đề tài môn phân tích thực phẩm quang phổ tử ngoại và nhìn thấy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM
Khoa Công Nghệ Hóa Học - Thực Phẩm

Môn: Phân tích thực phẩm
ĐỀ TÀI
QUANG PHỔ TỬ NGOẠI VÀ NHÌN THẤY
GVHD: THS Lê Hoàng Du
SV Thực hiện: Cao Nhân Nghĩa_12116056
Nguyễn Mạnh Trung_12116086
Nguyễn Trọng Nghĩa_12116057
Lê Đăng Khoa_12116037
i
Mục lục
ii
I. MỞ ĐẦU
Phân tích thực phẩm là một mảng lớn trong nghành công nghệ thực
phẩm. Có rất nhiều phương pháp để xác định nồng độ của các thành phần
dinh dưỡng có trong các loại thực phẩm. Trong đó, các phương pháp phân
tích quang phổ được quan tâm đến như một trong những phương pháp
được ứng dụng rất rộng rãi với độ chính xác tương đối cao, khi các máy
chỉ thu nhận photon đến từ vật chất mà không cần thực hiện đo đạc trực
tiếp trên vật.
Một ví dụ trong phân tích hóa học, có thể xác định nồng độ của một
chất trong một dung dịch, bằng cách tạo ra phức màu của chất cần xác
định hay một chất mà có khả năng xác định gián tiếp chất cần xác định với
thuốc thử hữu cơ, rồi quan sát quang phổ của hệ. Phương pháp này dựa
trên sự hấp thụ bức xạ điện từ của các dung dịch của chất phân tích. Ở
cùng một điều kiện, độ hấp thu hay mật độ quang sẽ tỷ lệ thuận với nồng
độ chất hấp thụ. Điều kiện để làm thuốc thử là phức tạo thành bền, cường
độ màu mạnh, cho các phức chiết tốt, đặc biệt là chiết trong môi trường
acid mạnh.

Trong bài báo cáo này, chúng em sẽ giới thiệu về nguyên tắc đối với
việc dùng phương pháp quang phổ tử ngoại và nhìn thấy, các bộ phận cấu
tạo nên một hệ thống thiết bị dùng trong phương pháp phân tích này.
Sau khi đọc kĩ bài báo cáo này, chúng ta sẽ hiểu hơn về phương pháp
và từ đó sẽ có những kĩ năng thực hành hiệu quả, giúp đạt được những
kết quả thuận lợi trong quá trình phân tích thực phẩm.
4

II. NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: KHÁI QUÁT VỀ QUANG PHỔ
1.1. GIỚI THIỆU VỀ QUANG PHỔ
Về mặt lịch sử, “quang phổ (spectroscopy)” là một nhánh của khoa học trong
đó ánh sáng được phân giải thành các bước sóng thành phần của nó để tạo ra phổ
quang học, là một đồ thị của một vài hàm của cường độ bức xạ với bước sóng hoặc
tần số. Hiện nay, nghĩa của quang phổ được mở rộng bao gồm những nghiên cứu
không chỉ với các bức xạ khả kiến mà còn với những loại khác của bức xạ điện từ
như tia X, tử ngoại, hồng ngoại, vi sóng và bức xạ tần số radio.
Quang phổ đóng một vai trò cốt yếu trong sự phát triển của thuyết nguyên tử hiện
đại. Hơn nữa, các phương pháp đo phổ cung cấp những công cụ được sử dụng
rộng rải trong việc so sánh cấu trúc của các loại phân tử cũng như phân tích định
tính và định lượng của các hợp chất vô cơ và hữu cơ.
Ngày nay phương pháp phổ được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu các hợp chất hóa
học cũng như các quá trình phản ứng hóa học. Những phương pháp này đặc biệt có
ý nghĩa đối với việc xác định các hợp chất hữu cơ. Cơ sở của phương pháp phổ là
quá trình tương tác của các bức xạ điện từ đối với các phân tử vậ chất. Khi tương
tác với các bức xạ điện từ, các phân tử có cấu trúc khác nhau sẽ hấp thụ và phát xạ
năng lượng khác nhau. Kết quả của sự hấp thụ và phát xạ năng lượng này chính là
phổ, từ phổ chúng ta có thể xác định ngược lại cấu trúc phân tử
Có 5 phương pháp phổ:
- Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử:

+ Phương pháp phổ quay và dao động: phương pháp quang phổ hồng ngoại
+ Phương pháp phổ Raman
+ Phương pháp electron UV-VIS.
- Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
- Phương pháp phổ khối lượng
Mỗi phương pháp phổ có một ứng dụng riêng. Thông thường, chúng ta kết hợp các
phương pháp với nhau để giải thích cấu tạo của một hợp chất hữu cơ.
1.2. Tính chất chung của bức xạ điện từ
Bức xạ điện từ là một dạng năng lượng mà dễ thấy nhất là ánh sáng khả kiến
và bức xạ nhiêt. Những loại khác gồm tia gamma, tia X, tia tử ngoại, vi sóng và sóng
5
radio. Nhiều tính chất của bức xạ điện từ được mô tả một cách thuận tiện bởi kiểu
sóng hình sin cổ điển sử dụng nhiều thông số như bước sóng, tần số, vận tốc và
biên độ. Khác với nhiều hiện tượng sóng khác như âm thanh, bức xạ điện từ không
đòi hỏi môi trường hỗ trợ cho sự lan truyền của nó và nhờ vậy nó có thể đi qua một
môi trường chân không.
Mô hình sóng thất bại trong việc giải thích những hiện tượng gắn liền với sự hấp
thụ và bức xạ của năng lượng bức xạ. Để hiểu những quá trình này cần thiết phải
nhờ đến một mô hình kiểu hạt trong đó bức xạ điện từ được xem như là một dòng
hạt rời rạc gọi là photon, với năng lượng của một photon tỉ lệ với tần số của bức xạ.
Quan niệm về lưỡng tính sóng hạt này của ánh sáng không loại trừ lẫn nhau mà có
tính chất bổ sung cho nhau. Thực vậy, lưỡng tính này được thấy trong những dòng
electron và những hạt cơ bản khác như proton và được hoàn toàn lý giải bởi cơ học
sóng.
1.3. Phổ bức xạ điện từ
Quang phổ của bức xạ điện từ bao gồm một dải rất lớn các bước sóng (và là
năng lượng). Trong đó phần của bức xạ khả kiến mà mắt người có thể thấy được là
rất nhỏ khi so với những vùng phổ khác. Cũng cần phải chú ý là các phương pháp
quang phổ sử dụng không chỉ ở vùng khả kiến mà còn tử ngoại, hồng ngoại và
thường được gọi là phương pháp đo quang mặc dù mắt người không nhạy với hai

loại sau.
Bảng liệt kê các dải bước sóng và tần số của những vùng phổ quan trọng trong
mục đích phân tích và cũng kèm theo tên của những phương pháp phổ liên quan.
Các cột cuối cùng liệt kê các loại chuyển dịch lượng tử của hạt nhân, nguyên tử và
phân tử, là cơ sở cho các kỹ thuật quang phổ khác nhau
Bảng 1.1: Một số thống kê về các loại quang phổ

Loại quang phổ Dải bước sóng Dải số sóng(cm
-1
) Kiểu dịch chuyển lượng
tử
Phát xạ tia gamma 0.005 – 1,4 A
0
Hạt nhân
Nhiểu xạ, huỳnh
quang, phát xạ, hấp
thu tia X
0.1-100 A
0
Electron bên trong
Hấp thu tử ngoại
chân không
10-180 nm 1 x 10
6
đến 5 x 10
4
Các electron liên kết
Hấp thu, phát xạ và
huỳnh quang tử
ngoại khả kiến

180-780 nm 5 x 10
4
đến 1.3 x
10
4
Các electron liên kết
6
Hấp thu hồng ngoại 0.78-300 µm 1.3x10
4
đến
3,3x10
1
13-27
Dao động điều
hòa/quay của phân tử
Hấp thu vi song 0.75-3.75 mm 13-27 Dao động quay phân tử
Cộng hưởng từ spin 3 cm 0.33 Spin của electron trong
từ trường
Cộng hưởng từ
nhân
0.6-10 m 1.7x10
-2
đến 1x 10
3
Spin của hạt nhân trong
từ trường
1.4. Sự tương tác giữa vật chất và bức xạ điện từ
Hình 1.1: Bước sóng của sóng ánh sáng
- Các bức xạ điện từ cũng mang năng lượng, các bức xạ có chiều dài bước sóng
càng nhỏ thì năng lượng của chúng càng lớn và tuân theo định luật:

E = h.ν =
Trong đó: h là hằng số planck. h = 6,6262.10
-34
J.s
Năng lượng E được đo bằng đơn vị eV, kcal/mol, cal/mol.
Khi các bức xạ điện từ tương tác với các phân tử vật chất, có thể xảy ra theo hai
khả năng: trạng thái năng lượng của phân tử thay đổi hoặc không thay đổi. Khi có
sự thay đổi năng lượng thì phân tử có thể hấp thụ hoặc bức xạ năng lượng.
Nếu gọi trạng thái năng lượng ban đầu của phân tử là E1, sau khi tương tác là E2
thì có thể viết: ΔE = E
2
– E
1
ΔE = 0 : năng lượng phân tử không thay đổi khi tương tác với bức xạ điện từ.
ΔE > 0 : phân tử hấp thụ năng lượng; ΔE < 0 : phân tử bức xạ năng lượng
7
Theo thuyết lượng tử thì các phân tử và bức xạ điện từ trao đổi năng lượng với
nhau không phải bất kỳ và liên tục mà có tính chất gián đoạn. Phân tử chỉ hấp thụ
hoặc bức xạ 0,1, 2, 3…n lần lượng tử h.ν . Khi phân tử hấp thụ hoặc bức xạ sẽ làm
thay đổi cường độ của bức xạ điện từ nhưng không làm thay đổi năng lượng của
bức xạ điện từ, bởi vì cường độ bức xạ điện từ xác định bằng mật độ các hạt photon
có trong chùm tia còn năng lượng của bức xạ điện từ lại phụ thuộc vào tần số ν của
bức xạ. Vì vậy, khi chiếu một chùm bức xạ điện từ với một tần số duy nhất đi qua
môi trường vật chất thì sau khi đi qua năng lượng của bức xạ không hề thay đổi mà
chỉ có cường độ của bức xạ thay đổi.
Khi các phân tử hấp thụ năng lượng từ bên ngoài có thể dẫn đến các quá trình
thay đổi trong phân tử (quay, dao động, kích thích electron phân tử…) hoặc trong
nguyên tử (cộng hưởng spin electron, cộng hưởng từ hạt nhân).
Hình 1.2: Các trạng thái kích thích của phân tử
Mỗi một quá trình như vậy đều đòi hỏi một năng lượng ΔE > 0 nhất định đặc

trưng cho nó, nghĩa là đòi hỏi bức xạ điện từ có một tần số riêng gọi là tần số quay
ν
q
, tần số dao động ν
d
và tần số kích thích điện từ ν
đ
.
Vì thế khi chiếu một chùm bức xạ điện từ với các tần số khác nhau vào thì các phân
tử chỉ hấp thụ được các bức xạ điện từ có tần số đúng bằng các tần số trên (ν
q
, ν
d
và ν
đ
) để xảy ra các quá trình biến đổi trong phân tử như trên. Do sự hấp thụ chọn
lọc này mà khi chiếu chùm bức xạ điện từ với một dải tần số khác nhau đi qua môi
trường vật chất thì sau khi đi qua, chùm bức xạ này sẽ bị mất đi một số bức xạ có
tần số xác định nghĩa là các tia này đã bị phân tử hấp thụ.
1.5. Định luật Lambert – Beer
Khi chiếu một chùng tia sáng đơn sắc đi qua một môi trường vật chất thì cường
độ của tia sáng ban đầu I
0
sẽ bị giảm đi chỉ còn là I.
8
Năng lượng ánh sáng: E = h.ν = h.c/λ
Năng lượng của ánh sáng phụ thuộc vào ν.
Cường độ ánh sáng I phụ thuộc vào biên độ dao động a
Hình 1.3: sự giảm cường độ của ánh sáng khi đi qua một môi trường vật chất
Với hai tia sáng có cùng năng lượng nhưng có cường độ ánh sáng khác nhau

T = I/I
0
.100%: độ truyền qua
A = (I
0
– I)/I
0
.100%: độ hấp thụ
Độ lớn của độ truyền qua T hay độ hấp thụ A phụ thuộc vào bản chất của chất hòa
tan, chiều dày d của lớp mỏng và nồng độ C của dung dịch. Do đó, có thể viết:
Log(I
0
/I)
λ
= ε
λ
.C.d = D
λ

ε
λ
= D
λ
/C.d; lgε
λ
= lgD
λ
/C.d
ε được gọi là hệ số hấp thụ, C được tính bằng mol/l, d tính bằng cm và D là mật độ
quang. Phương trình trên chỉ đúng với tia đơn sắc.

1.6. Phổ
- Khi cho bức xạ điện từ tương tác với phân tử vật chất, dùng thiết bị máy phổ để ghi
nhận sự tương tác đó, ta nhận được một dạng đồ thị gọi là phổ.
- Từ định luật Lambert-Beer, người ta thiết lập và biểu diễn sự phụ thuộc:
+ Trên trục tung: A, D, ε, lgε, T
+ Trên trục hoành: tần số bức xạ ν, số sóng ν, bước sóng bức xạ kích thích λ
Thu được đồ thị có dạng D
λ
= f(λ), lgε = f(λ), T = f(ν), A = f(ν)… đồ thị này gọi là
phổ. Các đỉnh hấp phụ cực đại gọi là dải (band) hay đỉnh hấp thụ (peak), chiều cao
của đỉnh
peak gọi là cường độ hấp thụ.
Riêng với phổ NMR và phổ MS thì đại lượng trên trục hoành được mở rộng hơn
thành độ chuyển dịch hóa học (ppm) hay số khối m/e.
1.7. Tóm lại
9
Phân tích Phổ, một nhánh của quang phổ, bao gồm một loạt các kỹ thuật được
sử dụng trong các phòng thí nghiệm phân tích để phân tích định tính và định lượng
các thành phần hóa học của thực phẩm. Phương pháp phân tích Phổ thông thường
bao gồm UV, Vis, và IR hấp thụ quang phổ; phân tử quang phổ huỳnh quang; và
NMR. Trong mỗi phương pháp , người phân tích cố gắng để đo lượng bức xạ hoặc
hấp thụ hoặc phát ra bởi các chất phân tích. Các phương pháp trên khác nhau ở các
bước sóng bức xạ được sử dụng trong phân tích, bản chất nguyên tử so với phân
tử của chất phân tích.
CHƯƠNG 2: QUANG PHỔ TỬ NGOẠI VÀ NHÌN THẤY
2.1 Giới thiệu
Phương pháp phân tích quang phổ trong miền tia tử ngoại và ánh sáng nhìn
thấy (UV – VIS ) là một trong những phương pháp phân tích phổ biến nhất trong lĩnh
vực phân tích thực phẩm . Ứng dụng trong những trường hợp như :
• phân tích định lượng những chất phân tứ lượng lớn ( vd : định lượng tổng

hàm lượng tinh bột bằng phương pháp phenol-sulfuric acid ) .
10
• phân tích định lượng những chất phân tứ lượng nhỏ ( vd : định lượng thiamin
bằng phương pháp thiochrome huỳnh quang ) .
• Đánh giá độ ôi hóa của dầu mỡ .
• phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu phân tích .
Trong những trường hợp trên , dấu hiệu phân tích được dựa trên sự hấp thụ
hoặc phát xạ của bức xạ điện từ UV – VIS . Dấu hiệu này phụ thuộc vào bản chất
vốn có của chất phân tích ( độ hấp thụ của bức xạ điện từ trong vùng ánh sáng nhìn
thấy ) hoặc kết quả của phản ứng hóa học liên quan đến chất phân tích ( phương
pháp so màu Lowry nhằm phân tích protein tan trong nước ) .
Bức xạ điện từ trong khoảng tia tử ngoại và ánh sáng nhìn thấy có bước sóng
dao động từ 200-700 nm , tia tử ngoại : từ 200-350 nm và ánh sáng nhìn thấy : 350-
700 nm ( bảng 2.1 ) . Không thể quan sát tia tử ngoại UV bằng mắt thường , trong
khi mỗi bước sóng của ánh sáng nhìn thấy cho ta 1 màu quan sát khác nhau , đó là
1 dãy màu liên tục gồm 7 màu cơ bản ( đỏ , cam , vàng , lục , lam , chàm , tím ) .
Ánh sáng đỏ có bước sóng lớn nhất , ánh sáng tím có bước sóng nhỏ nhất . Phân
tích quang phổ trong UV – VIS được chia thành 2 nhóm chính : quang phổ hấp thụ
và quang phổ huỳnh quang , nhờ vào mối quan hệ giữa bức xạ điện từ và vấn đề t
đang phân tích . Mỗi nhóm nhỏ trong 2 nhóm trên lại được chia thành 2 nhóm nhỏ
nữa : kỹ thuật định tính và kỹ thuật định lượng .
Bảng 2.1 : bước sóng của 1 số màu cơ bản
Nói chung , phương pháp quang phổ hấp thụ định lượng là phương pháp phổ
biến nhất trong phân tích quang phổ trong vùng tia tử ngoại và ánh sáng nhìn thấy .
11
2.2 Quang phổ hấp thụ trong vùng tia tử ngoại và ánh sáng nhìn
thấy
2.2.1 Cơ sở của phương pháp định lượng quang phổ hấp thụ
Mục đích của phương pháp trên nhằm xác định nồng độ của mẫu phân tích dựa
trên sự hấp thụ ánh sáng khi truyền qua 1 dung dịch mẫu . Trong 1 vài trường hợp ,

mẫu phân tích sẽ tự động hấp thụ bức xạ UV-VIS , như vậy , bản chất hóa học của
chất phân tích không bị thay đổi trong quá trình phân tích . Trong các trường hợp
còn lại , chất phân tích nếu không hấp thụ bức xạ UV-VIS tức là chúng đã bị thay đổi
bản chất hóa học , dẫn đến chỉ hấp thụ những bức xạ có bước sóng thích hợp . Do
đó , sự truyền cũng như hấp thụ của dung dịch mẫu có thể được dùng để xác định
nồng độ chất phân tích .
Trong thực tế , dung dịch mẫu được cho vào một ống hấp thụ nhỏ và được đặt
chắn ngang đường đi của bức xạ có bước sóng xác định . Lượng bức xạ truyền qua
mẫu sẽ được ghi nhận lại . Lượng ánh sáng truyền qua sẽ là căn cứ để ta xác định
nồng độ chất phân tích . Quá trình trên được mô tả qua hình 2.1 . Bức xạ truyền đến
P
0
có năng lượng lớn hơn bức xạ truyền qua P , sự giảm năng lượng trên xảy ra do
sự hấp thụ photon của chất mẫu . Mối quan hệ về năng lượng của tia tới và tia
truyền qua được biểu thị bằng đại lượng độ truyền suốt T (Transmittance) hay độ
hấp thụ A (Absorbance) .
Ta có : T = P/ P
0
[1]
T% = (P/ P
0
) × 100 [2]
Trong đó :
T = độ truyền suốt
P
0
= năng lượng tia tới
P = năng lượng tia truyền qua
%T = phần trăm độ truyền suốt
Tuy nhiên , T và T% không trực tiếp tỉ lệ với nồng độ nên gây ra sự khó khăn

trong quá trình tính toán , đại lượng thứ 2 dùng để biểu thị mối quan hệ giữa P và P
0
là A.
Ta có: A = log(P
0
/ P) = −logT = 2 – log(%T) [3]
Trong đó:
A = độ hấp thụ
T và %T = tương tự [1] and [2]
Mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ mẫu được biết đến với tên gọi định luật
Beer :
A = abc [4]
Trong đó :
12
A = độ hấp thụ
c = nồng độ mẫu (M, mM, mg/ml, %)
b = quãng đường truyền qua mẫu (cm)
a = hệ số hấp thụ ( phụ thuộc vào bản chất môi trường ) (cm)
-1
(nồng độ)
−1

Hình 2.1: Sự biến đổi năng lượng của tia bức xạ khi truyền qua một môi
trường vật chất
Trường hợp khi đơn vị nồng độ là M ( mol/l ) thì công thức Beer sẽ được viết lại :
A = εbc [5]
Trong đó :
A và b tương tự [4]
ε = hệ số hấp thụ mol (cm)
-1

(M)
−1
c = nồng độ mẫu ( M )
Quang phổ định lượng phụ thuộc rất nhiều vào việc xác định được chính xác tia
tới bị hấp thụ do mẫu . Nhiệm vụ dường như đơn giản này thực sự khá phức tạp
trong thực tế do các quá trình phụ như phản xạ hay tán xạ cũng góp phần làm giảm
đáng kể năng lượng của chùm tia tới . Một trường hợp mô phỏng sự phản xạ và tán
xạ làm giảm năng lượng của chùm tia tới được trình bày ở hình 2.2 . Rõ ràng ,
những quá trình này phải được xem xét nhằm mục đích giảm sai số đến mức thấp
nhất . Trong thực tế , mẫu trắng sẽ được sử dụng cho những quá trình này . Mẫu
trắng ( mẫu đối chứng ) theo lý thuyết định nghĩa có thành phần hoàn toàn giống với
mẫu phân tích nhưng không chứa chất phân tích . Mẫu trắng thường là một cuvette
có chứa nước cất . Mẫu này sau đó được đặt ngang đường truyền của chùm sáng ;
năng lượng của bức xạ ra khỏi mẫu trắng được đo lại và là giá trị P
0
cho mẫu phân
tích . Phương pháp này giả định rằng ngoại trừ sự hấp thụ có chọn lọc các bức xạ
bởi mẫu phân tích , tất cả các quá trình khác là tương đương cho mẫu phân tích và
mẫu trắng .
13
Hình 2.2 : những yếu tố ảnh hưởng đến sự giảm năng lượng chùm bức xạ khi
chúng truyền qua cuvette chứa mẫu hấp thụ dạng lỏng
Độ hấp thụ được tính xấp xỉ trong phòng thí nghiệm qua phương trình [6] :
A = log(P
dung môi
/ P
dung dịch phân tích
)= log(P
0
/P) [6]

Trong đó :
P
dung môi
= năng lượng bức xạ của chùm tia ra khỏi mẫu trắng
P
dung dịch phân tích
= năng lượng bức xạ của chùm tia ra khỏi dịch mẫu
P
0
và P = như phương trình [1]
A = như phương trình [3]
2.2.2 Sự sai lệch của định luật Beer
Ta không nên áp dụng tuyệt đối định luật Beer trong tất cả trường hợp . Thật vậy,
có một số lý do dễn đến độ hấp thụ và nồng độ có thể không quan hệ tuyến tính với
nhau . Nói chung , định luật Beer chỉ áp dụng với các mẫu pha loãng có nồng độ tối
đa 10mM cho hầu hết các chất phân tích . Nồng độ thực tế mà định luật Beer sai
lệch sẽ phụ thuộc vào bản chất hóa học của chất phân tích . Khi nồng độ chất phân
tích tăng , khoảng cách giữa các phân tử trong một dung dịch mẫu nhất định sẽ
giảm , cuối cùng , khi đạt đến một giá trị mà tại đó , các phân tử cạnh nhau sẽ sắp
xếp lại trật tự của nhau . Việc xáo trộn này có thể ảnh hưởng đáng kể khả năng thu
nhận photon của chất phân tích ở một bước sóng nhất định , nghĩa là , nó có thể
thay đổi hằng số hấp thụ của chất phân tích ( a ) . Việc này dẫn đến phá vỡ mối
quan hệ giữa tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ . Những quá trình hóa học khác
cũng có thể gây ra sai lệch cho định luật Beer , ví dụ : sự kết hợp – phân ly các phân
tử trong chất phân tích hoặc sự phân ly ion của acid yếu trong dung môi không chất
đệm . Trong các trường hợp trên , nếu những dạng phân ly khác nhau của 1 chất
14
phân tích ( ví dụ : ion và nguyên tử trung hòa ) có hằng số hấp thụ khác nhau ( a )
thì mối quan hệ giữa tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ không tồn tại .
Một nguyên nhân nữa dẫn đến sự sai lệch của định luật Beer có thể phát sinh

từ những hạn chế trong các thiết bị sử dụng để đo độ hấp thụ . Định luật Beer chỉ có
thể áp dụng cho những trường hợp bức xạ truyền qua mẫu là bức xạ đơn sắc , bởi
vì ở những điều kiện này , một giá trị hấp thụ thể hiện sự liên quan của chất phân
tích với tất cả bức xạ truyền qua mẫu . Nếu bức xạ đi qua một mẫu là đa sắc và có
sự thay đổi trong các hằng số hấp thụ cho các bước sóng thành phần khác nhau thì
định luật Beer không còn đúng nữa . Một ví dụ điển hình cho điều này : khi bức xạ
có bước sóng lý tưởng và bức xạ có bức sóng ko bị hấp thụ đồng thời đi qua một
mẫu và đến thiết bị lọc (detector) . Trong trường hợp này , sự truyền dẫn sẽ tuân
theo phương trình [7] . Lưu ý rằng 1 giá trị hấp thụ giới hạn sẽ đạt đến P
0
>> P ,
tương ứng với một nồng độ tương đối cao của chất phân tích.
A = log(P
0
+ P
S
) / (P+ P
S
) [7]
Trong đó :
P
S
= năng lượng bức xạ truyền lệch
A = tương tự phương trình [3]
P và P
0
= tương tự phương trình [1]
2.2.3 Xem xét phương pháp tiến hành
Nói chung , mục tiêu của định lượng quang phổ là xác định nồng độ của chất
phân tích với độ chính xác cao nhất trong khoảng thời gian ngắn nhất và chi phí

thấp nhất . Để đạt được điều này , người phân tích phải xem xét sai số có thể xảy ra
đồng thời kết hợp các phương pháp phân tích cụ thể . Những sai số xảy ra trong
phân tích quang phổ có thể do : kỹ thuật chuẩn bị mẫu không đúng , điều khiển thiết
bị không đúng , rối loạn trong thiết bị , và những điều kiện không phù hợp cho việc
xác định độ hấp thụ .
Việc chuẩn bị mẫu đo độ hấp thụ rất đa dạng . Ở những trường hợp đơn giản
nhất , dịch mẫu có thể được đo trực tiếp sau khi đã đồng hóa và để trong . Ngoài
những trường hợp đặc biệt , đồng hóa mẫu là việc bắt buộc trước khi tiến hành bất
cứ phép phân tích nào nhằm đảm bảo một mẫu tốt . Làm trong mẫu cũng là việc cần
thiết trước khi phân tích nhằm hạn chế hiện tượng tán xạ tia sáng . Loại mẫu trắng
đơn giản nhất là dung môi của chất cần phân tích , dung môi này thường là nước
hoặc dung dịch đệm trong nhiều trường hợp . Với những tình huống phức tạp hơn ,
chất phân tích cần phải được biến đổi hóa học trước khi xác định độ hấp thu . Ở
những trường hợp này , chất phân tích không hấp thụ bức xạ ở một vùng quang phổ
sẽ được biến đổi , tạo nên 1 mẫu mới với tính chất hấp thụ thích hợp với vùng
quang phổ được chọn . Những phản ứng như vậy được dùng trong rất nhiều phép
15
phân tích so màu dựa trên sự hấp thụ của bức xạ trong vùng nhìn thấy . Mẫu trắng
cho những phép phân tích này được chuẩn bị bằng cách xử lý dung môi giống với
mẫu phân tích . Mẫu trắng do đó sẽ giúp điều chỉnh độ hấp thụ nhờ vào việc thay đổi
thuốc thử chứ không phải chất phân tích .
Việc lựa chọn vật chứa mẫu ( cuvette ) phụ thuộc vào vùng quang phổ được đo .
Các loại cuvette khác nhau có thành phần hoặc ( và ) kích thước khác nhau . Khi sử
dụng , ta phải đảm bảo cuvette chứa mẫu không được làm từ chất liệu có hằng số
hấp thụ bức xạ trong vùng phổ cần đo . Cuvette đáp ứng yêu cầu trên trong vùng tử
ngoại có thể được làm từ thạch anh hoặc hợp chất silicate . Cuvette làm từ thủy tinh
silicate phù hợp để đo quang phổ trong vùng ánh sáng nhìn thấy và cuvette nhựa rẻ
tiền cũng thường được sử dụng cho 1 vài mục đích . Kích thước của cuvette rất
quan trọng vì nó liên quan đến lượng dung dịch cần đo và đại lượng quãng đường
( b ) trong định luật Beer . Cuvette tiêu chuẩn có diện tích 1cm

2
, dài khoảng 4.5 cm .
Quãng đường truyền cho loại cuvette truyền thống này là 1cm và lượng dung dịch
tối thiểu cần dùng khoảng 1.5 ml . Các loại cuvette được bán trên thị trường có
quãng đường đo dao động từ 1 đến 100mm . Ngoài ra còn có một số sản phẩm
cuvette hẹp với chiều rộng 4mm sử dụng để đo mẫu với thể tích nhỏ hơn 1ml .
Trong nhiều trường hợp , người phân tích cần phải chọn 1 bước sóng thích hợp để
xác định quang phổ . Nếu có thể , tốt nhất ta chọn bước sóng mà tại đó , giá trị độ
hấp thụ đo được là lớn nhất và độ hấp thụ không thay đổi nhiều khi ta điều chỉnh
bước sóng ( hình 2.3 ) . Trường hợp này tương ứng với vị trí đỉnh của đồ thị hình 2.3
, thực hiện việc xác định ở vị trí này có 2 điểm lợi : (1) độ nhạy tối đa ( sự thay đổi
độ hấp thụ khi ta thay đổi nồng độ cơ chất ) và (2) định luật Beer được nghiệm đúng
hơn vì chùm bức xạ gồm các bước sóng có hằng số hấp thụ phân tử không khác
biệt nhiều đối với chất phân tích ( hình 2.3 ) . Khoảng bandwidth bao gồm các bước
sóng có giá trị gần bằng nhau ứng với giá trị độ hấp thu cực đại .
16
Hình 2.3 : giả thuyết về độ hấp thụ bước sóng từ 340nm đến 700nm .
Trước khi thực hiện phép đo độ hấp thụ , ta phải hiệu chỉnh thiết bị về độ truyền
suốt 0% và 100% . Việc điều chỉnh về 0% được thực hiện bằng cách : ta chắn hoan
toàn chùm bức xạ truyền đến detector. Sự điều chỉnh này nhằm thiết lập một giá trị
nhỏ nhất cho trạng thái tối nhất ( không có bức xạ truyền đến ) , do đó , bộ phận
hiển thị sẽ hiển thị giá trị 0 . Mặt khác , điều chỉnh độ truyền suốt 100% lại được thực
hiện với việc cho bức xạ truyền qua cuvette chứa mẫu sau đó đến bộ phận thu
quang ( mẫu trắng phải tương ứng với mẫu cần phân tích ) . Trong nhiều trường
hợp , 1 loại cuvette được dùng cho cả mẫu trắng và mẫu cần phân tích . Thông
thường , cuvette mẫu trắng chứa dung môi nước cất . Hiệu chỉnh T 100% tức là mẫu
trắng T=1 , tương ứng với P
0
trong phương trình [1] và năng lượng bức xạ của chùm
đi ra khỏi mẫu . Thiết lập 0% T và 100% T nên được giữ nguyên trong suốt quá

trình phân tích và cuvette chứa mẫu được đo với thông số giữ nguyên như trên.
Việc điều chỉnh với mẫu trắng sẽ giúp thiết bị hiển thị kết quả là các giá trị ở
phương trình [6] . Kết quả đo cho mẫu dao động từ 0 đến 100% T . Hầu hết các thiết
bị quang phổ hiện đại cho phép lựa chọn hiển thị kết quả ở dạng độ hấp thụ hoặc %
độ truyền suốt . Thông thường , kết quả độ hấp thụ thường được chọn để hiển thị ,
ở những điều kiện tối ưu , độ hấp thụ sẽ tỉ lệ trực tiếp với nồng độ . Khi thực hiện đo
quang phổ bằng thiết bị sử dụng kết quả đồ thị hoặc kim xoay giá trị , sẽ thích hợp
hơn khi dùng thang đo phần trăm tuyến tính kết hợp với việc tính toán giá trị độ hấp
thụ tương ứng ( dùng phương trình [3] ) . Điều này đặc biệt đúng với những phép đo
có phần trăm độ truyền suốt ( %T ) nhỏ hơn 20 .
2.2.4 Xác định đường chuẩn
Trong một số trường hợp, phương pháp phân tích thực phẩm dùng đến đường
cong chuẩn để phân tích định lượng. Trong phân tích thực phẩm, có một số lượng
thí nghiệm thực nghiệm mà dùng đến đường chuẩn là cần thiết. Các đường cong
chuẩn này được sử dụng để thiết lập các mối quan hệ giữa nồng độ chất cần phân
tích với độ hấp thụ. Các mối quan hệ này được thiết lập thông qua thực nghiệm
phân tích một loạt các mẫu có nồng độ chất phân tích đã được xác định. Các giải
pháp tiêu chuẩn được chuẩn bị tốt nhất với các thuốc thử tương đương và cùng một
lúc. Khoảng nồng độ được lấy dùng trong biện pháp này là không xác định, có nghĩa
là khoảng cách giữa các nồng độ với nhau là có thể thay đổi . Đường cong chuẩn độ
điển hình được mô tả trong hình 1-4
17
Hình 2-4: Đường cong chuẩn độ ( tuyến tính(a) và phi tuyến tính(b))
Đường cong chuẩn độ tuyến tính phải tuân theo các quy tắc của định luật Beer.
Đường cong chuẩn độ phi tuyến tính được sử dụng cho một số thí nghiệm, nhưng
đường cong tuyến tính vẫn được ưa chuộng hơn vì dễ xử lí số liệu.
Các đường cong không tuyến tính trong hình 1-4b thể hiện sự nhạy cảm của
đường chuẩn, vạch rõ sự thay đổi của sự hấp thụ khi có sự biến đổi nồng độ của
chất cần phân tích. Đối với trường hợp được mô tả trong hình 1-4b thì sự phụ thuộc
vào nồng độ có dấu hiệu giảm độ nhạy rõ ràng, bắt đầu điểm hạn chế của nó trong

các chất phân tích có nồng độ cao hơn 10 mM
Trong nhiều trường hợp, việc xác định đường chuẩn thực sự sẽ gặp nhiều sự
khó khăn do sự phức tạp của mẫu phân tích. Hợp chất can thiệp vào bao gồm
những chất hấp thụ bức xạ trong vùng phổ tương tự như chất phân tích, những ảnh
hưởng đến sự hấp thụ của chất phân tích và những hợp chất phản ứng với thuốc
thử được cho là đặc trưng cho các chất phân tích. Như vậy, điều này có nghĩa rằng
các đường cong chuẩn là có khả năng lỗi nếu chưa biết về các tiêu chuẩn khác
nhau đối với pH, tác động ion, độ nhớt, các loại tạp chất và một số thứ khác. Trong
những trường hợp này thì nên điều chỉnh hệ thống khảo nghiệm bằng cách sử dụng
một giao thức bổ sung chuẩn. Một trong những giao thức này như sau: Để một loạt
các bình thêm một thể tích xác định của chất phân tích (V
u
) mà là chất bạn đang cố
gắng để xác định nồng độ chất phân tích (C
u
). Tiếp theo, thêm vào bình một lượng
thể tích (V
s
) của chất là giải pháp phân tích với nồng độ C
s
, như vậy mỗi bình chứa
một lượng thể tích tiêu chuẩn nhất định giống nhau. Các loạt kết quả của các bình
sẽ chứa khối lượng khác nhau của chất cần phân tích và khác nhau về khối lượng
chất chuẩn để phân tích. Tiếp theo, pha loãng tất cả các bình với tổng khối lượng là
18
như nhau, V
t
. Mỗi bình sau đó được khảo nghiệm, với mỗi bình được xử lí là như
nhau. Nếu tuân theo Beer’s law thì độ hấp thu đo được của mỗi bình sẽ tỉ lệ thuận
với nồng độ tổng số chất phân tích theo phương trình:

A = k[(VsCs + VuCu) / (Vt)]
 Trong đó:
V
s
= thể tích của chất chuẩn
V
u
= thể tích của chất cần phân tích
V
t
= thể tích tổng
C
s
= nồng độ của chất chuẩn
C
u
= nồng độ của chất cần phân tích
k = hệ số không đổi ( chiều dài đường truyền khả năng hấp
thụ)
Hình 2-5: Đường chuẩn để xác định các nồng độ chất phân tích khi thêm vào
một giao thức chuẩn.
Các kết quả từ các phép đo sau đó được vẽ với thể tích tiêu chuẩn thêm vào mỗi
bình (V
S
) là biến độc lập và kết quả hấp thụ (A) là biến phụ thuộc (hình 1-5). Theo
giả sử của Beer’s law, mối quan hệ của đường này sẽ được thể hiện trong công
thức [9], phương trình mà trong đó tất cả các số hạng ngoài V
s
và A đều là hằng số.
Hằng số góc của đường thẳng theo đồ thị này là phương trình [10], của tung độ gốc

là phương trình [11] và sắp xếp lại cho phương trình [12], từ đó nồng độ của chất
cần phân tích C
u
có thể tính từ C
s
và V
u
được thực nghiệm xác định là hằng số.
A = kC
s
V
s
/ V
t
+ kV
u
C
u
/ V
t
[9]
Slope = kC
s
/ V
t
[10]
Intercept = kV
u
C
u

/ V
t
[11]
C
u
= (Intercept / slope)(C
s
/ V
u
) [12]
Trong đó:
V
S
, V
U
, V
t
, C
S
, C
u,
và k: giống như công thức số [8]
2.2.5. Ảnh hưởng dụng cụ đến độ chính xác của sự đo lường hấp thụ.
Tất cả các thí nghiệm quang phổ sẽ có một số mức độ cẩu thả liên quan đến
việc đo độ hấp thụ/ truyền chính nó. Lỗi cẩu thả thuộc loại này được gọi là nhiễu
19
dụng cụ (instrument noise) . Điều quan trọng là thí nghiệm được thiết kế sao cho
nguồn lỗi này bị giảm thiểu, mục tiêu là để giữ cho nguồn lỗi này thấp so với sự thay
đổi liên quan đến các khía cạnh khác của việc khảo nghiệm, chẳng hạn như chuẩn
bị mẫu, mẫu phụ, xử lý thuốc thử…. Lỗi công cụ này được tìm thấy qua việc lặp đi

lặp lại phép đo của một mẫu đồng nhất duy nhất. Sai số tương đối do lỗi này không
phải là cố định trong phạm vi % truyền qua toàn bộ (0-100%). Các phép đo tại các
giá trị truyền trung gian có xu hướng có lỗi thấp hơn, độ chính xác tương đối do đó
lớn hơn, so với các phép đo thực tại hoặc truyền rất cao hoặc truyền rất thấp. Sai số
tương đối có thể được định nghĩa là S
C
/ C, trong đó S
c
là độ lệch chuẩn mẫu và C là
nồng độ đo được. Sai số tương đối từ 0,5 đến 1,5% là được dự kiến cho phép đo độ
hấp thu / độ truyền qua thực hiện trong phậm vi tối ưu. Phạm vi tối ưu cho phép đo
độ hấp thụ trên đơn giản, độ hấp thu quang phổ thấp từ khoảng 0,2-0,8 đơn vị hấp
thu, hoặc 15-65% đường truyền. Đối với các công cụ tinh vi hơn, phạm vi cho số ghi
hấp phụ tối ưu có thể được mở rộng lên tới 1,5 hoặc cao hơn. Để được an toàn,
việc làm phải cẩn thận để luôn luôn làm cho việc đọc độ hấp thụ trong điều kiện mà
tại đó độ hấp thu của dung dịch chất phân tích nhỏ hơn 1,0. Nếu có một nhu cầu dự
kiến để thực hiện các phép đo tại đó ghi hấp thụ lớn hơn 1,0, thì độ chính xác tương
đối của máy quang phổ sẽ được thiết lập qua thực nghiệm bằng cách đo lặp đi lặp
lại của mẫu thích hợp. Ghi độ hấp thụ bên ngoài phạm vi tối ưu của các công cụ có
thể được sử dụng, nhưng người phân tích phải chuẩn bị để giải thích cho sự sai số
tương đối cao kết hợp với đọc các giá trị ở cực. Khi đọc độ hấp thụ tiếp cận với giới
hạn của thiết bị đo đạc, khi đó sự khác biệt tương đối lớn trong nồng độ chất phân
tích có thể không được phát hiện.
2.2.6. Thiết bị đo đạc
Có rất nhiều thành phần của việc đo quang phổ tử ngoại trong máy đo quang
phổ UV- Vis. Một số thiết bị được thiết kế hoạt động trong phạm vi của ánh sáng
nhìn thấy, trong khi những cái khác thì bao gồm cả phạm vi của tia UV và Vis. Các
thiết bị có thể khác nhau về chi tiết thiết kế, chất lượng các thành phần và tính đa
dạng. Một máy đo quang phổ cơ bản gồm năm thành phần chính: nguồn sáng, máy
dò đơn sắc, bộ phận giữ mẫu phân tích / mẫu đối chiếu, máy dò bức xạ, và thiết bị

đọc kết quả. Một nguồn cung cấp điện là cần thiết cho hoạt động của các thiết bị.
Một sơ đồ mối quan hệ thành phần được thể hiện trong hình 2-6.
2.2.6.1. Nguồn sáng
Nguồn sáng được sử dụng trong quang phổ phải liên tục, phát ra một dải mạnh
của bức xạ bao gồm toàn bộ dải bước sóng mà thiết bị được thiết kế. Nguồn phát ra
bức xạ phải đủ để đáp ứng máy dò tương ứng và nó không nên thay đổi mạnh với
những thay đổi ở bước sóng hoặc thay đổi đáng kể so với quãng thời gian thí
nghiệm.
20
Hình 2-6: Sắp xếp các thành phần trong một máy đo quang phổ UV-Vis
Các nguồn bức xạ phổ biến nhất cho quang phổ nhìn thấy là đèn dây tóc
vonfram. Những chiếc đèn phát ra bức xạ đầy đủ bao gồm dãy bước song 350-
2500 nm. Do đó, bóng đèn dây tóc vonfram cũng không được sử dụng trong quang
phổ dưới hồng ngoại. Các nguồn bức xạ phổ biến nhất cho các phép đo trong
khoảng UV là các đèn có ống bức xạ điện deuterium (deuterium electrical-discharge
lamps). Những nguồn cung cấp một phổ bức xạ liên tục khoảng 160 nm đến 375
nm. Các loại đèn này sử dụng cửa sổ thạch anh và cần được sử dụng kết hợp với
bộ phận chứa mẫu thạch anh, vì thủy tinh hấp thụ đáng kể bức xạ dưới 350nm.
2.2.6.2. Thiết bị đơn sắc (monochromator)
Thiết bị có các chức năng phân tách cụ thể, nhóm các bước sóng liên tục được
sử dụng trong khảo nghiệm quang phổ đơn sắc. Thiết bị đơn sắc này được đặt tên
như vậy vì ánh sáng của một bước sóng duy nhất gọi là đơn sắc. Về mặt lý thuyết,
bức xạ đa sắc từ nguồn đi vào thiết bị đơn sắc và bị phân tán theo bước sóng, và
bức xạ đơn có một bước sóng được chọn thoát ra khỏi thiết bị. Trong thực tế, ánh
sáng thoát khỏi thiết bị này không phải là một bước sóng duy nhất, mà đúng hơn là
nó bao gồm một dải liên tục hẹp của các bước sóng. Một thiết bị điển hình được mô
tả trong hình 1-7. Như minh họa, một thiết bị đơn sắc bao gồm lối vào và lối ra khe
hở, gương cầu lõm (s), và một bộ phận phân tán ( bộ phận nhiễu xạ - trong ví dụ
này). Ánh sáng đa sắc vào trong thiết bị đơn sắc qua khe cửa vào và sau đó lên tới
đập vào một gương cầu lõm. Các bức xạ đa sắc lên tới đỉnh điểm sau đó được phân

tán, phân tán là hiện tượng vật lý tách các bức xạ của bước sóng khác nhau trong
không gian. Bức xạ của các bước sóng khác nhau sau đó được phản xạ từ một
gương lõm tập trung các bước sóng khác nhau của ánh sáng theo tuần tự dọc theo
mặt phẳng tiêu cự. Các bức xạ sắp xếp thẳng hàng với khe thoát trong mặt phẳng
tiêu cự do đó được phát ra từ thiết bị đơn sắc. Các bức xạ phát ra từ thiết bị này sẽ
bao gồm một phạm vi hẹp của các bước sóng có lẽ là tập trung vào các bước sóng
quy định về kiểm soát lựa chọn bước sóng của thiết bị.
21
Hình 2-7: Giản đồ của một thiết bị đơn sắc sử dụng phản xạ lưới như một yếu
tố phân tách. Các gương lõm dùng để hứng các bức xạ vào một chùm tia
song song.
Kích thước của dải bước sóng đi ra khỏi khe ra của thiết bị được gọi là khoảng
bandwidth của các bức xạ phát ra. Nhiều máy quang phổ cho phép các nhà phân
tích điều chỉnh kích thước của khe hở thoát ra và khe vào, do đó thay đổi khoảng
bandwidth của các bức xạ phát ra. Giảm chiều rộng khe ra sẽ làm giảm khoảng
bandwidth và năng lượng bức xạ của chùm tia phát ra. Ngược lai nếu mở rộng ra
khe thoát sẽ gây ra một chùm năng lượng bức xạ lớn hơn, nhưng một trong đó có
một khoảng bandwidth lớn hơn. Trong một số trường hợp cách giải quyết là rất quan
trọng, chẳng hạn như đối với công việc định tính, chiều rộng khe hẹp có thể được tư
vấn. Tuy nhiên, trong việc định lượng việc lựa chọn bề rộng của khe là tương đối
thoải mái hơn, có thể được sử dụng kể từ mức độ hấp thụ cao nhất trong dãy UV-
Vis nói chung là liên quan đến bề rộng bandwidth quang phổ. Ngoài ra, tỷ lệ nhiễu
tín hiệu kết hợp với các phép đo truyền được cải thiện do sự bức xạ cao hơn năng
lượng của chùm tia đo.
22
Hiệu quả bandwidth của một thiết bị được xác định không chỉ bởi chiều rộng khe
mà còn bởi chất lượng của các yếu tố phân tán của nó. Các chức năng của yếu tố
phân tán ảnh hưởng đến các bức xạ theo bước sóng. Cách tử nhiễu xạ như mô tả
trong hình 2-8, là yếu tố phân tán phổ biến nhất được sử dụng trong quang phổ hiện
đại. Lưới đôi khi được gọi là cách tử nhiễu xạ bởi vì việc tách các bước sóng thành

phần phụ thuộc vào bước sóng bị nhiễu xạ khác nhau ở các góc độ khác nhau liên
đến lưới bình thường. Một cách tử phản xạ kết hợp với một bề mặt phản chiếu trong
đó có một loạt các rãnh gần nhau đã được khắc, thường là 1200 đến 1400 rãnh trên
1 milimeter. Các rãnh tự phá vỡ các bề mặt phản chiếu như vậy mỗi điểm của nó
hoạt động như một nguồn điểm độc lập của bức xạ.
Hình 2-8: Sơ đồ thể hiện cách thức làm việc của cách tử nhiễu xạ, mỗi phản xạ
nguồn điểm của bức xạ được phân cách bằng một khoảng cách d
Xét đến hình 1-8, dòng 1 và 2 đại diện cho các tia bức xạ đơn sắc song song
đang trong giai đoạn chiếu tới bề mặt lưới với một góc tới i . Giao thoa cực đại của
bức xạ này được mô tả là xảy ra tai một góc phản xạ r. Ở tất cả các góc độ khác
nhau, hai tia sẽ một phần hoặc hoàn toàn triệt tiêu lẫn nhau. Bức xạ có bước sóng
khác nhau sẽ cho thấy sự giao thoa cực đại ở một góc độ khác nhau. Sự phụ thuộc
bước sóng của các góc nhiễu xạ có thể được hợp lý hóa bằng cách xem xét các
khoảng cách tương đối các photon của tia 1 và 2 đi, và giả định rằng sự giao thoa
cực đại xảy ra khi sóng liên kết với các photon là hoàn toàn cùng pha. Xét đến hình
1-8, trước khi phản xạ, photon 2 đi một quãng đường dài hơn photon 1 là một
khoảng CD. Sau khi phản xạ photon 1 đi một khoảng cách AB lớn hơn photon 2. Do
đó, các bước sóng liên quan với các photon 1 và 2 sẽ vẫn còn trong giai đoạn sau
khi phản xạ chỉ khi sự khác biệt trong khoảng cách truyền là một bội số nguyên của
bước sóng. Lưu ý rằng, đối với một góc độ khác nhau r thì khoảng cách AB sẽ thay
23
đổi và do đó khoảng cách mạng CD-AB sẽ là một bội số nguyên của các bước sóng
khác nhau. Kết quả thực sự là các bước sóng thành phần được mỗi các góc nhiễu
xạ riêng của mình r.
2.2.6.3 Máy dò (detector)
Trong một phép đo quang phổ, ánh sáng truyền qua các mẫu đối chiếu hoặc mẫu
phân tích bằng cách thức của máy dò. Các máy dò được thiết kế để tạo ra tín hiệu
điện khi nó bị tấn công bởi các photon. Một phát hiện lý tưởng sẽ đưa ra một tín hiệu
trực tiếp tỉ lệ thuận với năng lượng của chùm tia bức xạ nổi bậc nó, sẽ có một tỉ lệ
cao tín hiệu nhiễu, và sẽ có một trả lời tương đối ổn định ứng với các bước sóng

khác nhau, như vậy mà nó được áp dụng cho một loạt các phổ bức xạ. Có một số
loại và thiết kế của máy dò bức xạ hiện đang sử dụng. Các máy dò thường gặp nhất
là các ống photon (pin quang điện), các ống nhân quang (bộ nhân quang), và máy
dò photodiode (quang diot). Tất cả các thiết bị dò có chức năng bằng cách chuyển
đổi năng lượng kết hợp với photon đến thành dòng điện. Các ống photon bao gồm
một cathode semicylindrical ( catot bán trụ) được phủ lên bề mặt một hiệu ứng
quang điện ngoài (photoemissive) và một dây anot (anode), các điện cưc này được
đặt dưới chân không trong ống trong suốt ( hình 1-9a). Khi photon đập vào bề mặt
photoemissive của cathode, có một phát ra của các điện tử, và các electron tự do
sau đó được thu thập ở anode. Kết quả của quá trình này là một dòng điện có thể
được đo lường được tạo ra. Số lượng của các electron phát ra từ cathode và dòng
điện tiếp theo thông qua hệ thống là tỉ lệ thuận với số lượng photon, hay năng lượng
bức xạ của chùm tia, tác động đến trên bề mặt photoemissive. Các ống nhân quang
có thiết kế tương tự. Tuy nhiên, trong các ống nhân quang có khuếch đại số electron
thu thập tại anode, mỗi photon đập vào bề mặt photoemissive của cathode (hình 1-
9b). Các electron ban đầu được phát ra từ bề mặt cathode được thu hút vào một
dynode có điện tích dương tương đối. Tại dynode các electron tấn công bề mặt, gây
ra sự phát xạ của nhiều hơn electron ban đầu, kết quả là một sự khuếch đại của tín
hiệu. Khuếch đại tín hiệu tiếp tục theo cách này, ống nhân quang thường có chứa
một loạt các dynode như vậy, với khuếch đại điện tử xảy ra tại mỗi dynode. Các đợt
tiếp tục cho đến khi các điện tử phát ra từ dynode cuối cùng được thu thập tại anode
của ống nhân quang. Việc đạt được cuối cùng có thể đạt được 10
6
-10
9
electron thu
thập từ mỗi photon. Thiết bị dò photodiode đang được sử dụng phổ biến trong
quang phổ UV-Vis. Đây là những thiết bị trạng thái rắn trong đó các tín hiệu điện ánh
sáng gây ra là kết quả của các photon, các electron kích thích trong các vật liệu bán
dẫn mà từ đó chúng được chế tạo, thông thường nhất là silicon. Máy đo quang phổ

sử dụng máy dò photodiode có thể chứa một máy dò diode đơn lẻ hoặc một dãy các
diode được sắp xếp ngay ngắn (quang phổ mảng diode). Nếu một máy dò
photodiode đơn lẻ được sử dụng thì việc sắp xếp các thành phần thường theo như
24
mô tả trong hình 2-6. Nếu một loạt các máy dò photodiode được sử dụng, khi ấy ánh
sáng có nguồn gốc từ nguồn thường đi vào trong các mẫu trước khi nó được phân
tán. Ánh sáng được truyền qua mẫu này sau đó được phân tán vào các mảng
diode, với mỗi diode đo biên độ hẹp của kết quả quang phổ. Thiết kế này cho phép
một thiết bị có thể đo đồng thời nhiều bước sóng, cho phép bộ thu thập gần như tức
thời của toàn bộ quang phổ hấp thụ. Thiết bị dò bằng diode này thường được báo
cáo là nhạy cảm hơn các thiết bị ống photon nhưng ít nhạy cảm hơn so với ống
nhân quang.
Hình 2-9: Sơ đồ của một ống photon thiết kế điển hình (a) và sự sắp xếp
cathode-dynode-anode của một ống nhân quang đại diện (b).
2.2.6.4 Readout Device
Các tín hiệu từ các máy dò thường được khuếch đại và sau đó hiển thị trong
một hình thức có thể sử dụng để phân tích. Hình thức cuối cùng trong đó các tín
hiệu được hiển thị sẽ phụ thuộc vào sự phức tạp của hệ thống máy. Trong trường
hợp đơn giản, các tín hiệu liên tục từ các máy dò được hiển thị trên thiết bị analog
thông qua vị trí của một cây kim trên mặt đồng hồ đo hiệu chuẩn theo phần trăm
truyền hoặc hấp thụ. Readouts liên tục là đủ cho hầu hết các mục đích phân tích
thông thường; tuy nhiên,thiết bị analog có phần khó khăn hơn để đọc được chính
xác kết quả và do đó, các dữ liệu kết quả được dự kiến sẽ có độ chính xác thấp hơn
một chút so với thu được trên một readout kỹ thuật số (giả sử các readout kỹ thuật
số có đủ yêu cầu cần thiết). Readouts kỹ thuật số thể hiện các tín hiệu như số chia
đơn vị trên màn hình hiển thị . Trong những trường hợp này, đòi hỏi phải xử lý tín
hiệu giữa đầu ra tín hiệu liên tục của máy dò và màn hình hiển thị kỹ thuật số. Trong
hầu hết các trường hợp, bộ xử lý tín hiệu có khả năng biểu thị kết quả cuối cùng ở
25
dạng độ hấp thụ hoặc độ truyền suốt. Một số thiết bị mới hiện nay bao gồm bộ vi xử

lý có khả năng xử lý dữ liệu phong phú hơn trên các tín hiệu được số hóa. Ví dụ , bộ
phận readout của một số thiết bị quang phổ có thể hiển thị kết quả giá trị nồng độ ,
cung cấp các công cụ đã được hiệu chỉnh đúng với tiêu chuẩn tham chiếu thích hợp.
2.2.7 Cấu tạo thiết bị
Hệ thống quang học của các thiết bị quang phổ rơi vào một trong hai loại chính :
chùm đơn hoặc chùm đôi . Trong thiết bị chùm đơn , chùm bức xạ chỉ có một con
đường duy nhất là đi từ nguồn đến mẫu và sau cùng là máy dò (Hình 2-6) . Khi sử
dụng thiết bị chùm đơn, người phân tích thường đo độ truyền suốt ( T ) sau khi đã
thiết lập 100% T hoặc P
0
, với mẫu đối chứng hoặc mẫu trắng . Mẫu trắng và mẫu
phân tích lần lượt được chiếu bởi một chùm sáng duy nhất . mặt khác , đối với thiết
bị chùm đôi , một nửa chùm bức xạ đi qua cuvette chứa mẫu cần phân tích và nửa
còn lại sẽ đi qua mẫu trắng . Hình 2-10 mô tả một hệ thống quang học chùm đôi
trong đó chùm bức xạ được chia đôi trước khi đến mẫu cần phân tích và mẫu trắng .
Ở thiết kế này , chùm bức xạ được chia ra và truyền qua mẫu cần phân tích và mẫu
trắng nhờ một bộ phận gương xoay . Thiết kế chùm đôi cho phép các nhà phân tích
đo lường và so sánh độ hấp thụ tương đối của mẫu cần phân tích và mẫu trắng
đồng thời . Ưu điểm của thiết kế này là nó sẽ hạn chế sự sai lệch hoặc hao hụt
lượng bức xạ của nguồn vì bức xạ truyền qua hai mẫu là độc lập . Những bất lợi của
thiết kế chùm đôi là năng lượng bức xạ của chùm tia tới bị giảm bớt vì tia được chia
ra. Sự giảm sút năng lượng thiết kế chùm đôi thường gây ra vấn đề nhiễu tín hiệu .
Thiết bị đo quang phổ chùm đơn có kết nối máy tính hiện nay thường có những ưu
điểm của cả hai thiết kế chùm đơn và chùm đôi . Các nhà sản xuất khẳng định rằng
đã khắc phục được nhũng hạn chế về hao hụt bức xạ cũng như nhiễu sóng , vì vậy ,
việc chế tạo và sử dụng thiết bị chùm đôi là không cần thiết . Với những dụng cụ
này, mẫu trắng và mẫu cần phân tích được đo tuần tự, và các dữ liệu được lưu trữ
và sau đó xử lý bằng máy vi tính .