Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm

Bộ giáo dục và đào tạo bộ quốc phòng

Học viện quân y



NGUYễN THị VÂN QUỳNH
NGUYễN THị VÂN QUỳ
NGUYễN THị VÂN QUỳNH
NGUYễN THị VÂN QUỳNH
NGUYễN THị VÂN QUỳNH


Lê thanh sơn







A. Nghiên cứu áp dụng nội soi ổ bụng trong
B.
xác định
tổn thơng giảI phẫu bệnh và khả năng phẫu thuật ung
th 1/3 dới dạ dày giai đoạn tiến triển

luận án tiến sĩ y học







B GIO DC V O TO B QUC PHềNG

HC VIN QUN Y






NGUYN THN VN QUNH






Nghiên cứu PHáT TRIểN VắC XIN VIÊM GAN A BấT HOạT
Nghiên cứu PHáT TRIểN VắC XIN VIÊM GAN A BấT HOạTNghiên cứu PHáT TRIểN VắC XIN VIÊM GAN A BấT HOạT
Nghiên cứu PHáT TRIểN VắC XIN VIÊM GAN A BấT HOạT

TRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệM
TRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệMTRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệM
TRÊN DòNG Tế BàO MRC5 ở QUY MÔ PHòNG THí NGHIệM









luận án tiến sĩ y học









Hà nội - 2015




B GIO DC V O TO B QUC PHềNG

HC VIN QUN Y

NGHIấN CU PHT TRIN VC XIN
VIấM GAN A BT HOT TRấN DềNG T BO MRC5
QUY Mễ PHềNG TH NGHIM


Chuyên ngành: Vi sinh y học
Mã số: 62 72 01 15




luận án tiến sĩ y học

Cán bộ hớng dẫn luận án:
GS. TSKH. Nguyễn thu vân
Ts. đỗ tuấn đạt

Hà nội - 2015



Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Gíao s, Tiến sĩ khoa
học Nguyễn Thu Vân
Nguyễn Thu Vân Nguyễn Thu Vân
Nguyễn Thu Vân



Chủ tịch Hội đồng khoa học, Công ty Vắc xin và Sinh
phẩm số 1; Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt
Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt
Tiến sĩ Đỗ Tuấn Đạt



Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1


là những ngời thầy hớng dẫn, luôn tận tình chỉ bảo và trực tiếp sát cánh cùng
tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm
Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm
Ban Giám đốc Công ty Vắc xin và Sinh phẩm

số 1
số 1 số 1
số 1 -

-

Bộ Y tế, Bộ Môn Khoa Vi Sinh Y
Bộ Y tế, Bộ Môn Khoa Vi Sinh YBộ Y tế, Bộ Môn Khoa Vi Sinh Y
Bộ Y tế, Bộ Môn Khoa Vi Sinh Y học
học học
học



Bệnh viện Quân y 103, Ban
Bệnh viện Quân y 103, Ban Bệnh viện Quân y 103, Ban
Bệnh viện Quân y 103, Ban
Giám đốc Học viện Quân y v
Giám đốc Học viện Quân y vGiám đốc Học viện Quân y v
Giám đốc Học viện Quân y và Phòng Sau đại học
à Phòng Sau đại họcà Phòng Sau đại học
à Phòng Sau đại học đã cho phép và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, nhân viên Phòng Quản lý chất
Phòng Quản lý chất Phòng Quản lý chất
Phòng Quản lý chất
lợng, Phòng Công nghệ cao, Xởng Sản xuất vắc xin viêm gan A, Phòng
lợng, Phòng Công nghệ cao, Xởng Sản xuất vắc xin viêm gan A, Phòng lợng, Phòng Công nghệ cao, Xởng Sản xuất vắc xin viêm gan A, Phòng
lợng, Phòng Công nghệ cao, Xởng Sản xuất vắc xin viêm gan A, Phòng
Chăn nuôi động

Chăn nuôi động Chăn nuôi động
Chăn nuôi động vật thí nghiệm
vật thí nghiệm vật thí nghiệm
vật thí nghiệm



Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1
Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1
Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1 đã nhiệt
tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành bản luận án
này.
Tôi xin cảm ơn Phòng Thí nghiệm viêm gan vi rút, Trung tâm Dự phòng
và kiểm soát bệnh (CDC) đã giúp đỡ chúng tôi trong việc giải trình tự gen vi rút
viêm gan A -HM175 hệ chủng gốc giống.
Xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp đã đóng góp công sức cũng
nh động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin dành tình cảm sâu nặng nhất cảm ơn gia đình, nguồn
động lực, luôn cổ vũ, động viên và chia sẻ, giúp tôi hoàn thành tốt quá trình học
tập, công tác và nghiên cứu.

Nguyễn Thị Vân Quỳnh
Nguyễn Thị Vân QuỳnhNguyễn Thị Vân Quỳnh
Nguyễn Thị Vân Quỳnh

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong
công trình nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản
xuất vắc xin viêm gan A trên nuôi cấy tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí
nghiệm”. Kết quả công trình này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là
chủ nhiệm đề tài. Tôi đã được toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu
đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến
sĩ. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận án


Nguyễn Thị Vân Quỳnh









MỤC LỤC
Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục các biểu đồ

ĐẶT VẤN ĐỀ
1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
3

1.1. Những hiểu biết hiện nay về vi rút viêm gan A
3

1.1.1. Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan A 3

1.1.2. Đặc điểm sinh bệnh học, dịch tễ viêm gan vi rút A 10

1.1.3. Các biện pháp dự phòng 12

1.2. Các loại vắc xin viêm gan A và quy trình sản xuất 15

1.2.1. Các loại vắc xin viêm gan A 15

1.2.2. Tình hình sản xuất vắc xin viêm gan A ở Việt Nam 19

1.2.3. Quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt trên nuôi cấy tế
bào MRC5

20

1.3. Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A
24

1.3.1. Kiểm tra nguồn nguyên liệu sử dụng cho sản xuất vắc xin 24

1.3.2. Kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A trong quá trình sản
xuất

28

1.3.3. Kiểm tra chất lượng vắc xin thành phNm 29




CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
33

2.1. Vật liệu
33

2.1.1. Chủng vi rút 33

2.1.2. Các dòng tế bào 33

2.1.3. Vắc xin viêm gan A mẫu chuNn Quốc gia 34

2.1.4. Động vật thí nghiệm 34

2.1.5. Môi trường, hóa chất, sinh phNm 34

2.1.6. Dụng cụ, trang thiết bị 35

2.2. Phương pháp nghiên cứu
36

2.2.1. Thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tế bào MRC5 37

2.2.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A
bất hoạt trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm

44

2.2.3. Phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A trên nuôi
cấy tế bào MRC5 trong quá trình sản xuất và vắc xin thành phNm

48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
57

3.1. Kết quả thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tế bào MRC5
57

3.1.1. Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy cho HAV HM175 trên tế bào
MRC5 trong môi trường có huyết thanh

57

3.1.2. Kết quả cấy truyền thích ứng 60

3.1.3. Kết quả sản xuất chủng giống và kiểm tra chất lượng chủng 60

3.2. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất
hoạt trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm

67

3.2.1. Kết quả nuôi cấy và chuNn bị tế bào MRC5 67

3.2.2. Kết quả gây nhiễm, nuôi cấy và thu hoạch vi rút 68

3.3. Kết quả sản xuất thử nghiệm và kiểm tra chất lượng trong quá

trình sản xuất và vắc xin thành ph)m

73

3.3.1. Kết quả kiểm tra trong quá trình sản xuất 73

3.3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng vắc xin thành phNm 77




CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

82

4.1. Thích ứng chủng
4.1.1. Ưu điểm của tế bào MRC5 trong sản xuất vắc xin
83

83

4.1.2. Nguồn gốc và chất lượng tế bào MRC5 sử dụng để thích ứng
chủng và sản xuất vắc xin.

85

4.1.3. Chủng vi rút viêm gan A 86

4.1.4. Kỹ thuật lựa chọn để thích ứng chủng 86

4.1.5. Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy tối ưu 88


4.1.6. Chất lượng chủng giống vi rút viêm gan A cho sản xuất vắc xin 89

4.2. Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A trên MRC5
91

4.2.1. Quy trình nuôi cấy tế bào 92
4.2.2. Gây nhiễm vi rút 93

4.2.3. Quy trình nuôi cấy và thu hoạch vi rút 95

4.2.4. Tinh sạch hỗn dịch vi rút
4.2.5. Bất hoạt vi rút
96

98

4.3. Chất lượng vắc xin viêm gan A sản xuất thử nghiệm
4.4. Ưu điểm, hạn chế và tính mới của nghiên cứu
4.4.1. Ưu điểm
4.4.2. Hạn chế
4.4.3. Tính mới của nghiên cứu
99

106

106

107

108

KẾT LUẬN
109

KIẾN NGHN
111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ
NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
112


TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC



CÁC CHỮ VIẾT TẮT


Viết tắt Tiếng Anh/ nghĩa tiếng việt
ADN Desoxyribonucleic acid (Axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid (Axít ribonucleic)
CDC Centers of Diseases Control and Prevention
(Trung tâm dự phòng và kiểm soát bệnh – Mỹ)
ECACC The European Collection of Cell Cultures
(Ngân hàng tế bào châu Âu)
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(Kỹ thuật miễn dịch gắn men)
FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh bê bào thai)
FDA Food and Drug Administration

(Ủy ban Quản lý thực phNm và thuốc)
HAV Hepatitis A virus (Vi rút viêm gan A)
Ig Immunoglobulin (Globulin miễn dịch)
IRIVs
Immunopotentiating Reconstituted Influenza Virosomes
(Virosome vi rút cúm tái tạo có tính miễn dịch cao)
KD Kilodalton (Kilô dalton)
MCB Master cell bank (Tế bào giống gốc)
MEM Minimum Essential Medium (môi trường tối thiểu)
MOI Multiplicity of Infection (Liều gây nhiễm)
MRC5 Medical Reseach Council 5 (Tế bào lưỡng bội phổi người)
MSV Master seed virus (Chủng vi rút giống gốc)
MT Môi trường
P Passage (Đời cấy truyền)
PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
PFU Plaque Forming Unit ( Đơn vị tạo đám hoại tử)



PPLO Pleuropneumonia Like Organism
SIV Simian Immunodeficiency virus
(Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở khỉ)

VABIOTECH Công ty Vắc xin và Sinh phNm số 1
VGA Viêm gan A
WCB Working cell bank (Ngân hàng tế bào sản xuất)
WSV Working seed virus (Chủng vi rút giống sản xuất)
WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang
1.1 Các vắc xin viêm gan A bất hoạt được lưu hành 16
1.2 Các tiêu chuNn của vắc xin viêm gan A 30
3.1 Hiệu giá vi rút theo thời gian hấp phụ 59
3.2 Hiệu giá vi rút qua các đời cấy truyền 60
3.3 Hệ thống chủng giống cho sản xuất vắc xin viêm gan A trên MRC5 60
3.4 Kết quả kiểm tra vô khuNn chủng giống gốc (MSV) và
chủng giống sản xuất (WSV) 63
3.5 Kết quả kiểm tra hiệu giá và tính ổn định chủng 64
3.6 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trên chủng 65
3.7 Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch của chủng 66
3.8 Hiệu giá vi rút ở các môi trường duy trì 68
3.9 Hiệu giá vi rút ở các liều khác nhau trên môi trường LH3E 69
3.10 Hiệu giá vi rút trên MRC5 ở môi trường không chứa huyết thanh 71

3.11 Nuôi cấy và chuNn bị tế bào MRC5 của các loạt sản xuất thử nghiệm 73
3.12 Hiệu giá vi rút của 3 loạt sản xuất thử nghiệm 74
3.13 Kết quả kiểm tra hiệu giá sau cô đặc thNm tích hỗn dịch vi rút 75
3.14 Kết quả kiểm tra bất hoạt vi rút 3 loạt vắc xin viêm gan A 75
3.15 Kết quả kiểm định các loạt bán thành phNm 76
3.16 Kết quả thử nghiệm vô khuNn 3 loạt vắc xin viêm gan A 77
3.17 Kết quả kiểm tra chất gây sốt trên thỏ của vắc xin viêm gan A 78
3.18 Kết quả kiểm tra an toàn chung của vắc xin trên chuột nhắt 78
3.19 Kết quả kiểm tra an toàn chung vắc xin trên chuột lang 79
3.20 Kết quả kiểm tra công hiệu của 3 loạt vắc xin 80
3.21 Kết quả kiểm tra các thành phần hóa học trong vắc xin 80

4.1 Các vắc xin vi rút sản xuất trên MRC5 84



DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang
1.1 Hình ảnh vi rút viêm gan A dưới kính hiển vi điện tử 4
1.2 Cấu trúc vi rút viêm gan A 4
1.3 Cấu tạo hệ gen của vi rút viêm gan A 5
1.4 Sự nhân lên của vi rút viêm gan A trong tế bào gan 7
1.5 Diễn biến huyết thanh học trong bệnh viêm gan A 11
2.1 Tiêm phúc mạc kiểm tra an toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang 52
2.2 Tiêm tĩnh mạch tai thỏ kiểm tra chất gây sốt 54
3.1 Hình ảnh vi rút viêm gan A trong tế bào MRC5 trên kính hiển vi điện tử 57
3.2 Nhận dạng vi rút viêm gan A bằng phương pháp RT-PCR 62
3.3 Hình ảnh vi rút viêm gan A chủng WSV trong tế bào MRC5 trên
kính hiển vi điện tử 62
3.4 Hình ảnh điện di sản phNm PCR kiểm tra Mycoplasma trong chủng
giống MSV và WSV 63
3.5 ChuNn độ hiệu giá chủng bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử 64
3.6 Hình ảnh tế bào MRC5 qua các đời cấy chuyển 67
3.7 Máy Cogen Scale để cô đặc thNm tích vi rút viêm gan A 74
3.8 Hình ảnh kiểm tra bất hoạt vi rút trên tế bào 76




DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.1 Hiệu giá vi rút ở các liều gây nhiễm 58
3.2 Đường cong sinh trưởng của vi rút 58
3.3 Hiệu giá vi rút theo nhiệt độ nuôi cấy 59
3.4 Hiệu giá vi rút trong môi trường LH3E với các pH khác nhau 70



DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ Tên sơ đồ Trang

2.1 Thiết kế nghiên cứu 36
2.2 Gây miễn dịch và lấy máu 43
2.3 Thay môi trường và lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi rút 46
2.4 Tiêm vắc xin và theo dõi chuột trong kiểm tra an toàn chung 51
2.5 Tiêm vắc xin và lấy máu chuột trong kiểm tra công hiệu 55




1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan A (VGA) là bệnh truyền nhiễm do vi rút viêm gan A gây
nên. Bệnh phổ biến với 1,5 triệu người mắc mới hàng năm trên toàn thế giới
và có thể dự phòng được bằng vắc xin [33], [51], [72], [94]. Việt Nam là quốc
gia nằm trong vùng lưu hành cao của vi rút viêm gan A nên nhu cầu sử dụng
vắc xin viêm gan A là rất lớn [5], [9].

Nhằm thực hiện chiến lược dự phòng viêm gan A, Việt Nam đã sản
xuất thành công vắc xin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên
phát Maccaca mulatta. Vắc xin này đã phát huy được tính hiệu quả, an toàn,
đáp ứng được phần lớn nhu cầu vắc xin viêm gan A trong nước [18], [24],
[25]. Tuy nhiên, công nghệ sản xuất vắc xin này còn một số hạn chế vì tế bào
thận khỉ Maccaca mulatta phải chọn lọc qua việc kiểm soát chặt chẽ các vi rút
ngoại lai, khó mở rộng về quy mô sản xuất.
Xu hướng hiện nay trên thế giới là sử dụng vắc xin viêm gan A bất hoạt
sản xuất trên tế bào lưỡng bội phổi người (MRC5 - Medical Research
Council). Sử dụng dòng tế bào này để sản xuất vắc xin có ưu điểm :
- Tế bào MRC5 có nguồn gốc từ người nên sử dụng dòng tế bào này để
sản xuất vắc xin sẽ hạn chế được nguy cơ dị ứng cho người.
- Sử dụng tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin thì có thể chủ động và dễ
mở rộng quy mô sản xuất.
- Dòng tế bào này đã được kiểm tra chất lượng và cấp phép sản xuất
nhiều loại vắc xin trên thế giới với chất lượng tốt.
- Sử dụng dòng tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin thay thế cho quy trình
sản xuất vắc xin từ tế bào thận khỉ sẽ tránh phải sử dụng động vật là nguyên
liệu đầu vào cho sản xuất.

2
Hiện nay, chỉ có một số hãng dược phNm lớn như Glaxo Smith Kline, Merck

Sharp & Dohme, Aventis Pasteur sản xuất thành công vắc xin VGA trên tế
bào lưỡng bội, nhưng giá thành rất cao. Hơn nữa, việc chuyển giao công nghệ
sản xuất các loại vắc xin nói chung và vắc xin VGA nói riêng vào Việt Nam
còn khó khăn.
Để tiến tới tự lực sản xuất vắc xin viêm gan A trên tế bào MRC5 ở Việt
Nam nhằm đáp ứng được nhu cầu vắc xin phòng bệnh cho cộng đồng cả về số
lượng, chất lượng và giá thành, đề tài: “Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm

gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm”
được tiến hành với 3 mục tiêu:
1. Thích ứng chủng vi rút viêm gan A HM 175 trên tế bào MRC5 để sản
xuất vắc xin viêm gan A.
2. Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt trên nuôi
cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm.
3. Đánh giá chất lượng vắc xin viêm gan A trong quá trình sản xuất và
vắc xin thành phm.














3
CHƯƠNG 1:
TỔNG QUAN

1.1. Những hiểu biết hiện nay về vi rút viêm gan A
1.1.1. Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan A
Vi rút VGA (Hepatitis A virus - HAV) được Feinstone phát hiện lần
đầu tiên vào năm 1973 nhờ phương pháp hiển vi điện tử miễn dịch [1], [19].

Đến năm 1979, Phillip J. Provost và Maurice R. Hilleman đã nuôi cấy thành
công vi rút này trên tế bào và mở đầu cho nhiều nghiên cứu về vi rút cũng như
phát triển vắc xin VGA [81].
1.1.1.1. Phân loại
Vi rút VGA thuộc họ Picornaviridae. Họ này gồm các vi rút có kích
thước rất nhỏ, lõi chứa sợi ARN. Từ “pico” theo tiếng La Tinh là nhỏ. Tên gọi
Picornavirus được hình thành từ việc ghép hai từ trên đã nói lên đặc điểm
sinh học cơ bản của họ vi rút này [21]. Dựa trên đặc tính về trình tự gen và độ
nhạy với a xít, người ta chia Picornaviridae thành chín chi. Trong đó, có năm
chi gây bệnh cho người là: Enterovirus, Rhinovirus, Hepatovirus,
Parechovirus, Kobuvirus [21], [58].
Vi rút VGA thuộc chi Hepatovirus, loài Hepatitis A virus (vi rút gây
bệnh VGA). Vi rút VGA là thành viên duy nhất của chi Hepatovirus [19], [21].
Cho đến nay, người ta đã phân loại các chủng vi rút VGA thành 7 kiểu gen
được quy định từ I đến VII [33], [102]. Bốn trong số này có liên quan với việc
gây bệnh ở người là I, II, III và VII. Hầu hết các chủng vi rút VGA gây bệnh
ở người thuộc kiểu gen I và III với 80% thuộc về kiểu gen I [43]. Kiểu gen
IV, V và VI bao gồm các chủng phân lập từ khỉ [33].
1.1.1.2. Hình thái cấu trúc và sức đề kháng
Vi rút VGA có kích thước rất nhỏ, hình khối đa diện đều, đường kính
27-28 nm. Lõi chứa ARN sợi đơn cấu tạo bởi 7500 nucleotit. Vi rút VGA có

4
trọng lượng phân tử 2,5 triệu Dalton. Protein cấu trúc gồm 04 chuỗi
polypeptit: VP1, VP2, VP3, VP4 với trọng lượng phân tử khác nhau và tạo
nên capsid đối xứng hình khối với 20 mặt là các tam giác đều. Vi rút không
có vỏ bọc bên ngoài – là một vi rút trần [1], [21], [19], [43], [69], [102].

Hình 1.1. Hình ảnh vi rút viêm gan A dưới kính hiển vi điện tử (tỷ lệ 1/10
6
)
(Nguồn: theo WHO (2007) [94])












Hình 1.2. Cấu trúc vi rút viêm gan A
(Nguồn: theo Martin A. (2006) [69])

Vi rút VGA có sức đề kháng cao, có thể tồn tại được ở nhiệt độ 60
0
C
trong 1 giờ, 100
o
C trong 5 phút, 37

o
C trong 72 giờ, nhiệt độ phòng trong 1
ngày. Vi rút có thể bảo quản ở nhiệt độ từ -80
o
C đến -20
o
C trong nhiều năm.

5
Tồn tại trong cồn 70
o
trong 3 phút và chịu được môi trường pH ≤ 3 trong 1
giờ, nhờ vậy vi rút VGA có thể vượt qua hàng rào dịch vị.
Vi rút VGA bị bất hoạt khi tiệt trùng ướt ở 121
0
C/20 phút hoặc khô ở
180
0
C/1 giờ; formallin (1:4000 trong 72 giờ, 37
0
C) [7], [19], [94].
1.1.1.3. Cấu tạo hệ gen
Cấu tạo hệ gen của vi rút VGA là sợi đơn ARN (+) bao gồm 7500
nucleotid với cấu trúc bậc 2, 3 phức tạp và một khung đọc mở (ORF – open
reading frame) mã hóa cho tất cả các protein của vi rút.

Hình 1.3. Cấu tạo hệ gen của vi rút viêm gan A
(Nguồn: theo Martin A. (2006) [69])
Có ba phần chính trong bộ gen:
a) Đầu 5
’
gồm 742 nucleotid không dịch mã, nối với protein VPg bằng
liên kết đồng hóa trị. Cấu trúc bậc hai của vùng không mã hóa đầu 5
’
rất quan
trọng, tạo thành điểm gắn với ribosom có vai trò điều khiển dịch mã
polyprotein của vi rút.
b) Khung đọc mở (ORF) nằm ở vị trí trung tâm gồm 6681 nucleotid mã
hóa cho một polyprotein. Polyprotein được mã hóa bởi 3 vùng P1-2A, 2BC,

6
P3. Vùng cấu trúc tiền P1-2A về sau sẽ được tách ra bởi proteaza của vi rút
tạo thành VP4, VP2, VP1-2A và VP3. VP1-2A là protein cấu trúc quan trọng
khi hình thành hạt vi rút.
Khung đọc mở được dịch mã tạo ra polyprotein. Polyprotein này sau đó
được tách ra bởi một proteaza (3C
pro
) để tạo thành 4 protein cấu trúc (VP1,
VP2, VP3, VP4) và 7 protein không cấu trúc (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D).
Kháng thể kháng vi rút VGA gắn vào VP1 và/hoặc VP3 [33], [60], [69], [94].

c) Đầu 3
’
không mã hóa, gồm 63 nucleotid.
Protein VPg gắn với đầu 5
’
ở đoạn đầu của gen ARN và đóng vai trò
như là một protein khởi đầu cho sự tổng hợp ARN. Đột biến vùng 5
’
làm tăng
khả năng thích ứng của vi rút VGA trong nuôi cấy tế bào [33], [54]. Nghiên
cứu của Atsuko Totsuka và Yasuo Moritsugu (1999) xác định được đột biến ở
vùng 2B, 2C và 3A làm đNy nhanh quá trình nhân lên của vi rút khi thích ứng
trên nuôi cấy tế bào [88].
Một hạt vi rút VGA là một hình khối 20 mặt bao gồm một ARN và 60
tiểu thể VP1, VP2, VP3 và VP4 của capsid. Trình tự bộ gen của vi rút VGA
gây bệnh trên người ở các khu vực khác nhau đã được xác định đầy đủ và cho
thấy có sự tương đồng cao giữa các chủng này.
1.1.1.4. Sự sao chép và nhân lên
Vi rút VGA sao chép và nhân lên hoàn toàn trong tế bào chất của tế bào
gan theo cơ chế liên quan đến một ARN phụ thuộc ARN polymerase. Vật liệu
di truyền ARN (+) của vi rút VGA có trình tự nucleotid giống với trình tự của
mARN nên đảm nhiệm luôn chức năng của mARN để tổng hợp polyprotein.
Hạt vi rút trưởng thành có gen mã hóa cho ARN polymerase – là gen lớn nhất
trong hệ gen và độc lập hoàn toàn với nhân tế bào chủ trong sao chép và phiên
mã.


7

Hình 1.4. Sự nhân lên của vi rút viêm gan A trong tế bào gan
(Nguồn: theo Martin A. (2006) [69])
Quá trình nhân lên của vi rút VGA trong tế bào chủ gồm các giai đoạn [69]:
a. Vi rút nhận diện và gắn vào thụ cảm thể trên màng tế bào chủ.
b. Sợi ARN (+) được giải phóng vào tế bào chất.
c. Khởi đầu quá trình dịch mã là một ribosom nội bào vào vị trí 5
’
của gen
để dịch mã tạo chuỗi polyprotein của vi rút.
d. Chuỗi polyprotein tiếp tục dịch mã đồng thời nhờ protease của vi rút
phân cắt thành các phân tử nhỏ có chức năng khác nhau như protein
cấu trúc tạo capsid, ARN polymerase, protease, VPg.
e. Tổng hợp sợi ARN (-) bổ sung trên ARN (+) khuôn mẫu, bắt đầu từ
đầu 3
’
với sự tham gia của ARN polymerase.
f. Sợi ARN (-) vừa được sao chép làm khuôn để tổng hợp ra nhiều sợi
ARN (+) mới của vi rút.
g. ARN (+) mới được tổng hợp có thể làm khuôn để tổng hợp nhiều ARN
(-) rồi từ đó tổng hợp nhiều sợi ARN hoặc dùng làm mARN để tổng
hợp polyprotein.
h. Lắp ráp sợi ARN (+) với protein cấu trúc để tạo ra hạt vi rút mới.
i. Hạt vi rút mới nNy chồi qua những vị trí trên màng tế bào chủ ra ngoài.

8
Vi rút viêm gan A trong nuôi cấy tế bào:
Nuôi cấy vi rút VGA trên tế bào giữ vai trò quan trọng trong nghiên
cứu vi rút này. Để có thể phát triển trên các tế bào ngoài tế bào đích (tế bào
gan), vi rút VGA cần phải trải qua quá trình thích ứng với sự tăng trưởng
trong nuôi cấy tế bào. Năm 1979, Phillip J. Provost và Maurice R. Hilleman là
những người đầu tiên nuôi cấy thành công vi rút này trên tế bào [81]. Vi rút
VGA khác với Enterovirus khác ở quá trình nhân lên chậm, kéo dài, thường
không gây hủy hoại tế bào
và sản lượng vi rút thấp. Do đó, việc nhân nuôi vi
rút để sản xuất vắc xin gặp nhiều khó khăn [28], [73], [80], [81]. Các nghiên
cứu đột biến thích ứng vi rút VGA trên nuôi cấy tế bào đã được tiến hành và
qua đó, phân lập được các chủng có khả năng nhân lên trên nuôi cấy tế bào
[29], [45], [35], [69], [81], [52], [55], [86], [100]. Do vậy cho đến năm 1995,
vắc xin VGA bất hoạt đầu tiên mới được cấp phép sử dụng trên người.
Phương pháp thích ứng chủng vi rút VGA trên tế bào: Hầu hết các
chủng vi rút VGA trong sản xuất vắc xin trên thế giới là kết quả của quá trình
cấy truyền liên tiếp chủng trên tế bào và hoặc trên mô của động vật. Từ các
chủng vi rút VGA gây bệnh thành dịch, qua quá trình cấy truyền liên tiếp đã
tạo được chủng giảm độc lực, nhưng vẫn còn giữ được tính kháng nguyên có
khả năng sinh miễn dịch bảo vệ [29], [50], [55], [86].

Funkhouser A. W và cộng sự (1999), khi nghiên cứu sự nhân lên của vi
rút VGA trên tế bào MRC5 để xác định yếu tố hạn chế sự nhân lên của vi rút.
Tác giả đã phát hiện thấy vi rút VGA chủng HM175 sử dụng để sản xuất vắc
xin có 4 đột biến tự nhiên ở vùng 5’, những đột biến này xảy ra khi chủng
HM175 được cấy truyền trên MRC5. Các chủng HM175 này có khả năng
nhân lên tốt trên tế bào MRC5 [53]. Nuôi cấy vi rút VGA trên dòng tế bào
lưỡng bội MRC5 là một tiến bộ quan trọng trong sản xuất vắc xin VGA [52],
[83], [91]. Vi rút VGA sao chép và nhân lên trong tế bào MRC5 qua các giai

đoạn : tổng hợp các hạt vi rút VGA trưởng thành xuất hiện vào ngày thứ 2 - 4

9
sau gây nhiễm và đạt hiệu giá cao nhất vào ngày thứ 8. Từ ngày thứ 14 sau
gây nhiễm, khi vi rút nhân lên đã đạt đến mức ổn định, sự tổng hợp ARN vi
rút giảm dần. Sự nhân lên của vi rút VGA không làm gián đoạn quá trình tổng
hợp protein, ADN, ARN cũng như không gây hủy hoại tế bào trong thời gian
ủ kéo dài. Những điều này liên quan tới sự nhân lên kéo dài của vi rút trong
nuôi cấy trên tế bào. Vi rút được giải phóng ra khỏi tế bào theo cơ chế nNy
chồi [35]. Do đó các chủng vi rút VGA trong nuôi cấy tế bào được đặc trưng
bởi việc giải phóng khoảng 30- 50% vi rút (vi rút ngoại bào) và có một số
lượng lớn 50-70% các vi rút nằm trong tế bào – đây chính là nguyên liệu để
tinh chế thành vắc xin [65], [87], [74], [78], [79].

Sự nhân lên của vi rút VGA trên tế bào được xác định bằng việc phát
hiện kháng nguyên hoặc phát hiện vi rút.
Hiệu suất nuôi cấy vi rút thu được
phụ thuộc vào một số điều kiện nuôi cấy như : nhiệt độ, thời gian, môi trường
nuôi cấy và liều vi rút gây nhiễm. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp dao động từ 32
đến 35
o
C. Liều gây nhiễm 0,05-0,1 PFU/tế bào tùy từng công nghệ sản xuất
[29], [83], [77], [101],
[52], [36], [100], [29], [59].
Vi rút VGA phân lập từ người đã được nuôi cấy thành công trên các
dòng tế bào khác nhau và sử dụng cho sản xuất cả hai loại vắc xin
VGA bất hoạt và vắc xin sống giảm độc lực [18], [61], [80], [82].

1.1.1.5. Kháng nguyên và tính sinh miễn dịch
Tính kháng nguyên của vi rút VGA phụ thuộc vào hình thái của hạt vi

rút. Hạt vi rút nguyên vẹn có tính kháng nguyên cao, nhưng nếu hạt vi rút
không nguyên vẹn thì tính kháng nguyên của nó trở nên rất thấp. Tính kháng
nguyên của hạt vi rút VGA nguyên vẹn tương tự như tính kháng nguyên của
một hạt rỗng [30].
Các kháng nguyên quan trọng kích thích sản xuất kháng thể trung hòa
nằm tập trung ở VP1 (Ser 102 và Ser 114) và VP3 (Asp 70) trên capsid [33].

10
Vi rút VGA bị trung hòa bởi cả hai kháng thể IgG anti-HAV và IgM
anti-HAV. Không thấy phản ứng chéo về huyết thanh giữa vi rút VGA và các
vi rút viêm gan khác. Vi rút VGA chỉ có một týp huyết thanh đã được xác
định và nhiễm trùng tự nhiên sẽ tạo miễn dịch bền vững. Các chủng vi rút
khác nhau cho phản ứng giống nhau đối với kháng thể đơn dòng kháng vi rút
VGA. Đây là cơ sở miễn dịch để có thể sản xuất vắc xin VGA từ nhiều loại
chủng vi rút VGA khác nhau [94].
1.1.2. Đặc điểm sinh bệnh học, dịch tễ viêm gan vi rút A
1.1.2.1. Khả năng gây bệnh
Đường lây bệnh chủ yếu của vi rút VGA là đường phân – miệng. Sau
khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, vi rút vào máu sau đó nhân lên ở tế bào gan
[1], [19]. Một số đường lây nhiễm khác nhưng hiếm gặp cũng đã được đề cập
tới như: đường máu, tình dục đồng giới nam [43], [49], [72], [85].
Diễn biến lâm sàng của VGA cấp tính thường không phân biệt được
với các loại viêm gan vi rút khác. Thể lâm sàng biểu hiện ở các giai đoạn tiền
cấp tính (thời kỳ khởi phát) với triệu chứng sốt, mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn,
khó chịu ở bụng. Thời kỳ cấp tính (toàn phát) biểu hiện lâm sàng gồm vàng
da, gan to và đau kéo dài khoảng hai tuần. Mức độ nghiêm trọng và tỷ lệ tử
vong tăng dần theo nhóm tuổi. Diễn biến nặng nhất của bệnh là VGA tối cấp,
chiếm khoảng 0,3% số bệnh nhân với triệu chứng đặc trưng là suy giảm
nhanh chóng chức năng gan, tỷ lệ tử vong rất cao. Bệnh VGA thường phục
hồi chậm với cảm giác mệt mỏi, buồn nôn, chán ăn kéo dài. Hiện nay chưa có

thuốc kháng vi rút đặc hiệu [4], [19], [21], [89].
1.1.2.2. Đáp ứng miễn dịch của cơ thể với vi rút viêm gan A
Đáp ứng miễn dịch tự nhiên với vi rút VGA rất phức tạp và có sự tham
gia của một vài thành phần khác nhau trong hệ miễn dịch. Có bằng chứng cho
thấy tế bào giết tự nhiên (NK - natural killer), tế bào T gây độc và các kháng

11
thể được sản xuất ra từ dòng tế bào B tham gia vào đáp ứng miễn dịch với
nhiễm vi rút VGA. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Lemon S. (1993), chỉ
riêng kháng thể dịch thể cũng đủ khả năng bảo vệ không bị bệnh VGA trên
lâm sàng [64]. Đáp ứng miễn dịch dịch thể liên quan chủ yếu đến kháng thể
trung hòa. Kháng thể này bao gồm hai lớp IgG và IgM. Sự có mặt của IgM
kháng vi rút VGA chứng tỏ bệnh nhân đang ở thời kỳ cấp tính của bệnh. Sự
xuất hiện và tồn tại của mỗi loại kháng thể trên được tìm thấy trong huyết
thanh bệnh nhân từ giai đoạn khởi phát đạt cao nhất 7 - 21 ngày, và thường
biến mất trong vòng một đến hai tháng. Tuy nhiên, một số trường hợp hiếm
gặp, chúng có thể tồn tại nhiều tháng sau khi bệnh nhân đã khỏi hoàn toàn
[63], [93], [97], [73]. Ngoài IgM kháng vi rút VGA, người ta còn thấy IgG
kháng vi rút VGA. Kháng thể này cũng bắt gặp từ giai đoạn khởi phát của
bệnh và kéo dài trong nhiều năm. Sự có mặt của IgG kháng vi rút VGA chứng
tỏ bệnh nhân đang hoặc đã mắc VGA trong quá khứ. Như vậy, ở giai đoạn
phục hồi, IgG kháng vi rút VGA trở thành chủ yếu và tồn tại rất lâu, có khả
năng chống tái nhiễm [51], [63], [73], [93], [97].

Hình 1.5. Diễn biến huyết thanh học trong bệnh viêm gan A
(Nguồn: Nguyễn Thu Vân (2002) [22])


12
1.1.2.3. Tình hình nhiễm vi rút viêm gan A
* Trên thế giới: Vi rút VGA phổ biến ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Tỷ lệ nhiễm vi rút VGA khác nhau ở các khu vực, dao động từ 15 – 100% dân
số và có liên quan chặt chẽ với tình trạng kinh tế, xã hội và vệ sinh môi
trường. Ước tính có khoảng 1,5 triệu người mắc VGA cấp tính hàng năm và
số lượng nhiễm trùng vi rút VGA thật sự có thể cao hơn gấp 10 lần [24], [25],
[33], [37, 51]. Trong khi nhiễm vi rút VGA ở trẻ em thường không có triệu
chứng thì ở người lớn, tỷ lệ có triệu chứng tăng dần theo tuổi. Với nhóm bệnh
nhân VGA, tỷ lệ vàng da ở trẻ dưới 6 tuổi khoảng 10%; ở trẻ lớn hơn và
người lớn, tỷ lệ này khoảng 70%
[4], [19], [22], [70]. Những nước có mức độ
lưu hành thấp, nhiễm vi rút VGA xảy ra chủ yếu ở những người có nguy cơ
cao (người đi vào vùng dịch, nhân viên khoa truyền nhiễm, giáo viên nhà trẻ,
công nhân vệ sinh môi trường) . Những nước có mức độ lưu hành trung bình,
nhiễm vi rút VGA xảy ra trong toàn bộ cộng đồng và rải rác có các vụ bùng
nổ dịch. Những nước có mức độ lưu hành cao, nhiễm vi rút VGA gặp nhiều ở
ngay cả trẻ dưới 10 tuổi và thường không có triệu chứng [22], [27], [56] ,[57],
[75].
* Ở Việt Nam: Việt Nam là nước có mức độ lưu hành cao của vi rút VGA.
Theo các nghiên cứu dịch tễ, tỷ lệ nhiễm vi rút VGA trong cộng đồng là 97%.

Tỷ lệ này tăng dần theo nhóm tuổi, từ 62% (ở nhóm dưới 5 tuổi) tới gần 100%
(ở nhóm trên 10 tuổi). Một số tác giả khác cũng cho kết quả tương tự [5], [7].
Tỷ lệ IgM anti-HAV ở các bệnh nhân viêm gan cấp tại các bệnh viện theo một
số nghiên cứu trong nước giao động từ 36,89 – 51,35% [7].
1.1.3. Các biện pháp dự phòng
Dự phòng VGA cần phải xem xét đến các yếu tố sinh miễn dịch và các
đường lây chính của bệnh. Có hai biện pháp cơ bản là ngăn chặn sự xâm nhập
của vi rút VGA vào cơ thể và tạo miễn dịch với vi rút VGA [1], [9], [19],
[22], [51].