luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ (tóm tắt )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



Trần Cao Sơn

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT
BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN
PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 62 72 04 10

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC





HÀ NỘI, NĂM 2015

Công trình được hoàn thành tại :
Trường Đại học Dược Hà Nội
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

Người hướng dẫn khoa học
PGS. TS. Thái nguyễn Hùng Thu
TS. Lê Thị Hồng Hảo

Phản biện 1 : ………………………………… …

Phản biện 2 : …………………………… ………
Phản biện 3 : …………………………… ………


Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án
cấp Trường tổ chức tại Trường Đại học Dược Hà Nội.
Vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia VN
Thư viện trường ĐH Dược HN

-1-

A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Tính cấp thiết của luận án
Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đóng vai trò quan trọng để phòng trừ các loại dịch
bệnh cho các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói riêng. Khi được sử dụng,
HCBVTV có thể tồn lại trong sản phẩm. Nếu lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách các
loại HCBVTV làm cho tồn dư HCBVTV trong sản phẩm tăng cao, gây ra các tác dụng không
mong muốn cho người sử dụng. Việc xác định mức tồn dư HCBVTV trong dược liệu và các
sản phẩm từ dược liệu có ý nghĩa quan trọng để sàng lọc, loại bỏ các sản phẩm không đáp ứng
được sự an toàn cho người sử dụng.
Hiện nay, có hàng nghìn HCBVTV đang được sử dụng. Các phương pháp phân tích do đó
hướng đến xác định đồng thời nhiều HCBVTV cùng lúc. Các phương pháp này được gọi là
phân tích đa dư lượng. Các phương pháp xác định HCBVTV trong dược liệu được quy định
theo các dược điển hiện nay chỉ xác định được từng nhóm HCBVTV cụ thể, và chưa có các
phương pháp để xác định các nhóm HCBVTV mới hiện nay.
Phương pháp chiết QuEChERS (viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged, Safe)

phối hợp với kỹ thuật sắc ký khí và sắc ký lỏng khối phổ là một phương pháp đa dư lượng đã
được nhiều nước chấp nhận làm phương pháp chuẩn để áp dụng phân tích HCBVTV trong
rau quả. Nhằm nghiên cứu xác định dư lượng HCBVTV trên dược liệu và các sản phẩm dược
liệu ở Việt Nam, luận án “Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong một
số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ” đã được thực hiện.
2. Mục tiêu của luận án
1. Xác định các HCBVTV thường được dùng tại một số vùng trồng dược liệu ở phía Bắc;
2. Xây dựng và thẩm định một phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV trong dược
liệu và một số sản phẩm từ dược liệu;
3. Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu.
Để đạt được mục tiêu đề ra, luận án được tiến hành với các nội dung sau:

Về khảo sát tình hình sử dụng HCBVTV
Khảo sát thông qua phiếu hỏi, thực hiện tại một số địa phương có vùng trồng dược liệu ở
miền Bắc:
- Loại HCBVTV được kinh doanh phổ biến
- Loại HCBVTV được sử dụng phổ biến trong trồng dược liệu

Về xây dựng và thẩm định phương pháp
- Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng phương pháp
QuEChERS
- Khảo sát các điều kiện phân tích HCBVTV bằng LC-MS/MS
- Khảo sát các điều kiện phân tích HCBVTV bằng GC-MS/MS
- Thẩm định phương pháp về tính chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp
lại, độ thu hồi

Về xác định dư lượng HCBVTV trong một số loại dược liệu và sản phẩm
-2-

Ứng dụng phương pháp để xác định HCBVTV trong các loại dược liệu tươi, dược liệu khô,

các sản phẩm từ dược liệu gồm thực phẩm chức năng (TPCN) dạng viên, dạng trà hay dạng
nước ép và chè xanh (khô).
3. Những đóng góp mới của luận án
3.1. Về tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc
Luận án đã xác định được 75 loại HCBVTV với 39 hoạt chất được tiêu thụ tại các vùng
trồng dược liệu ở các tỉnh phía Bắc. Nhiều nhất là nhóm lân hữu cơ có 9 hoạt chất. Có 23 hoạt
chất được sử dụng trong trồng cây thuốc. Một số địa phương người dân còn sử dụng các
HCBVTV không rõ nguồn gốc.
3.2. Về phương pháp xác định dư lượng HCBVTV
Về xử lý mẫu phân tích:
- Đã nghiên cứu và đưa ra quy trình chiết QuEChERS đồng thời với các HCBVTV nghiên
cứu đối với các nền mẫu khác nhau bao gồm dược liệu tươi, dược liệu khô, TPCN có thành
phần thảo dược và chè xanh (khô). Quy trình chiết theo QuEChERS có nhiều ưu điểm hơn
các quy trình truyền thống trước đây và các quy trình theo dược điển Việt Nam: đó là sử dụng
lượng dung môi ít hơn nên giảm các chi phí và giảm ảnh hưởng đến môi trường và sức khoẻ
kiểm nghiệm viên, quá trình chiết nhanh hơn mà vẫn đảm bảo được độ chính xác theo yêu
cầu.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với các nền mẫu dược liệu khô, cần bổ sung thêm nước
và thực hiện xử lý mẫu ngay trong khoảng 15 phút vì kéo dài thời gian này hàm lượng các
HCBVTV có xu hướng giảm trên các nền mẫu được nghiên cứu.
- Sử dụng chất hấp phụ PSA và GCB trong xử lý mẫu là cần thiết. GCB được thêm vào có
vai trò loại các tạp chất chlorophill với lượng phù hợp là 7,5 mg, nhiều hơn sẽ làm giảm độ
thu hồi của một số HCBVTV. Lượng PSA sử dụng phù hợp là 40mg, không cần thiết phải
dùng lượng lớn hơn.
- Việc chiết sử dụng các hệ dung môi không dùng đệm, có dùng đệm acetat và có dùng
đệm citrat cho thấy hệ dung môi dùng đệm acetat cho độ thu hồi tốt hơn đối với nhiều
HCBVTV. Đệm acetat cũng phù hợp hơn với thiết bị LC-MS/MS.
- Lần đầu tiên chì acetat được sử dụng trong quá trình chiết QuEChERS nhằm loại tannin
trong mẫu chè. Lượng muối chì acetat cho hiệu quả nhất là 1,5g.
- Sử dụng việc xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu cũng như dùng nội chuẩn đã giúp giảm

ảnh hưởng của các nền mẫu dưới 20%.
Điều kiện phân tích:
- Đã xác định được các điều kiện để phân tích đồng thời 25 HCBVTV bằng LC-MS/MS.
Tổng thời gian phân tích trên thiết bị là 15 phút. Mỗi HCBVTV đã xác định được 1 ion phân
tử và 2 ion sản phẩm đặc trưng nên phương pháp có tính đặc hiệu cao đối với mỗi HCBVTV.
Trong số 25 HCBVTV phân tích bằng LC-MS/MS, có nhiều HCBVTV chưa từng được báo
cáo trước đây tại Việt Nam.
- Đã xác định được các điều kiện để phân tích đồng thời 7 HCBVTV bằng GC-MS/MS.
Phương pháp sử dụng chế độ MS/MS nên rất đặc hiệu đối với các HCBVTV nghiên cứu.
Về kết quả thẩm định phương pháp:
-3-

- Phương pháp đã được thẩm định trên các nền mẫu dược liệu tươi, dược liệu khô, TPCN
có thành phần thảo dược và chè về các tiêu chí độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định
lượng, độ lặp lại và độ thu hồi. Phương pháp có độ nhạy tốt với giới hạn định lượng của tất cả
các HCBVTV nghiên cứu trên các nền mẫu nghiên cứu đều thấp hơn mức tồn dư tối đa
(MRL=0,01 mg/kg).
3.3. Về dư lượng HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm dược liệu
- Đã xác định dư lượng của 32 HCBVTV trên nhiều loại dược liệu và sản phẩm từ dược
liệu khác nhau. Trong đó, đây là lần đầu tiên dư lượng các nhóm HCBVTV neonicotinoid và
macrocyclic lacton được triển khai xác định ở Việt Nam.
- Các nền mẫu chè xanh (khô) và chè túi lọc (thảo dược) có tỷ lệ nhiễm HCBVTV rất cao;
lần lượt chiếm 50% và 40% số lượng mẫu phân tích.
4. Ý nghĩa của luận án
- Phương pháp xác định đa dư lượng HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm dược liệu
được áp dụng nhằm góp phần giám sát, kiểm tra mức độ tồn dư các HCBVTV trong các sản
phẩm này. Các kết quả kiểm nghiệm này sẽ góp phần quan trọng để loại bỏ những sản phẩm
không đảm bảo an toàn cho sức khỏe người sử dụng.
- Phương pháp đã được xây dựng và thẩm định chặt chẽ trong điều kiện trang thiết bị Việt
Nam có thể sử dụng là tài liệu tham khảo quan trọng của các PTN trong nước và quốc tế.

Phương pháp có thể được áp dụng tại các phòng thí nghiệm được trang bị hệ thống sắc ký khí
khối phổ hoặc sắc ký lỏng khối phổ. Năm 2012, phương pháp đã được đào tạo chuyển giao
cho 20 học viên từ các trung tâm kiểm nghiệm an toàn thực phẩm nhằm kiểm nghiệm dư
lượng HCBVTV trong các sản phẩm nông nghiệp và các sản phẩm thực phẩm chức năng.
- Dư lượng HCBVTV trong một số đối tượng dược liệu và sản phẩm từ dược liệu đã được
xác định. Các kết quả cho thấy vẫn còn tỷ lệ lớn dược liệu và sản phẩm dược liệu có chứa dư
lượng HCBVTV. Đây là cơ sở để tăng cường quản lý sát sao hơn nữa, tăng cường các biện
pháp giám sát, hậu kiểm để nâng cao chất lượng các sản phẩm. Việc tồn tại hàm lượng khá
lớn các HCBVTV trong các sản phẩm cho thấy cần có nhiều hơn nữa các quy định về giới
hạn tồn dư tối đa của HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu.
5. Bố cục của luận án
Luận án gồm 4 chương, 43 bảng, 40 hình, 140 tài liệu tham khảo với 27 tài liệu tiếng Việt
và 113 tài liệu tiếng Anh, 7 phụ lục. Luận án có 142 trang gồm các phần chính: Đặt vấn đề (2
trang); Chương 1: Tổng quan (46 trang); Chương 2: Đối tượng, phương tiện và phương pháp
nghiên cứu (14 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (58 trang); Chương 4: Bàn luận (22
trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang).

-4-

B. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Đã tập hợp và trình bày có hệ thống các kết quả nghiên cứu từ trước đến nay ở Việt Nam
và trên thế giới về xác định đa dư lượng HCBVTV trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu,
trong đó đi sâu giới thiệu về phương pháp chiết QuEChERS và các kỹ thuật sắc ký lỏng khối
phổ hai lần và sắc ký khí khối phổ hai lần.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu gồm 32 HCBVTV thuộc các nhóm khác nhau.

Đối tượng phân tích là các dược liệu và sản phẩm dược liệu sau:
- Dược liệu tươi: mã đề (Plantago major) và bồ công anh Việt Nam (Pterocypsela indica)
được sử dụng để xây dựng và thẩm định phương pháp. Ứng dụng phương pháp để phân
tích HCBTVTV trên 22 dược liệu tươi.
- Dược liệu khô: dây thìa canh (Gymnema sylvestre) và lá giang (Aganonerion
polymorphum) được sử dụng để xây dựng và thẩm định phương pháp. Ứng dụng
phương pháp để phân tích HCBVTV trên 30 dược liệu khô.
- TPCN có thành phần thảo dược: Mẫu trà túi lọc (trà mướp đắng) được sử dụng để khảo
sát và xây dựng phương pháp. Áp dụng phương pháp trên 140 mẫu bao gồm 3 nhóm
mẫu: dạng viên, dạng trà và dạng nước ép.
- Chè xanh (khô): Mẫu chè xanh khô (Camellia sinensis) được sử dụng để khảo sát và
xây dựng phương pháp. Áp dụng để phân tích trên 20 mẫu chè.
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn
- Hóa chất thuốc thử: Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân
tích, bao gồm methanol, acetonitril, acid acetic, magnesi sulfat, natri acetat, PSA, GCB.
- Chất chuẩn 32 HCBVTV của Sigma-aldrich hoặc của Dr. Erhenstorsfer có độ tinh khiết
trên 95%.
- Chất chuẩn nội TPP (triphenyl phosphat).
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị, máy phân tích tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
được hiệu chuẩn theo qui định của ISO/IEC 17025 gồm: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai
lần (LC-MS/MS) của ABSciex, hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) của
Agilent, cân phân tích XT22A (độ chính xác 0,1 mg) của Precisa, máy ly tâm Z383K của
Hermle và các trang thiết bị, dụng cụ khác của phòng thí nghiệm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫu
Thực hiện khảo sát các HCBVTV đang được sử dụng phổ biến, nhằm xác định đối tượng
nghiên cứu chứa nhiều nguy cơ nhiễm HCBVTV nhất.
-5-


- Công cụ: phiếu hỏi thiết kế sẵn gồm có phiếu khảo sát cơ sở cung ứng HCBVTV và phiếu
khảo sát việc sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc, chè
- Địa phương thực hiện khảo sát: Các địa phương được khảo sát bao gồm: Hà Nội, Hưng
Yên, Nam Định, Thái Nguyên, Phú Thọ, Hà Giang.
- Việc khảo sát kết hợp với lấy mẫu tại các địa phương.
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu
- Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn bộ mẫu được xay nhỏ (đối với mẫu rắn), lắc trộn đều (đối với
mẫu lỏng).
- Xử lý mẫu: Sử dụng phương pháp QuEChERS dựa trên việc chiết HCBVTV bằng
acetonitril đã được ổn định pH bằng đệm acetat và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phân bố
lỏng lỏng nhờ muối magnesi sulfat (MgSO
4
). Dịch chiết được làm sạch bằng chiết phân tán
pha rắn (d-SPE) để loại các acid hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác nhờ chất hấp
phụ PSA, GCB và MgSO
4
. Dịch chiết được tách bằng sắc ký và phân tích bằng kỹ thuật khối
phổ hai lần.
2.3.3. Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ
2.3.3.1. LC-MS/MS
- Sử dụng sắc ký lỏng pha đảo với cột sắc ký XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5
µm) của Waters, nhiệt độ cột: 30
o
C. Pha động gồm hai kênh A (acid acetic 0,1% trong nước)
và B (methanol) với chế độ gradient, tốc độ dòng: 0,7 mL/phút. Thể tích tiêm mẫu: 10 µL.
- Khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+). Mỗi HCBVTV lựa chọn 1 ion phân tử, bán phá và
lựa chọn 2 ion sản phẩm để định lượng và xác nhận.
2.3.3.2. GC-MS/MS
- Sử dụng cột sắc ký DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) với nhiệt độ buồng bơm mẫu:

250
o
C, chế độ tiêm mẫu không chia dòng. Khí mang heli, tốc độ dòng 0,8 mL/phút. Chương
trình nhiệt độ: 60
o
C (giữ trong 2 phút), tăng 20
o
C /phút lên 180
o
C (0 phút), sau đó tăng 4
o
C
/phút lên 260
o
C (giữ trong 2 phút). Nhiệt độ bộ phận kết nối sắc ký khí và khối phổ: 280
o
C
- Bộ tiêm mẫu tự động CTC-Pal với thể tích tiêm mẫu 1 µL
- Khối phổ ba tứ cực với nguồn ion hoá: EI 70 eV, nhiệt độ nguồn Ion: 230
o
C, cắt dung
môi 5 phút. Phân tích ở chế độ MRM với 1 ion phân tử và 2 ion sản phẩm cho mỗi HCBVTV.
2.3.4. Phương pháp thẩm định
Thẩm định các thông số cơ bản của phương pháp bao gồm
2.3.4.1. Độ chọn lọc
Đánh giá tính chọn lọc theo hai phương pháp:
- Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không được cho tín hiệu,
trong khi mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu tương đồng với mẫu chuẩn.
- Đánh giá điểm xác nhận và tỷ lệ ion theo tiêu chuẩn châu Âu EC 657/2002.
2.3.4.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu thêm
chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định tỷ lệ tín hiệu
chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) dựa vào phần mềm của thiết bị.
- LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3).
-6-

- LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10).
2.3.4.3. Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và
khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu
được vào nồng độ cho đến khi không còn tuyến tính.
Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu
đến kết quả phân tích.
2.3.4.4. Độ lặp lại và độ thu hồi
Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp
lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ thực hiện 6 lần.
Độ thu hồi còn được xác định trên nền mẫu thực bằng cách thêm chuẩn trên nền mẫu đã
được xác định là có HCBVTV và xác định độ thu hồi.
2.3.5. Phân tích mẫu thực
Sử dụng đường chuẩn trên nền mẫu thực với các nền mẫu phù hợp với đối tượng cần phân
tích để tính kết quả.
2.3.6. Xử lý kết quả
Các kết quả tích phân diện tích và định lượng được xử lý theo phần mềm của thiết bị phân
tích: Phần mềm Analyst của thiết bị LC-MS/MS và phần mềm Mass Hunter của thiết bị GC-
MS/MS. Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsolf Excel.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Khảo sát tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc
3.1.1. Nguồn cung hóa chất bảo vệ thực vật
3.1.1.1. Kiến thức và thực hành kinh doanh HCBVTV

Trong số 19 cơ sở, có 15 cơ sở có giấy đăng ký buôn bán thuốc bảo vệ thực vật. 4 cơ sở
không có giấy phép kinh doanh. 63% số nhân viên kinh doanh của cơ sở buôn bán HCBVTV
đều không được đào tạo chuyên ngành về HCBVTV hay có chứng chỉ đào tạo ngắn hạn về
HCBVTV. Có khoảng 50% các cơ sở và nhân viên kinh doanh chưa tiếp cận các danh mục
HCBVTV được phép sử dụng, cấm sử dụng và hạn chế sử dụng do các danh mục này không
sẵn có tại nơi bán.
3.1.1.2. Các HCBVTV được buôn bán phổ biến
Hầu hết các HCBVTV được bán tại các cơ sở đều nằm trong danh mục cho phép sử dụng ở
Việt Nam, chỉ có 2 HCBVTV nằm trong danh mục HCBVTV hạn chế sử dụng ở Việt Nam
(hoạt chất là carbofuran và kẽm phosphid). Trong số 75 HCBVTV được kinh doanh, có 9
HCBVTV gồm hai thành phần và 2 HCBVTV gồm 3 thành phần. Đa số các HCBVTV được
sử dụng để trừ sâu hại, các HCBVTV khác được sử dụng để trừ cỏ và trừ nấm. Ngoài ra, có
một số HCBVTV không rõ nguồn gốc vẫn được người dẫn sử dụng.
Tổng số hoạt chất là 39 hoạt chất trong đó nhóm phosphor hữu cơ là nhóm HCBVTV có
nhiều hoạt chất và tên thương mại được sử dụng nhất (9 hoạt chất chiếm 23% và 20 tên
thương mại chiếm 51%). Nhóm pyrethroid tuy chỉ có 3 hoạt chất được sử dụng nhưng có
thành phần cypermethrin được sử dụng rất phổ biến (9 tên thương mại). Bên cạnh đó, nhóm
-7-

neonicotinoid cũng là nhóm HCBVTV được kinh doanh rất phổ biến với 2 hoạt chất chính là
imidacloprid và acetamiprid.
3.1.2. Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc tại Hà Nội và một số vùng
lân cận
Tại thời điểm khảo sát, tại xã Tân Quang (Văn Lâm, Hưng Yên) có 17 loại cây thuốc; trong
khi tại xã Bình Minh (Khoái Châu, Hưng Yên) có 15 loại cây thuốc được trồng. Trong khi đó,
tại các cơ sở bán buôn bán lẻ dược liệu ở Ninh Hiệp và Lãn Ông (Hà Nội), hầu như có thể
mua được các loại dược liệu khác nhau. Ở Hải Hậu (Nam Định) một số địa phương áp dụng
mô hình GACP theo hợp tác với các công ty Dược để trồng cây thuốc như dây thìa canh, đinh
lăng. Ngoài ra, vùng trồng chè xanh ở Tân Cương (Thái Nguyên) cũng đã được khảo sát. Qua
khảo sát ở các địa phương nói trên, đa số các loại cây thuốc được trồng thuộc loại thân thảo

hoặc dây leo, giống cây ngắn ngày và bộ phận sử dụng là phần trên mặt đất.
Có nhiều loại HCBVTV đã được sử dụng trong trồng cây thuốc, tuỳ thuộc vào loại cây
thuốc và mục đích. Có 21/28 loại thuốc (75%) các loại HCBVTV là thuốc dùng để diệt trừ
sâu, trong đó một số hoạt chất thường được sử dụng là cypermethrin, chlorpyrifos, abamectin,
emamectin, imidacloprid, acetamiprid…

3.2. Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời hóa chất bảo vệ thực vật trong dược
liệu
3.2.1. Xây dựng các điều kiện sắc ký khối phổ
3.2.1.1. Điều kiện sắc ký lỏng khối phổ
Trong nghiên cứu này, cột pha đảo XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5µm)
(Waters, Mỹ) được sử dụng để tách các HCBVTV. Tiền cột XBridge C18 (20mm x 3,9 mm;
3,5 µm) (Waters, Mỹ) được sử dụng để bảo vệ cột. Khảo sát và tối ưu chế độ gradient phù
hợp để tách các HCBVTV với pha động gồm 2 kênh: A (acid acetic 0,1% trong nước) và B
(methanol): Ban đầu 25% B đến 1 phút, tăng lên 90% từ 1-8 phút; giữ 90% B trong 4 phút và
đưa về điều kiện ban đầu. Tổng thời gian 15 phút.
Sử dụng khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+), tiêm dung dịch chuẩn của các HCBVTV để
tối ưu hóa các điều kiện. Lựa chọn 1 ion phân tử và hai ion sản phẩm cho mỗi HCBVTV. Đã
lựa chọn được các điều kiện tối ưu để phân tích 25 HCBVTV bao gồm: acetochlor, aldicarb,
atrazin, azoxystrobin, abamectin, acetamiprid, carbaryl, carbofuran, carbendazim, carboxin,
dichlorvos, dimethoat, edifenphos, emamectin, fenobucarb, imidacloprid, indoxacarb,
isoprocarb, methiocarb, methomyl, profenofos, propoxur, tebuconazol, thiamethoxam và
trichlorfon.
Qua đánh giá độ lặp lại của thiết bị cho thấy hệ số biến thiên của diện tích píc dao động từ
1,9 đến 5,0% đáp ứng yêu cầu để ứng dụng phương pháp khối phổ (≤ 5%), trong khi hệ số
biến thiên của thời gian lưu rất thấp (< 1%) cho thấy thiết bị có độ ổn định đáp ứng yêu cầu.
3.2.1.2. Điều kiện sắc ký khí khối phổ
Các điều kiện về cột tách, pha động, điều kiện gradient nhiệt độ, thể tích tiêm mẫu đã được
lựa chọn để phân tích đồng thời 7 HCBVTV. Pha tĩnh với tính phân cực trung bình yếu ((5%-
Phenyl)-methylpolysiloxan) đã được sử dụng: Cột DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm). Thời

-8-

gian lưu của các HCBVTV được khóa theo chương trình phụ thuộc áp suất. Mỗi HCBVTV
được lựa chọn ít nhất 1 ion phân tử và 2 ion sản phẩm để định lượng và xác nhận. Các
HCBVTV được phân tích bằng GC-MS/MS bao gồm Acephat, aldrin, chlorothalonil,
chlorpyrifos, cypermethrin, endosulfan sulfat và permethrin.
Qua đánh giá độ lặp lại của thiết bị cho thấy hệ số biến thiên của diện tích píc dao động từ
1,6 đến 4,5% đáp ứng yêu cầu để ứng dụng phương pháp khối phổ (≤ 5%), trong khi hệ số
biến thiên của thời gian lưu rất thấp (< 1%) cho thấy thiết bị có độ ổn định đáp ứng yêu cầu.
3.2.2. Xây dựng quy trình chiết hóa chất bảo vệ thực vật từ một số dược liệu và sản phẩm
dược liệu
3.2.2.1. Nền mẫu dược liệu tươi
- Lựa chọn dung môi chiết: So sánh 3 quy trình phân tích sử dụng các dung môi acetonitril
(quy trình 1), acetonitril với đệm citrat (quy trình 2) và acetonitril với đệm citrat (quy trình 3).
Các kết quả cho thấy hầu hết các HCBVTV cho hiệu suất cao hơn khi xử lý bằng quy trình 2,
chỉ có azoxystrobin và edifenphos cho hiệu suất cao với quy trình 1 và có 3 chất cho hiệu suất
cao với quy trình 3 (imidachloprid, aldicarb, abamectin). Đa số các chất cho hiệu suất cao trên
60% khi phân tích bằng quy trình 2. Do đó, quy trình 2 đã được lựa chọn để thực hiện các
khảo sát tiếp theo.
- Ảnh hưởng của GCB: GCB được thêm vào d-SPE để tăng khả năng loại tạp do GCB có
khả năng hấp phụ các hợp chất hữu cơ có cấu trúc phẳng, các chất diệp lục. Mẫu mã đề và bồ
công anh được cho thêm chuẩn ở nồng độ 0,1 mg/kg (n = 2) và phân tích bằng hai quy trình.
Một quy trình không sử dụng GCB và một quy trình có thêm 7,5 mg GCB trong d-SPE. Kết
quả cho thấy khi sử dụng GCB dịch chiết đã được loại các chất diệp lục, trong khi độ thu hồi
của các chất tương đương với khi không sử dụng GCB, một số chất có độ thu hồi cao hơn hẳn
như imidachloprid, aldicarb, carboxin Do đó, việc sử dụng GCB trong bước chiết d-SPE với
lượng 7,5 mg là cần thiết và phù hợp.
3.2.2.2. Nền mẫu dược liệu khô
- Độ ẩm của mẫu khoảng 80% có thể cho hiệu suất chiết cao nhất khi xử lý bằng phương
pháp QuEChERS. Do đó, mẫu khô được bổ sung thêm nước với tỷ lệ mẫu:nước (1:5) và khảo

sát thời gian ngâm mẫu trong nước. Qua khảo sát cho thấy trong khoảng từ 0 đến 15 phút, thu
được nồng độ các HCBVTV khảo sát là cao nhất. Do đó nhằm tiết kiệm thời gian, không cần
thiết phải thực hiện ngâm mẫu trong nước trước khi chiết.
- Lựa chọn loại đệm chiết: Thực hiện so sánh 3 quy trình tương tự như mẫu dược liệu tươi.
Kết quả cho thấy trên nền mẫu dây thìa canh, pH của dịch chiết khá ổn định đối với cả 3
phương pháp; phương pháp không sử dụng đệm cho độ thu hồi tốt nhất. Tuy nhiên, trên nền
mẫu lá giang (pH acid), phương pháp không dùng đệm cho hiệu quả rất thấp, 20/25 HCBVTV
phân tích có độ thu hồi dưới 70%. Phương pháp dùng đệm citrat có độ thu hồi tốt hơn nhưng
chưa đáp ứng được yêu cầu (14/25 HCBVTV có độ thu hồi dưới 70%). Phương pháp dùng
đệm acetat cho pH ổn định nhất và độ thu hồi của các HCBVTV đều đáp ứng được yêu cầu.
Mặt khác do nền mẫu dược liệu đa dạng về tính acid base, do đó việc sử dụng đệm acetat là
cần thiết.
-9-

- Khảo sát muối chiết: Khảo sát bổ sung thêm NaCl nhằm tăng khả năng phân lớp giữa
acetonitril với nước. Các mức NaCl từ 0 g; 0,5 g; 1,0 g; 1,5 g và 2,0 g đã được khảo sát. Việc
sử dụng NaCl trong muối chiết có ảnh hưởng đến độ thu hồi của phương pháp, lượng NaCl tốt
nhất là từ mức 1,5 g. Ngoài ra, khi tăng lượng NaCl thì pH của dịch chiết acetonitril giảm dần
từ 5,88 (0 g) đến 5,63 (1,5 g) và 5,50 (2 g); màu sắc dịch chiết cũng nhạt dần cho thấy NaCl
có vai trò quan trọng trong việc tách giữa hai pha nước và acetonitril. Do đó, việc thêm NaCl
vào muối chiết với khối lượng 1,5 g/15 mL dịch chiết acetonitril là cần thiết.
3.2.2.3. Nền mẫu thực phẩm chức năng có thành phần dược liệu
- Lựa chọn loại đệm chiết: Thực hiện thí nghiệm tương tự như đối với nền mẫu dược liệu
khô, so sánh 3 quy trình chiết QuEChERS không sử dụng đệm, dùng đệm acetat và dùng đệm
citrat. Theo kết quả thu được, hầu hết các chất đều cho hiệu suất cao hơn khi xử lý bằng quy
trình 2. Kết quả này cũng phù hợp với hai nền dược liệu tươi và dược liệu khô. Do đó quy
trình 2 được chọn để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
- Khảo sát thành phần d-SPE: Khảo sát lượng PSA từ 20, 30, 40, 50, 60 mg và khảo sát
lượng GCB từ 0; 5; 7,5 và 10 mg cho 1 mililit dịch chiết. Các kết quả cho thấy, lượng PSA và
GCB sử dụng có ảnh hưởng đến độ thu hồi của HCBVTV. Lượng PSA và GCB tối ưu lần

lượt là 40 mg và 7,5 mg.
3.2.2.4. Nền mẫu chè
Nền mẫu chè có sự khác biệt so với các loại dược liệu khác do thành phần chè có nhiều hợp
chất như cafein, polyphenol và đặc biệt là tannin có thể gây ảnh hưởng lớn đến hiệu suất
chiết. Để loại các tạp chất, muối chì acetat ((CH
3
COO)
2
Pb) được thêm vào hỗn hợp muối
chiết để kết tủa tannin, cafein. Khảo sát các lượng muối chì acetat từ 0 đến 2,0 g. Khi sử dụng
chì acetat, hiệu suất chiết các HCBVTV đều tăng rõ rệt. Càng tăng lượng muối sử dụng, hiệu
suất chiết càng tăng. Tuy nhiên, nếu lượng muối tăng quá 1,5 g cho thấy hiệu suất chiết giảm
với đa số các HCBVTV nghiên cứu. Do đó, lượng muối chì acetat được sử dụng trong quy
trình xử lý mẫu này là 1,5 g.
3.2.2.5. Đánh giá ảnh hưởng nền và vai trò của nội chuẩn
Để đánh giá ảnh hưởng nền, thực hiện so sánh hệ số góc của hai đường chuẩn xây dựng
trên nền dung môi và trên nền mẫu trắng (mẫu trắng được chiết theo quy trình để thu lấy dịch
chiết, sau đo pha chuẩn trên dịch chiết thu được). Đường chuẩn sử dụng gồm 5 điểm chuẩn có
nồng độ là 5, 10, 50, 100 và 200 µg/mL. Kết quả cho thấy ảnh hưởng của nền mẫu khá khác
nhau tuỳ từng HCBVTV thực vật và tuỳ thuộc vào nền mẫu. Do đó, đối với phương pháp
phân tích đa dư lượng áp dụng trên nhiều đối tượng khác nhau thì cần phải có biện pháp để
loại bỏ các ảnh hưởng nền này.
Các kết quả cho thấy, nếu không sử dụng nội chuẩn ảnh hưởng nền khá lớn, có đến 14/25
hợp chất có ảnh hưởng nền lớn hơn ±20%. Khi định lượng theo nội chuẩn ảnh hưởng nền
giảm rõ rệt, 23/25 hợp chất có ảnh hưởng nền nằm trong khoảng 20%, trong đó có khoảng
50% số chất có ảnh hưởng nền thấp dưới 5%. Trên nền mẫu chè, ảnh hưởng nền cũng thấp khi
sử dụng nội chuẩn. Do đó, việc sử dụng nội chuẩn rất cần thiết nhằm loại trừ các sai số do nền
mẫu.
-10-


3.2.3. Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số dược
liệu và sản phẩm dược liệu
3.2.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc
Thực hiện phân tích các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Thời gian lưu của các
HCBVTV trên nền mẫu thêm chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn, không xuất hiện pic
ở mẫu trắng ở khoảng thời gian của các píc nói trên.
Hơn nữa, với mỗi chất phân tích đều có hai ion sản phẩm dùng để định tính và định lượng
do đó sự có mặt của HCBVTV được chắc chắn thêm nhờ vào tỷ lệ các ion. Theo yêu cầu của
các tổ chức phân tích trên thế giới như AOAC, Châu Âu, tỷ lệ của ion xác nhận chia cho ion
định lượng thu được trên mẫu không được sai khác quá một mức cho phép nhất định. Nghiên
cứu này đã xác định được tỷ lệ ion của các HCBVTV nghiên cứu. Như vậy, tính chọn lọc của
phương pháp được đảm bảo ở mức cao.
3.2.3.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Đường chuẩn được chuẩn bị trên nền mẫu để loại trừ ảnh hưởng nền. Mẫu trắng được chiết
theo quy trình để thu lấy dịch chiết, pha dung dịch chuẩn trên dịch chiết ở các nồng độ 0; 2;
10; 20; 50; 100 và 200 ng/mL. Nồng độ nội chuẩn giữ cố định là 100 ng/mL. Các mẫu trắng
được sử dụng gồm có dược liệu tươi (mã đề), dược liệu khô (dây thìa canh), TPCN (dạng viên
và dạng trà thảo dược) và mẫu chè búp Thái Nguyên.
Các đường chuẩn xây dựng đều có hệ số tương quan trên 0,99 và độ chệch của các điểm
nhỏ hơn 15% (nhỏ hơn 20% tại nồng độ thấp nhất) do đó trong khoảng nồng độ từ 2 đến 200
ng/mL có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng. Khoảng nồng độ
này đã bao trùm được giá trị MRL của các HCBVTV do đó đáp ứng được yêu cầu ứng dụng
trong thực tế. Trong nghiên cứu này, các nồng độ cao hơn không được khảo sát; đối với các
mẫu có nồng độ cao hơn 200ng/mL, tiến hành pha loãng mẫu trước khi phân tích.
3.2.3.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ thấp (5 và 10 µg/kg tính trên mẫu;
tương đương 1-2 µg/L trên dịch chiết) và xác định giá trị S/N. Dựa vào S/N để ước lượng các
giá trị LOD, LOQ. Các kết quả cho thấy, đối với LC-MS/MS tất cả các chất có thể định lượng
trên tất cả các nền mẫu nghiên cứu tại nồng độ thấp hơn hoặc bằng giá trị MRL (10 µg/kg hay
0,01 mg/kg). LOD của các hợp chất trên thiết bị LC-MS/MS tốt hơn so với thiết bị GC-

MS/MS.
3.2.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi
Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu trắng
thêm chuẩn ở ba mức nồng độ 2; 20 và 200 ng/mL đại diện cho ddierm đầu, giữa và cuối
khoảng tuyến tính, phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ (n = 6). Nồng độ tính tương đương
trên mẫu cụ thể như sau:
- Đối với mẫu dược liệu tươi: 0,002; 0,02 và 0,2 mg/kg
- Đối với mẫu dược liệu và sản phẩm dược liệu khô: 0,01; 0,1 và 1 mg/kg.
Các kết quả cho thấy CV% và R% dao động tuỳ từng HCBVTV và tùy từng loại nền mẫu;
đa số các trường hợp đều có CV% dưới 15% và R% trong khoảng 80-110%. Điều này khẳng
định phương pháp có độ lặp lại và độ thu hồi tốt, đáp ứng yêu cầu hiện nay của AOAC.
-11-

Ngoài ra, để đánh giá độ thu hồi, thực hiện thêm chuẩn trên nền mẫu thực (mẫu đã phát
hiện có HCBVTV) gồm trinh nữ hoàng cung, cỏ ngọt, mã đề. Thêm các chuẩn của các
HCBVTV đã được phát hiện vào mẫu, phân tích lặp lại 3 lần đối với cả mẫu trắng và mẫu
thêm. Độ thu hồi đạt được trên nền mẫu thực khá tốt, tất cả các kết quả đều trên 70% với các
khoảng nồng độ thêm chuẩn khác nhau từ 0,05 đến 0,5 mg/kg.
3.3. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trên một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu
3.3.1. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi
Dược liệu tươi được lấy tại vườn của một số vùng trồng dược liệu ở Hà Nội và Hưng Yên.
Thời điểm lấy mẫu là ngay giai đoạn thu hoạch hoặc sau khi vừa thu hoạch xong. Số lượng
mẫu đã lấy gồm 22 loại dược liệu, trong đó chủ yếu là các loại dược liệu lấy lá. Các kết quả
cho thấy có 8/22 mẫu (khoảng 36%) đã được phát hiện có HCBVTV vượt MRL (0,01 mg/kg).
Carbendazim và azoxystrobin là các HCBVTV được phát hiện nhiều nhất trong 3 mẫu và
carbendazim cũng là hợp chất có hàm lượng cao nhất (0,39 mg/kg).
3.3.2. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô
Các mẫu được liệu khô được lấy tại 3 địa điểm, với tổng số mẫu là 30 mẫu. Đa số các mẫu
dược liệu đều không có nguồn gốc, được bày bán tại chợ thuốc Ninh Hiệp (Hà Nội) và các
quầy thuốc đông y tại Lãn Ông (Hà Nội). Một số mẫu được lấy ở Hải Hậu (Nam Định) trong

đó gồm các mẫu được công ty dược đặt hàng sản xuất (dây thìa canh, đinh lăng). Trong số 30
mẫu dược liệu được phân tích có 7 mẫu (khoảng 23%) có chứa HCBVTV, trong đó tần suất
xuất hiện lớn nhất là các HCBVTV nhóm neonicotinoid với 4/7 mẫu. Các mẫu dược liệu được
sản xuất theo tiêu chuẩn GACP đều không phát hiện thấy HCBVTV.
3.3.3. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có thành phần thảo
dược
- Tổng số mẫu được phân tích: 140 mẫu trong đó số mẫu phát hiện HCBVTV (nồng độ trên
0,01 mg/kg): 41 mẫu chiếm 29,3%.
- Các HCBVTV phát hiện và số lượng như sau: chlorpyrifos: 12 mẫu, imidacloprid: 8 mẫu,
cypermethrin: 7 mẫu, permethrin: 6 mẫu, acetamiprid: 6 mẫu, carbofuran: 5 mẫu, fenobucarb:
4 mẫu, azoxystrobin: 3 mẫu, dimethoat: 2 mẫu, abamectin: 2 mẫu, endosulfan sulfat: 2 mẫu
và trichlorfon: 1 mẫu. Trong đó, riêng hợp chất endosulfan sulfat là HCBVTV nhóm clor hữu
cơ đã bị cấm sử dụng nhiều năm nay nhưng vẫn có mặt trong 2 mẫu với hàm lượng là 0,033
và 0,10 mg/kg.
- Các mẫu TPCN được thống kê theo nhóm sản phẩm, ba nhóm sản phẩm được đánh giá
gồm: nhóm sản phẩm dạng viên; nhóm sản phẩm dạng túi, trà; và nhóm sản phẩm dạng nước
ép. Tỷ lệ HCBVTV phát hiện thấy trong các mẫu tương đối cao đặc biệt trong các nền mẫu trà
thảo dược với tỷ lệ lên đến 40% tổng số mẫu. Nguyên nhân là do trong các nền mẫu trà hàm
lượng thảo dược cao hơn các nền mẫu viên và nước ép; đồng thời quá trình xử lý (ảnh hưởng
nhiệt, ẩm, ánh sáng) đối với các sản phẩm trà thảo dược khá ít nên HCBVTV bị phân huỷ ít
trong quá trình chế biến so với sản phẩm dạng viên (trải qua quá trình đóng nang hoặc dập
viên với sự có mặt của các tá dược khác) hoặc dạng nước ép (qua quá trình chiết với dung môi
hoặc nước).
-12-

- Các mẫu TPCN được đánh giá theo nguồn gốc mẫu: nhập khẩu hoặc trong nước. Kết quả
cho thấy, tỷ lệ phát hiện nhiễm HCBVTV ở các mẫu nội địa cao hơn các mẫu nhập khẩu đặc
biệt đối với nhóm trà thảo dược. Tỷ lệ phát hiện khá cao trong mẫu nhập khẩu (25-30%) cho
thấy TPCN trà thảo dược nhập khẩu vẫn chứa đựng nguy cơ cao. Tỷ lệ phát hiện ở mẫu sản
xuất trong nước cao hơn chưa khẳng định được nguyên nhân là từ dược liệu trong nước, vì

nhiều loại TPCN được chế biến từ dược liệu nhập khẩu, đa số là từ Trung Quốc.
3.3.4. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong trà xanh
Các mẫu trà xanh được lấy tại các cửa hàng ở Hà Nội, tổng số mẫu là 20 mẫu. Có 10/20
mẫu có phát hiện HCBVTV, tuy nhiên hàm lượng khá thấp, dao động từ 0,004-0,15 mg/kg.
Các HCBVTV nhóm neonicotinoid được phát hiện nhiều nhất bao gồm cả imidacloprid,
acetamiprid và thiamethoxam.

Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Về việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc và chế biến dược
liệu
Qua nghiên cứu ở một số vùng dược liệu ở phía Bắc cho thấy đã có sự thay đổi về loại
HCBVTV thường được sử dụng so với các nghiên cứu trước đây. Các HCBVTV nhóm
neonicotinoid, macrocyclic lacton được sử dụng bên cạnh các HCBVTV nhóm lân hữu cơ,
pyrethroid và carbamat.
4.1.1. Về loại hoá chất bảo vệ thực vật được kinh doanh
4.1.1.1. Địa điểm khảo sát
Địa điểm được lựa chọn để khảo sát là các địa phương có vùng trồng cây thuốc và kinh
doanh dược liệu phổ biến ở phía Bắc. Một số địa phương có vùng trồng dược liệu lớn như ở
Hưng Yên, Hải Dương, Nam Định. Một số địa phương có vùng trồng chè xanh lớn gồm Phú
Thọ, Thái Nguyên. Ngoài ra, một số cửa hàng ở Hà Giang được khảo sát thêm với mục đích
tìm hiểu các HCBVTV được nhập khẩu theo con đường tiểu ngạch từ Trung Quốc. Hà Nội
cũng là địa điểm được lựa chọn vì có nhiều địa điểm trồng cây thuốc và kinh doanh dược liệu
tươi và khô.
4.1.1.2. Hoá chất bảo vệ thực vật được kinh doanh
- Có 75 loại HCBVTV được kinh doanh tại các địa chỉ đã khảo sát, trong đó có 9 loại có
thành phần gồm 2 hoạt chất, và 2 loại có thành phần gồm 3 hoạt chất. Các loại HCBVTV
được nhiều cửa hàng kinh doanh có thành phần chủ yếu thuộc nhóm neonicotinoid
(imidacloprid, acetamiprid), nhóm macrocyclic lacton (abamectin, emamectin), nhóm
phosphor hữu cơ (chlorpyrifos) và nhóm pyrethroid (cypermethrin). Kết quả này cho thấy xu
hướng sử dụng HCBVTV hiện nay, đó là sử dụng các HCBVTV ít độc hơn và phối hợp nhiều

thành phần trong cùng một loại thuốc. Trong số này, các hợp chất nhóm phosphor hữu cơ và
nhóm pyrethroid đã được quan tâm từ lâu, nhưng các hợp chất nhóm neonicotinoid và nhóm
macrocyclic lacton vẫn chưa được quan tâm. Hiện nay, yêu cầu về công bố sản phẩm của Bộ
Y tế chỉ xác định 4 nhóm chính là nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, carbamat và
pyrethroid.
-13-

- Về số lượng hoạt chất được sử dụng, trong tổng số 39 hoạt chất có 9 hoạt chất (20 tên
thương mại) nhóm phosphor hữu cơ cho thấy nhóm này vẫn đang được sử dụng phổ biến
nhất. Ngoài ra, các nhóm carbamat, neonicotinoid, pyrethroid, macrocyclic lacton cũng là các
nhóm phổ biến (từ 10-12 tên thương mại). Không có hoạt chất nhóm clor hữu cơ được kinh
doanh. Kết quả này cùng với số lượng cơ sở kinh doanh, một lần nữa khẳng định xu hướng sử
dụng HCBVTV hiện nay. Các loại HCBVTV có độc tính cao thuộc nhóm clor hữu cơ đã
được loại bỏ hoàn toàn.
- Trong 75 loại HCBVTV, có 56 loại là thuốc trừ sâu (74,7%), 9 loại thuốc trừ nấm
(12,0%) và 8 loại thuốc trừ cỏ (10,7%), chỉ có 1 loại thuốc tăng trưởng (acid giberellic) và 1
loại thuốc trừ chuột (kẽm phosphid). Như vậy, mục đích việc sử dụng HCBVTV trong nông
nghiệp nói chung và trong trồng cây thuốc nói riêng nhằm trừ sâu hại.
- Việc khảo sát dựa trên cơ sở phiếu hỏi và danh sách HCBVTV của cửa hàng kinh doanh.
Tuy nhiên, có một số loại HCBVTV không được bán tại các cửa hàng vật tư nông nghiệp mà
chỉ được mua bán truyền tay. Việc tìm hiểu các loại HCBVTV này phải thông qua những
người dân địa phương. Các loại HCBVTV thu thập được đều không có thông tin về hoạt chất
và hàm lượng bằng tiếng Việt hay tiếng Anh. Các hoạt chất này chỉ được xác định sau khi
phân tích tại PTN. Các sản phẩm này đều thuộc nhóm phosphor hữu cơ, tuy nhiên có thể còn
nhiều sản phẩm tương tự đã được sử dụng. Điều này cho thấy, việc quản lý sử dụng
HCBVTV còn gặp nhiều khó khăn.
4.1.2. Về loại HCBVTV được sử dụng trong trồng cây thuốc
- Theo kết quả khảo sát sơ bộ có 28 loại HCBVTV với 23 hoạt chất được sử dụng, trong đó
9 loại HCBVTV có 2 thành phần và 1 loại HCBVTV có 3 thành phần. Tất cả các hoạt chất
này đều phù hợp với các hoạt chất đã được khảo sát tại các cửa hàng kinh doanh HCBVTV.

Những hoạt chất này (trừ acid giberellic là chất tăng trưởng) được ưu tiên lựa chọn để đưa vào
nghiên cứu phân tích.
- Trong số các HCBVTV được sử dụng, nhóm phosphor hữu cơ được dùng nhiều nhất
(25% số thuốc và 18% số hoạt chất). Kết quả này phù hợp với kết quả khảo sát tại các cửa
hàng kinh doanh HCBVTV nhưng thấp hơn so với nghiên cứu trước đây của Trần Việt Hùng
(36% số thuốc và 37% số hoạt chất). Sự khác biệt là do xu hướng sử dụng các HCBVTV mới
thuộc các nhóm neonicotinoid (14% số thuốc và 13% số hoạt chất) và macrocyclic lacton
(18% số thuốc và 9% số hoạt chất). Các nhóm khác bao gồm nhóm pyrethroid, nhóm
carbamat, nhóm strobin…
- Trong số các hoạt chất được sử dụng, không có hoạt chất nằm trong danh mục cấm sử
dụng hay danh mục hạn chế sử dụng ở Việt Nam. So với kết quả phân tích HCBVTV, có 2
mẫu phát hiện HCBVTV trong danh mục cấm sử dụng (endosulfan sulfat) và 5 mẫu phát hiện
HCBVTV trong danh mục hạn chế sử dụng (carbofuran). Có thể thấy rằng, bên cạnh việc sử
dụng các HCBVTV có nguồn gốc rõ ràng, còn tồn tại những loại HCBVTV được truyền tay
và chưa được kiểm soát.
- Các HCBVTV đã được sử dụng cho 24 loại dược liệu khác nhau, đa số đều là thân thảo
với các bộ phận dùng chính là lá và hoa. Có 21/28 loại HCBVTV được sử dụng để trừ sâu hại.
Điều này phù hợp với nguy cơ bị sâu hại của các bộ phận dùng nói trên.
-14-

4.2. Về phương pháp phân tích dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản
phẩm dược liệu
Luận án đã đóng góp một phương pháp phân tích mới áp dụng để phân tích HCBVTV
trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu. Phương pháp dựa trên kỹ thuật chiết QuEChERS và
phân tích bằng sắc ký lỏng và sắc ký khí khối phổ hai lần có thể áp dụng để phân tích đồng
thời nhiều HCBVTV hơn các phương pháp thông thường hiện nay. Hơn nữa, phương pháp
mới cũng có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp hiện nay theo Dược điển của các nước, đó
là giảm thời gian phân tích, quy trình đơn giản dễ thực hiện, giảm chi phí phân tích, giảm ảnh
hưởng đến môi trường và sức khoẻ của kiểm nghiệm viên, đồng thời vẫn đạt được độ chính
xác theo yêu cầu.

4.2.1. Lựa chọn đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu
4.2.1.1. Lựa chọn HCBVTV cho nghiên cứu phân tích
Trên cơ sở khảo sát về tình hình kinh danh HCBVTV và sử dụng HVBVTV trong trồng
cây thuốc và bảo quản dược liệu, các HCBVTV có chứa nguy cơ lớn nhất được lựa chọn để
phân tích bao gồm:
- Các hoạt chất được sử dụng nhiều trong trồng cây thuốc gồm có abamectin, acetamiprid,
acetochlor, atrazin, azoxystrobin, carbaryl, carbendazim, chlorpyrifos, cypermethrin,
dimethoat, emamectin, fenobucarb, imidacloprid, indoxacarb, isoprocarb, permethrin,
tebuconazol, thiamethoxam, trichlorfon.
- Một số hoạt chất thường gặp nhất có trong thành phần các thuốc được kinh doanh phổ biến
(trừ các hoạt chất ở trên): aldicarb, chlorothalonil, edifenphos, methiocarb, methomyl,
profenofos, propoxur.
- Một số hoạt chất có trong thành phần của các thuốc không nguồn gốc: acephat, dichlorvos,
carboxin.
- Một số hợp chất cấm sử dụng hoặc hạn chế sử dụng: aldrin, endosulfan sulfat carbofuran.
Các HCBVTV được lựa chọn để nghiên cứu có sự khác biệt rõ so với các nghiên cứu trước
đây Các HCBVTV nhóm clor hữu cơ không được lựa chọn chính do kết quả khảo sát cho thấy
không còn được sử dụng. Trong 32 hợp chất được nghiên cứu, có 7 HCBVTV nhóm
phosphor hữu cơ, 7 HCBVTV nhóm carbamat, 3 HCBVTV nhóm neonicotinoid, 2 HCBVTV
nhóm pyrethroid, 2 HCBVTV nhóm macrocyclic lacton, 2 HCBVTV nhóm clor hữu cơ và
một số HCBVTV thuộc các nhóm khác. Trong danh mục cấm sử dụng còn nhiều HCBVTV
nhóm clor hữu cơ, tuy nhiên do nguy cơ nhiễm nhóm này khá thấp nên chỉ có aldrin và
endosulfan sulfat được lựa chọn nhằm đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp trên nhóm
HCBVTV này. Ngoài ra, một số HCBVTV khác cũng được sử dụng, tuy nhiên do thiếu chất
chuẩn nên chưa được thực hiện phân tích. Các chất này bao gồm: buprofezin, fenitrothion,
cyhalothrin và acid gibberellic.
Trong số 32 HCBVTV được lựa chọn, có 7 HCBVTV cho hiệu quả phân tích tốt hơn với
GC, một số HCBVTV có thể phân tích đồng thời bằng GC và LC, còn đa số hợp chất cần sử
dụng LC để phân tích.
4.2.1.2. Lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu

-15-

Dược liệu rất đa dạng về chủng loại, tuy nhiên để phù hợp với các đối tượng có nguy cơ
nhiễm HCBVTV nhất, các loại dược liệu có bộ phận dùng chính là lá, thân thảo được lựa
chọn. Hai loại dược liệu tươi được sử dụng để thẩm định phương pháp là mã đề và bồ công
anh.
Hơn nữa, quy trình chiết HCBVTV trên mẫu dược liệu tươi và các mẫu khô có sự khác
biệt, dược liệu khô được khảo sát riêng. Để đánh giá ảnh hưởng của pH nền mẫu đến quy
trình chiết, hai loại dược liệu khô là dây thìa canh (môi trường trung tính) và lá giang (môi
trường acid) được lựa chọn để khảo sát.
Sản phẩm từ dược liệu được nghiên cứu này là thực phẩm chức năng có thành phần thảo
dược. Trong các loại TPCN, sản phẩm dạng trà thảo dược chứa nguy cơ nhiễm HCBVTV lớn
nhất do có quy trình sản xuất đơn giản (chủ yếu là xay nhỏ và đóng gói). Trà mướp đắng đã
được sử dụng để thẩm định phương pháp.
Ngoài ra, để đánh giá khả năng áp dụng phương pháp trên các nền mẫu dược liệu chứa
nhiều tannin hay polyphenol, chè xanh (khô) đã được sử dụng.
Việc lựa chọn các đối tượng mẫu rất đa dạng cho thấy khả năng áp dụng rộng của phương
pháp QuEChERS được nghiên cứu trên dược liệu.
4.2.2. Về phương pháp xử lý mẫu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát và lựa chọn được các điều kiện tối ưu của
phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS áp dụng trên các nền mẫu dược liệu và sản phẩm
dược liệu. Đây là lần đầu tiên ở Việt Nam, phương pháp QuEChERS được nghiên cứu để xác
định dư lượng HCBVTC trên nền mẫu dược liệu. Các kết quả cho thấy phương pháp có nhiều
ưu điểm so với các phương pháp hiện nay được quy định tại Dược điển Việt Nam:
- Phương pháp có thể áp dụng trên dải rộng nhiều loại HCBVTV trên nhiều loại nền mẫu
dược liệu có bản chất khác nhau. Theo các kết quả thu được ở chương 3, độ thu hồi của hầu
hết các HCBVTV nghiên cứu nằm trong khoảng từ 80-110%; độ thu hồi của tất cả các
HCBVTV nghiên cứu đều trong khoảng 70-120%. Do đó, phương pháp có thể ứng dụng để
sàng lọc nhiều HCBVTV trong cùng một lần phân tích.
- Bên cạnh việc sàng lọc, phương pháp đã được ứng dụng để định lượng HCBVTV trong

dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu. Các kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ
chính xác tốt và độ nhạy đáp ứng được yêu cầu.
- Phương pháp sử dụng ít dung môi (15 mL acetonitril), không sử dụng các dung môi có
tính độc hại cao do đó một mặt giảm ảnh hưởng đến sức khỏe kiểm nghiệm viên, giảm các
ảnh hưởng đến môi trường, mặt khác tiết kiệm chi phí phân tích.
- Sử dụng kỹ thuật làm sạch với chiết phân tán pha rắn, không cần thực hiện làm sạch bằng
sắc ký cột như quy định theo Dược điển Việt Nam. Quy trình chiết nhanh, tổng thời gian xử
lý 1 lô 6 mẫu chỉ chưa đến 30 phút mà vẫn đảm bảo được hiệu quả làm sạch mẫu cũng như độ
chính xác của phương pháp.
- Phương pháp QuEChERS hướng đến khả năng chiết xuất đồng thời nhiều HCBVTV
thuộc nhiều nhóm khác nhau ở nhiều nồng độ khác nhau trong cùng một lần xử lý mẫu.
Phương pháp QuEChERS được nghiên cứu và tối ưu trên nền mẫu rau quả, tuy nhiên khi áp
-16-

dụng trên nền mẫu dược liệu cần phải có những điều chỉnh thích hợp để đạt được hiệu suất
chiết tốt nhất.
4.2.2.1. Lượng mẫu ban đầu
Nhằm mục đích giảm thiểu dung môi, giảm các bước chiết phương pháp QuEChERS
hướng đến giảm lượng mẫu ban đầu. Các phương pháp trước đó thường sử dụng khoảng 20-
50 g mẫu (đối với mẫu tươi). Phương pháp QuEChERS chỉ sử dụng ≤ 15 g mẫu. Việc giảm
lượng mẫu giúp quá trình chiết được thực hiện dễ dàng hơn, giảm lượng dung môi, hoá chất
sử dụng. Tuy nhiên, khi giảm lượng mẫu, đòi hỏi quá trình đồng nhất phải tốt để phần mẫu
đem phân tích đủ đại diện cho mẫu. Để đảm bảo độ đồng nhất, một lượng mẫu đủ lớn (khoảng
1 kg trở lên) cần được cắt và nghiền nhỏ bằng dụng cụ xay nghiền thích hợp.
Đối với các loại dược liệu tươi, lượng mẫu được sử dụng là 15 g trong ống ly tâm 50 mL vì
để đảm bảo đủ không gian còn lại cho quá trình lắc khi thêm dung môi và muối chiết. Đối với
các mẫu dược liệu khô, cần phải bổ sung nước để đảm bảo độ ẩm của mẫu trong vòng khoảng
70-90%. Việc thêm nước cho phép các dung môi tiếp xúc tốt hơn với mẫu và đảm bảo quá
trình tách lớp giữa dịch nước và dung môi hữu cơ khi cho thêm muối. Lượng mẫu được lựa
chọn đối với các nền mẫu khô là 3 g và tiến hành thêm nước với tỷ lệ mẫu : nước là 1 : 5

(v/v). So với một số nghiên cứu tương tự trên các nền mẫu khô, các tác giả cũng bổ sung thêm
nước vào một lượng mẫu nhất định (từ 2-3 g) và với tỷ lệ mẫu : nước thông thường là 1 : 5
(v/v).
Về thời gian ngâm các mẫu khô trong nước, kết quả cho thấy sau 15 phút từ khi lắc mẫu
với nước, hàm lượng HCBVTV có xu hướng giảm dần. Nguyên nhân của hiện tượng này có
lẽ do một số HCBVTV bị chuyển hoá trong môi trường nước hoặc do nước làm hoà tan nhiều
hợp chất khác từ nền mẫu gây ảnh hưởng đến khả năng chiết HCBVTV.
4.2.2.2. Dung môi chiết và loại dung dịch đệm
Acetonitril là dung môi cho hiệu quả tốt nhất trong QuEChERS do có nhiều ưu điểm hơn
một số dung môi khác như aceton và ethyl acetat. Thứ nhất, acetonitril có thể trộn lẫn với
nước nhưng có thể tách lớp với nước khi thêm các muối. Thứ hai, acetonitril không kéo theo
nhiều tạp chất như lipid hoặc protein, muối nên dịch chiết mẫu sạch hơn. Hơn nữa, acetonitril
là dung môi phù hợp với cả sắc ký lỏng và sắc ký khí.
Nói chung, đa số các HCBVTV có thể chiết được bằng acetonitril theo phương pháp
QuEChERS. Tuy nhiên, đối với các HCBVTV phụ thuộc pH hoặc kém bền trong môi trường
kiềm hoặc acid lại cho độ thu hồi thấp khi không sử dụng đệm. Có thể dùng đệm acetat hoặc
citrat. Các kết quả trong nghiên cứu này cho thấy, cần phải sử dụng đệm để đảm bảo có được
hiệu suất chiết cao trên các nền mẫu có tính acid. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên
cứu trước đây, điển hình là kết quả của Lehotay và cộng sự khi nghiên cứu trên nền rau quả.
4.2.2.3. Nội chuẩn
Các nghiên cứu cho thấy, phương pháp QuEChERS cho kết quả tốt mà không cần sử dụng
nội chuẩn. Tuy nhiên, để tránh những ảnh hưởng chưa biết trong quá trình chiết, nội chuẩn đã
được sử dụng trong nghiên cứu này.
Trong kỹ thuật sắc ký khối phổ, nội chuẩn tốt nhất là nội chuẩn đồng vị của từng
HCBVTV. Trong thực tế, không thể dùng đồng vị cho tất các các HCBVTV.
-17-

Triphenylphosphat (TPP) qua khảo sát có thể được dùng để làm nội chuẩn do chất này có
những tính chất tương tự phần lớn các HCBVTV. Với các kết quả thu được, TPP có thể được
sử dụng làm nội chuẩn trong phương pháp QuEChERS.

4.2.2.4. Muối chiết
Cả ba phiên bản của phương pháp QuEChERS đều sử dụng muối MgSO
4
khan với lượng
0,4 g cho mỗi mililit dịch chiết acetonitril (6 g cho 15 mL dịch chiết). MgSO
4
đóng vai trò
quan trọng trong tách lớp giữa acetonitril và nước. Thực tế sau khi ly tâm, vẫn còn một lượng
nước trong lớp dung môi acetonitril (khoảng 8% xác định được bằng NMR), lượng nước này
có vai trò hoà tan các HCBVTV phân cực và chiết HCBVTV không phân cực không tan trong
hỗn hợp dung môi ban đầu (acetontril-nước khoảng 1:1).
Các nghiên cứu của Anastassiades và cộng sự trên nhiều loại muối khác nhau gồm LiCl,
MgCl
2
, NaCl, NaNO
3
, Na
2
SO
4
, MgSO
4
cho thấy MgSO
4
cho hiệu quả tốt nhất. Các nghiên
cứu cũng cho thấy, việc sử dụng đồng thời MgSO
4
và NaCl với tỷ lệ 4:1 cho hiệu quả chiết tốt
nhất. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ MgSO
4

và NaCl cũng được giữ cố định 4:1.
Natri acetat được thêm vào muối chiết, tuy nhiên vai trò thực sự của nó là tạo hệ đệm với
acid acetic có trong thành phần của dung môi acetonitril. Hệ đệm acetat này có vai trò đảm
bảo pH của dịch chiết ban đầu (dịch chiết acetonitril) trong khoảng từ 4,5-5,0 là pH tối ưu để
chiết phần lớn HCBVTV.
4.2.2.5. Làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn
Chiết phân tán pha rắn (d-SPE) là bước làm sạch tạo nên hiệu quả của phương pháp
QuEChERS. Trong đó, chất hấp phụ PSA đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm sạch.
PSA là một chất hấp phụ trao đổi anion yếu trên nền silica dùng để hấp phụ các acid béo, acid
hữu cơ. Vì có chứa nhóm amin bậc hai, PSA có tác dụng tốt hơn aminopropyl trong việc làm
sạch.
Theo kết quả thu được, lượng PSA được sử dụng là 40 mg cho nền mẫu dược liệu và sản
phẩm dược liệu. Khi tăng PSA có thể làm tăng hiệu quả chiết nhưng để tiết kiệm chi phí,
lượng PSA 40 mg đã được chọn. Kết quả này không có nhiều khác biệt so với các nghiên cứu
trước đây. Lượng PSA sử dụng trong phương pháp QuEChERS ban đầu là 25 mg với mỗi
mililit dịch chiết. Sau đó, Lehotay tăng PSA lên 50 mg trên mỗi mililit dịch chiết. Đối với các
mẫu chứa nhiều acid béo như ngũ cốc, Mastovska còn sử dụng lượng PSA đến 150 mg cho
mỗi mililit dịch chiết.
Trong bước d-SPE, MgSO
4
khan có vai trò loại lượng nước còn dư trong dịch chiết
acetonitril. Lượng MgSO
4
được sử dụng là 150 mg cho mỗi mililit dịch chiết. Theo nghiên
cứu của Lehotay, lượng nước có chứa trong dịch chiết acetonitril khoảng 8%. Nếu sử dụng
150 mg MgSO
4
khan, lượng nước trong dịch chiết cuối cùng khoảng 1-2%. Đây là tỷ lệ chấp
nhận được khi phân tích trên GC.
Việc sử dụng thêm GCB có tác dụng làm sạch các sterol, clorophyl và các chất có cấu trúc

phẳng. GCB do vậy cũng lưu giữ các thuốc trừ sâu có cấu trúc phẳng. Sử dụng 7,5 mg GCB
với mỗi mililit dịch chiết cho độ thu hồi khoảng 70% với các thuốc trừ sâu dạng phẳng trong
khi loại được khoảng 90% clorophyl. Thực tế, khi tăng GCB cao hơn, hiệu quả làm sạch thu
-18-

được tốt hơn nhưng hiệu suất đa số HCBVTV lại giảm. Do đó, sử dụng 7,5 mg GCB cho mỗi
mililit dịch chiết là phù hợp nhất.
4.2.2.6. Sử dụng muối chì acetat trong xử lý mẫu chè
Một đóng góp quan trọng trong nghiên cứu này là việc sử dụng muối chì acetat để kết tủa
tannin trong nền mẫu chè, giúp giảm ảnh hưởng nền nhờ đó tăng hiệu suất chiết HCBVTV.
Việc sử dụng chì acetat có thể được mở rộng trên các loại dược liệu có chứa nhiều tannin
khác. Đây là là một kết quả mới chưa thấy báo cáo trong các nghiên cứu trước đây.
Nguyên lý của quy trình xử lý này là ion Pb
2+
sẽ tạo phức với tannin tạo thành chì (II)
tannat, phức này kết tủa và được loại khỏi pha lỏng nhờ quá trình ly tâm. Pb
2+
dư hòa tan vào
pha nước và được tách khỏi dung môi chiết (acetonitril) nhờ phân bố lỏng lỏng với các muối
MgSO
4
và NaCl. Do đó, lượng dư Pb
2+
không ảnh hưởng đến phân tích trên thiết bị.
Để đánh giá hiệu quả của việc xử lý mẫu với chì acetat, có thể sử dụng giá trị ảnh hưởng
nền (%ME). Kết quả so sánh ảnh hưởng nền theo phương pháp nghiên cứu với ảnh hưởng nền
theo nghiên cứu của Raski trên nền mẫu chè cho thấy có nhiều HCBVTV cho ảnh hưởng nền
thấp hơn theo phương pháp nghiên cứu, trong khi đó chỉ có 2 HCBVTV cho ảnh hưởng nền
thấp hơn theo phương pháp của Raski. Do đó, có thể thấy rằng việc sử dụng chì acetat đã góp
phần làm sạch mẫu tốt hơn đối với nền mẫu chè.

4.2.3. Về phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ
Các phương pháp xác định HCBVTV hiện nay theo quy định của Dược điển Việt Nam chủ
yếu sử dụng phương pháp sắc ký khí với các detector NPD và ECD. Việc sử dụng đồng thời
cả hai kỹ thuật sắc ký khí và sắc ký lỏng khối phổ đã mở rộng rất đáng kể phạm vi áp dụng
trên nhiều loại HCBVTV hơn.
4.2.3.1. Sắc ký lỏng khối phổ
Quá trình phân tích bằng LC-MS/MS gồm hai giai đoạn: tách bằng LC và xác định bằng
MS/MS.
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo đã được sử dụng với pha tĩnh là cột
C18 và pha động là hỗn hợp methanol và acid acetic 1% trong nước. Đây là các điều kiện
phân tích sắc ký lỏng rất cơ bản và có thể dễ dàng áp dụng. Chế độ gradient đã được nghiên
cứu nhằm tách được các chất phân tích khỏi nền mẫu đồng thời đưa điều kiện pha động về
trạng thái ban đầu để phân tích các mẫu tiếp theo. Với các điều kiện này, có nhiều HCBVTV
chưa tách khỏi nhau hoàn toàn. Tuy nhiên, việc sử dụng detector MS/MS có tính chọn lọc rất
cao đã giúp tách các HCBVTV về tín hiệu.
Trong MS/MS, mỗi HCBVTV khi được ion hoá, có thể tạo thành nhiều loại ion khác nhau
tuỳ thuộc vào kỹ thuật ion hoá và chế độ ion dương hay âm. Phương pháp nghiên cứu sử dụng
kỹ thuật ion hoá ESI, chế độ ion dương thông thường tạo được ion phân tử là [M+H]
+
ngoài
ra, có thể tạo thành một số ion khác như [M+CH
3
OH]
+
, [M+Na]
+
… Mỗi ion phân tử khi đi
qua tứ cực thứ hai lại được bắn phá để tạo thành các ion sản phẩm, hai ion được lựa chọn là
hai ion có cường độ cao nhất.
Khi sử dụng các detector thông thường như UV-VIS, FL thì hiệu quả tách của sắc ký lỏng

đóng vai trò rất quan trọng. Tuy nhiên, khi sử dụng detector khối phổ đặc biệt là khối phổ hai
lần thì hiệu quả tách của sắc ký lỏng ít ảnh hưởng đến kết quả do tính chọn lọc cao của
-19-

detector MS. Mỗi HCBVTV được đặc trưng bởi các ion phân tử, ion sản phẩm khác nhau do
đó, mặc dù trong sắc ký lỏng có thể không hoàn toàn tách khỏi nhau, nhưng qua khối phổ tín
hiệu của các chất được tách khỏi nhau hoàn toàn. Trong phương pháp đã xây dựng, một số
HCBVTV rửa giải khá gần nhau như trichlorfon và dichlorvos; carboxin và carbaryl;
isoprocarb và atrazin; edifenphos, tebuconazol và TPP, tuy nhiên hiệu quả tách bằng khối phổ
vẫn đảm bảo.
Chế độ gradient trong phương pháp có vai trò tách các HCBVTV khỏi những thành phần
của nền mẫu, trong đó các thành phần có tính phân cực cao thường rửa giải ở giai đoạn đầu
(0-3 phút) và các thành phần ít phân cực được rửa giải ở giai đoạn cuối. Việc tách khỏi các
thành phần nền giúp giảm ảnh hưởng của nền mẫu đối với quá trình ion hoá và kéo theo là độ
chính xác của khối phổ. Trong phương pháp đã xây dựng, thời gian lưu của các HCBVTV
dao động từ 4-14 phút, trong đó đa số các hợp chất được rửa giải từ 7-11 phút; điều này giúp
phần nào giảm được ảnh hưởng nền.
Mặc dù về lý thuyết, sắc ký lỏng khối phổ có thể ứng dụng để phân tích được hầu hết
HCBVTV. Tuy nhiên đối với một số hợp chất rất phân cực thì khó lưu giữ khi sử dụng sắc ký
pha đảo. Ngược lại đối với các hợp chất không phân cực, thì quá trình ion hoá không thực
hiện được. Có thể sử dụng các kỹ thuật ion hoá khác như APCI, APPI … tuy nhiên việc áp
dụng rất khó khăn vì cần quá trình chuyển nguồn dung môi.
Đối với HCBVTV, theo nghiên cứu của Alder và cộng sự cho thấy có 49 HCBVTV trong
số 500 HCBVTV không cho tín hiệu đối với LC-MS/MS khi sử dụng nguồn ion hoá ESI ở cả
hai chế độ ion dương và âm. Do đó, để có thể phân tích được các HCBVTV này, cần phối hợp
thêm các kỹ thuật phân tích khác trong đó GC-MS/MS là lựa chọn tốt nhất.
4.2.3.2. Sắc ký khí khối phổ
Trong vài thập kỷ gần đây, sắc ký khí với các detector ECD, NPD hay MS đã được nhiều
tác giả nghiên cứu để phân tích HCBVTV cho thấy khả năng ứng dụng tốt đối với các
HCBVTV nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ và pyrethroid. Tuy nhiên, bản thân sắc ký khí

không thể phân tích trực tiếp được tất cả các HCBVTV. Đối với các chất khó bay hơi, các
chất bền nhiệt hay các hợp chất có độ phân cực cao rất khó để thực hiện phân tích bằng GC.
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật GC-MS/MS với nguồn ion hoá EI, bộ phân tích khối ba tứ
cực được sử dụng cho thấy có thể phân tích khá nhiều HCBVTV.
Nhiều HCBVTV có thể phân tích đồng thời bằng cả LC-MS/MS và GC-MS/MS. So với
GC-MS/MS, kỹ thuật LC-MS/MS có thể cho độ nhạy tốt hơn ít nhất là 5 lần. Nếu áp dụng
trên các nền mẫu khô, cần phải làm giàu mẫu trước khi phân tích bằng GC-MS/MS để đáp
ứng được mức MRL 0,01 mg/kg (10 µg/kg). Trong nghiên cứu này đối với các HCBVTV có
thể phân tích được đồng thời bằng cả hai kỹ thuật, LC-MS/MS được ưu tiên lựa chọn do ưu
điểm về độ nhạy. Tuy nhiên, đối với các phòng thí nghiệm không được trang bị thiết bị LC-
MS/MS có thể sử dụng GC-MS hoặc GC-MS/MS đối với các HCBVTV này.
4.2.4. Về kết quả thẩm định phương pháp
4.2.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc
Cả hai kỹ thuật LC-MS/MS và GC-MS/MS đều có tính đặc hiệu cao, sự có mặt của bất kỳ
HCBVTV nào cũng được khẳng định chắc chắn thông qua ion phân tử và hai ion sản phẩm.
-20-

Theo quyết định 657/2002 của Uỷ ban Châu Âu, tính đặc hiệu có thể được đánh giá thông qua
số điểm nhận dạng (IP) và tỷ lệ các ion định tính và định lượng.
Số điểm IP cần phải đạt là 4 điểm. Trong đó, mỗi ion mẹ được tính là 1 điểm, mỗi ion con
được tính 1,5 điểm. Như vậy, theo các kết quả thu được số điểm IP có thể đạt được trong
phương pháp này là từ 4-5 điểm, đáp ứng được yêu cầu đề ra.
Tỷ lệ các ion định tính và định lượng cũng được sử dụng để đánh giá tính đặc hiệu. Tỷ lệ
ion trên mẫu thử so với tỷ lệ ion trên chuẩn đã được sử dụng trong đánh giá phương pháp theo
phần mềm đi kèm từng thiết bị. Do đó, tính đặc hiệu của phương pháp phân tích được đảm
bảo tốt hơn.
4.2.4.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Trong khoảng nồng độ từ 2 đến 200 ng/mL (tương đương trên các nền mẫu tươi là từ 2-200
µg/kg và nền mẫu khô là từ 10-1000 µg/kg), tất các các chất phân tích nghiên cứu đều cho
thấy độ tuyến tính đạt yêu cầu. Khoảng nồng độ này đã bao trùm được giá trị MRL của các

HCBVTV do đó đáp ứng được yêu cầu ứng dụng trong thực tế. Trong nghiên cứu này, đối với
các mẫu có nồng độ cao hơn 200 ng/mL, tiến hành pha loãng dịch chiết mẫu trước khi phân
tích.
Đường chuẩn phân tích các HCBVTV được xây dựng trên nền mẫu nhằm loại trừ các ảnh
hưởng nền. Tuy nhiên, không thể xây dựng đường chuẩn trên tất cả các nền mẫu nghiên cứu.
Do đó, các nền mẫu đại diện cho từng nhóm sản phẩm được xây dựng. Khi ứng dụng các
đường chuẩn này cho các sản phẩm khác trong nhóm, các sai số nếu có được giảm thiểu thông
qua việc sử dụng nội chuẩn.
4.2.4.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thu được trong nghiên cứu này khá tương đồng
với các kết quả của các nghiên cứu trên thế giới. Các tác giả đều cố gắng, bằng cách này hay
cách khác, đạt được khả năng phân tích tại nồng độ 0,01 mg/kg. Trong nghiên cứu này, tất cả
các chất phân tích đều có thể định lượng được tại nồng độ thấp hơn hoặc bằng mức 0,01
mg/kg.
Các kết quả cũng cho thấy LC-MS/MS cho thấy có nhiều thuận lợi hơn so với GC-MS/MS
vì có độ nhạy tốt hơn và thời gian phân tích ngắn hơn. Đối với GC-MS/MS để đảm bảo khả
năng phân tích tốt tại nồng độ 0,01 mg/kg cần trải qua quá trình làm giàu. Mẫu được làm giàu
5 lần trước khi tiêm vào GC-MS/MS. 4 mL dịch chiết được sử dụng trong bước làm sạch d-
SPE (600 mg MgSO
4
khan, 160 mg PSA và 30 mg GCB), sau đó 2,5 mL dịch chiết được lấy
ra, thổi khô bằng dòng khí N
2
ở 40
o
C và hoà cặn trong 0,5 mL acetonitril chứa 1% acid acetic
sau đó tiêm vào GC-MS/MS. Một số nghiên cứu trước đây cũng sử dụng kỹ thuật cô mẫu để
đảm bảo độ nhạy cần thiết. Ngoài ra, một số tác giả sử dụng các bộ tiêm mẫu thể lớn như bộ
tiêm mẫu PTV, có thể tiêm đến 5 µL mẫu.
4.2.4.4. Độ lặp lại và độ thu hồi

Các kết quả về độ lặp lại và độ thu hồi trên các nền mẫu khác nhau, tại 3 nồng độ thấp
(0,01 mg/kg), trung bình (0,1 mg/kg) và cao (1 mg/kg) cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt
và độ thu hồi đáp ứng được yêu cầu. Kết quả này khá tương đồng so với các nghiên cứu trước
đây. Kết quả so sánh độ lặp lại (thông qua RSD%) và độ thu hồi (R%) của phương pháp
-21-

nghiên cứu so với một số nghiên cứu gần đây sử dụng cùng kỹ thuật phân tích và phương
pháp xử lý mẫu theo QuEChERS cho thấy độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp
QuEChERS nghiên cứu rất tốt. Tuy nhiên đây là một phương pháp phân tích đa dư lượng, do
đó đối với một số HCBVTV vẫn còn cho độ thu hồi chưa đạt yêu cầu. Độ lặp lại và độ thu hồi
của phương pháp nghiên cứu khá tương đồng so với các kết quả của một số nghiên cứu trước
đây trên thế giới.
4.3. Về dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu
Tỷ lệ phát hiện HCBVTV trên các mẫu dược liệu tươi được lấy tại một số vùng trồng lân
cận Hà Nội vượt giới hạn MRL 0,01 mg/kg là 36% (8/22 mẫu), trong khi đó tỷ lệ phát hiện
HCBVTV trên các mẫu dược liệu khô được lấy tại các chợ dược liệu chính ở Hà Nội là 30%
(8/27 mẫu). Dược liệu tươi có tỷ lệ phát hiện cao hơn do chưa trải qua quá trình chế biến gồm
việc phơi, sấy… Tuy nhiên, do nguồn gốc các mẫu dược liệu khô bao gồm cả dược liệu được
nhập khẩu từ nước ngoài (phần lớn là Trung Quốc), nên chưa đủ cơ sở để đánh giá mỗi liên
hệ giữa dư lượng HCBVTV trong dược liệu tươi và dược liệu khô. Tỷ lệ phát hiện trung bình
khoảng 30% cho thấy một tỷ lệ khá lớn dược liệu có chứa HCBVTV. Tuy nhiên, cỡ mẫu phân
tích còn nhỏ do đó chưa thể đánh giá toàn diện về chất lượng dược liệu trên thị trường hiện
nay.
Đây là lần đầu tiên một số nhóm HCBVTV mới đã được nghiên cứu và phân tích trong
dược liệu và sản phẩm dược liệu. Các nghiên cứu trước đây chỉ xác định các HCBVTV nhóm
clor hữu cơ, lân hữu cơ và pyrethroid. Nghiên cứu này đã cho thấy các HCBVTV được phát
hiện chủ yếu thuộc nhóm neonicotinoid (imidacloprid và acetamiprid). Ngoài ra
cypermethrin, chlorpyrifos, carbendazim và carbofuran cũng được phát hiện trên nhiều mẫu.
Kết quả này có sự khác biệt so với nghiên cứu trước đây của Trần Việt Hùng năm 2005, các
HCBVTV được phát hiện chính là DDT, cypermethrin và trichlorfon. Điều này cho thấy xu

hướng sử dụng HCBVTV có sự thay đổi, đòi hỏi việc phân tích và yêu cầu quản lý cũng phải
thay đổi để có thể kiểm soát tốt hơn dư lượng HCBVTV trong dược liệu nói riêng và nông
nghiệp nói chung.
So với một số nghiên cứu về dược liệu ở Trung Quốc, tỷ lệ mẫu phát hiện HCBVTV khá
lớn. Nghiên cứu của Chen và cộng sự đã phát hiện dư lượng HCBVTV trong 95/138 mẫu
phân tích, chiếm 69%. Các HCBVTV được phát hiện với tần suất nhiều nhất bao gồm
carbendazim, carbofuran, propoxur, triazophos và acetamiprid. Như vậy, ngoại trừ triazophos,
các thành phần còn lại được phát hiện khá tương đồng với kết quả thu được trong nghiên cứu
này. Một nghiên cứu khác của Nguyen và cộng sự trên dược liệu của Hàn Quốc, cho thấy chỉ
có 4,9% (11/224) mẫu dược liệu có dư lượng HCBVTV. Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ sử
dụng GC-MS/MS nên không phát hiện được một số HCBVTV phân tích bằng LC-MS/MS,
điển hình là các HCBVTV nhóm neonicotinoid (imidacloprid, acetamiprid).
Đối với các sản phẩm dược liệu, nghiên cứu này chỉ xác định HCBVTV trong một số loại
TPCN dạng viên, dạng trà và dạng nước ép. Đây là các sản phẩm được sử dụng ngay không
qua qua trình chế biến như đun nấu nên nguy cơ đối với sức khoẻ cao hơn. Tỷ lệ phát hiện cao
(29,3%), đặc biệt sản phẩm trà thảo dược (40%) cho thấy thực sự đây là một mối lo ngại đối
với người sử dụng.
-22-

Trong các mẫu TPCN, còn phát hiện thấy HCBVTV đã bị cấm (endosulfan sulfat) hay
HCBVTV hạn chế sử dụng (carbofuran). Một số mẫu phát hiện thấy hàm lượng rất cao của
chlorpyrifos và cypermethrin, permethrin. Đây là các HCBVTV truyền thống đã được sử
dụng rất phổ biến từ trước đến nay. Những HCBVTV này đang được BYT kiểm soát (Bộ Y tế
quy định kiểm soát HCBVTV thuộc 4 nhóm: clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, carbamat và
pyrethroid). Tuy nhiên, ngoài các HCBVTV truyền thống này, còn phát hiện thấy một số
HCBVTV mới điển hình là nhóm neonicotinoid (acetamiprid, imidacloprid). Các HCBVTV
này vẫn chưa được kiểm soát đúng mức, do đó cần có những chế tài phù hợp để kiểm soát các
loại HCBVTV mới này.
Chè xanh là một loại nông sản rất phổ biến ở Việt Nam và cũng là một loại dược liệu đặc
biệt. Tỷ lệ mẫu chè xanh được phát hiện thấy HCBVTV rất cao (chiếm đến 50%). Hiện nay,

chè Việt Nam không hoặc rất khó xuất khẩu được vào các thị trường khó tính như châu Âu,
Nhật Bản và Mỹ do chưa kiểm soát được dư lượng HCBVTV. Nhiều lô chè của Việt Nam đã
bị các nước này trả lại do nhiễm HCBVTV, do nhiễm hai HCBVTV là imidacloprid và
acetamiprid. Điều này phù hợp với các kết quả nghiên cứu này, khi phần lớn các HCBVTV
chính được phát hiện trên chè thuộc nhóm neonicotinoid gồm có imidacloprid, acetamiprid và
thiamethoxam. Các HCBVTV được người trồng chè sử dụng để diệt rầy xanh và bọ cánh đỏ
trên chè. Như vậy, các nhà quản lý cần có định hướng để điều chỉnh thói quen sử dụng các
HCBVTV trên chè.
Về giá trị MRL trên dược liệu và các sản phẩm dược liệu, hiện nay theo Dược điển Việt
Nam mới chỉ quy định cho 32 hợp chất, trong đó chủ yếu là các HCBVTV nhóm clor hữu,
phosphor hữu cơ và pyrethroid. Phần lớn các HCBVTV hiện nay không còn được sử dụng
nữa. Còn quy định 46/2007 của Bộ Y tế chỉ áp dụng đối với các sản phẩm rau quả, thực
phẩm. Trong nghiên cứu này, giá trị MRL mặc định (0,01 mg/kg) được chúng tôi sử dụng với
mục tiêu hướng đến sự hài hoà với các quy định hiện nay trên thế giới. Khi tham gia vào tổ
chức thương mại thế giới, Việt Nam cần đáp ứng được các yêu cầu của các nước. Do đó, việc
áp dụng một giá trị MRL mặc định theo như quy định của nhiều nước trên thế giới là cần thiết
và phù hợp. Mức MRL mặc định này khá thấp, do đó tỷ lệ phát hiện HCBVTV vượt MRL
trên các sản phẩm nghiên cứu khá cao.
Qua nghiên cứu về hàm lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm dược liệu, luận
án đã có những đóng góp tuy còn khiêm tốn về hảm lượng HCBVTV trong dược liệu và các
sản phẩm từ dược liệu. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên một số nhóm HCBVTV mới như
neonicotinoid, macrocyclic lacton được phát hiện và định lượng. Việc phát hiện nhiều
HCBVTV mới trong dược liệu cho thấy cần tăng cường công tác hậu kiểm đối với các
HCBVTV này bên cạnh việc thiết lập mức MRL mặc định cho dược liệu và các sản phẩm
dược liệu.

-23-

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN

Luận án đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và thu được các kết quả như sau:
1. Qua khảo sát tình hình sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu
tại một số địa phương miền Bắc nước ta, nhận thấy:
- Các HCBVTV được buôn bán phổ biến gồm 39 hoạt chất với 75 tên thương mại được
trong đó nhóm phosphor hữu cơ, nhóm neonicotinoid và nhóm pyrethroid là sẵn có nhất.
- Có 23 hoạt chất với 28 tên thương mại được sử dụng chính ở các vùng trồng dược liệu
trong đó nhóm phosphor hữu cơ, nhóm neonicotinoid, nhóm pyrethroid được sử dụng phổ
biến nhất.
2. Đã nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV
trong dược liệu và một số sản phẩm dược liệu
- Đã xác định được các điều kiện LC-MS/MS phù hợp để phân tích đồng thời 25
HCBVTV. Các HCBVTV được tách bằng sắc ký lỏng pha đảo với pha tĩnh C18 theo gradient
pha động; phát hiện và định lượng bằng MS/MS với nguồn ion hoá ESI, chế độ ion dương,
mỗi chất phân tích được lựa chọn một ion phân tử để tiếp tục phân mảnh tạo ra hai ion sản
phẩm cần thiết.
- Đã tối ưu được các điều kiện GC-MS/MS để phân tích 7 HCBVTV. Các HCBVTV được
tách bằng GC; phát hiện và định lượng bằng MS/MS với nguồn ion hoá EI, mỗi chất phân tích
được lựa chọn một ion phân tử để tiếp tục phân mảnh tạo ra hai ion sản phẩm cần thiết.
- Đã khảo sát được điều kiện chiết HCBVTV trên các nền mẫu khác nhau theo nguyên lý
của phương pháp chiết QuEChERS. Hệ đệm acetat với pH từ 4,5-5,0 được sử dụng nhằm đảm
bảo hiệu suất chiết trên các nền mẫu khó. GCB được sử dụng cùng với PSA và MgSO
4
trong
bước d-SPE để tăng khả năng làm sạch mẫu. Lượng chất hấp phụ phù hợp của GCB là 7,5
mg, còn của PSA là 40 mg cho mỗi mililit dịch chiết. Đối với các dạng mẫu khô, cần bổ sung
thêm nước với tỷ lệ nước : mẫu (5:1).
- Đối với mẫu có nhiều tanin, chì acetat được sử dụng để tăng khả năng loại tạp và thu
được dịch chiết mẫu sạch hơn, giúp giảm ảnh hưởng nền.
- Đã đánh giá ảnh hưởng của tất cả các nền mẫu đối với kết quả, việc sử dụng nội chuẩn
đóng vai trò quan trọng để giảm các ảnh hưởng của nền mẫu dưới 20%.

- Đã thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao, có khả năng định
lượng các HCBVTV tại nồng độ thấp hơn MRL 0,01 mg/kg; có độ chính xác đạt yêu cầu với
độ lặp lại < 20% và độ thu hồi từ 70-120% cho tất cả các chất; trong đó phần lớn các chất có
độ lặp lại < 15% và độ thu hồi từ 80-110%.
3. Đã sơ bộ đánh giá dư lượng của 32 HCBVTV trên các nền mẫu gồm dược liệu tươi,
dược liệu khô, TPCN có thành phần thảo dược và chè. Có khoảng 30% số mẫu được phát hiện
thấy HCBVTV với hàm lượng vượt MRL 0,01 mg/kg. Các mẫu chè và mẫu TPCN dạng trà
túi lọc được phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm cao hơn, lần lượt là 50% và 40%.