CHIẾN lược TINH CHẾ PROTEIN, các PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH ví dụ TINH CHẾ một PROTEIN tự NHIÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA KHOA HỌC SỰ SỐNG
BÀI TIỂU LUẬN
MÔN: CÔNG NGHỆ PROTEIN
Đề tài:
CHIẾN LƯỢC TINH CHẾ PROTEIN,
CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH. VÍ DỤ
TINH CHẾ MỘT PROTEIN TỰ NHIÊN
Giảng viên : ThS. Trịnh Đình Khá
Sinh viên thực hiện : Trương Thị Thu Huyền
Mã sinh viên : DTZ1153310024
Lớp : Công nghệ sinh k9
Thái Nguyên, tháng 12 năm 2014
1
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Mối liên hệ giữa DNA, RNA và protein trong tế bào 5
Hình 2: Các bậc cấu trúc của protein 6
Hình 3: Sơ đồ chiến lược tinh chế protein 7
Hình 4: Sơ đồ sắc ký lọc gel 12
Hình 5: Mô tả nguyên lý của quá trình sắc ký trao đổi ion 13
Hình 6: Sơ đồ sắc ký ái lực 14
Hình 7: Hệ thống HPLC 15
Hình 8: Điện di đồ SDS-PAGE của ricin tinh chế. Điện di được thực hiện trong điều kiện có
0,1% SDS trong gel polyacrylamide 12,6%. Các băng protein được nhuôm bằng Coommasie
Brillant Blue R250; 1: ricin dưới các điều kiện biến tính; 2: marker protein: 4,4, 18,4, 25, 35,
45, 66,2, 116 (kDa); 3: ricin dưới điều kiện không biến tính 24
2
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 4
CHƯƠNG 1: ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN 5
1. Khái niệm và cấu trúc protein 5

2. Vai trò của protein 6
CHƯƠNG 2: CHIẾN LƯỢC TINH CHẾ PROETIN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP 7
1. Thu hồi và chiết xuất protein. 7
1.1. Thu hồi các protein ngoại bào 8
1.2. Thu hồi các protein nội bào 8
1.3. Phá vỡ tế bào 8
1.4. Chiết rút protein 9
2. Tinh sạch sơ bộ 9
2.1. Loại bỏ các mảnh vỡ của tế bào 9
2.2. Ly tâm mẻ 9
2.3. Ly tâm dòng chảy liên tục 9
2.4. Lọc bằng màng 9
3. Thẩm tích 9
4. Hệ phân tách hai pha nước 10
5. Các phương pháp kết tủa 10
5.1. Kết tủa bằng ammonium 11
5.2. Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ 11
5.3. Kết tủa bằng các polymer khối lượng phân tử cao 11
5.4. Kết tủa bằng nhiệt 11
6. Các phương pháp sắc ký 12
6.1. Sắc ký lọc gel 12
6.2. Sắc ký trao đổi ion 13
6.3. Sắc ký ái lực (affinity chromatography) 13
6.4. Sắc ký tương tác kỵ nước 14
6.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid chromatographic
techniques)-HPLC 15
7. Siêu lọc 15
8. Thiết kế các protein để tinh sạch 16
8.1. Các thể vùi (inclusion) 16
8.2. Các đuôi ái lực 16

9. Phân tách protein bằng điện di trên gel 18
9.1. Điện di một chiều 18
9.2. Điện di dựa vào điểm đẳng điện 19
9.3. Điện di hai chiều 19
9.4. Đánh giá kết quả tinh sạch 20
10. Kết tinh protein 20
11. Làm khô và bảo quản chế phẩm protein 21
CHƯƠNG 3: VÍ DỤ VỀ TINH CHẾ PROTEIN TỰ NHIÊN TINH SẠCH 22
VÀ XÁC ĐỊNH RICIN TỪ HẠT THẦU DẦU (RICINUS COMMUNIS) 22
KẾT LUẬN 26
KẾT LUẬN 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO 28
3
MỞ ĐẦU
Đất nước ngày càng phát triển, mức sống của người dân cũng được nâng cao
nên nhu cầu về ăn, mặc, đáp ứng các dịch vụ cũng tăng lên. Để đáp ứng đầy đủ nhu
cầu dinh dưỡng thì cơ thể cần cung cấp đầy đủ các acid amin nên protein là nguồn
dinh dưỡng rất quan trọng cho con người nói riêng và vi sinh vật nói chung. Ngoài ra
protein còn là chất xúc tác quan trọng cho các phản ứng sinh học trong sản xuất và
được gọi là enzyme.
Trong sản xuất protein để sử dụng ở các lĩnh vực khác nhau đặc biệt trong
chuẩn đoán lâm sàng và cho ứng dụng trị liệu, công nghệ protein và công nghệ DNA
tái tổ đã thể hiện một vai trò ngày càng quan trọng. Các protein vốn chỉ có một lượng
nhỏ từ mô động vật bây giờ có thể sản xuất trong một lượng gần như vô hạn từ các vi
khuẩn sinh trưởng dễ dàng. Trong quá trình sản xuất đó thì mức độ protein ở mức độ
tinh sạch là điều vô cùng quan trọng. Xuất phát từ việc tinh sạch protein quan trong đó
chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu: “Chiến lược tinh chế protein, các phương pháp và
ví dụ tinh chế một protein tự nhiên.”
4
CHƯƠNG 1: ĐẠI CƯƠNG VỀ PROTEIN

Hình 1: Mối liên hệ giữa DNA, RNA và protein trong tế bào
1. Khái niệm và cấu trúc protein
Protein (Protid hay Đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa
phân mà các đơn phân là acid amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ
các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc
gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.
Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các
axit amin. Acid amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amine (-NH2), hai
là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1
nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của acid amine. Người ta đã
phát hiện ra được tất cả 20 acid amin trong thành phần của tất cả các loại protein khác
nhau trong cơ thể sống.
Cấu trúc protein được chia làm thành bốn bậc: Cấu trúc bậc một (cấu trúc sơ cấp)
là trình tự sắp xếp các amino acid trong chuỗi polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững
nhờ các liên kết peptide (liên kết cộng hóa trị). Cấu trúc bậc hai (cấu trúc thứ cấp) là
tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau trong chuỗi polypeptide, hay
nói cách khác đó là dạng cuộn xoắn cục bộ (local fold) của từng phần trong chuỗi
polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ liên kết hydrogen được tạo thành giữa các
liên kết peptide ở gần kề nhau, cách nhau những khoảng xác định. Cấu trúc bậc ba là
5
tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở xa nhau trong chuỗi polypeptide, là dạng
cuộn xoắn trong không gian của toàn chuỗi polypeptide (overall fold), đây là hình dạng
chung của chuỗi polypeptide. Các liên kết như liên kết Van der Waals, liên kết tĩnh điện,
liên kết hydrogen giữa các mạch bên của các gốc amino acid đều tham gia giữ vững cấu
trúc bậc ba. Cấu trúc bậc bốn xuất hiện ở những phân tử protein bao gồm hai hay nhiều
chuỗi polypeptide hình cầu (bậc ba), tương tác không gian (sự sắp xếp) giữa các chuỗi này
trong phân tử gọi là cấu trúc bậc bốn. Mỗi chuỗi polypeptide này được gọi là một tiểu
đơn vị (subunit). Chúng gắn với nhau nhờ các liên kết hydrogen, lực Van der Waals giữa
các nhóm phân bố trên bề mặt của các tiểu đơn vị.
Hình 2: Các bậc cấu trúc của protein

2. Vai trò của protein.
- Vai trò vận chuyển
- Vai trò xúc tác
- Vai trò dinh dưỡng và dự trữ
- Vai trò vận động
- Vai trò cấu trúc, chống đỡ cơ học
- Vai trò bảo vệ
- Vai trò điều hoà
- Các vai trò khác
6
CHƯƠNG 2: CHIẾN LƯỢC TINH CHẾ PROETIN VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP
Trong thiết kế quy trình tinh sạch ở quy mô lớn thì số lượng các bước và sự thu
hồi sản phẩm ở mỗi bước đã ảnh hưởng quan trọng lên sản lượng toàn phần. Sự thu
hồi đặc trưng của một bước sắc ký là trong khoảng 80% và 90%, vì sự tinh sạch phức
tạp đòi hỏi nhiều bước do đó sản lượng toàn phần nhiều khi chỉ bằng 10% của nguyên
liệu khởi đầu. Điều này không thành vấn đề ở trường hợp tinh sạch quy mô phòng thí
nghiệm, nhưng nếu tinh sạch ở quy mô lớn thì đó là vấn đề rất quan trọng cần quan
tâm để tối ưu toàn bộ quá trình từ hệ thống biểu hiện hoặc sự lên men đến bước tinh
sạch cuối cùng, để giảm thiểu số bước tinh sạch cần thiết. Chiến lược tinh chế gồm
những bước sau:
 Giải phóng protein đích ra khỏi nguyên liệu
 Hòa tan vào dung dịch nổi, loại chất cặn.
 Loại nước, cô đặc protein.
 Loại chất tạp nhiễm, tinh sạch.
 Làm bền protein.
Hình 3: Sơ đồ chiến lược tinh chế protein.
1. Thu hồi và chiết xuất protein.
Sự thu hồi và tinh sạch các protein và enzyme cũng quan trọng như các giai
đoạn lên men xét theo góc độ kinh tế của quá trình sản xuất. Thách thức chính trong
các bước thu hồi là giảm thiểu sự mất hoạt tính của protein. Trong phần này sẽ trình

bày các bước thu hồi và tinh sạch truyền thống cho protein.
7
1.1. Thu hồi các protein ngoại bào
Các protein ngoại bào tương đối dễ thu hồi và tinh sạch. Tế bào và nồng độ của
dung dịch hoạt động được loại bỏ một cách đơn giản, và có thể cung cấp trực tiếp
protein thô thích hợp cho một số ứng dụng. Dung dịch protein tương đối sạch có thể
thu được bằng cách cho các nuôi cấy sinh trưởng trên môi trường đơn giản có thành
phần xác định. Các bước thu hồi và tinh sạch giống như các bước đã dùng cho
protein nội bào sau khi phá vỡ tế bào.
1.2. Thu hồi các protein nội bào
Để tách chiết các protein nội bào từ các nguồn động-thực vật, mô phải được phá
vỡ để giải phóng chúng.
1.3. Phá vỡ tế bào
Protein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Sau
khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch
môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào
(protein enzyme nội bào). Các protein enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan
trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v ) của tế bào.
Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng. Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và
dày. Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của
tế bào. Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và
màng của các bào quan của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội
bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và
chuyển chúng vào dung dịch.
Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với
bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị nghiên đồng thể
(homogenizator). Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với một môtơ quay và có thể điều
chỉnh được tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào giữa chày thùy tinh và thành cối sẽ bị
phá hủy. Để việc phá vỡ có hiệu quả, ở mô thực vật, trước khi nghiền, người ta thường
thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước. (ví dụ như đối với mẫu hạt khô).

Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết protein enzyme người ta cần
cắt bỏ các mô liên kết.
Muốn tách được các protein trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng
các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như
butanol, acetone, glycerin, ethylacetat và chất tẩy (detergent). Các hóa chất tốt cho
việc phá vỡ các bào quan của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.
8
1.4. Chiết rút protein
Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất các protein
enzyme bằng các dụng dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước
đối với protein enzyme nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với các protein
enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùy thuộc vào
tính chất của protein enzyme cần nghiên cứu.
2. Tinh sạch sơ bộ
Tinh sạch protein là một bước rất cần thiết, tuy nhiên thường chỉ thực hiện đối
với những protein có giá trị ứng dụng cao.
2.1. Loại bỏ các mảnh vỡ của tế bào
Sau khi phá vỡ tế bào, bước đầu tiên trong quá trình tinh sạch protein nội bào là
loại bỏ các mảnh vỡ tế bào. Sự phân tách các vật rắn khỏi chất lỏng là hoạt động cơ
bản rất quan trọng trong phân lập protein, và thường được tiến hành bằng phương pháp
ly tâm hoặc lọc.
2.2. Ly tâm mẻ
Ly tâm mẻ thích hợp với các dung tích ly tâm trong khoảng từ nhỏ hơn 1 mL
đến một vài lít, và có khả năng sử dụng một lực ly tâm (rotational centrifugal force,
RCF) tương đối lớn lên tới 100.000 g (hằng số hấp dẫn). Tuy nhiên, để loại bỏ các tế
bào vi khuẩn, mảnh vỡ tế bào và các kết tủa protein, thì lực ly tâm chỉ cần đạt khoảng
20.000 g.
2.3. Ly tâm dòng chảy liên tục
Ly tâm dòng chảy liên tục thường được sử dụng cho quá trình tinh sạch protein
ở quy mô lớn để loại bỏ các chất dạng hạt. Có ba kiểu ly tâm chính thích hợp hơn cả

là: ly tâm thùng rỗng (hollow bowl), ly tâm thùng có nhiều buồng (multi-chamber)
hoặc đĩa (dics), và ly tâm thúng (basket).
2.4. Lọc bằng màng
3. Thẩm tích
Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những
chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharid) nhưng thấm đối với các dạng dịch
các tinh thể.Các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử
thấp ) có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick. Nước sẽ khuếch tán từ dung
dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó
9
các ion (cation và anion) và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển vào dung dịch có nồng độ
thấp hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa). Trong quá trình tách chiết và tinh sạch
protein, để loại muối ammonium sulphate ra khỏi dung dịch protein thì cho dung dịch
protein vào cái túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm. Thông thường người ta
hay dùng túi colodion hoặc cellophane (loại sau hay được dùng hơn). Sau đó đặt cả túi
vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (ví dụ
đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M). Vì màng cellophane là màng bán thấm, có
kích thước lỗ chỉ cho các chất có phân tử đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo
định luật khuếch tán. Như vậy, muối sẽ khuyến tán vào nước hoặc dung dịch đêm
loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ
dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua
túi thẩm tích và được giử lại trong túi.
Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủa protein vào túi
thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi). Cho thuốc sát trùng hoặc toluen để bảo quản
protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị thối hỏng). Buộc túi vào một que
thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữa chậu. Cho vòi nước
chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên. Muối (NH
2
)SO
4

hòa
tan trong nước và bị loại dần. Thời gian thẩm tích có thể từ 24 - 48 giờ, làm thẩm tích
lần cuối cùng bằng nước cất.
4. Hệ phân tách hai pha nước
Một phương pháp khác với ly tâm và lọc là phương pháp phân tách hai pha
nước (aqueous two-phase separation), hay chất lỏng-chất lỏng. Các hệ hai pha nước
đặc trưng được tạo ra bằng cách trộn các dung dịch polyethylene glycol (PEG) và
dextran hoặc PEG và các loại muối như potassium phosphate hoặc ammonium
sulphate để tạo thành hai pha riêng biệt. Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng
hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì thế kỹ thuật này có thể được dùng cho cả hai trường
hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia (partitioning) protein trong
suốt quá trình tinh sạch. Sự phân chia chính xác của một protein tùy thuộc vào các
thông số như khối lượng phân tử và điện tích của chúng, nồng độ và khối lượng phân
tử của các polymer, nhiệt độ, pH và lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các muối
đa trị như phosphate hoặc sulphate.
5. Các phương pháp kết tủa
Thông thường cần tiến hành giai đoạn kết tủa mẻ đầu tiên để làm giảm thể tích
tổng số của dung dịch enzyme. Các enzyme có thể được kết tủa đơn giản, tuần tự hoặc
10
phối hợp với ammonium sulphate, sodium sulphate, polyethyleneimine và
polyallylamine, hoặc với các dung môi hữu cơ như là isopropanol, ethanol và
acetone. Streptomycin sulphate, polyethyleneimine và các polyamine khác có thể kết
tủa các chất có tính chất acid như nucleic acid và các nucleoprotein. Ammonium
sulphate và các dung môi hữu cơ có thể kết tủa một cách chọn lọc enzyme mong
muốn với hoạt tính thu hồi từ 80-90%.
5.1. Kết tủa bằng ammonium
Phương pháp xử lý muối các protein đã đạt được cả hai mục đích tinh sạch và
cô đặc. Loại muối được sử dụng phổ biến nhất là ammonium sulphate, do khả năng
hòa tan của nó, không có độc tính cho hầu hết các enzyme, và giá thành thấp. Kết tủa
protein bằng muối phụ thuộc vào nhiều nhân tố như: pH, nhiệt độ, nồng độ protein, và

loại muối được sử dụng. Nồng độ protein là thông số đặc biệt quan trọng khi tăng quy
mô, bởi vì hầu hết sự tinh sạch ở quy mô lớn được tiến hành ở các nồng độ protein cao
hơn sự tinh sạch ở quy mô phòng thí nghiệm.
5.2. Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ
Việc bổ sung các dung môi hữu cơ vào các dung dịch nước làm giảm khả năng
hòa tan của protein do giảm hằng số điện môi của môi trường. Các dung môi hữu cơ
khác nhau được dùng để kết tủa protein như ethanol, acetone, và 2-propanol là quan
trọng nhất. Thường các protein bị biến tính bởi các dung môi hữu cơ nên cần thiết làm
việc ở nhiệt độ dưới 0ºC.
5.3. Kết tủa bằng các polymer khối lượng phân tử cao
Các chất kết tủa hữu cơ khác có thể được dùng để phân đoạn các protein là các
polymer hòa tan trong nước như PEG. Chất này có ưu điểm là không có độc tính,
không dễ cháy và không gây biến tính các protein. Nó được dùng chủ yếu trong lĩnh
vực xử lý máu.
5.4. Kết tủa bằng nhiệt
Khi protein đủ bền khó bị biến tính, thì xử lý nhiệt có thể cung cấp một mức độ
tinh sạch cao được xem như là bước đầu tiên. Ví dụ: Ở quy mô lớn, 55% protein
không mong muốn được loại bỏ trong một bước riêng rẽ bằng cách làm nóng dịch
chiết E. coli mang protein A của Staphylococcus tái tổ hợp ở 80ºC trong 10 phút.
Nếu protein tái tổ hợp được tinh sạch khỏi một cơ thể ưa nhiệt thì kết quả của xử lý
nhiệt đầu tiên có thể là hiệu quả hơn nhiều.
11
6. Các phương pháp sắc ký
Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký là một thực hành chuẩn ở phòng thí
nghiệm trong nhiều năm. Để tinh sạch các sản phẩm có thể tích nhỏ và giá trị cao,
các protein trị liệu hoặc chẩn đoán đặc hiệu, thì phương pháp sắc ký là phương
pháp được sử dụng rộng rãi nhất. Sắc ký chỉ là phương pháp, với khả năng chọn
lọc được yêu cầu, để tinh sạch một protein riêng rẽ khỏi hỗn hợp phức tạp của các
protein tới một sự tinh sạch cuối cùng lớn hơn 95%. Các kỹ thuật phân tách bằng
sắc ký được sử dụng phổ biến, bao gồm trao đổi ion, tương tác kỵ nước, ngăn

chặn kích thước, ái lực và ái lực giả. Các kết tủa enzyme tinh sạch cao thường được
đông khô để bảo quản và vận chuyển.
6.1. Sắc ký lọc gel
Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong
tách chiết và tinh sạch protein. Dịch chiết protein enzyme đã được loại bỏ phần lớn
các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết được tiếp tục làm sạch
bằng phương pháp sắc ký cột.
Sắc ký lọc gel còn được gọi là phương pháp dùng chất rây phân tử, lọc gel (gel
filtration). Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau nhau về kích thước,
hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra. Để
đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ,
không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền
với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích
lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước
(hidrofil). Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên.
Hình 4: Sơ đồ sắc ký lọc gel
12
6.2. Sắc ký trao đổi ion
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của
các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của
phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và
các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa
có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong
nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex,
Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm
ion hóa. Các chất trao đổi ion có chất giá là celluose, sephadex, molselect thông
thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là
polistirol (ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng
phân tử nhỏ hơn.
Hình 5: Mô tả nguyên lý của quá trình sắc ký trao đổi ion

6.3. Sắc ký ái lực (affinity chromatography)
Phương pháp này dựa vào khả năng liên kết đặc hiệu và thuận nghịch của một
protein với một phân tử khác (phối tử), đã được gắn bằng liên kết đồng hóa trị vào một
chất mang không hòa tan chứa trong cột sắc ký. Khi cho một hỗn hợp có chứa protein cần
làm sạch đi qua thì chỉ có protein quan tâm bị giữ lại, còn tất cả các protein khác không
tương tác được với phối tử (ligand) sẽ bị rửa trôi ra khỏi cột. Tiếp đó, protein sẽ bị rửa
giải ra bằng các phương pháp khác nhau. Phương pháp sắc ký ái lực rất hiệu quả trong
13
việc tinh sạch các enzyme, cho phép thu được enzyme có độ sạch cao (hơn sắc k ý trao
đổi ion khoảng 10 lần) chỉ bằng một giai đoạn và trong một thời gian ngắn.
Hình 6: Sơ đồ sắc ký ái lực
6.4. Sắc ký tương tác kỵ nước.
Sắc ký tương tác kỵ nước sử dụng tính chất kỵ nước của protein bề mặt như là
một đặc điểm để chọn lọc. Loại phân tách này thích hợp khi được tiến hành tiếp theo
bước kết tủa ammonium sulphate, và không cần thiết phải loại bỏ muối trước khi thực
hiện bước sắc ký này. Bằng cách dùng các kỹ thuật hấp phụ và khử hấp phụ bề mặt sẽ
làm giảm mạnh thể tích của các dung dịch protein và lượng protein cần tinh sạch sẽ
tăng lên từ 90-95%. Chất lượng này đủ cho hầu hết các ứng dụng của protein đặc biệt.
Các protein sẽ lần lượt được phân tách ra tùy theo tương tác của chúng với một chất
mang có chứa các nhóm kỵ nước (ưa béo). Các protein chứa các nhóm kỵ nước trên bề
mặt, chất mang kỵ nước và dung môi ưa nước tạo
14
thành một hệ ba thành phần và tương tác được với nhau. Hệ này có thể bị rối
loạn khi thay đổi nhiệt độ, pH hoặc lực ion.
6.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid
chromatographic techniques)-HPLC
Đây là phương pháp phân tách các chất bằng cách dùng áp suất để đẩy nhanh
dung dịch qua cột sắc ký với một hiệu suất cao. Đầu tiên, kỹ thuật này được thiết kế
để phân tách các phân tử hữu cơ nhỏ hòa tan trong các dung môi không phải nước, sau
đó kỹ thuật này đã nhanh chóng phát triển thành một phương thức thích hợp để phân

tách các protein trong các dung môi nước.
Hình 7: Hệ thống HPLC
HPLC sử dụng một loại cột chứa các hạt nhỏ rất đồng nhất, có tác dụng cải thiện
sự ổn định vật lý và hóa học và phân tách nhanh hơn các gel mềm truyền thống. Cột sắc
ký chứa các vật liệu đệm kín có độ phân giải cao (8, 15 hoặc 40 µm) cho phép sản xuất
các phân đoạn cô đặc hơn. Các hạt nhỏ có sức bền cao đối với dòng chảy của chất lỏng
để thiết bị được thiết kế hoạt động ở áp suất tương đối cao. Dung môi được phân phối
vào cột bằng bơm với dòng không có xung, không thay đổi ở áp suất ngược cao. Cột có
khả năng chịu đựng sự tăng áp suất. Đầu dò (detector) có thời gian phản ứng nhanh vì
các đỉnh protein có thể trải qua trong một vài giây. Ưu điểm chính của hệ thống HPLC
là có thời gian chạy nhanh hơn nhiều so với các phương pháp sắc ký khác nhưng nhược
điểm của hệ thống này là đắt tiền nên khó áp dụng ở quy mô lớn.
7. Siêu lọc
Phương pháp này được sử dụng trong trường hợp thẩm tách hoặc lọc gel để
khử muối hoặc trao đổi đệm. Bằng cách dùng các chất kết tủa ái lực để tăng khối
15
lượng phân tử của protein mong muốn, phương pháp này cũng có thể được dùng như
một kỹ thuật tinh sạch.
Hệ siêu lọc thường sử dụng màng lọc có bề mặt nhẵn hoặc màng lọc hệ sợi
rỗng. Các sợi này có đặc điểm tương tự với các bề mặt nhẵn, nhưng đối với các quá
trình ở quy mô lớn thì nó tạo ra một diện tích bề mặt lớn hơn thể tích đã cho. Ở trường
hợp hoạt động ở quy mô pilot, hệ siêu lọc thích hợp với diện tích màng lên tới 6,4 m
2
,
cho tốc độ siêu lọc lên tới 200 L/giờ, tùy thuộc vào nồng độ của protein. Các hệ lớn
hơn thích hợp với các tốc độ siêu lọc của hàng trăm lít/giờ. Sử dụng phương pháp này
có thể ứng dụng cho hầu hết mọi quy mô hoạt động.
8. Thiết kế các protein để tinh sạch
Các nhân tố ở quá trình chuẩn bị cơ chất và nguyên liệu sản xuất (upstream
processing) có thể ảnh hưởng đến sự phát triển phương thức tinh sạch protein sau

này, công nghệ DNA tái tổ hợp cũng có một ảnh hưởng quan trọng lên sự tinh sạch
protein. Bằng cách dung hợp một gen quan tâm với một trình tự promoter hiệu quả, thì
một protein ngoại lai có thể được biểu hiện trong cơ thể vật chủ từ 10 tới 40% protein
tổng số hòa tan của tế bào. Điều này có thể so sánh với sự biểu hiện của nhiều protein
nguyên thể (chỉ chiếm khoảng 0,01 tới 4% protein tổng số hòa tan của tế bào). Vì vậy,
quá trình tinh sạch tiếp theo của protein được đơn giản hóa. Đối với các protein được
biểu hiện trong một dạng hòa tan, các kỹ thuật di truyền có thể được dùng để hướng
tới việc protein được tổng hợp mới trong gian bào, hoặc thậm chí trong môi trường
nuôi cấy. Điều này có thể làm tăng sự ổn định của protein được biểu hiện (vì chỉ hai
trong số tám protease được biết của E. coli là hoàn toàn ở trong gian bào) và đơn giản
hóa sự tinh sạch (vì chỉ khoảng 8% của tất cả protein của E. coli là ở khoang gian bào).
8.1. Các thể vùi (inclusion)
Các mức độ biểu hiện cao như thế đã sản xuất được rất nhiều protein, dẫn đến
xuất hiện các hạt không hòa tan được gọi là các thể vùi. Trường hợp này đã được
quan sát ở nhiều protein tái tổ hợp, bao gồm urogastrone, interleukin-2, prochymosin
và các interferon. Sau khi phá vỡ tế bào, các hạt như thế có thể được lắng xuống đáy
với một lực ly tâm (RCF) tương đối thấp, sản xuất nguyên liệu không hòa tan chứa
hơn 50% protein mong muốn.
8.2. Các đuôi ái lực
Khái niệm đuôi ái lực xuất hiện khi thiết kế di truyền với mục đích giúp cho sự
tinh sạch protein hoặc enzyme hiệu quả hơn. Gen của protein quan tâm được dung hợp
với chuỗi DNA mã hóa cho một số trình tự amino acid sẽ đơn giản hóa quá trình tinh
16
sạch protein, bằng cách biến đổi các tính chất của nó trong một kiểu có thể dự đoán.
Một trong các trường hợp đầu tiên là dung hợp di truyền của một số gốc arginine với
C-terminus của urogastrone. Gen này sẽ sản xuất một protein liên kết mạnh với khuôn
trao đổi ion cho cation. Đuôi polyarginine sau đó được loại bỏ bằng cách dùng enzyme
bất động carboxypeptidase A.
Khó khăn chủ yếu ở các dung hợp ái lực để tinh sạch protein là phải loại bỏ
thành công đuôi ái lực và các tác nhân được sử dụng. Vấn đề này có thể được giải

quyết từng phần bằng sự biến nạp di truyền các điểm đặc hiệu cao cho protease hoặc
cho sự cắt bỏ các liên kết acid không bền ở chỗ nối của protein tái tổ hợp và đuôi ái
lực. Sử dụng các protease đặc hiệu là thích hợp hơn cả, bởi vì có thể ứng dụng trong
các điều kiện “nhẹ nhàng”, chủ yếu là thrombin, enterokinase và Factor Xa. Tất cả
những protein này hoạt động ở 37ºC và có thể phân cắt ở các vị trí bên trong protein
quan tâm, hoặc do mất tính đặc hiệu hoặc từ sự nhiễm bẩn các protease. Cuối cùng,
các bước sắc ký tiếp theo sẽ được yêu cầu để loại bỏ đuôi ái lực được phân cắt và
protease.
Bảng 1: Các phương pháp tinh sạch protein bằng đuôi ái lực
17
9. Phân tách protein bằng điện di trên gel
Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác
định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách
là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực
hiện nhờ kỹ thuật điện di.
9.1. Điện di một chiều.
Điện di luôn được thực hiện trên gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì gel
giống như một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích
thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ
gel thì gần như không di chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển
trong gel với nhiều vận tốc khác nhau. Điện di được thực hiện trên một bảng
polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Hướng của dòng điện từ trên xuống.
Gel polyacrylamide, được tạo thành từ sự polymer hóa acrylamide và sự liên
kết chéo của methylenebisacrylamide, được chọn làm môi trường cho điện di vì nó có
tính trơ về mặt hóa học và được tạo hình nhanh chóng. Điện di là một cách lọc qua gel
mà theo đó tất cả các phân tử, không xét về kích thước, sẽ bị tác động một lực để di
chuyển trong cùng một chất nền. Gel ở đây có thể xem tương đương với một hạt trong
cột lọc gel.
Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên
acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung

dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các
nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay
dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS
với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của
protein. Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân
protein ban đầu; vì thế, điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến
điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi
điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng
cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những đánh dấu
phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp x quang lên miếng
gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi.
Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở
phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới
những điều kiện như thế tỉ lệ với khối lượng của chúng. Tuy nhiên, cũng có vài protein
18
giàu carbohydrate và protein màng không tuân theo mối tương quan này. SDS-PAGE
có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng
0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí
ít hơn (~0.02ug) vẫn có thể được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Những protein chênh
lệch về khối lượng khoảng 2% (ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhau khoảng 10 acid
amin) có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE.Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta đánh
giá kết quả của quá trình tinh sạch. Với những phân đoạn đầu tiên, kết quả là dãy gồm
rất nhiều protein. Nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số lượng protein sẽ giảm và sẽ có
một băng ngày càng đậm. Vạch đó tương ứng với protein mục tiêu.
9.2. Điện di dựa vào điểm đẳng điện
Các protein còn có thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid amin
có tính acid và số acid amin có tính base của chúng. Điểm đẳng điện của một protein
(pI) là điểm pH mà ở đó điện tích thực của nó bằng 0. Tại điểm pH này, tính di động
của protein trong điện trường cũng bằng 0. Giả định cho một hỗn hợp protein chạy
trong điện trường trong một miếng gel với một khuynh độ pH, không có sự hiện diện

của SDS. Mỗi protein sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của
nó. Dựa vào hiện tượng này, ta có phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng
điện của protein. để tạo Khuynh độ pH, trước hết là cho vào gel một hỗn hợp
polyampholyte (những polymer nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau đó điện di
hỗn hợp này. Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng
phân biệt được sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một
đơn vị điện tích cũng có thể được phân tách bằng phương pháp này.
9.3. Điện di hai chiều
Đây là một phương pháp có khả năng phân tách cao do sư kết hợp SDS-PAGE
với điện di dựa vào điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựa
vào điểm đẳng điện. sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa được điện di lên tấm
gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm ngang. Protein sẽ chịu một điện trường
theo chiều dọc. Kết quả là một mô hình các điểm được phân tách hai chiều, chiều
ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng. Khả năng phân tách của
phương pháp này được chứng minh khi hơn một ngàn protein của vi khuẩn E.coli có
thể được phân tách trong một lần chạy điện di.
Những protein được phân tách từ tế bào ở các điều kiện sinh lý khác nhau có
thể phân tách được bằng phương pháp này, sau đó cường độ của tính hiệu sẽ được xác
19
định. Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnh hay yếu tùy vào
tình trạng sinh lý.
9.4. Đánh giá kết quả tinh sạch
Sau mỗi bước tinh sạch, những thông số sau cần được ghi nhận để có thể đánh
giá quá trình tinh sạch protein:
Protein tổng số: lượng protein có trong một phân đoạn. Thông số này tính bằng
cách nhân nồng độ một phần của phân đoạn với tổng thể tích của phân đoạn đó.
Hoạt tính tổng: hoạt tính của enzyme trong phân đoạn đó. Thông số này được
tính bằng cách nhân hoạt tính của enzyme có trong lượng mẫu được xét nghiệm với
tổng thể tích của phân đoạn đó.
Hoạt tính riêng: bằng hoạt tính tổng chia cho protein tổng số.

Yield: hoạt tính còn lại sau mỗi bước tinh sạch được thể hiện bằng phần trăm
hoạt tính của dịch chiết thô với hoạt tính trong dịch chiết khởi đầu là 100%.
Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh sạch, được tính bằng cách chia hoạt tính riêng,
được tính sau mỗi bước tinh sạch, với hoạt tính riêng của dịch chiết ban đầu.
Qua theo nghiên cứu khảo nghiệm, người ta thấy rằng sau mỗi bước tinh sạch,
mức độ tinh sạch tăng lên trong khi yield lại giảm. Vì vậy, đánh giá quá trình tinh
sạch phải dựa cả vào 2 thông số mức độ tinh sạch và yield. Một quá trình tinh sạch tốt
sẽ có mức độ tinh sạch cao và chỉ số yield thấp. Nếu chỉ số yield cao còn mức độ tinh
sạch thấp có nghĩa là còn nhiều tạp nhiễm trong mẫu (nhiều protein ngoài protein mục
tiêu) và làm phức tạp việc giải thích thí nghiệm.
10. Kết tinh protein.
Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ở giai
đoạn tinh chế cuối cùng. Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ
sạch không vượt quá 50% và có thể chứa các protein enzyme khác. Người ta thường
tiến hành kết tinh protein enzyme trong dung dịch (NH
4
)
2
SO
4
. Thông thường là thêm
muối (NH
4
)
2
SO
4
vào dung dịch protein enzyme khá đậm đặc cho đến khi làm vẫn đục
nhẹ nhàng dung dịch. Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng
thời tăng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch. Có thể tiến hành tăng nồng độ

muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch protein
enzyme theo từng giọt, thêm muối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơi chậm
chạp dung dịch protein enzyme. Trong quá trình kết tinh có thể thay đổi chỉ số pH
20
hoặc nhiệt độ. Để kết tinh proteinenzyme được dễ dàng, ở những giai đoạn trước đó,
người ta thường tách từng phần các protein enzyme bằng các dung môi hữu cơ.
11. Làm khô và bảo quản chế phẩm protein
Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước của
chúng. Nếu dung dịch protein enzyme bị khô ở độ nhiệt trong phòng thì đa số protein
enzyme bị biến tính. Protein enzyme chỉ có thể được giữ ở dang khô trong trường hợp
nếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ở nhiệt độ thấp. Nhiều protein
như chúng ta đã biết, ở độ nhiệt thấp có thể được kết tủa bằng rượu hoặc acetone. Nếu
kết tủa thu được bằng cách đó đem xử lý bằng rượu tuyệt đói, bằng acetone hoặc bằng
ether và sau đó làm khô thật nhanh thì protein sẽ không bị biến tính. Ở dạng khô, bột
protein có thể giữ một thời gian lâu, khi hòa tan nó trong nước nó thể hiện những tính
chất ban đầu của mình.
21
CHƯƠNG 3: VÍ DỤ VỀ TINH CHẾ PROTEIN TỰ NHIÊN TINH SẠCH
VÀ XÁC ĐỊNH RICIN TỪ HẠT THẦU DẦU (RICINUS COMMUNIS).
Ricin là một glycoprotein thực vật cực độc, có cấu trúc gồm hai tiểu phần RTA và
RTB với tổng khối lượng phân tử khoảng 64 kDa. Ricin đã và đang được sử dụng trong
nhiều lĩnh vực, trong đó nổi bật nhất là các ứng dụng từ y học. Để tinh sạch ricin ra khỏi
hỗ hợp các protein khác, quy trình nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp như: tách và
tinh chế protein bằng các dung dịch muối điều chỉnh pH, sắc ký trao đổi cation kết hợp và
điện di chiết rút protein từ gel không biến tính. Kết quả thu được chế phẩm tinh chế là
ricin đã tinh sạch ở dạng prepropolypeptide với khối lượng 64734 kDa.
NGUYÊN LIỆU
Hạt thầu dầu mua ở chợ Đồng Xuân có nguồn gốc từ Vĩnh Phúc. Các hóa chất
được sử dụng trong thí nghiệm đều có độ tinh sạch cao: acetonitrile, methanol mua từ
HPLC grade, J.T. Barker, USA; nước sử dụng lọc qua hệ thống Milli-Q; cột

Hydroxyaptite, trysin; triflouracetic acid; formic acid; hóa chất điện di SDS-PAGE;
cột sắc ký ngược pha C18; đầu đưa mẫu Fused Silica Tip.
PHƯƠNG PHÁP
Tách chiết và tinh chế ricin
100mg bã ép hạt Thầu dầu được nghiền đồng nhất trong 250ml dung dịch đệm
(0,15M NaCl, 0,01M phosphate Buffer Saline (PBS), pH 7,4) và trộn đều ở nhiệt độ
phòng 30 phút. Dịch huyền phù sau đó được chiết ở 4ºC qua đêm và thu dịch chiết
bằng ly tâm 12000 vòng/ phút trong 30 phút. Dịch chiết được tủa bằng ammonium
sulfate (NH)
2
SO
4
bão hòa (60%) và ly tâm thu protein tủa với tốc độ 12000 vòng /phút
trong 30 phút. Sau đó, hòa tan tủa thu được bằng 100ml đung dịch 0,01M PBS, ph 6,8
và thẩm tích loại muối 3 lần trong 0,01M PBS. Tiếp theo dung dịch protein sau khi
loại muối được phân tách trên hệ thống sắc ký FPLC với cột trao đổi cation –
Hydroxyapatite (2,0 x 25 cm). Trước khi đưa dung dịch protein lên cột, cột được cân
bằng với 500ml dung dịch 0,01M PBS. Các protein không bám cột sẽ được rửa trôi
bằng dung dịch 0,01M PBS. Các protein bám cột được thôi bằng gradient 0,01 – 0,3M
PBS đồng thời thu phân đoạn và cất giữ ở 4ºC. Sau đó kiểm tra các phân đoạn thu
được bằng điện di SDS – PAGE 12,6% ở các điều kiện biến tính.
Điện di SDS – PAGE biến tính và không biến tính
Phương pháp điện di SDS – PAGE được tiến hành theo Laemmli (1970)
22
Thủy phân protein trong gel bằng enzyme trysin
Protein sau khi phân tách qua SDS – PAGE được cắt băng thành các phân đoạn
và tiến hành thủy phân protein trong gel theo phương pháp được mô tả. Các peptide
sau thủy phân được chiết rút khỏi gel bằng dịch chiết (60% acetonitrle, 1% TFA). Dịch
chiết cố chứa peptide được làm khô bằng hệ máy SPD1010 SpeeVac System.
Phân tích thành phần peptide qua hệ thống sắc ký 1 chiều NanoLC

Hỗ hợp peptide sau khi thủy phân được phân tích qua hệ thống sắc ký lỏng một
chiều thông qua cột ngược pha. Mẫu được đưa vào với thể tích 20µl và được đẩy lên
cột với tốc độ dòng 30µl/phút bằng 0,1% formic acid. Các peptide bám trên cột RP-
C18 được thôi ra bằng pha linh động A (0,1% formic acid) và B (85% acetonitrile và
0,1% formic acid) với tốc độ dòng 200nl/phút, theo gradient nồng độ tuyến tính từ 5
đến 100% pha linh động B trong 90 phút. Cột ngược pha C18 được gắn vào đầu mẫu
Silica Tip kết nối với máy quang phổ QSTAR XL bằng nguồn ESI.
Ghi phổ LC-ESI-MSIMS
Máy khối phổ QSTART XL được vận hành ở chế độ IDA để thực hiện việc
chuyển từ quét phổ TOF MS đối với các ion nằm trong dải khổi từ 400 – 1200 sang
khối phổ liên tiếp 3 ion phân tử có mật độ cao nhất và lớn hơn 15 được xác định nhờ
phần mềm BioAnalyst QS. Sai số về khối được đặt ở mức 100 ppm, thời gian thực
hiện MS/MS đối với mỗi ion không quá 90 giây. Hiệu điện thế được đặt để ion hóa
mẫu là 2200V.
Phân tích phổ khối peptide bằng phần mềm Mascot
Phổ khối MS/MS được phân tích bằng phần mềm Mascot v1.8 đây là phần
mềm có khả năng phân tích dữ liệu phổ MS/MS để nhận dạng protein dựa vào thuật
toán Mowse được phát triển bởi MatrixScience. Cơ sở dữ liệu được dùng để tìm kiếm
trong Mascot là NCBInr.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Theo một số nghiên cứu, thành phần protein trong hạt thầu dầu khá đa dạng với dải
khối phổ rộng. Trong đó chủ yếu là các protein dữ trữ như crystalloid,
phytohemagglutimin và ricin. Trong thí nghiệm này dịch chiết protein tổng số và các
dung dịch muối tinh chế được điều chỉnh pH thích hợp nhằm tối ưu các quá trình hòa tan
và thu tủa protein kiềm, quá trình này được lặp lại nhiều lần. kết quả cho thấy các protein
không mong muốn đã được loại ra khỏi protein kiềm và thu chế phẩm được là hỗn hơp
23
các protein có pH cao. Để thu được ricin tinh khiết đã tiến hành sử dụng hai phương pháp
tinh chế bao gồm sắc ký trao đổi ion và điện di rút protein từ gel không biến tính.
Đầu tiên chế phẩm được tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi cation hydroxyapatite.

Sau quá trình chiết rút protein từ cột bằng đệm PBS với nồng độ thây đổi tuyến tính từ
0,01 – 0,3M có 3 đỉnh protein đã được thu. Đỉnh protein 1 thu được tại nồng độ PBS
trong khoảng 0,08 – 0,12M, kết quả điện di SDS-PAGE biến tính và không biến tính
trên hình 8. Đỉnh protein 2 và 3 được thôi ra muộn hơn, sau khi kiểm tra cho thấy đó
chính là hỗn hợp của các protein tương ứng với khối lượng phân tử lớn và nhỏ hơn ricin.
Hình 8: Điện di đồ SDS-PAGE của ricin tinh chế. Điện di được thực hiện trong
điều kiện có 0,1% SDS trong gel polyacrylamide 12,6%. Các băng protein được
nhuôm bằng Coommasie Brillant Blue R250; 1: ricin dưới các điều kiện biến tính;
2: marker protein: 4,4, 18,4, 25, 35, 45, 66,2, 116 (kDa); 3: ricin dưới điều kiện
không biến tính.
Kết quả phân tích protein từ đỉnh 1 (Hình 8) cho thấy khối lượng phân tử của
ricin đã tinh chế xấp xỉ 64 kDa, được xá định bằng điện di SDS-PAGE (nồng độ
12,6%) dưới các điều kiện không gây biến tính. Khi điện di biến tính, ricin xuất hiện ở
hai tiểu phần tương ứng với khối lượng phân tử xấp xỉ 30 kDa và 34 kDa. Kết quả điện
di chỉ ra chế phẩm ricin sau tinh chê có độ tinh sạch cao, ở giống điện di biến tính chỉ
có 2 vạch rõ riêng biệt, đối với giếng điện di không biến tính do các protein tan không
tốt dưới điều kiện này nên có xuất hiện một số vạch phụ. Chế phẩm protein này sau đó
tiếp tục được tinh chế bằng điện di SDS-PAGE kết hợp thôi protein từ gel điện di
không biến tính nhằn thu protein nguyên. Tuy nhiên, phương pháp này không nên áp
dụng ở quy mô lớn vì tốn kém và hiệu xuất tinh chế không cao. Trong các trường hợp
24
muốn thu lượng ricin tinh sạch, có một số tác giả gợi ý cần phải kết hợp nhiều phương
pháp tinh sạch bằng sắc kí như sắc ký ái lực, trao đổi ion, hoặc sắc ký lọc gel( Daniel
et al, 2003; ưu et al, 2005).
Protein sau khi tinh sạch được thủy phân và nhận dạng bằng hệ thống khối phổ
QSTA XL(AplliedBiosystems,MDS SCIEX, Canada) kết hợp với sắc ký lỏng ngược
pha cao áp NanoLC. Ba băng protein (Hình 8) đã đồng thời được phân tích và nhận
dạng. Kết quả ghi phổ khối LC-MS/MS của hỗn hợp peptide đã cho thấy mật độ icon
tổng thu được cao 1.5e3 và có một lượng lớn các peptide đã được nhận dạng.
Phổ MS/MS thu được từ phân tích nano LC-MS/MS được tìm kiếm dưới sự hỗ

trợ của phần mềm Mascot vl.8 trên cơ sở dữ liệu protein quốc tế NCBInr. Kết quả
nhận dạng cho thấy, băng protein tại giếng 3 là ricin nguyên ở dạng pre-
propolypeptide, băng trên (RTA) tại giếng 1 tương ứng với kích thước xấp xỉ 30 kDa
là chuỗi B ricin ( ví dụ phổ MS/MS của hai peptide chuỗi B được chỉ như hình 3).
Đồng thời, các peptide trong các protein đã được nhận có điểm số lớn hơn 31 đảm bảo
sự tương đồng của các phổ thực nghiệm và lý thuyết, với mức ý nghĩa P<=0,05,
phương pháp này.
Hiện nay, để kiểm tra hay khẳng định lại tên, khối lượng phân tử và độ tinh
sạch của một chế phẩm protein nào đó thì người ta thường sử dụng các phương pháp
như điện di SDS-PAGE, Western Blot hay kết hợp hai phương pháp này. Tuy nhiên,
nếu chỉ điện di SDS-PAGE thì rất khó có thể khẳng định được điều gì vì có rất nhiều
protein có khối lượng phân tử như nhau nên trên bản điện di chúng sẽ nằm tại cùng
một vạch. Trong khi đó, Western Blot là phương pháp dựa vào phản ứng miễn dịch
giũa kháng nguyên và kháng thể do vậy rất dễ để xảy ra trường hợp dương tính giả và
đặc biệt phụ thuộc vào người thực hiện. Mặt khác hai phương pháp trên đều không thể
xác định chính xác khối lượng phân tử protein cũng như không thể xá định độ tinh
sạch. Phân tích khối phổ là một phương pháp mới, quá trình phân tích hầu như thực
hiện bằng các phần mềm và hệ thống máy móc tự động do vậy độ chính xá đã được
khẳng định( Hunt et a, 1992). Với phương pháp này, một lượng protein rất
nhỏ( pictogram) có thể được xác định và kết quả còn chỉ ra được chính xác tên, khối
lượng phân tử và giá trị pI. Vì vậy, phương pháp khối phổ không chỉ nhận dạng/ khẳng
định tên, khối lượng phân tử chính xác của protein mà còn đánh giá mức độ tinh sạch
của nó. Kết quả nhận dạng khối phổ chế phẩm của chúng tôi cho thấy chế phẩm tinh
sạch cuối cùng chỉ có ricin, ở dạng tiềm chất pre-propolypeptide với khối lượng phân
tử chính ác là 64734 Da. Như vậy, có thể khẳng định rằng chế phẩm ricin đã được tách
chiết và tinh chế có độ tinh sạch cao.
25