Trục xoay microplate
Hình 2.2 Các lo ại dụng cụ nuôi cấy tế b ào lớp đơn
- Nuôi cấy huyền ph ù (Suspension culture): Nuôi trong bình có cánh quát xoay t ừ
(Spinner flask) ho ặc bình lắc Erlenmeyer. Trong đó tế b ào được giữ trạng thái huyề n
phù trong môi trư ờng.

Bình Erlenmeyer Bình có cánh qu ạt xoay (Spinner flask)
Hình 2.3 Các lo ại dụng cụ nuôi cấy tế b ào huyền phù





10
2.4 Các lo ại tế bào trong nuôi c ấy tế bào động vật
Những tế bào nuôi cấy thường được mô tả dựa trên hình thái (hình d ạng và biểu
hiện) hoặc đặc điểm chức năng của chúng. Có 5 dạng h ình thái c ơ bản:
- Dạng biểu mô (Epithelial – like): nh ững tế bào này bám trên b ề mặt có dạng đa
giác và dát m ỏng.
- Lympho bào (Lymphoblast – like): là nh ững dòng tế bào thường không bám

lên bề mặt nh ưng tồn tại trong dịch huyền ph ù dưới dạng h ình cầu.
- Nguyên s ợi bào (Fibroblast – like): nh ững tế b ào bám trên b ề mặt và có biểu
hiện thon d ài, có hai đ ầu, thường có dạng xoáy khi nuôi cấy với mật độ d ày đặc.
- Tế bào thần kinh (Neuron): cấu tạo có mấu lồi và sợi trục đặc tr ưng, ít quan sát
được sự phân chia trong môi tr ường.
- Tế bào cơ (Muscle – like): dạng ống nhỏ có nhiều nhân, biệt hóa th ành dạng
ống trong quá tr ình nuôi c ấy.
2.5 Những đặc điểm v à chức năng của tế b ào nuôi c ấy
Đặc điểm của nh ững tế b ào nuôi c ấy phụ thuộc v ào nguồn gốc và khả năng thích
nghi của chúng với điều kiện môi tr ường. Những chất đánh dấu hóa sinh đ ược sử dụng
để kiểm tra xem tế b ào có mang nh ững đặc điểm chức năng m à chúng có trong cơ th ể
sống hay không (ví dụ: tế b ào gan tiết albumin). Những dấu hiệu h ình thái h ọc hay
siêu cấu trúc cũng có thể đ ược xác định (chẳng hạn sự đập của tế b ào tim). Thông
thường, những đặc điểm n ày có thể thay đổi hoặc mất đi khi đặt tế b ào trong đi ều kiện
nhân tạo.
2.6 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế b ào động vật
Một điều kiện thích hợp l à điều kiện tốt h ơn so với điều kiện cho phép tế b ào tồn
tại trong nuôi cấy. Nó cho phép các tế b ào ở số lượng ít tăng số l ượng thông qua sự
phân chia c ũng như mang các chức năng sinh lý, sinh hóa quan trọng như trong cơ th ể.
Để có điều kiện sống n ày, cần cung cấp cho tế b ào nhiệt độ thích hợp, vật bám tốt và
điều kiện nuôi cấy chuẩn xác.
Nhiệt độ ủ ấm : nhiệt độ thích hợp l à nhiệt độ gần với nhiệt độ c ơ thể động vật
chủ mà tế bào được tách ra. Với đ ộng vật máu lanh, nhiệt độ thay đổi từ 18 -25
0
C, hầu
hết động vật hữu nhũ đ òi hỏi nhiệt độ từ 36 -37
0
C. Phạm vi nhiệt độ n ày được đảm bảo
bằng nhiệt kế v à tủ ấm phải đ ược kiểm tra th ường xuyên.
Chổ bám (giá đỡ ): những tế bào phụ thuộc chổ bám cũng đ òi hỏi một chất nền

tốt để bám v à phát tri ển. Thủy t ình và plastic ( được xử lý đặc biệt) th ường được sử
dụng nhất. Những yếu tố bám khác nh ư collagen, gelatin, fibronectin có th ể sủ dụng
phủ bề mặt cho tác dụng bám tốt h ơn. Những tế bào sẽ có chức năng tốt nếu ch úng


11
được phát triển tr ên một chất nền xốp hay có dạng tổ ong. Tế bào cũng có thể phát
triển trên các hạt trong huyền ph ù (hạt thủy tinh, plastic, polyacrylamide v à hệ thống
các phân tử dextrin). Bằng cách n ày, các tế bào phụ thuộc chỗ bám có thể phát triển
trong hệ thống nuôi cấy huyền ph ù và làm tăng kh ả năng sản xuất tế b ào bằng phương
pháp sinh h ọc.
Môi trư ờng nuôi cấy : môi trường nuôi cấy chia l àm hai lo ại:
- Môi trường tự nhi ên: gồm huyết thanh động vật, n ước ép bào thai và dung d ịch
muối đệm (nh ư dung d ịch Hanks).
- Môi trường tổng hợp: tổng hợp nhiều th ành phần, tương đối đầy đủ d ưỡng chất
cho sự sống v à phát tri ển của tế b ào (như các môi trư ờng MEM, E’MEM, D’MEM).
Môi trường nuôi cấy l à yếu tố phức tạp v à quan tr ọng nhất để kiểm soát khả năng
làm tế bào phát tri ển tốt. B ên cạnh những đ òi hỏi dinh d ưỡng cơ bản của tế b ào, môi
trường nuôi cấy phải có nhiều yếu tố phát triển cần thiết, điều chỉnh pH v à áp suất,
cung cấp các khí thiết yếu (O
2
và CO
2
). Thành ph ần dinh d ưỡng của môi tr ường nuôi
cấy gồm amino acid, vitamine, khoáng và carbohydrate. Chúng cho phép t ế bào tạo ra
những protein mới v à các thành ph ần thiết yếu khác cho sự phát triển v à các hoạt động
chức năng – tương tự như sự cung cấp năng l ượng cho trao đổi chất .
Amino acid : các amino acid c ần thiết là các amino acid không đ ược tổng hợp
trong cơ th ể nên cần phải đ ược bổ sung v ào môi tr ường nuôi cấy. Nhu cầu về cysteine
và tyrosine thay đ ổi khác nhau t ùy theo dòng t ế bào. Các amino acid không c ần thiết

khác cũng được bổ sung v ào môi trường để bù đắp cho những dòng tế bào không có
khả năng tổng hợp.
Vitamine : môi trường MEM của Eagle ( hoặc E’MEM) chỉ có các vitamine thuộc
nhóm B, các vitamine t ừ nhóm khác sẽ đ ược bổ sung từ huyết thanh. Khi tăng th ành
phần môi trường lên (mục đích để giảm l ượng huyết thanh xu ống) thì danh sách các
vitamine trong môi tr ường cũng phải tăng theo. Khi giảm l ượng huyết thanh trong môi
trường thì việc bổ sung các vitamine khác ngo ài những vitamine đ ã có sẳn trong môi
trường là rất cần thiết. Khi mật độ tế b ào trong môi tr ường nuôi cấy thấp (trong giai
đoạn nhân d òng tế bào) thì c ần phải tăng l ượng vitamine cho d ù trong môi tr ường đã
có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn chế về vitamine có ảnh h ưởng rõ rệt trên sức
sống và tốc độ tăng tr ưởng của tế b ào hơn là trên m ật độ tế bào.
Muối: các loại muối chủ yếu nh ư Na
+
, K
+
, Mg
2+
, Ca
2+
, Cl
-
, SO
3
2-
, PO
4
3-
và HCO
3
-

là thành ph ần chính tạo ra áp suất thẩm thấu của môi tr ường. Trong huyền phù tế bào,
lượng Ca
2+
thường được giảm xuống để hạn chế sự kết cụm của tế b ào. Nồng độ của
HCO
3
-
được xác định bởi nồng độ CO
2
ở dạng khí.


12
Glucose: glucose được bổ sung vào môi trư ờng nuôi cấy để cung cấp năng
lượng. Glucose đ ược chuyển hóa chủ yếu bởi quá tr ình đường phân (glycolyse) tạo ra
acid lactic đ ể đi qua chu tr ình Krebs gi ải phóng CO
2
. Nghiên cứu lượng acid lactic tích
tụ trong môi tr ường, đặc biệt l à khi nuôi các t ế bào phôi và các t ế bào biến đổi, ng ười
ta thấy rằng chu tr ình Krebs ở đây hoạt động không trọn vẹn nh ư in vivo, và carbon
trong acid lactic ch ủ yếu là chuyển hóa từ glutamine, chỉ một phần nhỏ l à từ glucose.
Điều này giải thích cho nhu cầu về glutamine v à glutamate c ủa tế b ào nuôi c ấy.
Khoáng ch ất: việc bổ sung các chất v ào môi trường nói chung không cần thiết
lắm, trừ khi có sự giảm l ượng huyết thanh trong môi tr ường. Trong môi tr ường có hàm
lượng huyết thanh thấp hoặc ho àn toàn không có huy ết thanh th ì lúc đó cần phải bổ
sung sắt, đồng, kẽm, selenium các và các nguyên t ố khác v ào môi tr ường nuôi cấy.
Các chất hữu c ơ khác: hợp chất khác nhau nh ư nucleoside, các ch ất trung gian
của chu trình Krebs, pyruvate và lipid c ũng có mặt trong các môi tr ường nuôi cấy phức
tạp. Những hợp chất n ày cần thiết khi giảm l ượng huyết thanh trong môi tr ường nuôi
cấy. Các chất n ày có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng t ế bào chuyên biêt.

L-Glutamine: cần thiết cho hầu hết các d òng tế bào. Glutamine đư ợc sử dụng
trong môi trư ờng nuôi cấy tế b ào như ngu ồn cung cấp năng l ượng và carbon (Reitzer
et al, 1979)
Huyết thanh : hầu hết các loại môi tr ường nuôi nuôi cấy tế bào đều cần đến huyết
thanh vì nó có vai trò quan trọng như sau: cung cấp chất dinh d ưỡng quan trọng cho tế
bào như các amino acid thi ết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguy ên tố vi lương… ,
cung cấp nhân tố tăng tr ưởng kích thích tế bào tăng trư ởng và phân chia, k ích thích s ự
phục hồi do các tổn thương tế bào khi cấy truyền v à các protein trong huy ết thanh làm
bất hoạt trypsine tránh c ác enzyme gây t ổn thương tế bào, cải thiện tính tan c ủa các
chất dinh d ưỡng, cải thiện tính dính của tế b ào lên bề mặt nuôi nhờ các yếu tố l àm tăng
độ dính của tế bào lên giá đ ỡ, chống oxy hóa m ạnh và ức chế độc tính của oxy. (Phan
Kim Ngọc, 2002)
Huyết thanh đ ược sử dụng trong môi tr ường nuôi cấy l à huyết thanh b ê (sử dụng
nhiều nhất), huyết thanh phôi b ò, huyết thanh ngựa v à huyết thanh ng ười (sử dụng
trong nuôi c ấy một số d òng tế bào của người). Tuy nhiên, huy ết thanh l àm tăng giá
thành nuôi lên r ất nhiều. Ngo ài ra, huyết thanh c òn dễ bị nhiễm virus, mycoplasma v à
khó ổn định chất l ượng của những lô môi tr ường khác nhau cũng nh ư chứa những
thành ph ần gây ức chế sự phân b ào của một tế b ào đặc biệt. Do đó, cần chọn loại huyết
thanh phù h ợp.
Hormone: hormone có nh ững ảnh h ưởng khác nhau tr ên tế bào và thường khó
có thể nhận ra đ ược tác động chính của chúng. Insulin kích thích sự hấp thu glucose v à
amino acid và có lẽ khả năng kích thích sự phân chia tế b ào của nó đã ảnh hưởng đến


13
thuộc tính n ày. Một vài yếu tố tăng tr ưởng kết hợp với chất nhận của insulin tr ên bề
mặt của tế b ào và có nh ững hoạt động t ương tự. Các hormone tăng tr ưởng có thể có
mặt trong huyết thanh, đặc biệt là trong huy ết thanh b ò và cùng v ới somatomedine ảnh
hưởng trên sự phân bào. Hydrocortisone c ũng có trong huyết thanh với h àm lượng
thay đổi. Chất n ày có thể kích thích sự bám dính của tế b ào và sự tăng sinh của tế b ào.

Nhưng trong nh ững điều kiện nhất định (nh ư khi mật độ tế b ào cao) thì c ản sự phân
bào và có th ể cảm ứng sự biệt hóa tế b ào. Trong các thí nghi ệm giảm hoặc bỏ hẳn
huyết thanh trong môi tr ường nuôi c ấy cho thấy các hormone cần thiết cho sự nuôi cấy
nên việc bổ sung huyết than h vào môi tr ường nuôi cấy l à cần thiết.
Các chất biến d ưỡng và các dưỡng chất: trong huyết thanh cũng có các amino
acid, glucose, ketoacid và m ột số các d ưỡng chất, các chất biến d ưỡng trung gian.
Những chất n ày quan tr ọng trong các môi tr ường đơn giản, nhưng ít quan tr ọng hơn
trong các môi tr ường phức tạp, đặc biệt l à những môi tr ường có ít các chất bổ sung
khác và các amino acid v ới nồng độ cao.
Các yếu tố kiềm h ãm: huyết thanh có thể có chứa những c ơ chất có tác dụng
kiềm hãm sự tăng sinh của tế b ào. Một số chất có thể đ ược tạo ra trong quá tr ình chuẩn
bị môi tr ường như độc tố của các loại vi khuẩn nhiễm v ào môi tr ường trước khi qua
lọc vô trùng, các phân đo ạn của γ – globulin có th ể chứa các loại kháng sinh gây trở
ngại cho việc nuôi cấy. H ơi nóng có th ể làm phân h ủy một v ài phức chất trong huyết
thanh và làm gi ảm tính độc của immunoglobulin m à không gây h ại đến các yếu tố
tăng trưởng là polypeptide, hơi nóng có th ể làm phân h ủy một số chất dễ bị biến tính
bởi nhiệt v à thành ph ần của huyết thanh sẽ không còn giống như trước khi xử lý.
Các chất đệm : góp phần kiểm soát v à tránh s ự thay đổi pH đột ngột. T ùy vào
từng loại tế b ào, khi chúng phát tri ển càng nhanh thì càng sinh nhi ều lactic acid l àm
pH môi trư ờng giảm, do đó c ần bổ sung chất đệm. Có hai hệ đệm thường dùng: hệ
đệm CO
3
2-
/HCO
3
-
(NaHCO
3
) và hệ đệm hữu c ơ như HEPES (Hydroxy – Ethyl –
Piperazine – Ethane – Sulphonic acid). Đ ệm NaHCO

3
điều chỉnh l ượng CO
2
hòa tan
trong môi trư ờng, thường được sử dụng khi d ùng tủ ấm kiểm soát CO
2
cung cấp từ 2-
10% CO
2
.
Đệm HEPES l à loại đệm lưỡng cực, có khả năng điều ch ình pH môi trư ờng nuôi
cấy theo cả 2 h ướng acid v à base, do đó g iữ pH môi tr ường trong khoảng 7,0 - 7,4.
Đệm không nhạy cảm với CO
2
, chúng cung c ấp một hệ thống tốt để các tế b ào có thể
chuyển hóa mạnh (sả n xuất nhiều CO
2
) giữ ỗn định pH.
Áp suất thẩm thấu : rất quan trọng với việc điều chỉnh d òng chất trong v à ngoài
tế bào. Nó đ ược kiểm soát bởi sự th êm hay b ớt một lượng muối trong môi tr ường nuôi
cấy. Sự bay h ơi của môi tr ường ở hệ thống nuôi cấy hở (đĩa…) sẽ làm tăng nhanh áp