Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn ChồngNha Trang

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang,
Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại
học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong
những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội -
Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học
Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực
hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công
nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu
để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo
trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường
- Trường Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập
vừa qua.
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier
Science Publishing CO, INC, p. 1-70 45
26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761-
789, 879-915, 993-1018 47
DANH MỤC BẢNG
LỜI CẢM ƠN i
11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier

Science Publishing CO, INC, p. 1-70 45
26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761-
789, 879-915, 993-1018 47
ii
DANH MỤC HÌNH
LỜI CẢM ƠN i
11. William MF, Catherine TK, (1990), “Microbial enzymes and biotechnology”. Elsevier
Science Publishing CO, INC, p. 1-70 45
26. John RW (2002), “Handbook of Enzymology”. Marcel Dekker Inc, p. 707-718, 761-
789, 879-915, 993-1018 47
iii
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như:
công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Các enzyme đang được
sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase, glucooxydase, …
Cellulase là một trong số các enzyme được ứng dụng phổ biến trong công nghệ thực
phẩm, công nghiệp dệt, bia - rượu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y tế, xử lý môi
trường, Đặc biệt hiện nay cellulase được toàn thế giới quan tâm nghiên cứu và phát
triển nhằm ứng dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh học. Đây là nguồn nhiên
liệu thân thiện với môi trường và có thể giải quyết được vấn đề thiếu nhiên liệu khi các
nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn kiệt.
Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase được sử dụng trong các ngành công nghiệp ở
Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Nước ta là một nước
sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme cellulase là rất
phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự
nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật
có khả năng sản xuất enzyme nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các
nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi
sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do

trên và tình hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ
rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật
chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao
làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong
biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm.
Nội dung của đề tài:
1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh
cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang;
1
2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được;
3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của chủng vi sinh tuyển chọn được.
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh được các hạn
chế. Em rất mong nhận được các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề
này, để cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn.
2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE
1.1.1. Giới thiệu về cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng
có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào
vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi.
Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose
Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch
thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với
nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4
glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch nhau một góc 180
o
và có

dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và
3
được cấu tạo như hình 1.1 và hình 1.2.
Hình 1.2. Cấu
trúc phân tử
celulose
Cellulose
là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân
hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có
nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên
nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả năng phân hủy
cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá
và cộng sự, 2007).
Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đường
β-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới
tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-
glucananse hay enzyme C
1
, Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là
enzyme CMC-ase hay C
x
và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase:
• Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng
cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC
nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một
phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì
có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
• Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4-
glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình
thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy

tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm
các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động
mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.
• ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các
4
cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase,
còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức
năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của
cellulase.
Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase
Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành
cellobiose và cuối cùng thành glucose.
Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3
giai đoạn chủ yếu sau:
Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C
1
, cellulose bị thủy phân
thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân
dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme C
x
tạo thành đường cellobiose.
Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay
cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose.
5
ﾧ
Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase
Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự
nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có
loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose
trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.

1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện
hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản
phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme
6
có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn
và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia
quá trình phân giải này. Bảng 1.1 dưới đây là một số loại VSV được các nhà khoa
học nghiên cứu kỹ nhất.
7
Bảng 1.1. Một số VSV sản xuất cellulase
Nấm sợi Xạ khuẩn Vi khuẩn
Aspergillus niger
A.oryzae
A.terreus
A.syndovii
A. flavus
Fusarium culmorum
Fusarium oxysporum
Mucor pusilus
Pen. notatum
Penicillium spp
Trichoderma lignorum
Trichoderma reesei
Trichoderma viride
Trichoderma konongi
Actinomyces aureus
Act.cellulose
Act.diastaticus
Act. roseus

Act.griseus
Act.melamocylas
Act.coelicolor
Act.candidus
Act.chromogenes
Act. hygroscopicus
Act.griseofulvin
Act.ochroleucus
Act.thermofulcus
Act.xanthostrums
Thermonospora curvata
Preudomonas
Fluorescens
B.megaterium
B.mensenteroides
Clostridium sp.
Acetobacter xylinum
Vi khuẩn dạ cỏ
Ruminoccus albus
Ruminobacter parum
Bacteroides
Amylophillus sp.
Clos.butiricum
Clos.locheheadil
Cellulosemonas
1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE
Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công
nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu,
công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất
giấy, trong nông nghiệp

Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là tăng độ hấp
thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt
là đối với thức ăn cho trẻ em. Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau
quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo, mỳ… hay xử lý
8
chè và các loại tảo biển… Hay trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, cellulase
cùng với hemicellulase được ứng dụng nhằm làm tăng khả năng hấp thu các chất từ
thức ăn.
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có
cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động
của protease và quá trình đường hóa.
Trong sản xuất agar-agar, sử dụng cellulase xúc tác để xử lý rong thu agar-
agar có chất lượng cao hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào.
Mặt khác khi sử dụng cellulase để xử lý rong thu agar-agar lại giúp hạn chế ô nhiễm
môi trường so với phương pháp sử dụng acid vốn gây ô nhiễm môi trường.
Cellulase ứng dụng trong xử lý môi trường: enzyme cellulase đóng một vai trò
vô cùng quan trọng trong việc phân hủy cellulose có trong chất thải, sự có mặt của
enzyme cellulase sẽ giúp cho sự phân hủy cellulose trong tự nhiên dễ dàng và hiệu
quả hơn. Hiện nay enzyme cellulase là thành phần quan trọng của chế phẩm sinh
học (các chế phẩm EM) trong xử lý ô nhiễm môi trường.
Trong nông nghiệp, cellulase được dùng để phân hủy cellulose từ các phế phụ
phẩm để sản xuất phân bón hữu cơ thay thế cho các loại phân bón hóa học truyền
thống làm giảm ô nhiễm môi trường cũng như sự thoái hóa đất.
Trong ngành công nghệ sản xuất bột giặt enzyme cellulase được sử dụng như
một tác nhân nhằm làm hoàn thiện cho bột giặt (tẩy sạch vết bẩn, vải rờ mịn tay, sợi
vải sáng bóng hơn và không làm hại da tay).
Cellulase được ứng dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sự phá vỡ màng
tế bào là một việc đòi hỏi các kỹ thuật công phu và tốn kém. Người ta có thể thu
nhận các tế bào trần bằng phương pháp xử lý qua enzyme cellulase. Khi đó ta sẽ thu
được tế bào trần của thực vật (protoplast) và tế bào trần nấm men (spheroplast).

Chế phẩm cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong
kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplas), người ta thường dùng chế phẩm cellulase tinh
khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng cellulase phá vỡ thành tế bào thực
vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn các
9
nhân tố di truyền.
Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulose
thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang được quan tâm đặc biệt trong ngành công
nghiệp năng lượng sạch của toàn thế giới.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950. Cuối thế
kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các
loại vi sinh vật. Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một sồ tác giả như :
Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp. (Lusta và cộng sự,
1999), Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985), Fusarium lini, Penicillium
funiculosum (Fogarty & Kelly, 1990). Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên
cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm
phức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân
hoàn toàn cellulose.
Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì
Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lượng lớn, và
được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự,
1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumilus
(Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp. KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) và
KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989).
Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên rất nhiều nghiên cứu về enzyme
cellulase như: nghiên cứu về các tính chất hóa lý của chúng như xác định khối
lượng phân tử của Macarrón và cộng sự (1993); Sang và cộng sự (1995);
Henriksson và cộng sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và cộng sự

(2002); Hiroshi và cộng sự (2005), xác định nhiệt độ tối ưu của Isabel và cộng sự
(1992); Macarrón và cộng sự (1993); Coral và cộng sự (2002), xác định pH tối ưu
(Macarrón và cộng sự, 1993; Coral và cộng sự, 2002), xác định ảnh hưởng của ion
kim loại (Sang và cộng sự, 1995).
10
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật
phân hủy cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và
cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự,
2006). Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật
và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase như: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả
năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ
chủng penicillium sp. DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Nghiên cứu
phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ưa nhiệt XKS
2
(Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006).
Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Việt Nam chưa có công trình nào công
bố về việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong
giấy. Vì thế việc “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh
enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” là cần thiết nhằm thu thập các
chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy
với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase ứng dụng trong sản
xuất cồn từ rong biển - một hướng đang được toàn thế giới quan tâm.
11
CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Rong giấy:
Mẫu rong giấy mục được lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang. Rong Giấy
có tên khoa học là: Ulva retieulata, Thuộc ngành: Chlorophyta, lớp:

Chlorophyceae, bộ: Ulvales.
2.1.2. VSV sinh cellulase:
Bao gồm cả nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn hiện diện trên rong giấy.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
* Môi trường phân lập VSV: các loại môi trường sử dụng: thạch thường,
capek, ISP
4
, các môi trường đường (glucose, maltose, manitol, D-frucrose, sucrose,
lactose) đều của Merck - Đức cung cấp.
* Môi trường ISP - 4 (g/l):
K
2
HPO
4
.3H
2
O 1 g
MgSO
4
.7H
2
O 1 g
CaCO
3
2 g
(NH
4
)
2
SO

4
2 g
Tinh bột tan 10 g
NaCl 1 g
Agar 15 g
Nước 1 lít
pH 6 - 7
* Môi trường Capek - dox (g/l):
NaNO
3
3 g
KH
2
PO
4
1 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5 g
KCl 0,5 g
Saccarose 30 g
Agar 20 g
12
Nước cất 1 lít
pH 5 - 6
* Môi trường thạch thường (g/l):
Nước mắm 10 ml
Pepton 10 g

Agar 15 - 20 g
Nước 1 lít
pH 7
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VSV có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phân giải
tốt cơ chất cellulose. Vì thế các chủng VSV sinh enzyme cellulase cao thường hiện diện ở
những nơi giàu nguồn cellulose như: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục, mùn cưa mục hay
hiện diện trên thân rong… Vì thế chúng tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn những
VSV sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn các chủng sinh cellulase cao
theo các bước sau:
- Thu rong giấy đã ủ mục tại bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang.
- Phân lập và tuyển chọn các chủng VSV trên môi trường thạch đặc trưng
(chọn chủng VSV có vòng phân giải CMC lớn nhất là chủng có khả năng sinh
cellulase cao nhất).
- Sơ bộ phân loại các chủng VSV được tuyển chọn bằng phương pháp truyền
thống.
- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của
chủng VSV được tuyển chọn.
2.2.1. Phương pháp phân lập
Tiến hành phân lập các mẫu rong như sau:
Lấy 10 g rong đã ủ mục cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước cất đã vô
trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau. Pha loãng mẫu theo
các nồng độ từ 10
-1
- 10
-8
. Lấy 1 ml ở bình tam giác sau khi lắc đều cho vào ống
nghiệm thứ nhất chứa 90 ml nước cất, lắc đều rồi lại lấy 1 ml cho vào ống nghiệm
thứ hai, cứ làm như vậy cho đến khi được nồng độ thí nghiệm (để có số khuẩn lạc
13

trên đĩa phù hợp, mẫu thường được pha loãng. Do hiếm khi biết trước được nồng độ
VSV trong mẫu, người ta dùng nhiều nồng độ khác nhau). Tùy vào số lượng VSV
nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thường từ 10
-3
– 10
-8
).
Dùng môi trường thạch thường để phân lập các chủng vi khuẩn, môi trường
Capek để phân lập các chủng nấm và môi trường ISP
4
để phân lập các chủng xạ
khuẩn. Các môi trường được hấp khử trùng rồi phân phối vào các đĩa peptri. Dùng
pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ
và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt thạch. Sau đó cất
và nuôi cấy mẫu phân lập ở 37
0
C. Sau khoảng 24 h vi khuẩn đã phát triển trên đĩa
thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc đối với vi khuẩn. Sau 2 - 3
ngày đối với nấm và 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn.
+ Đối với vi khuẩn: bề mặt nhẵn, ướt, khi dùng que gạt không còn lại trong
thạch.
+ Đối với xạ khuẩn: bề mặt khô xù xì, có hình tròn.
+ Đối với nấm: có hệ sợi.
Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri
cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để
cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 37
0
C. Sau các khoảng thời gian
thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạch
nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra

độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi. Khi được
khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống
(hình 2.1).
Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn
lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống
thạch nghiêng để được giống thuần khiết. Giống thuần khiết được bảo quản trong tủ
lạnh ở nhiệt độ 4
0
C, thời gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền
định kì để đảm bảo dinh dưỡng cho vi sinh vật. Trước khi sử dụng chủng thuần
khiết cần được hoạt hóa.
14
Hình 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy
Lưu ý: Mọi thao tác trên phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng:
• Tay và bề mặt tiếp xúc trong tủ cấy được khử trùng bằng cồn.
• Không khí trong tủ cấy được khử trùng bằng tia UV.
• Dụng cụ phải được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn.
2.2.2. Phương pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất
VSV được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng, trong môi trường
dịch thể. Sau 24 h đối với vi khuẩn, 36 - 48 h đối với nấm và 72 h đồi với xạ khuẩn
tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút hoặc lọc thu
dịch enzyme rồi đem xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp Miller (phụ lục
02), (Miller, 1959).
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp
* Phương pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp
Nấm mốc được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở các khoảng thời gian: 6; 12; 18;
24;30; 36; 42; 48; 54 và 60 h. Sau đó lọc thu sinh khối và xác định hoạt độ enzyme.
* Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
15
Nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35;

40; 45; 50
o
C. Sau 36 - 48 h sấy ở nhiệt độ 50
0
C, đem nghiền mịn bằng máy nghiền
bi rồi cho vào đó một lượng nước gấp 4 - 5 lần khối lượng canh trường để hòa tan
protein-enzyme từ khối canh trường nấm sợi. Sau đó đem xác định hoạt độ enzyme
cellulase bằng phương pháp đổ dịch.
* Phương pháp xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp
Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trường có chứa
nồng độ chất cảm ứng (rơm và rong) ở các nồng độ từ 1% - 8%. Sau 36 - 48 h thu
dịch lọc và xác định hoạt tính enzyme cellulase.
* Phương pháp xác định pH môi trường nuôi cấy thích hợp
Nấm mốc được nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trường có pH là :
3,4,5,6,7,8 ở nhiệt độ phòng. Sau 36 - 48 h đem xác định hoạt tính enzyme.
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp
2.2.4. Phương pháp phân loại chủng VSV (phân loại theo phương pháp
16
truyền thống)
Phân loại theo phương pháp truyền thống là phương pháp phân loại chủng
VSV dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Dựa vào đó người ta phân
loại chúng và các chi. Đối với nấm sợi chúng tôi tiến hành phân loại bằng phương
pháp quan sát đặc điểm hình thái đặc trưng trên kính hiển vi.
Nguyên lý:
Nấm thường được nhận diện bằng các đặc điểm hình thái đặc trưng quan sát
được dưới kính hiển vi. Tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty
thể. Sợi nấm có thể có hay không có vách ngăn. Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơ
chất thường là những cấu trúc mang bào tử. Cuống mang bào tử có thể phân nhánh
hay không phân nhánh. Bào tử vô tính của nấm sợi thường tập trung trong hai nhóm
là bào tử kín và bào tử trần.

• Cách tiến hành:
- Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên đĩa petri.
- Lấy một miếng băng dính trong suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm,
sau đó lấy ra và áp sát vào phiến kính sao cho băng dính dính chặt vào phiến kính.
- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi.
2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đường và khả năng sinh hơi
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy vào mỗi ống nghiệm có
chứa từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 37
o
C. Sau 24 - 72 h lấy ra đọc kết quả:
Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và ngược
lại; VSV có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml.
2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối
Cấy vi sinh vật lên đĩa peptri chứa môi trường đặc trưng với các nồng độ muối
khác nhau từ 1 - 11%, giữ trong tủ ấm 37
o
C. Sau 1 - 5 ngày lấy ra đọc kết quả, nếu
VSV mọc được ta kết luận chúng có khả năng chịu muối và ngược lại.
2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác
(protease và amylase)
17
Nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường capek lỏng, lắc 200 vòng/phút, sau 36
– 48 h tiến hành thu dich lọc và xác định hoạt tính các enzyme theo phương pháp
khuếch tán trên môi trường thạch chứa cơ chất đặc trưng (casein với protease và
tinh bột với amylase). Để tủ ấm 37
0
C trong 24 h rồi đổ lugol và xác định hoạt tính
enzyme bằng cách đo vòng thủy phân.
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phương pháp thống kê sinh học. Mỗi thí nghiệm

đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí
nghiệm.
Số liệu được xử lý được vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tương quan R ≥ 0,95.
2.4. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
Sử dụng các thiết bị hiện đại có tại phòng thí nghiệm CNSH: thiết bị ly tâm
(Eppendorf Centrifuge 5417R - Mỹ), máy vortex (máy trộn mẫu BE34), tủ lạnh
(NANO Silver, Việt Nam), kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic
BA 300 - Mỹ), máy lắc (GFL 3005 - Đức), tủ cấy (Telstar AV 100 - Tây Ban Nha),
tủ sấy (Binder - Đức), tủ ấm Memmert - Đức,
18
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH
CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY
Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phân
cellulose, chúng tôi tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong giấy đã mục thu tại bãi
biển Hòn Chồng - Nha Trang. Sử dụng môi trường thạch thường để phân lập vi
khuẩn, môi trường Capek để phân lập nấm mốc và môi trường ISP
4
để phân lập xạ
khuẩn. Sơ tuyển VSV bằng phương pháp đặt thỏi thạch trên môi trường CMC và
xác định hoạt tính enzyme cellulase bằng cách đo vòng thủy phân trên CMC. Kết
quả phân lập thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập
STT Ký hiệu chủng Hoạt tính cellulase (D-mm)
1 VK1 27
2 VK2 24
3 VK3 23
4 VK4 30
5 VK5 24
6 VK6 12

7 VK7 15
8 N1 32
9 N2 36
10 N3 48
11 N4 40
12 N5 31
13 XK1 24
14 XK2 26
15 XK3 31
16 XK4 30
Nhận xét:
Kết quả phân lập ở bảng 3.1 cho thấy đã phân lập được 16 chủng VSV có khả
năng sản xuất enzyme cellulase, trong đó có 14 chủng VSV có hoạt tính enzyme
cellulase cao bao gồm 7 chủng vi khuẩn, 4 chủng nấm mốc và 4 chủng xạ khuẩn.
Từ những chủng có họat tính cellulase cao, chúng tôi chọn được bốn chủng VSV
19
có vòng thủy phân cellulose mạnh nhất gồm VK
4
, N3, N4 và XK
4
. Tiếp tục xác định
hoạt độ enzyme cellulase theo phương pháp Miller để chọn chủng có hoạt tính
cellulase cao nhất. Kết quả xác định hoạt tính cellulase được thể hiện như sau (bảng
3.2).
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển
Chủng
Hoạt tính
cellulase (mm)
Hoạt tính C
1

(đơn vị/ml)
Hoạt tính C
x
(đơn vị/ml)
VK4 24 x x
N3 35 0,147 0,189
N4 32 0,192 0,182
XK4 25 x x
Ghi chú: x coi như không có hoạt tính (lượng dịch enzyme không đủ làm
chuyển màu của methylene xanh (phụ lục 02)).
Qua bảng kết quả xác định họat tính cellulase, chúng tôi chọn được hai chủng
nấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập được từ rong giấy đã ủ mục tại bãi biển
Hòn Chồng - Nha Trang là những chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất (hình
3.1 và 3.2). Hai chủng này được đem bảo quản và phục vụ cho các thí nghiệm về
sau.
20

Hình 3.1. Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất
(N3 và N4) được tuyển chọn
21

Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC
3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4
TUYỂN CHỌN ĐƯỢC
3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian
Tiến hành nuôi cấy hai chủng N3 và N4 trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút
trong môi trường Capek, sau các khoảng thời gian: 6; 12; 18; 24; 30; 36; 42; 48; 54;
60 h lấy mẫu để xác định hoạt tính của enzyme cellulase và đo sinh khối tế bào. Kết
22