bài giảng các phương pháp cô lập hợp chất thiên nhiên

NỘI DUNG
•
PHÂN TÍCH SƠ BỘ HÓA THỰC VẬT
•
CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
CÁC PHƯƠNG PHÁP CƠ LẬP HỢP
CHẤT TỰ NHIÊN
104/26/15
PHÂN TÍCH SƠ BỘ HOÁ THỰC VẬT CỦA CAO TRÍCH
Mg/HCl đđ
FLAVONOID
ACID BÉO
ANTHRAGLYCOSID
TINH DẦU
PHYTOSTEROL
CAROTENOID
ALCALOID
SAPONIN
ANTHOCYANIN
ĐƯỜNG
ALCALOID
ACID HỮU CƠ
TANIN
FLAVONOID
ANTHRAGLYCOSID
STEROID
H/C URONIC
TANIN
ĐƯỜNG
ALCALOID
SAPONIN

Chi t ế
b ng etherằ
Chi t ế
b ng c nằ ồ
Vết trên giấy lọc
+KOH 10%
Cặn có mùi thơm
Liebermann
+ H
2
SO
4
đđ
TT Mayer, Bouchardat
Dragendorff , Liebermann
KOH, HCl
TT Fehling A, B
TT Mayer, Bouchardat
Na
2
CO
3
Na Acetat + FeCl
3

3%
Mg/HCl đđ
KOH 10%
Liebermann
Cồn cao độ

FeCl
3

TT Fehling A, B
TT Mayer, Bouchardat
Tạo bọt
KOH
10%
H
2
SO
4

10%
H
2
SO
4

10%
NGUYEÂN LI UỆ
Baõ nguyeân li uệ
L p ki mớ ề
Baõ nguyeân li uệ
D ch chi t c nị ế ồ
Baõ nguyên li uệ
D ch acidị
D ch c nị ồ
L p etherớ
D ch etherị

D ch acidị
D ch etherị
204/26/15
Cân 5g bột nguyên liệu cho vào bình nón nút mài 250ml, lắc với 30
ml ether ethylic trong 5 phút. Làm như vậy 3 lần cho tới khi dịch
ether không còn màu.
Tập trung dịch lọc trong một bình lắng gạn, lắc với 60ml KOH
(20ml x 3 lần) sẽ tách ra 2 lớp: lớp kiềm và lớp ether.
Xác định các chất tan trong dịch ether ethylic
304/26/15
Xác định các chất tan trong dịch ether ethylic
Phân tích dung dịch kiềm
Dung dịch kiềm được cho vào becher và được trung hòa bằng
HCl 25% để trung tính, lọc. Tủa trên phểu lọc hòa với 5ml cồn
90o, chia làm 3 ống nghiệm.
Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10% nếu có màu đỏ, sơ bộ nhận định có
hợp chất ANTHRAGLYCOSID.
Ống 2: acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho một ít bột Mg kim
loại, nếu có màu đỏ, sơ bộ nhận định có FLAVONOID
Ống 3: nhỏ một giọt lên giấy lọc khô, hơ khô, nếu trên giấy lọc có
vết mờ thì sơ bộ nhận định có ACID BÉO.
404/26/15
Phân tích dung dịch ether
Lớp dung dịch ether được rửa 3 lần với nước cất (20ml x 3 lần),
sau đó lắc 3 lần với dung dịch H2SO4 2% (5ml x 3 lần)
Các dịch acid được góp lại để làm phản ứng định tính alcaloid
với:
Thuốc thử Mayer: Tủa vàng nhạt.
Thuốc thử Dragendorff: Tủa Cam
Thuốc thử Bouchardat: Tủa nâu

504/26/15
Phân tích dung dịch ether
Dịch ether chia làm 3 phần cho vào 3 chén sứ, bốc hơi đến cạn
Chén 1: nếu có mùi thơm thì có TINH DẦU
Chén 2: nhỏ vài giọt H2SO4 đđ, nếu có màu xanh thì có
CAROTENOID
Chén 3: Hóa cắn với 10 giọt anhydrid acetic cho vào ống nghiệm,
nhỏ từ từ vài giọt H2SO4 đđ theo thành ống nghiệm. Nếu chổ
giáp giới có màu vàng lục hay lục đỏ thì sơ bộ nhận định có hợp
chất PHYTOSTEROL.
604/26/15
Bã nguyên liệu sau khi chiết bằng ether đem chiết nóng với cồn 90
o

(30ml x 3 lần) trên bếp cách thủy, lọc. Tập trung dịch lọc vào bình
nón, chia làm 6 phần.
Phần 1: Pha loãng dung dịch cồn với 4 thể tích nước cất, kiềm hóa
bằng dung dịch NH
4
OH đđ, lọc:
Tủa trên phễu hòa với 1 ml CHCl
3
, hứng vào ống nghiệm. Sau đó
cho vào 1ml anhydrid acetic và nhỏ từ từ vài giọt H
2
SO
4
đđ. Nếu
dung dịch có màu xanh thì có nhân STEROID.
Xác định các chất tan trong dịch cồn

704/26/15
Dịch lọc được acid hóa bằng HCl, lọc. Tủa trên phểu hòa với 3-4
ml cồn 90
o
chia làm 2 ống nghiệm
Ống 1: Cho vài giọt KOH, nếu có màu đỏ thì có hợp chất
ANTHRAGLYCODID
Ống 2: cho vào ít bột Mg kim loại và vài giọt HCL nếu có màu đỏ
thì có hợp chất FLAVONOID .
Xác định các chất tan trong dịch cồn
804/26/15
Phần thứ 2: Pha loãng dịch cồn với một thể tích nước cất rồi
chia làm 2 phần:
Ống 1: Trung hòa với natri acetat, thêm vài giọt FeCl
3
2%, nếu
có màu xanh đen thì có TANIN.
Ống 2: cho vào vài tinh thể Na
2
CO
3
, nếu có sủi bọt thì có acid
hữu cơ.
Xác định các chất tan trong dịch cồn
904/26/15
Phần thứ 3: Dịch cồn được bóc hơi cách thủy trong chen sứ đến cạn,
hòa cắn với 4-5 ml H
2
SO
4

2%, lọc. Chia dịch lọc ra làm 3 phần để
làm phản ứng định tính alcaloid.
Ống 1: + thuốc thử Mayer.
Ống 2: + thuốc thử Dragendorff.
Ống 3: + thuốc thử Bouchardat.
Phần thứ 4: Bốc hơi dịch cồn trong chén sứ cho đến cạn, hòa cắn
với 3ml nước cất đun nóng. Lọc, cho thêm vào nước lọc 4-5 giọt
thuốc thử Fehling A và 4-5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy,
nếu có tủa gạch thì có ĐƯỜNG KHỬ.
Xác định các chất tan trong dịch cồn
1004/26/15
Xác định các chất tan trong dịch cồn
Phần thứ 5: Dịch cồn được pha loãng với một thể tích nước
cất, chia làm 2 ống nghiệm:
Ống 1: acid hóa (màu đỏ)
Ống 2: Kiềm hóa (màu lục)
Thì có ANTHOCYNANOSID
1104/26/15
Phần thứ 6: Chia dịch cồn làm 2 phần, bóc hơi cách thủy trong
chén sứ
Chén 1: hòa với 5 ml nước cất, lắc mạnh nếu có bọt thì có
SAPONIN.
Chén 2: hòa vào chén 0,5 ml CHCl
3
và 0,5 ml anhydric acetic,
cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ H
2
SO
4
đđ.

+ Có vòng tím thì có SAPONIN TRITERPEN.
+ Có vòng xanh lục thì có SAPONIN STEROID
Xác định các chất tan trong dịch cồn
1204/26/15
Bã nguyên liệu sau khi chiết với cồn 90
o
được chiết với H
2
SO
4

2% (20ml x 3 lần). Lọc, chia nước lọc ra làm 5 phần:
Phần 1: Lắc trong ống nghiệm, nếu có bọt bền thì có SAPONIN.
Phần 2: Kiềm hóa với NH
4
OH 10% , lắc với ether (5ml x 3 lần).
Loại bỏ lớp nước, lớp ether lắc với H
2
SO
4
2%. Dịch acid được
chia làm 3 phần để làm phản ứng tìm alcaloid (thuốc thử Mayer,
Bouchardat, Dragendorff).
Xác dịnh các chất tan trong dịch acid
1304/26/15
Xác dịnh các chất tan trong dịch acid
Phần thứ 3: Cho tác dụng với thuốc thử Fehling, nếu có tủa đỏ
gạch thì có ĐƯỜNG KHỬ.
Phần 4: trung tính hóa với natri acetat, sau đó thêm vài giọt FeCl
3

10% , nếu có tủa xanh nâu thì có TANIN.
Phần 5: Pha dịch với 2 thể tích cồn 90
o
, nếu có tủa nhiều thì có
hợp chất URONIC.
1404/26/15
Cao trích bởi các dung môi
Thuốc thử Phản ứng màu
Hợp chất
thiên nhiên
Ether
ethyl
Ethanol
90%
Acid 1%
+ + - KOH 10% Màu đỏ nhạt Antraglycoside
+ - - Nhỏ lên giấy lọc Có vết ố màu Acid béo
- + - Mg/HCl dung dịch Có vòng màu đỏ Flavonoid
+ - - Liebermann Có màu lục đỏ Phytosterol
+ - - H
2
SO
4
đđ Không màu Carotenoid
- + + Mayer, Bouchardat,
Hager, Dragendorff
Có tủa màu Alcaloid
- - Lắc mạnh dung dịch Không có bọt Saponin
++ + FeCl 5% Màu lục đen Tanin

- +++ - Fehling Tủa màu đỏ gạch Đường khử
Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao trích
1504/26/15
CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng nhiều từ lâu. Phương pháp được
phát triển nhanh chóng từ những năm 1930-1940.
Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do
sự phân bố không đồng đều của chúng giữa những pha tĩnh và
pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh.
Trong những năm 1930, một loạt các nhà hóa học được nhận giải
thưởng Nobel về Hóa học các hợp chất thiên nhiên nhờ ứng dụng
thành công phương pháp cô lập bằng sắc ký cột hấp phụ.
1604/26/15
1937, P. KARRER (Thụy sĩ) về hóa học Carotenoid, đặc biệt là
vitamin A và B.
1938, R. KURN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin
1939, L.RIZICKA (Thụy sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid
1940, MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký
phân bố trên lớp silicagel và về sau phát triển sang sắc ký giấy.
Hai ông được giải thưởng Nobel năm 1952 về sắc ký phân bố.
1948, TISLIUS (Thụy điển) được giải thưởng Nobel về kỹ thuật
điện di và sắc ký hấp phụ.
1704/26/15
Phương pháp sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách
chiết hiệu quả và nhanh chóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của
ngành hóa học, đặc biệt là hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, cho phép ta ứng
dụng nó ở bất cứ mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện… Trong hoàn cảnh chưa
được trang bị những máy chuyên dùng hiện đại như máy sắc ký khí, máy
sắc ký lỏng cao áp… chúng ta vẫn có thể thực hiện việc phân tích sắc ký

bằng áp dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy hay sắc ký cột hấp
phụ cổ điển với những dụng cụ phương tiện đơn giản mà bất cứ ở một cơ
sở nghiên cứu nào cũng có thể sắm được.
Ngay cả ở những nước tiên tiến, bên cạnh những máy hiện đại, sắc ký
lớp mỏng, sắc ký cột vẫn là công cụ đắc lực trong công tác nghiên cứu
hằng ngày.
1804/26/15
Có nhiều phương pháp để phân loại sắc ký:
Nếu dựa theo trạng thái liên hợp của pha động thì có sắc ký lỏng và
sắc ký khí.
Nếu dựa theo cơ chế của quá trình tách:
+ Sắc ký hấp phụ
+ Sắc ký phân bố
+ Sắc ký gel
+ Sắc ký trao đổi ion
1904/26/15
Sắc ký hấp phụ
- Hấp phụ là sự tích tụ một hợp chất ở trạng thái khí hoặc lỏng lên bề
mặt một chất rắn. Hay nói cách khác là sự tích tụ ở ranh giới giữa 2
pha: khí-rắn, lỏng-rắn.
-Trong sắc ký hấp phụ lỏng, pha tĩnh là chất rắn mịn và xốp, pha
động là chất lỏng.
- Dựa trên tính hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần
tách đối với chất hấp phụ (pha tĩnh), dùng dung môi thích hợp (pha
động) qua pha tĩnh để giải hấp, sẽ tách riêng được từng phần các cấu
tử trong hỗn hợp.
2004/26/15
Sắc ký hấp phụ
Yếu tố quan trọng trong sắc ký hấp phụ là lựa chọn chất hấp
phụ và dung môi.

Chất hấp phụ cần phải thỏa mãn các tính chất sau:
- Không tương tác với cấu tử cần phân tách: không tạo phản
ứng phụ
- Phải có tính chọn lọc
- Độ mịn của hạt phải thích hợp
- Chất hấp phụ phải ổn định và được tiêu chuẩn hóa để kết quả
trùng lập
2104/26/15
Than hoạt tính
Silicagel
Đất tẩy trắng
Magie silicat
Nhôm oxyd (axit)
Nhôm oxyd (baz)
Crom (III) oxyd
Kẽm sulfur
Nhôm oxyd (trung tính)
Nhôm hydroxyd
Calci hydroxyd
Calci carbonat
Calci sulfat
Tal C
Đường, tinh bột
Inulin
Bột Celluloz
Dựa trên kinh nghiệm, chất hấp phụ được sắp xếp theo thứ tự hoạt
tính giảm dần như sau:
Trong thực tế, người ta hay dùng rộng rãi oxyd nhôm và silicagel để tách hỗn hợp phân
cực hoặc không phân cực.
22

Đối với dung môi phải thỏa mãn các điều kiện sau:
+ Hòa tan tương đối tốt tất cả các cấu tử trong hỗn hợp cần phân
tích.
+ Bị hấp phụ ít nhất đối với pha tĩnh
+ Không phản ứng hóa học đối với các chất cần phân tích cũng như
chất hấp phụ
+ Phải tinh khiết
+ Đối với chất phân tích (chất bị hấp phụ), cấu trúc hóa học có ảnh
hưởng trực tiếp lên độ hấp phụ của chúng.
+ Các hợp chất hydrocarbon bão hòa có độ hấp phụ rất kém, nếu
thêm một nối đôi hay một nhóm chức thì ái lực hấp phụ của chúng sẽ
tăng lên.
2304/26/15
Đối với dung môi phải thỏa mãn các điều kiện sau:
Trong thực nghiệm, người ta đã xây dựng được một dãy các
nhóm chức có độ hấp phụ giảm dần như sau:
- Đối với hydrocarbon nhân thơm:
-COOH > -CONH
2
> -OH > -NHCOCH
3
> -NH
3
> -OCOCH
3
>
-(CH
3
)
2

> -OCH
3
> -H > -Cl
- Đối với hydrocarbon mạch thẳng:
-COOH > -OH > -NH
2
> C=O > -OR > -CH
3
2404/26/15
Sắc ký phân bố
Sắc ký phân bố dựa trên sự phân chia một chất giữa 2 chất lỏng
không trộn lẫn vào nhau (hoặc giữa chất lỏng và chất khí) khi cho
chất lỏng thứ 2 (pha động) di chuyển qua chất lỏng thứ nhất (pha
tĩnh).
Thông thường pha tĩnh được hấp thụ trên bề mặt của một chất rắn
gọi là chất mang hoặc liên kết hóa học với chất mang.
Các phương pháp sắc ký dựa trên nguyên tắc phân bố:
- Sắc ký cột
- Sắc ký giấy
- Sắc ký khí
2504/26/15