Kỹ thuật PCR trong y học

KỸ THUẬT PCR VÀ
REALTIME-PCR
Dương Thị Loan
MỤC TIÊU
1. N m đ c nguyên t c chung c a quá trình ly ắ ượ ắ ủ
trích DNA - RNA
2. Hi u rõ nguyên t c c a k thu t PCR.ể ắ ủ ỹ ậ
3. K đ c các chu k nhi t trong ph n ng ể ượ ỳ ệ ả ứ
PCR.
4. K tên đ c các thành ph n chính tham gia ể ượ ầ
trong ph n ng PCR.ả ứ
5. Nêu đ c s khác nhau c a ph n ng PCR ượ ự ủ ả ứ
và Realtime-PCR
KHÁI NIỆM

PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay "phản ứng
khuếch đại gen“(polymerase chain reaction)

Là một kỹ thuật phổ biến trong lĩnh v c ự sinh học
phân tử, tạo ra nhiều bản sao c a ủ một đoạn DNA
mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli
hay nấm men.

Được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y
học v i ớ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện
các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những
bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và
xác định huyết thống.
CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO VI KHUẨN
CẤU TRÚC VIRUS VIÊM GAN C

Ly trích DNA gồm 3 bước cơ bản
Phá vở cấu trúc tế bào
Dùng các hóa chất loại bỏ
Lipid màng tế bào, protein
Tủa DNA với alcohol
NGUYÊN T C LY TRÍCH DNAẮ
NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT PCR

PCR là một thử nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi
nucleic acid ban đầu thành hàng tỷ bản sao, sau
đó bằng phương pháp điện di trên mội trường
thạch, các sản phẩm PCR sẽ được phát hiện
dưới ánh sáng đèn UV. Ðể thực hiện được việc
khuếch đại acid nucleic đích, thử nghiệm PCR
dựa vào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có 3
bước.
NGUYÊN LÝ
NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT PCR

Sau 30 đến 40 chu kỳ nhiệt, để hoàn tất thử
nghiệm PCR, thường có thêm một giai đoạn gọi
là bù thêm (soaking). Giai đoạn này nhiệt độ
được giữ 72°C trong thời gian tương đối lâu (10
phút). Ðây là giai đoạn để một số các bản sao
của DNA đích vì một lý do nào đó trong các giai
đoạn kéo dài của các chu kỳ PCR, không kéo
dài được một cách đồng bộ như các bản sao
khác, có thể kéo dài để hoàn tất chiều dài của
sản phẩm PCR.
NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT PCR


Như vậy từ một số lượng N DNA đích ban đầu,
sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR đã tổng hợp
được N. 2
n
bản sao.

Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản
phẩm PCR (PCR product) hay amplicon rất lớn
(trên 10
9
bản sao) sau 30 chu kỳ

Những sản phẩm PCR được phát hiện bằng các
phương pháp phát hiện nucleic acid (điện di trên
môi trường thạch).
QUI TRÌNH KỸ THUẬT PCR

Bước 1: Khởi đầu. Đun hỗn hợp ở 96 °C trong vòng 5
phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm
nóng. DNA-Polymerase có tác d ng t t nh tụ ố ấ .

Bước 2: Biến tính (denaturation). 96 °C trong 30
giây. Đối với mỗi chu kì thì lượng thời gian này là đủ
để biến tính DNA.

Bước 3: Gắn mồi (Annealing). 65 °C trong 30 giây.

Bước 4: Kéo dài (Elongation).72 °C trong 45 giây.
THÀNH PHẦN CHỦ YẾU

CỦA THỬ NGHIỆM PCR
THÀNH PHẦN CHỦ YẾU
CỦA THỬ NGHIỆM PCR
DNA hay nucleic acid đích (DNA
template), t c là chu i acid nucleic ( đo n ứ ỗ ạ
acid nucleic đ c hi u c a vi khu n gây b nh, ặ ệ ủ ẩ ệ
c a gene b nh lý, c a d u n di truy n,. ). Vì ủ ệ ủ ấ ấ ề
v y v n đ s a so n b nh ph m cho th ậ ấ ề ử ạ ệ ẩ ử
nghi m PCR ph i đ c coi tr ng, đ c bi t ệ ả ượ ọ ặ ệ
trong các phòng thí nghi m áp d ng PCR đ ệ ụ ể
ch n đoán phát hi n b nh. ẩ ệ ệ
THÀNH PHẦN CHỦ YẾU
CỦA THỬ NGHIỆM PCR
•
Primer hay đo n m i, t c là nh ng đo n DNA đ n ạ ồ ứ ữ ạ ơ
(oligonucleotide) có kích th c ch vài ch c base (18-30), ướ ỉ ụ
có th b t c p theo nguyên t c b sung vào đo n kh i ể ắ ặ ắ ổ ạ ở
đ u và đo n k t thúc c a chu i DNA đích. Trong th ầ ạ ế ủ ỗ ử
nghi m PCR, đo n m i có hai vai trò chính : (*) Quy t ệ ạ ồ ế
đ nh nên tính đ c hi u c a th nghi m, nghĩa là ch có ị ặ ệ ủ ử ệ ỉ
th b t c p trên chu i đích mà không th b t c p đ c ể ắ ặ ỗ ể ắ ặ ượ
trên các chu i DNA khác ngoài chu i đích, (**) Kh i ỗ ỗ ở
đ ng men polymerase đ t ng h p s i b sung cho chu i ộ ể ổ ợ ợ ổ ỗ
DNA đích m t khi nó nh n d ng đ c đ u 3’, Thông ộ ậ ạ ượ ầ
th ng trong ph n ng PCR, ng i ta dùng m t c p ườ ả ứ ườ ộ ặ
m i, g i là ồ ọ primer set, trong đó có m t ộ m i lênồ g i là ọ up-
stream primer và m t ộ m i xu ngồ ố g i là ọ down-stream
prime. C p m i này quy t đ nh nên kích th c c a s n ặ ồ ế ị ướ ủ ả
ph m PCR. ẩ
THÀNH PHẦN CHỦ YẾU

CỦA THỬ NGHIỆM PCR
•
dNTP: t c là đ n v đ có th t ng h p đ c các b n ứ ơ ị ể ể ổ ợ ượ ả
sao c a DNA đích. dNTP có c u t o g m m t đ ng ủ ấ ạ ồ ộ ườ
deoxyribose có g n m t base, có th là adenine ắ ộ ể
(dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay
guanine (dGTP) , carbone s 1 (C1). Ba phân t ở ố ử
phosphate (triphosphate) đ c g n t i carbone s 5 ượ ắ ạ ố
(C5) c a phân t deoxyribose này và đây chính là n i ủ ử ơ
mà dNTP g n vào đ u 3’ c a chu i b sung trên ắ ầ ủ ỗ ổ
chu i đích. Năng l ng đ cho ph n ng này x y ra ỗ ươ ể ả ứ ả
đ c l y t các n i phosphate giàu năng l ng c a ượ ấ ừ ố ươ ủ
triphosphate trên dNTP. Ðó cũng chính là lý do t i ạ
sao ph i là dNTP ch không ph i là dNDP ả ứ ả
(diphosphate) hay dNMP (monophosphate).
THÀNH PHẦN CHỦ YẾU
CỦA THỬ NGHIỆM PCR
•
Men polymerase, ph i là men polymerase ch u ả ị
đ c nhi t đ . Ngày nay có nhi u lo i ượ ệ ộ ề ạ
polymerase ch u đ c nhi t đ đã đ c ly trích ị ượ ệ ộ ượ
ho c t ng h p, tùy m c đích s d ng mà chúng ặ ổ ợ ụ ử ụ
ta có th ch n polymerase thích h p. Th ng ể ọ ợ ườ
dùng nh t trong các phòng thí nghi m là men ấ ệ
Taq polymerase. Là men polymerase trích t vi ừ
khu n ẩ Thermus aquaticus, là các vi khu n s ng ẩ ố
đ c trong các su i n c nóng.ượ ố ướ
THÀNH PHẦN CHỦ YẾU
CỦA THỬ NGHIỆM PCR
•

Dung d ch đ mị ệ cho ph n ng PCR, th ng ả ứ ườ
ch a mu i đ m Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và ứ ố ệ
MgCl
2
1.5mM. Ngoài ra dung d ch đ m PCR còn ị ệ
có th ch a 0.001% BSA hay Gelatine và trong ể ứ
m t s ph n ng PCR còn có th thêm tween ộ ố ả ứ ể
hay formamide. Trong các thành ph n trên, nh ầ ả
h ng đ n th nghi m PCR nhi u nh t là n ng ưở ế ử ệ ề ấ ồ
đ MgClộ
2
, vì v y đ có đ c m t th nghi m ậ ể ượ ộ ử ệ
PCR có đ nh y cao, ph n ng rõ nét, ng i ta ộ ạ ả ứ ườ
ph i t i u hóa ph n ng b ng cách thăm dò ả ố ư ả ứ ằ
m t n ng đ MgCl2 thích h p nh t.ộ ồ ộ ợ ấ
MÁY PCR

Ngoài ra, một thiết bị
hết sức quan trọng cho
thử nghiệm PCR là
máy chu kỳ nhiệt
(thermal cycler) là máy
có thể đưa nhiệt độ
trong buồng ủ PCR lên
cao rồi hạ xuống trong
những khoảng thời gian
nhất định theo chương
trình mà người sử dụng
định sẵn.

KẾT QỦA PCR

Sản phẩm PCR có thể được nhận biết d a vàoự kích
thước của chúng qua việc sử dụng sắc ký gel agarose.
Sắc ký gel agarose là phương pháp bao gồm việc cho
mẫu sản phẩm PCR của DNA vào gel agarose và sau
đó chạy điện di trên gel. Kết quả là các đoạn DNA nhỏ
hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn qua gel từ
cực âm đến cực dương. Kích thước của sản phẩm PCR
có thể được xác định bằng việc so sánh vói thang
DNA, thang này có chứa các DNA đã biết trước kích
thước, cũng nằm trong gel (hình 3).
KẾT QỦA PCR
