luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


TRẦN CAO SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ
DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC




HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



TRẦN CAO SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ
DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 62 72 04 10

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
TS. Lê Thị Hồng Hảo


HÀ NỘI, NĂM 2015
i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu và TS. Lê Thị Hồng Hảo. Các
số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án



Trần Cao Sơn


ii

LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và nghiên cứu thực hiện luận án dưới sự hướng dẫn của
PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu và TS. Lê Thị Hồng Hảo,

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, Phó hiệu trưởng Trường Đại học Dược Hà
Nội, Trưởng bộ môn Hóa Phân tích - Độc chất và TS. Lê Thị Hồng Hảo, Phó
Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, là hai
người thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ và cho tôi những kiến
thức quý báu để tôi hoàn thành luận án.
Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia học tập và hoàn thành luận án đúng thời
gian quy định.
Các thầy, cô Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất và Phòng Sau đại học, Trường
Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại
Trường.
PGS. Phạm Gia Huệ nguyên Trưởng Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất,
Trường Đại học Dược Hà Nội là người thầy đã đóng góp ý kiến, chỉ dẫn tôi
hoàn thành luận án.
Các anh chị em tại Khoa Độc học dị nguyên và các đồng nghiệp ở Viện Kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã động viên, giúp đỡ và chia sẽ với
những khó khăn trong công việc.
Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên
tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án.
Tác giả luận án
Trần Cao Sơn
iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ x
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 3
1.1.1. Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật 3
1.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật 3
1.1.3. Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật chính 5
1.2. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 13
1.2.1. Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trên thế giới 13
1.2.2. Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật ở Việt Nam 14
1.2.3. Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật an toàn và hiệu quả 15
1.3. DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ
SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 16

1.3.1. Khái niệm về dư lượng và mức dư lượng tối đa 16
1.3.2. Quy định về mức dư lượng tối đa 17
1.3.3. Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu 19
1.3.4. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm dược liệu 22
1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 23
1.4.1. Các phương pháp xử lý mẫu 23
1.4.2. Một số kỹ thuật dùng trong phân tích hóa chất bảo vệ thực vật 39
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 49
2.1.1. Hoá chất bảo vệ thực vật 49
2.1.2. Đối tượng phân tích 53
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 54
2.2.1. Hoá chất, thuốc thử 54
2.2.2. Chất chuẩn 54
iv


2.2.3. Thiết bị, dụng cụ 56
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 57
2.3.1. Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫu 57
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu 58
2.3.3. Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ 58
2.3.4. Phương pháp thẩm định 59
2.3.5. Phân tích mẫu thực 62
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 62
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63
3.1. KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
TRONG TRỒNG CÂY THUỐC 63

3.1.1. Nguồn cung hóa chất bảo vệ thực vật 63
3.1.2. Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc tại Hà Nội và một số
vùng lân cận 70

3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT BẢO
VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU 75

3.2.1. Xây dựng các điều kiện sắc ký khối phổ 75
3.2.2. Xây dựng quy trình chiết hóa chất bảo vệ thực vật từ một số dược liệu và sản
phẩm dược liệu 85

3.2.3. Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số
dược liệu và sản phẩm dược liệu 100

3.3. DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 115

3.3.1. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi 116

3.3.2. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô 117
3.3.3. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có thành phần
thảo dược 118

3.3.3. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong trà xanh 120
Chương 4. BÀN LUẬN 122
4.1. VỀ VIỆC SỬ DỤNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG TRỒNG CÂY
THUỐC VÀ CHẾ BIẾN DƯỢC LIỆU 122

4.1.1. Về loại hoá chất bảo vệ thực vật được kinh doanh 122
4.1.2. Về loại HCBVTV được sử dụng trong trồng cây thuốc 123
v

4.2. VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC
VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM DƯỢC LIỆU 124

4.2.1. Lựa chọn đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu 124
4.2.1.2. Lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu 126
4.2.2. Về phương pháp xử lý mẫu 127
4.2.3. Về phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ 132
4.2.4. Về kết quả thẩm định phương pháp 138
4.3. VỀ DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ
SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 141

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 144
KẾT LUẬN 144
KIẾN NGHỊ 145
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 146
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
vi


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
TT Chữ viết tắt Giải thích
1 AOAC
Hiệp hội các cộng đồng phân tích (Association of analytical
communities)
2 APCI
Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical
ionization)
3 APPI
Ion hóa quang học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure photo
ionization)
4 BVTV Bảo vệ thực vật
5 ChE Cholinestase
6 D-SPE Chiết phân tán pha rắn (Dispersive solid phase extraction)
7 ECD Detector bắt điện tử (Electron capture detector)
8 EI Va chạm điện tử (Electron impact)
9 EPA Cục Bảo vệ môi trường Mỹ (Environmental protection agency)
10 ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray ionization)
11 FAO
Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực (Food and agriculture
organization)
12 FDA
Cục dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (Food and drug
administration)
13 FL Huỳnh quang (Fluorescence)
14 GACP
Thực hành tốt trồng và thu hái dược liệu (Good agriculture and
collection practice)
15 GAP Thực hành tốt nông nghiệp (Good agriculture practice)

16 GC Sắc ký khí (Gas chromatography)
17 GCB Than đen hoạt tính (Graphite carbon black)
18 GC-MS Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography mass spectrometry)
19 GC-MS/MS
Sắc ký khí khối phổ hai lần (Gas chromatography tandem mass
spectrometry)
20 GPC Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography)
21 HCBVTV Hóa chất bảo vệ thực vật
22 HLB Cân bằng thân nước, thân dầu (Hydrophilic lipophilic balance)
23 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)
vii

TT Chữ viết tắt Giải thích
24 IAC Sắc ký ái lực miễn dịch (Immunoaffinity chromatography)
25 IS Chất chuẩn nội (Internal standard)
26 LC Sắc ký lỏng (Liquid chromatography)
27 LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography mass spectrometry)
28 LC-MS/MS
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography tandem mass
spectrometry)
29 LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)
30 LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantification)
31 LD
50
Liều chết trung bình (Median lethal dose)
32 LPME Vi chiết pha lỏng (Liquid phase microextraction)
33 MAE Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction)
34 MRL Giới hạn dư lượng tối đa (Maximum residue limit)
35 MMM Phương pháp đa dư lượng (Multiresidues multiclasses method)
36 MRM Kiểm soát đa phản ứng (Multi reaction mornitoring)

37 MS Khối phổ (Mass spectrometry)
38 MSPD Phân tán pha rắn mẫu thử (Matrix solid phase dispersion)
39 NCI Ion hóa hóa học âm (Negative chemical ionization)
40 NPD Detector nitơ phosphor (Nitrogen phosphorus detector)
41 PCI Ion hóa hóa học dương (Positive chemical ionization)
42 PDA Chuỗi diod quang (Photo-diod array)
43 PSA Các amin bậc 1 và bậc 2 (Primary secondary amines)
44 PS-DVB Polystyren divinylbenzen
45 SE Chiết dung môi (Solvent extraction)
46 SFE Chiết siêu tới hạn (Supercritical-fluid extraction)
47 SPE Chiết pha rắn (Solid phase extraction)
48 SPME Vi chiết pha rắn (Solid phase microextraction)
49 TPP Triphenyl phosphat
50 UV-VIS Tử ngoại khả kiến (Ultra violet – Visible)
51 WHO Tổ chức Y tế thế giới (World health organization)
52 WTO Tổ chức Thương mại thế giới (World trade organization)
viii

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Phân loại HCBVTV theo mối nguy 4
Bảng 1.2. Số lượng hoạt chất HCBVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng và cấm
sử dụng ở Việt Nam 14

Bảng 1.3. Quy định của Dược điển Việt Nam IV về giới hạn HCBVTV 17
Bảng 1.4. Giá trị MRL mặc định của một số nước 19
Bảng 1.5. Một số ứng dụng của phương pháp QuEChERS để phân tích HCBVTV
trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu 38

Bảng 1.6. Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng GC-MS 44
Bảng 1.7. Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng LC-MS 48

Bảng 2.1. Một số HCBVTV được nghiên cứu trong khóa luận [17][124] 49
Bảng 2.2. Thông tin về các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu 54
Bảng 2.3. Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion 60
Bảng 3.1. Các HCBVTV được tiêu thụ phổ biến tại các địa phương khảo sát 65
Bảng 3.2. Sự phổ biến của các HCBVTV theo nhóm phân loại 69
Bảng 3.3. Danh mục cây thuốc và dược liệu ở các địa phương khảo sát 71
Bảng 3.4. Danh mục HCBVTV sử dụng trong trồng cây thuốc 73
Bảng 3.5. Các điều kiện MS trong LC-MS/MS để phân tích HCBVTV 76
Bảng 3.6: Các thông số hoạt động đã tối ưu của nguồn ion hoá 77
Bảng 3.7. Khảo sát gradient pha động (A = acid acetic 0,1%; B = methanol) 79
Bảng 3.8. Điều kiện gradient để tách hỗn hợp HCBVTV 80
Bảng 3.9. Độ lặp lại của hệ thống LC-MS/MS 81
Bảng 3.10. Điều kiện MS trong GC-MS/MS được sử dụng trong nghiên cứu 83
Bảng 3.11. Độ lặp lại của hệ thống GC-MS/MS 84
Bảng 3.12. So sánh các phương pháp chiết và pH dịch chiết đo được 90
Bảng 3.13. Tỷ lệ ion xác nhận và ion định lượng của các HCBVTV 103
Bảng 3.14. Các nồng độ HCBVTV được sử dụng để khảo sát khoảng tuyến tính và
đường chuẩn 104

Bảng 3.15. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn của HCBVTV trên mẫu dây thìa canh 104
Bảng 3.16. LOD, LOQ của các HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau phân tích bằng
LC-MS/MS 107

Bảng 3.17. LOD, LOQ của các HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau phân tích bằng
GC-MS/MS 108

ix

Bảng 3.18. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu mã đề tươi (n=6) 110
Bảng 3.19. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu trà thảo dược (n=6) 111

Bảng 3.20. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dây thìa canh (n=6) 112
Bảng 3.21. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu trà xanh (n=6) 113
Bảng 3.22. Độ thu hồi của các HCBVTV trên một số nền mẫu thực 115
Bảng 3.23. Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu tươi 116
Bảng 3.24. Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu khô 117
Bảng 3.25. Tần suất phát hiện HCBVTV trong các nhóm sản phẩm khác nhau 119
Bảng 3.26. Đánh giá hàm lượng HCBVTV trong TPCN theo nguồn gốc mẫu 120
Bảng 3.27. Kết quả phân tích HCBVTV trong trà xanh 120
Bảng 4.1. Danh mục HCBVTV được lựa chọn cho nghiên cứu phân tích 125
Bảng 4.2. Tóm tắt các bước chiết HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau bằng
phương pháp QuEChERS 128

Bảng 4.3. So sánh ảnh hưởng nền của phương pháp nghiên cứu với ảnh hưởng nền
theo phương pháp của Raski. 132

Bảng 4.4. Thời gian lưu và điều kiện MS của một số HCBVTV rửa giải gần nhau 134
Bảng 4.5. Đánh giá khả năng phân tích các HCBVTV bằng GC-MS/MS và LC-
MS/MS 136

Bảng 4.6. So sánh độ lặp lại và độ thu hồi với các nghiên cứu khác 140
x

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Các trạng thái vật lý theo nhiệt độ vào áp suất 26
Hình 1.2. Bộ dụng cụ chiết siêu tới hạn 26
Hình 1.3. Dụng cụ chiết pha rắn thông thường (a) và tự động (b) 28
Hình 1.4. Các loại nhóm silanol 29
Hình 1.5. Nguyên tắc của vi chiết sợi rỗng 35
Hình 1.6. Tóm tắt các bước chiết của ba phiên bản phương pháp QuEChERS 37
Hình 2.1. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và sắc ký khí khối phổ sử dụng trong nghiên

cứu 57

Hình 3.1. Hiểu biết về HCBVTV của cán bộ kinh doanh 64
Hình 3.2. Hiểu biết của nhân viên kinh doanh về danh mục HCBVTV 64
Hình 3.3. Hình ảnh một số HCBVTV không có nguồn gốc 68
Hình 3.4. Một số loại cây thuốc được trồng phổ biến ở các địa phương 73
Hình 3.5. Một số vỏ HCBVTV sau sử dụng tại ruộng 73
Hình 3.6. Sắc đồ tổng ion của hỗn hợp chuẩn HCBVTV 0,1 mg/mL và sắc đồ của 2
mảnh ion sản phẩm của carboxin, 2 mảnh ion sản phẩm của carbaryl 78

Hình 3.7. Sắc ký đồ một số HCBVTV theo chế độ gradient 4. 80
Hình 3.8. Khảo sát quy trình chiết HCBVTV từ mẫu dược liệu tươi 85
Hình 3.9. So sánh hiệu suất chiết HCBVTV trên mẫu mã đề tươi của 3 quy trình 86
Hình 3.10. Dịch chiết bồ công anh xử lý theo quy trình có GCB (trái) và không có
GCB 87

Hình 3.11. Ảnh hưởng của GCB đến độ thu hồi HCBVTV trên nền mẫu mã đề 88
Hình 3.12. Ảnh hưởng của GCB đến độ thu hồi HCBVTV trên nền mẫu bồ công anh . 88
Hình 3.13. Quy trình chiết HCBVTV từ mẫu dược liệu tươi 89
Hình 3.14. Ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu đến hiệu suất chiết một số HCBVTV 90
Hình 3.15: So sánh số lượng HCBVTV ở các khoảng độ thu hồi khác nhau (>80%; 70-
80% và <70%) khi xử lý bằng 3 quy trình 91

Hình 3.16. So sánh số lượng HCBVTV có độ thu hồi ở các khoảng khác nhau (>80%;
70-80% và <70%) khi sử dụng các lượng NaCl khác nhau. 92

Hình 3.17. Quy trình QuEChERS chiết HCBVTV trong mẫu dược liệu khô 92
Hình 3.18. So sánh hiệu suất chiết HCBVTV trên mẫu TPCN xử lý theo 3 quy trình 93
Hình 3.19. Ảnh hưởng của lượng PSA sử dụng đến độ thu hồi 94
Hình 3.20. Ảnh hưởng của lượng GCB sử dụng đến độ thu hồi 95

xi

Hình 3.21. Quy trình chiết HCBVTV trên nền TPCN 95
Hình 3.22. So sánh độ thu hồi của các HCBVTV khác nhau khi sử dụng các lượng
muối chì acetat khác nhau 96

Hình 3.23. Ảnh hưởng nền với mẫu dược liệu tươi (bồ công anh) 97
Hình 3.24. Ảnh hưởng nền với mẫu TPCN (trà mướp đắng) 98
Hình 3.25. So sánh ảnh hưởng nền của hai kỹ thuật định lượng: không sử dụng nội
chuẩn và có sử dụng nội chuẩn (TPP). 98

Hình 3.26. Ảnh hưởng nền với mẫu chè (có sử dụng nội chuẩn) 99
Hình 3.27. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn của atrazin và
dimethoat theo LC-MS/MS 101

Hình 3.28. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của cypermethrin (4
đồng phân) và permethrin (2 đồng phân) theo GC-MS/MS 102

Hình 3.29. Đường chuẩn phân tích HCBVTV trên một số nền mẫu 106
Hình 3.30. Một số sắc đồ xác định LOD, LOQ thông qua xác định S/N 109
Hình 4.1. Sự phân mảnh của carbendazim 133
Hình 4.2. Sắc ký đồ của hai chất có thời gian lưu gần nhau (trichlorfon và dimethoat)135

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và
chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm… Dược liệu là một
loại sản phẩm nông nghiệp đặc biệt, do đó cũng có nguy cơ mắc phải các dịch bệnh
nói trên. Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đóng vai trò quan trọng để phòng và

loại trừ các loại dịch bệnh cho các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói
riêng. Hiện nay, khi trồng hầu hết các loại dược liệu cần phải sử dụng HCBVTV nhằm
tăng năng suất và chất lượng dược liệu.
Khi được sử dụng, HCBVTV có thể tồn dư trong sản phẩm. Nếu HCBVTV
được dùng đúng theo quy định, mức tồn dư này là an toàn cho người sử dụng. Theo
quy định, mỗi loại HCBVTV đều có giá trị giới hạn dư lượng tối đa (MRL). Tuy
nhiên, việc lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách các loại HCBVTV dẫn đến tồn
dư HCBVTV trong sản phẩm tăng lên vượt quá MRL. Khi đó, HCBVTV sẽ gây ra các
tác dụng không mong muốn cho người sử dụng.
Việc xác định mức dư lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm từ
dược liệu có ý nghĩa quan trọng để sàng lọc, loại bỏ các sản phẩm không đáp ứng được
sự an toàn cho người sử dụng. Hiện nay, có hàng nghìn HCBVTV được cho phép sử
dụng trong nông nghiệp. Để có thể phân tích hết các HCBVTV, cần phải áp dụng rất
nhiều kỹ thuật chiết và phân tích khác nhau, dẫn đến rất mất thời gian và tốn kém kinh
phí. Do đó, việc xây dựng được các phương pháp có thể xác định đồng thời nhiều
HCBVTV thuộc nhiều nhóm khác nhau là nhu cầu cần thiết. Trên thế giới, các phương
pháp xác định HCBVTV đã được phát triển từ rất lâu và đã trải qua nhiều thành tựu…
Hầu hết các phương pháp cố gắng hướng đến một phương pháp phân tích đồng thời
nhiều HCBVTV trong cùng một lần phân tích. Các phương pháp này được gọi là
phương pháp đa dư lượng (MMM). Cục Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ đã ban hành
và thay đổi khá nhiều phương pháp đa dư lượng. Trước đây, chiết lỏng lỏng kết hợp
với làm sạch bằng sắc ký cột là phương pháp kinh điển trong phân tích dư lượng
HCBVTV.
Năm 2003, Anastassiades và cộng sự lần đầu tiên giới thiệu một phương pháp
chiết và làm sạch nhanh, dễ dàng mà sau này được gọi là QuEChERS (viết tắt của
Quick, Easy, Cheap, Efficient, Rugged, Safe) kết hợp với sắc ký khí khối phổ và sắc
ký lỏng khối phổ để phân tích HCBVTV trên rau quả [32]. Phương pháp QuEChERS
đã nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi và được nhiều nước chấp nhận làm phương
2


pháp chuẩn để áp dụng phân tích HCBVTV trong rau quả. Sau đó, QuEChERS đã
được nhiều tác giả nghiên cứu và mở rộng áp dụng trên nhiều chỉ tiêu của nhiều đối
tượng khác nhau, trong đó phân tích HCBVTV trong dược liệu là một hướng rất mới
và có triển vọng.
Hiện nay, theo quy định của Dược điển các nước, phương pháp chiết truyền
thống với kỹ thuật chiết bằng dung môi sau đó làm sạch bằng SPE hoặc GPC vẫn là
phương pháp được sử dụng để chiết HCBVTV trong dược liệu. Phương pháp này có
một số hạn chế như khả năng ứng dụng hạn chế trên một nhóm HCBVTV nhất định,
sử dụng lượng dung môi hữu cơ rất lớn và trải qua rất nhiều bước nên chi phí rất tốn
kém.
Với những thực tế như vậy, đề tài “Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo
vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ”
được thực hiện với các mục tiêu như sau:
1. Xác định các HCBVTV thường được dùng tại một số vùng trồng dược liệu ở
phía Bắc.
2. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV trong
dược liệu và một số sản phẩm từ dược liệu.
3. Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm từ
dược liệu.
3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
1.1.1. Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật
Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được chuyển nghĩa từ thuật ngữ tiếng Anh
“pesticide” có nghĩa là thuốc trừ côn trùng gây hại. Tuy nhiên, hiện nay khái niệm này
được mở rộng cho nhiều loại hóa chất được sử dụng trong trồng trọt bao gồm cả thuốc
điều hòa sinh trưởng, thuốc làm rụng lá, thuốc trừ cỏ… [7][108].
Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO) đã đưa ra định
nghĩa về HCBVTV như sau: “HCBVTV là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với

mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ
trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn
của thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế
biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức
ăn chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện
hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng. HCBVTV còn được dùng làm
tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân
làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm. Cũng có thể dùng HCBVTV cho cây
trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá
trình bảo quản và vận chuyển” [50].
1.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật
Có nhiều cách phân loại HCBVTV khác nhau như phân loại theo mối nguy,
theo công dụng hay theo cấu tạo hóa học.
1.1.2.1. Phân loại theo mối nguy
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) phân loại HCBVTV dựa vào các nghiên cứu về
nguy cơ độc hại, chủ yếu là độ độc cấp tính đường uống và đường ngoài da khi thử
nghiệm trên chuột.
Giá trị LD
50
trên chuột theo đường uống và đường dùng ngoài da được sử dụng
để phân loại. LD
50
(Median lethal dose – Liều chết trung bình) là liều lượng chất độc
gây chết cho một nửa (50%) số cá thể dùng trong nghiên cứu.
Theo cách phân loại này, HCBVTV được chia thành 5 nhóm [133] (bảng 1.1).

4

Bảng 1.1. Phân loại HCBVTV theo mối nguy
Nhóm Mức độ độc

LD
50
trên chuột (mg/kg cân nặng)
Đường uống Đường ngoài da
Ia Cực độc < 5 < 50
Ib Độc tính cao 5-50 50-200
II Độc trung bình 50-2000 200-2000
III Độc nhẹ > 2000
U Không có mối nguy độc cấp > 5000

1.1.2.2. Phân loại theo công dụng
Dựa vào công dụng của HCBVTV, người ta có thể phân loại như sau [7]:
 Hóa chất diệt trừ sinh vật gây hại: được gọi theo nhóm sinh vật gây hại như:
- Hóa chất trừ sâu (insecticides)
- Hóa chất trừ nấm (fungicides)
- Hóa chất trừ cỏ (herbicides)
- Hóa chất trừ chuột (rodenticides)
- Hóa chất trừ ốc sên (molluscicides)
- Hóa chất trừ nhện (acaricides)
- Hóa chất trừ vi khuẩn (bactericides)…
 Hóa chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR – plant growth regulators) là các hóa
chất sử dụng để kích thích, làm chậm hoặc ức chế sự phát triển của thực vật.
 Hóa chất dùng trong bảo quản, xử lý hay chế biến sau thu hái.
Trên cơ sở cách phân loại này, Alan Wood đã giới thiệu một trang điện tử trực
tuyến giới thiệu bộ sưu tập đầy đủ các loại HCBVTV được sử dụng [134].
1.1.2.3. Phân loại theo cấu tạo hóa học
Đây là cách phân loại được sử dụng phổ biến trong việc triển khai xây dựng các
phương pháp phân tích, vì các HCBVTV có cấu tạo tương tự thường có tính chất
giống nhau do đó phương pháp chiết và phân tích cũng giống nhau. Hơn nữa, từng
nhóm HCBVTV tác động đến sinh vật và con người theo các nguyên lý tương tự nhau.

Theo cách phân loại này một số nhóm HCBVTV chính như sau [7][108][130]:
- HCBVTV nhóm clor hữu cơ;
- HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ;
- HCBVTV nhóm pyrethroid;
5

- HCBVTV nhóm carbamat;
- HCBVTV nhóm neonicotinoid;
- HCBVTV nhóm macrocyclic lacton;
- HCBVTV vô cơ;
- HCBVTV có nguồn gốc thực vật;
- Các HCBVTV khác.
1.1.3. Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật chính
1.1.3.1. Nhóm clor hữu cơ (organochlorines)
HCBVTV nhóm clor hữu cơ là các hợp chất hữu cơ được hình thành khi thay
thế các nguyên tử hydro của phân tử hydrocarbon và các dẫn xuất hydrocarbon bằng
các nguyên tử clor. Trong phân tử các hợp chất này có thể tồn tại vòng benzen hoặc dị
vòng (chứa dị tố O, N, hay S). Các chất này thường là các dẫn xuất clor của một số
hợp chất hữu cơ như diphenyl ethan, cyclodien, benzen, hexan… [7][13][108]
Về mặt cấu tạo, HCBVTV nhóm clor hữu cơ được xếp vào 4 nhóm nhỏ [130]:
- Nhóm diphenyl aliphatic: DDT, dicofon, methoxychlor…
- Nhóm hợp chất benzen: lindan, hexaclorocyclohexan (HCH), pentaclorophenol…
- Nhóm hợp chất cyclodien: endrin, dieldrin, heptachlor, aldrin, endosulfan sulfat…
- Nhóm hợp chất polycloroterpen: toxaphen, polyclorocamphen…
Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm clor hữu cơ:

Aldrin Methoxychlor 4,4-DDT

Lindan (-HCH)
Endrin Endosulfan sulfat
Các HCBVTV nhóm clor hữu cơ nói chung có phổ tác dụng rộng, rất an toàn
với cây trồng ở liều thông dụng nhưng lại độc với các loài động vật máu nóng. Các
chất này có thể tích lũy trong cơ thể sinh vật gây độc mạn tính, chúng cũng rất bền
trong môi trường, hiệu lực tồn dư lâu dài [23][68].

6

Cơ chế gây độc của HCBVTV nhóm clor hữu cơ phụ thuộc vào dạng cấu tạo
của chúng. DDT và các HCBVTV có cấu trúc tương tự DDT là những chất rất độc trên
hệ thần kinh. Chúng có tác dụng trên thần kinh ngoại biên thông qua ức chế các kênh
vận chuyển Na
+
qua màng tế bào thần kinh dẫn đến tê liệt và có thể dẫn đến tử vong.
Còn một số loại HCBVTV có cấu trúc dị vòng hoặc vòng chứa nhiều clor như aldrin,
dieldrin, heptachlor, endrin… tác động thông qua việc gắn với các vùng pícrotoxinin
của acid γ-aminobutyric dẫn đến ức chế ion Cl
-
vào trong tế bào thần kinh. Hậu quả là
gây nên trạng thái kích thích thần kinh [27][44][60][71].
Mặc dù các HCBVTV clor hữu cơ có tác dụng diệt trừ mạnh đối với nhiều loại
sâu hại nhưng do vấn đề ô nhiễm môi trường và dư lượng HCBVTV trong nông sản,
sự tích lũy và tính độc cao đối con người và các loài động vật, mà ngày nay đa số các
HCBVTV clor hữu cơ đã bị cấm sử dụng.
1.1.3.2. Nhóm phosphor hữu cơ (organophosphorus)
HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ chủ yếu là các hợp chất của phospho hóa trị
5, chúng là các ester hoặc amid của acid phosphoric hoặc dẫn xuất của acid
phosphoric. Công thức cấu tạo chung của các hợp chất phosphor hữu cơ như sau [23]:
R

1
O
P
OR
3
OR
2
O

Trong đó R
1
, R
2
, R
3
có thể là nhóm alkyl, aryl, amin hay các hợp chất thơm, dị
vòng. Các nguyên tử O có thể được thay thế bằng S hay N để tạo ra các dẫn xuất
thiophosphat, amidat và cũng được xếp vào nhóm phosphor hữu cơ.
Tùy theo sự thay thế các O bởi S, N và gốc ester hay amid mà có thể chia thành
một số nhóm nhỏ như: phosphat, phosphorothionat, phosphorothiolat,
phosphorothionothiolat, phosphorodithiolat, phosphoroamidat, phosphoroamido-
thionat, phosphoroamidothiolat [23][130].
 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphat [130]

HC
OH
C
Cl
Cl
Cl

P
OCH
3
O
CH
3
O
Trichlorfon

7


 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothionat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothiolat
Profenofos
 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothionothiolat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorodithiolat
Edifenphos
 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidothionat

8

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidothiolat

Các HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ có đặc điểm chung là phổ tác dụng rộng,
an toàn với cây trồng, diệt được nhiều sâu hại, tác dụng diệt côn trùng nhanh, có độc

tính cao với động vật máu nóng, nhưng không tích lũy lâu dài thường được thải trừ
nhanh qua nước tiểu và thời gian tồn dư trong môi trường không dài [23].
HCBVTV phosphor hữu cơ tác động vào thần kinh của côn trùng và người bằng
cách ngăn cản sự tạo thành men cholinestase (ChE) làm cho thần kinh hoạt động kém,
làm yếu cơ, gây choáng váng và chết. Các chất nhóm phosphor hữu cơ gây phosphorin
hóa enzym acetylcholinesterase. ChE có tác dụng phân giải acetylcholin trong cơ chế
dẫn truyền xung động thần kinh qua synap. Khi ChE bị ức chế, làm ứ động
acetylcholin, gây rối loạn dẫn truyền cholinergic, làm ức chế dẫn truyền các xung thần
kinh tới các tế bào cơ, tuyến, não và hạch. Nhiễm độc xảy ra cấp tính có thể gây nôn,
co thắt ruột, nhức đầu, mệt mỏi, chóng mặt, co giật, suy hô hấp hôn mê và tử vong
[54][60][68][71].
Các HCBVTV nhóm phospho hữu cơ được sử dụng phổ biến từ những năm
1980, nhưng ngày nay, do độc tính cao nên rất nhiều chất trong nhóm này đã bị cấm
hoặc hạn chế sử dụng ở Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới.
1.1.3.3. Nhóm pyrethroid
HCBVTV nhóm pyrethroid là những chất hữu cơ có cấu trúc tương tự các
pyrethrin tự nhiên có mặt trong một số loại hoa cúc (Chrysanthemum
cinerariaefolium và Chrysanthemum coccineum) [23][108][130].
Có hai thế hệ HCBVTV nhóm pyrethroid đã được sử dụng [130]:
- Thế hệ thứ nhất được phát triển từ những năm 60 của thế kỷ XX (ví dụ như
tetramethrin, resmethrin, bioallethrin …) với mục tiêu thay thế các hợp chất nhóm clor
hữu cơ. Tuy nhiên, do đặc tính rất kém ổn định trong môi trường dưới tác dụng của
ánh sáng nên các HCBVTV này hiện không còn được sử dụng rộng rãi.
- Thế hệ thứ hai được phát triển từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX (ví dụ như
permethrin gồm 2 đồng phân, cypermethrin gồm 4 đồng phân, deltamethrin,
cyfluthrin, λ-cyhalothrin…) có độ ổn định trong môi trường tốt hơn thế hệ thứ nhất do
9

đó được sử dụng nhiều trong nông nghiệp. Tuy nhiên, các chất thế hệ thứ hai có độc
tính cao với động vật có vú và con người.

Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm pyrethroid.


Deltamethrin

α-Cypermethrin
Cyfluthrin

Permethrin
Ngày nay, các hợp chất nhóm pyrethroid thường được sử dụng phối hợp với
một số HCBVTV nhóm khác nhằm tăng tác dụng BVTV. Ngoài việc được sử dụng
làm HCBVTV trong nông nghiệp, các chất nhóm pyrethroid còn được sử dụng nhiều
để làm các thuốc diệt côn trùng (ruồi, muỗi, gián…) trong nhà [108].
Các chất nhóm pyrethroid là các chất độc đối với dẫn truyền thần kinh do tác
dụng luôn giữ kênh Na
+
mở trong màng tế bào thần kinh gây ảnh hưởng đến sự dẫn
truyền các xung thần kinh làm mất cảm giác, tê liệt, ở liều cao có thể gây tử vong. Khi
tiếp xúc trong thời gian dài có thể gây ngộ độc gan. Các chất này thường ít độc qua
đường tiếp xúc và qua hô hấp. Liều độc của các chất nhóm pyrethroid cũng thấp hơn
nhiều loại HCBVTV khác [44][55][60][68][71].
1.1.3.4. Nhóm carbamat
HCBVTV nhóm carbamat là các ester của acid carbamic (H
2
N-COOH) và dẫn
xuất của acid carbamic. Đại diện cho nhóm này như: aldicarb, carbofuran, carbaryl,
fenobucarb, isoprocarb… Ngày nay, các hợp chất carbamat được sử dụng rất phổ biến
và được phối hợp với các HCBVTV khác để tăng cường phổ tác dụng [23][108][130].
Các HCBVTV nhóm carbamat có đặc điểm chung là phổ tác dụng hẹp, hiệu lực
thuốc ngắn, ít tan trong nước, tan nhiều dung môi hữu cơ, bị kiềm phân hủy. Không

tồn lưu lâu dài trong môi trường [23].
Các hợp chất carbamat cũng có khả năng tích lũy và đầu độc hệ thần kinh của
người và động vật nhưng độc tính kém các hợp chất phosphor hữu cơ. Khi sử dụng,
10

chúng tác động trực tiếp vào men cholinesterase của hệ thần kinh và có cơ chế gây độc
giống như nhóm phosphor hữu cơ tuy nhiên mức độ độc hại không bằng các hợp chất
nhóm phosphor hữu cơ [53][60][71].
Một số HCBVTV nhóm carbamat có công thức cấu tạo như sau:


Aldicarb

Carbaryl

Carbofuran


Methomyl


Fenobucarb

Indoxacarb
1.1.3.5. Nhóm neonicotinoid
Neonicotinoid là nhóm HCBVTV gây kích thích thần kinh có cấu trúc tương tự
nicotin được sử dụng từ những năm 80 của thế kỷ XX. Đại diện cho nhóm này gồm
các chất như imidachloprid, acetamiprid, thiamethoxam, dinotefuran… [130][134].
Gần đây, một số nước hạn chế sử dụng những chất của nhóm này vì có nhiều
bằng chứng cho thấy nguy cơ gây hội chứng CDD (rối loạn sụt giảm bầy đàn) đối với

ong mật. Nguyên nhân là do các chất này phá huỷ hệ thống miễn dịch tự nhiên của ong
mật nhạy cảm với nhiều trường hợp nhiễm trùng gây chết [52]. Hiện nay, ở Việt Nam
các chất này vẫn được phép sử dụng làm HCBVTV trong nông nghiệp [2].
Một số HCBVTV nhóm neonicotinoid có công thức cấu tạo như sau:

Imidacloprid

Acetamiprid

Thiamethoxam

Dinotefuran

Clothianidin
11

Nhóm HCBVTV này có độc tính thấp hơn các nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu
cơ và carbamat. Tuy nhiên, một số sản phẩm chuyển hoá của nhóm này lại cho thấy có
độc tính cao đối với chim và cá. Cơ chế gây độc là do các sản phẩm này này gắn với
các receptor của acetylcholin, gây độc thần kinh trung ương. Đường tiếp xúc qua da có
độc tính thấp, có thể gây đỏ và ngứa mắt nhẹ. Chưa có các bằng chứng về gây ngộ độc
cấp tính trên người. Các nghiên cứu cũng cho thấy các chất này phân hủy nhanh trong
đường tiêu hóa và loại trừ qua phân, nước tiểu trong vòng 48 giờ [52][60][71].
1.1.3.6. Nhóm macrocyclic lacton
Các hợp chất nhóm macrocyclic lacton là các sản phẩm được lên men tự nhiên
từ các loài vi khuẩn Streptomyces giống nấm. Một số hợp chất đại diện của nhóm này
gồm abamectin, ivermectin, emamectin, spinosad…có công thức cấu tạo như sau
[108][130][134]:
Abamectin (B
1a

: B
1b
= 8:2)
Emamectin
Spinosad
12

Trước đây, tác dụng chính của các chất thuộc nhóm này là tác dụng diệt giun
sán đối với gia súc. Hiện nay, các chất thuộc nhóm này được sử dụng để làm
HCBVTV trong nông nghiệp. Các HCBVTV nhóm macrocyclic lacton thường được
phối hợp với các HCBVTV nhóm khác để tăng khả năng diệt trừ sâu hại [2][130].
Các chất này ngăn cản sự dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh và tế bào cơ
bằng cách tăng cường sự giải phóng và gắn acid γ-aminobutyric vào đầu tế bào thần
kinh dẫn đến làm tăng ion Cl
-
vào trong tế bào làm tê liệt hệ thần kinh. Các triệu chứng
ngộ độc cấp có thể gặp phải bao gồm hôn mê, giảm huyết áp, suy hô hấp và tử vong
[60][71].
1.1.3.7. Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật khác
Một số HCBVTV có cấu tạo khác biệt do đó không được xếp vào các nhóm
HCBVTV chính nêu trên. Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV thuộc
các nhóm nhỏ nhưng đang được sử dụng phổ biến [134].

Acetochlor
(Nhóm chloroacetanilid)

Atrazin
(Nhóm triazin)
Carbendazim
(Nhóm benzimidazol)

Azoxystrobin
(Nhóm strobin)


Carboxin
(Nhóm carboxamid)


Tebuconazol
(Nhóm azol)
Ngoài ra, có thể kể đến một số HCBVTV thuộc các nhóm khác như nhóm thuốc
có nguồn gốc thực vật (allicin, nicotin, pyrethrin, rotenone…), diamid
(chlorantraniliprole, cyantraniliprole) và nhiều HCBVTV không được phân loại vào
một nhóm cụ thể nào [134].