Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm

BKHCN-BYT
VVSDT TƯ
BKHCN-BYT

VVSDT TƯ

BKHCN-BYT
vvsdt t

Bộ khoa học công nghệ Bộ y tế
Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ơng
1 Yersin, Hà Nội




báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài
nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản
xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên
phát ở quy mô phòng thí nghiệm
m số : ĐTĐL-2006/02G
GS.TSKH.Nguyễn THU VÂN

6374
14/5/2007
Hà nội 2007
Bản quyền 2007 thuộc Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1,Viện VSDTTƯ
Đơn xin sao chép bản toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Giám đốc
Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1 trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu

Bộ khoa học công nghệ Bộ y tế
Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ơng
1 Yersin, Hà Nội

báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài
nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản
xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên
phát ở quy mô phòng thí nghiệm
m số : ĐTĐL-2006/02G
GS.TSKH.Nguyễn THU VÂN


Hà nội 2007
Bản thảo viết xong tháng 3/2007
Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nớc,
mã số ĐTĐL-2006/02G

đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ nhà nớc ĐTĐL-2006/02G
nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản
xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ
tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm
Cố vấn khoa học :
GS.TSKH.Hoàng Thủy Nguyên

Chủ nhiệm đề tài : GS.TSKH Nguyễn Thu Vân
Các cán bộ tham gia
TS.Nguyễn Tuyết Nga
Thạc sỹ Đinh Thúy Vân
KS.Trịnh Tuấn Việt
CNSH.Nguyễn Kim Dung
Thạc sỹ Đoàn Văn Lu
TS.Đỗ Thủy Ngân
Thạc sỹ Nguyễn Thu Hằng
CNSH.Nguyễn Hoàng Mai
Thạc sỹ Nguyễn Bích Thủy
TS.Nguyễn Quế Anh
TS.Lê Quỳnh Mai
Thạc sỹ Nguyễn Lê Khánh Hằng
Cơ quan thực hiện :
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng


các chữ viết tắt
ADN Desoxyribonucleic acid
(axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid
(axít ribonucleic)

BSA Bovine Serum Albumin
CCID 50 Cell Culture Infectious Dose 50
(Liều gây nhiễm 50% tế bào)
CDC Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ)
CPE Cytopathic effect
tác động gây hủyhoại tế bào
dpi day post infection
Ngày sau gây nhiễm
E.coli Escherichia coli
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
(thử nghiệm miễn dịch gắn enzym)
EID50 Effective infectious dose 50
(Liều gây nhiễm hiệu quả 50%)
ED50 Effective dose 50
(Liều gây miễn dịch 50%)
FDA Food and Drug Administration
(Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc)
HA Hemagglutination assay
Thử nghiệm ngng kết hồng cầu
HAU HA unit
Đơn vị HA
HI Hemagglutination inhibition
ức chế ngng kết hồng cầu
IVPI Intravenous Pathogenicity Index
Chỉ số độ lực tiêm tĩnh mạch
kD kiloDalton
mARN message ARN
ARN thông tin
MDCK Madin-Darby Canine Kidney

MDHQ Miễn dịch huỳnh quang
MEM Minimum Essential Medium
Môi trờng cần thiết tối thiểu
ml mililit
àg mcg
MSV Master seed virus
(Chủng gốc giống)
M.tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
Trực khuẩn Lao
nm nanomet
NMWL Nominal Molecular Weight Limit
( Kích cỡ giới hạn trọng lợng phân tử )
OD Optical Density
Mật độ quang học
PBS Phosphat Buffer Saline
pfu Plaque Forming Unit
(Đơn vị tạo đám hoại tử)
PMKc Primary Monkey Kidney cells
QC Quality Control
Kiểm tra chất lợng
RNP Ribonucleoprotein
RT- PCR Reverse transcription- Polymerase chain reaction
(phản ứng chuỗi polymeraza phiên mã ngợc)
rpm round per minute
(Vòng/phút)
RV Realase Virus
Virut giải phóng
rg Reverse genetics
Di truyền ngợc
SIV Simian Immunodefficiency Virus

Virut gây suy giảm miễn dịch ở khỉ
SV40 Simian Virus 40
SFV Simian Foamy Virus
Virut tạo bọt của khỉ
SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis
(điện di trên gel polyacrylamid)
SRID Single Radial Immuno Diffusion
Khuyếch tán miễn dịch vòng tròn đơn
SPF Specific Pathogen Free
Không có các yếu tố gây bệnh đặc biệt
TCYTTG Tổ Chức Y Tế Thế Giới
TB Tế bào
VX Vắcxin
VABIOTECH Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1
WSV Working seed virus
( Chủng sản xuất)
WHO World Health Organization
Tổ chức Y tế thế giới



mục lục

Đặt vấn đề 1
Phần 1 : tổng quan 3
1.1. Đặc điểm chung của virút cúm
3
1.2.Cấu trúc virion
3

1.3. Cấu trúc hệ gen virút Cúm và các protein mã hóa 4
1.4. Sự tái tổ hợp của virút Cúm 8
1.5. Sự phát triển của

virút trên tế bào
9
1.6. Sinh bệnh học
9
1.7. Chẩn đoán

virút Cúm
10
1.8. Đặc điểm dịch tễ học
10
1.9. Kỹ thuật di truyền ngợc
13
1.10. Dự phòng 15
1.11. Một số quy trình sản xuất vắcxin Cúm 19

Phần

2: vật liệu và phơng pháp 21
2.1. Vật liệu
21
2.1.1 Tế bào
21
2.1.2. Virút 21
2.1.3 Kháng nguyên chuẩn A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) 22
2.1.4. ADN plasmit
22

2.1.5. Vật liệu và trang thiết bị khác
23
2.2. Phơng pháp
23
2. 2.1. Phơng pháp tạo virut tái tổ hợp
23

2.2.2. Sản xuất chủng giống gôc và chủng sản xuất vắcxin H5N1
23
2.2.3. Thử nghiệm kiểm tra độc lực của WSV rgA/H5N1 24

2.2.4. Quy trình lựa chọn khỉ sạch
24
2.2.5. Quy trình sản xuất vắc xin Cúm H5N1 trên quy mô phòng thí
nghiệm 25
2.2.6. Phơng pháp định lợng HA trong vắcxin 27
2.2.7. Phơng pháp sản xuất kháng huyết thanh khỉ kháng H5N1 sử dụng
trong thử nghiệm SRID
28
2.2.8. Các thử nghiệm huyết thanh học
28
2.2.9. Các thử nghiệm xác định hiệu giá virút
28
2.2.10. Các thử nghiệm kiểm tra chất lợng
29
2.2.11. Đánh giá sự nhân lên của virút trong quá trình nuôi cấy 34
2.2.12. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trong thử nghiệm tiền
lâm sàng
34
2.2.13. Phơng pháp thích ứng chủng NIBRG-14 trên tế bào PMKc và

Vero
35

2.2.14. Phơng pháp thích ứng chủng rgA/H5N1 trên tế bào Vero
35
Phần 3: Kết quả 35
3.1. Thiết lập hệ chủng gốc và chủng sản xuất vắc xin Cúm rgA/ H5N1
với đầy đủ các chỉ tiêu kỹ thuật theo quy định
36
3.2. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắc xin Cúm rgA/H5N1 trên
tế bào PMKc
43
3.3. Kết quả sản xuất thử nghiệm vắc xin Cúm ở quy mô phòng thí
nghiệm 48
3.4. Kiểm tra chất lợng và đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin Cúm
rgA/H5N1 trên động vật thực nghiệm
50
3.5. Kết quả nghiên cứu thích ứng chủng NIBRG-14 trên dòng tế bào
PMKc, Vero và rgA/H5N1 trên Vero
59
3.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin cúm A/H5N1 về các mặt
64
KÕt luËn 70

KiÕn nghÞ 72

Tµi liÖu tham kh¶o
73

Danh mục các bảng trong báo cáo
Bảng Tên bảng
Trang
Bảng 1 Các đoạn ARN trong hệ gen virút Cúm A và các protein mã hóa
5
Bảng 2 Các vắcxin Cúm đã đợc đăng ký sử dụng trên thế giới 16
Bảng 3 Hiệu giá virút rg 15T qua các lần cấy truyền 37
Bảng 4 Kết quả thử nghiệm kiểm tra độc tính của các chủng virút
A/VN/1203,PR8 và rgA/H5N1 trên chồn sơng
39
Bảng 5 Kết quả phân tích tính kháng nguyên bằng phơng pháp HI của các
chủng vắcxin và chủng bố mẹ
39
Bảng 6 Kết quả so sánh chủng rgA/H5N1 với chủng NIBRG -14 (WHO) 40
Bảng 7 Các phơng pháp kiểm tra khỉ sạch 44
Bảng 8 Quy trình kiểm tra khỉ sạch 45
Bảng 9 Kết quả nghiên cứu xác định quy trình gây nhiễm 45
Bảng
10
Kết quả nghiên cứu xác định hàm lợng nhôm hấp phụ tối u 48
Bảng
11
Kết quả kiểm tra trong quá trình sản xuất 49
Bảng

12
Kết quả hiệu giá kháng thể HI của khỉ sau khi tiêm 50
Bảng
13
Tơng quan giữa nồng độ huyết thanh khỉ và hàm lợng HA trong
vắcxin Cúm bằng thử nghiệm SRID
51
Bảng
14
Hàm lợng HA trong các loạt vắcxin đợc định lợng theo phơng pháp
SRID
52
Bảng
15
Kết quả các thử nghiệm kiểm tra về mặt sinh học 53
Bảng
16
Kết quả thử nghiệm hóa lý của các loạt vắcxin 54
Bảng
17
Kết quả kiểm tra tính gây miễn dịch trên gà 56
Bảng
18
Kết quả thử nghiệm công hiệu (ED50) trên chuột 56
Bảng
19
Kết quả hiệu giá HI sau khi gây miễn dịch trên khỉ 56
Bảng
20
Kết quả hiệu giá HI sau khi tiêm cho khỉ các liều khác nhau 58

Bảng
21
Hiệu giá virut các lần cấy truyền chủng NIBRG -14 trên tế bào Vero và
PMKc
61
Bảng
22
Kết quả cấy truyền rgA/H5N1 trên dòng tế bào Vero 64


Danh mục các hình trong báo cáo
Hình Tên hình Trang
Hình 1 Quy trình sản xuất vắc xin Cúm A/H5N1
25
Hình 2 Trình tự nucleotit ở vị trí cắt liên quan đến độc tính của virút
trên đoạn gen HA của virút rgA/H5N1 trong mỗi loạt vắcxin so
với trình tự đó trên gen HA của chủng virut hoang dại
A/VN/1194
36
Hình 3 Thân nhiệt của chồn sau khi gây nhiễm với các chủng virút
rgA/H5N1
38
Hình 4 Hình ảnh gây nhiễm chủng vắcxin rgA/H5N1 trên PMKc sau
72h
41
Hình 5 Hình ảnh tế bào PMKc sau gây nhiễm 72h chủng vắcxin
rgA/H5N1
41
Hình 6 Hình ảnh tế bào PMKc sau khi gây nhiễm 72h với chủng
vắcxin rgH5N1

42
Hình 7 Hình ảnh tế bào PMKc sau khi gây nhiễm 72h với chủng
vắcxin rgA/H5N1
42
Hình 8 Hình ảnh tế bào PMKc sau khi gây nhiễm 72h với chủng
vắcxin rgA/H5N1
43
Hình 9 Kết quả HA và OD280nm của các phân đoạn sau khi siêu ly
tâm
47
Hình 10
Hình ảnh SRID sử dụng 1,2àl huyết thanh khỉ /ml agarose định
lợng HA trong vắcxin Cúm
51
Hình 11 Hình ảnh SRID định lợng HA trong vắcxin Cúm H5N1 55
Hình 12 Hình ảnh tế bào PMKc và Vero sau khi gây nhiễm chủng
NIBRG-14 sau 48h
60
Hình 13 Kết quả PCR nhận dạng NIBRG -14 sau khi cấy truyền 62
H×nh 14 ChØ sè pH trong 15 lo¹t v¾c xin Cóm 66
H×nh 15 Hµm l−îng Protein toµn phÇn trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 67
H×nh 16 Hµm l−îng Formaldehyt (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 67
H×nh 17 Hµm l−îng Thimerosal (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 68
H×nh 18 hµm l−îng Al+++ (g%) trong 15 lo¹t v¾cxin Cóm 68

Bài tóm tắt
Đề tài:
Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm
A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm
1. Mục tiêu chính của đề tài:

1.1. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên
tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm
1.2. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin sản xuất
đợc trên động vật thực nghiệm.
2. Phơng pháp nghiên cứu : Đề tài đã sử dụng phơng pháp di truyền
ngợc (revese genetics) để tạo ra chủng virut tái tổ hợp giảm độc lực
mà vẫn giữ nguyên tính kháng nguyên của chủng gốc
A/VN/1194/2004, có hiệu giá cao. Các phơng pháp kiểm tra chất
lợng chủng là các phơng pháp chuẩn thức do TCYTTG quy định,
đảm bảo yêu cầu của chủng sản xuất vắcxin. Các phơng pháp tinh chế
kháng nguyên hiện đại nh: gặt virut, cô đặc, thẩm tích, tinh khiết, siêu
lọc. cũng đợc áp dụng để sản xuất các loạt vắcxin ở quy mô phòng
thí nghiệm. Các phơng pháp kiểm tra chất lợng vắcxin chuẩn thức
theo quy định của TCYTTG cũng đợc áp dụng để đảm bảo chất lợng
của vắcxin xuất xởng.
3. Các kết quả chính đạt đợc
3.1. Thiết lập hệ chủng gốc và chủng sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1
với đầy đủ các chỉ tiêu kỹ thuật theo quy định
Tạo chủng virút mang gen HA và NA nguồn gốc từ chủng
A/Vietnam/1194/2004 và 6 gen còn lại nguồn gốc từ chủng A/PR8/34
(PR8) bằng kỹ thuật di truyền ngợc đợc thực hiện trên dòng tế bào
PMKc, một dòng tế bào đã đợc sử dụng để sản xuất vắcxin. Lần cấy
truyền thứ 13 đợc lựa chọn làm chủng virút rgA/H5N1 gốc (MSV) và
đời thứ 14 làm chủng sản xuất vắcxin rgA/H5N1. (WSV) đợc cấy
truyền 1 đời từ MSV. Sau khi rgA/H5N1 đợc xác định là không còn
khả năng gây độc và có tính kháng nguyên, chủng virút tái tổ hợp này
đợc sử dụng để sản xuất chủng giống gốc (MSV) và chủng sản xuất
(WSV). Đề tài đã sản xuất đ
ợc 460 ống chủng MSV và 555 ống chủng
WSV. Tất cả các ống chủng này đều đợc lu trữ ở -80C.

3.2. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên
tế bào PMKc
Đã xây dựng đợc quy trình sản xuất đảm bảo chất lợng, ổn định với
các thông số kỹ thuật phù hợp trong quy mô phòng thí nghiệm.
Quy trình sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 quy mô phòng thí nghiệm

Chủng gốc giống

Chủng sản xuất v
ắ
cxin

Gây nhiễm trên tế bào thận khỉ tiên phát 1 lớp

Nuôi cấy 3 ngày, 37
o
C 1
o
C


Gặt -70 1
o
C (đông tan 3 lần)

Ly tâm 5000 rpm, 30 phút, 4
o
C

Nớc nổi (RV)

Bất hoạt formalin 1:2000, 37 1
o
C, 96h

Cô đặc, siêu lọc bằng Millipore Pellicon Cassette

Pha bán thành phẩm cuối cùng


Đóng ống

Dán nhãn, đóng hộp
3.3. Kết quả sản xuất thử nghiệm vắcxin Cúm ở quy mô phòng thí nghiệm

Sản xuất thử nghiệm vắcxin cúm bất hoạt H5N1 từ chủng dự tuyển này
ở quy mô phòng thí nghiệm đợc thực hiện với 26 loạt liên tiếp để đánh
giá tính ổn định của quy trình và chia làm 2 giai đoạn:
o
Giai đoạn I: Nghiên cứu thăm dò các thông số kỹ thuật và tính
khả thi của qui trình sản xuất gồm 6 loạt (từ loạt 010305 đến loạt
050305B);
o Giai đoạn II: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm ở qui mô phòng thí
nghiệm gồm 20 loạt (từ loạt 060405 đến loạt 091006).
3.4. Kiểm tra chất lợng và đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin
Cúm A/H5N1 trên động vật thực nghiệm
Các loạt vắcxin Cúm đợc kiểm tra chất lợng theo quy định của
TCYTTG đối với vắcxin Cúm bất hoạt. Thử nghiệm công hiệu đối với
vắcxin Cúm đợc tiến hành trên cả động vật thực nghiệm và định lợng
HA bằng SRID sử dụng huyết thanh ngời và huyết thanh khỉ.

Các kết quả kiểm tra hóa lý của vắcxin xuất xởng cho thấy đều đạt yêu
cầu về các mặt pH, formaldehyt, thimerosal và nhôm. Từ loạt 010506
trở đi, với quy trình công nghệ ổn định và pha vắcxin dựa vào hàm
lợng HA theo thử nghiệm SRID, hàm lợng protein toàn phần
<50àg/ml đối với các loạt vắcxin có hàm lợng HA là 15àg/ml. Để
đánh giá an toàn chung của vắcxin dự tuyển, mỗi loạt đợc kiểm tra
trên chuột lang, chuột nhắt trắng và thỏ giống nh các vắcxin thông
thờng khác. Kết quả cho thấy tất cả các loạt vắcxin đều đạt yêu cầu
theo tiêu chuẩn quốc gia và của TCYTTG về an toàn chung. Để đánh
giá tính miễn dịch của vắcxin dự tuyển, vắcxin của mỗi loạt đợc tiêm
cho 5 con gà. Các kết quả HI cho thấy liều tiêm hiệu quả cho đáp ứng
miễn dịch ở 50% số gà đợc tiêm dao động từ 8,0 9,66
à
g và ở chuột
nhắt trắng là 5,37 10,0
à
g. Từ loạt 010506 trở đi, do kết quả ổn định
của quy trình sản xuất và áp dụng thử nghiệm SRID để pha vắcxin cùng
một hàm lợng 15
à
g /ml nên kết quả công hiệu rất cao (ED501,1
à
g).
Thêm vào đó, các loạt vắcxin 010305 và 030305 đã đợc xác định khả
năng gây miễn dịch trên khỉ. Sau 3 mũi tiêm, mỗi mũi cách nhau 1
tháng, hiệu giá HI của nhóm tiêm vắcxin là 1:32 1:128 so với nhóm
đối chứng âm.
Kết quả tiêm liều khác nhau trên khỉ cho thấy tại thời điểm 28 ngày
sau khi tiêm mũi 2 tất cả khỉ có đáp ứng miễn dịch > 1:40 (1:40-1:320),
đạt yêu cầu có kháng thể bảo vệ. Liều tiêm thấp nhất (7,5àg/0,5ml)

cũng cho đáp ứng miễn dịch đủ bảo vệ. Các số liệu theo dõi về an toàn
trên khỉ (nhiệt độ, cân nặng, các biểu hiện bệnh lý) cũng chứng tỏ tính
an toàn của vắcxin thử nghiệm.
3.5. Kết quả nghiên cứu thích ứng chủng NIBRG-14 trên dòng tế bào
PMKc, Vero và rgA/H5N1 trên Vero
Từ những kết quả thu đợc cho thấy chủng virút NIBRG-14 đã không
thích ứng đợc trên tế bào Vero cũng nh tế bào thận khỉ tiên phát sau
17 lần cấy truyền. Ngợc lại, kết quả cấy truyền chủng rgA/H5N1 qua
12 đời cho thấy chủng đã thích ứng và có hiệu giá ổn định HA 512-
1024 và hiệu giá virút bằng 10
11
PFU/ml. Với kết quả trên cho thấy
virút rgA/H5N1 bớc đầu đã thích ứng và có khả năng nhân lên cũng
nh sản sinh ra kháng nguyên HA đặc hiệu trên dòng tế bào thờng trực
Vero và có thể khả thi để ứng dụng trong sản xuất vắcxin cúm A/H5N1
trên dòng tế bào thờng trực Vero.
3.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin Cúm A/H5N1 về các mặt
Tiêu chuẩn đề nghị nh sau :
* Formaldehyt : 0,02g%.
* Al
+++
: 1200àg/ml.
* pH 5,5-7,5.
*Protein toàn phần 300
à
g/ml.
*Thimerosal 0,012g%.
*Vô khuẩn : Không phát hiện đợc nấm và tạp khuẩn.
* An toàn chung:
o

Trên chuột lang: Chuột khỏe mạnh, tăng trọng bình thờng
trong thời gian theo dõi.
o Trên chuột nhắt: Chuột khỏe mạnh, tăng trọng bình thờng
trong thời gian theo dõi.
* Chất gây sốt: Tổng nhiệt độ không tăng quá 13/3 thỏ
* Công hiệu (bán thành phẩm): HA 15
à
g/ml
4. Kết luận
1. Xây dựng đợc quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm
A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở qui mô phòng thí nghiệm
đảm bảo tính ổn định và cho hiệu suất cao.
2. Các loạt vắcxin Cúm A/H5N1 sản xuất quy mô phòng thí nghiệm
đã chứng minh đợc tính an toàn và hiệu quả gây miễn dịch trên
thử nghiệm tiền lâm sàng. Thử nghiệm tiêm các liều khác nhau
trên khỉ cho thấy đáp ứng miễn dịch đạt yêu cầu sau 2 mũi tiêm
với liều tiêm từ 7,5
à
g/ml trở lên với hiệu giá HAI 1/40.
5. Những đóng góp mới của đề tài
Đề tài đã xây dựng quy trình công nghệ và sản xuất thành công vắc xin
Cúm A/H5N1 trên tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm. Đây là một thành
công có ý nghĩa to lớn đối với cả trong và ngoài nớc. Vắcxin Cúm
A/H5N1 thử nghiệm thành công trên thực địa lâm sàng sẽ đem lại khả
năng phòng chống đại dịch nếu xẩy ra.


1
Đặt vấn đề
Dịch Cúm gia cầm độc lực cao týp A/H5N1 xuất hiện từ giữa tháng

12/2003 tại Hàn Quốc và lan rộng ra một số nớc châu á hiện nay đang là
mối quan tâm lo ngại hàng đầu. Chủng virút týp A/H5N1 đợc xác định là có
khả năng lan truyền sang ngời từ năm 1997 và xuất hiện ở Việt Nam từ
tháng 1/2004. Sự lan truyền trong loài chim, gia cầm và thủy cầm làm tăng
khả năng lây truyền trực tiếp sang ngời. Nếu có càng nhiều ca bệnh trên
ngời xẩy ra, càng nhiều nguy cơ nhiễm đồng thời chủng virút Cúm ngời và
Cúm gia cầm trên ngời, dẫn đến nguy cơ tạo ra biến chủng mới có khă năng
lây truyền dễ dàng từ ngời sang ngời.
Chủng virút cúm týp A/H5N1 là mối nguy cơ đặc biệt đối với sức
khỏe con ngời vì hai lý do. Thứ nhất, virút cúm týp A/H5N1 là tác nhân
gây bệnh trên gia cầm nhng có khả năng truyền trực tiếp từ gia cầm sang
ngời. Thứ hai, virút cúm týp A/H5N1 gây bệnh với tỷ lệ tử vong rất cao trên
ngời. Tất cả những lý do đó làm cho virút cúm týp A/ H5N1 trở nên đặc
biệt nguy hiểm với nguy cơ xẩy ra đại dịch nghiêm trọng.
Số các trờng hợp nhiễm Cúm gia cầm týp A/H5N1 trên ngời đã đợc
xác định tính đến thời điểm 23/2/2007 là 274 theo số liệu của WHO, trong
số đó có 167 ca tử vong. Số mắc/số chết tại Việt Nam cho đến thời điểm báo
cáo là 93/42.
Đặc điểm dịch tễ học nhiễm virút Cúm týp A/H5N1 tại Việt Nam
đợc thông báo với 3 đợt dịch:
(1) Đợt 1: Từ 26/12/2003 đến 10/3/ 2004, có 16 trờng hợp tử vong
trong 23 ca bệnh đợc xác định (Tỷ lệ tử vong/ ca bệnh (CFR) là
69,9%);
(2) Đợt 2: Từ 19/7/2004 đến 26/8/2004, có 4 ca bệnh và tất cả đều tử
vong (CFR 100%); v
(3) Đợt 3: Từ 16/12/2004 đến 1/11/2005, 21 trờng hợp tử vong trong 64
ca bệnh đợc xác định (CFR 32,8%).
Việc phát triển vắcxin phòng cúm A/H5N1 cho ngời là một yêu cầu
cấp bách đặt ra. Trong điều kiện xẩy ra đại dịch Cúm, việc sử dụng vắcxin và
thuốc kháng virút là hai biện pháp hữu hiệu nhất có thể làm giảm tỷ lệ mắc

và tỷ lệ chết.

2
Ngay sau khi virút cúm A/ H5N1 đợc phân lập ở các bệnh nhân tại Việt
Nam, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển vắcxin cúm A/H5N1 tại
Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH), Viện Vệ Sinh Dịch Tễ
TW (NIHE), Hà Nội. Kỹ thuật di truyền ngợc đã đợc ứng dụng để tạo
chủng cúm A/H5N1 giảm độc lực dùng cho sản xuất vắcxin từ chủng virút
H5N1 có độc tính cao (A/Vietnam/1194/2004) với sự giúp đỡ và hợp tác của
Khoa Virút- Viện Y khoa- Đại học Tokyo- Nhật Bản, dới sự chỉ đạo của
giáo s Yoshihiro Kawaoka.
Nghiên cứu này đợc tiến hành với 2 mục tiêu chính:
1. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên tế
bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm
2. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin sản xuất
đợc trên động vật thực nghiệm.

3
Phần 1
Tổng quan
1.1. Đặc điểm chung của virút cúm
Các virút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là những chủng virút có hệ
gen dạng sợi đơn ARN (-) gồm 8 phân đoạn lần lợt mã hoá cho các protein
PA, PB1, PB2, NS, M, NP, HA, NA của virút (cúm A, B). Họ
Orthomyxoviridae gồm 4 giống: Virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C, và
Thogovirus. Virút Cúm B và C thờng chỉ gây nhiễm cho ngời trong khi
phần lớn virút Cúm A gây nhiễm trên gia cầm và chỉ có một vài phân týp gây
nhiễm cho ngời và các động vật khác nh lợn, ngựa. Virút Cúm A, B và C
khác nhau về tính kháng nguyên của nucleocapsit (NP) và protein Matrix
(M). Trong đó virút cúm A lại đợc chia thành các phân týp dựa theo cấu

trúc kháng nguyên của haemagglutinin (HA) và neuramidaza (NA)
glycoprotein. Chủng virút Cúm đợc đặt tên theo nguồn gốc phân lập, vùng
địa lý phân lập, số chủng, năm phân lập. Đồng thời tên chủng virút cũng nói
lên phân týp kháng nguyên haemagglutinin (HA) và neuraminidaza (NA)
của chủng đó (ví dụ A/Vietnam/1194/2004 (H5N1). Có 16 phân týp HA và 9
phân týp NA; các phân týp khác nhau ít nhất 30% trình tự axít amin. Từ năm
1983 đến nay, không có thêm phân týp mới nào đợc phát hiện, điều này cho
thấy có một số giới hạn về sự biến chủng của virút cúm A [1].

1.2. Cấu trúc virion
Thành phần của các virút trong họ Orthomyxoviridae bao gồm 1%
ARN, 70% protein, 20% lipit và 5 đến 8% carbonhydrat [2]. Lớp màng lipit
của virỳt Cúm đợc tạo thành từ màng bào tơng của tế bào chủ nơi virút
nhân lên [2]. Virút Cúm A và B có cấu trúc giống nhau trong khi virút Cúm
C có cấu trúc khác biệt với các gai glycoprotein sắp xếp theo hình 6 cạnh.
Virút Cúm A và B nuôi cấy trên tế bào hoặc trứng có hình dạng thông thờng
đờng kính 80-120 nm. Ngợc lại, virút Cúm phân lập từ ngời và động vật
sau đó đợc cấy truyền một lần trên tế bào thờng có hình thái khác biệt và
đa dạng. Hình thái virút Cúm A là một kiểu gen riêng biệt [3] nhng phụ
thuộc rất nhiều vào loại tế bào chủ khi virút nhân lên [4].
Đặc điểm hình thái nổi bật của virion Cúm A là lớp bao gồm 500 gai
(10-14 nm) xòe ra phía ngoài lớp lipit. Có 2 loại gai khác nhau: Gai hình gậy

4
là kháng nguyên HA và gai hình nấm là kháng nguyên NA. Tỷ lệ HA:NA
thờng dao động nhng thông thờng từ 4:1 cho đến 5:1. Protein matrix M1
đợc cho là nằm dới lớp lipit kép và liên kết với Ribonucleoprotein (RNP)
lõi của virút. M1 là protein có nhiều nhất trong virion.
Bằng phơng pháp cắt lớp mỏng tiêu bản có các hạt virút hoặc phá vỡ
hạt, cấu trúc RNP có thể đợc chia thành nhiều lớp có kích thớc khác

nhau và chứa 8 đoạn gen của ARN đơn [5].
Các RNP có chứa 4 loại protein và ARN. NP là protein tiểu đơn vị nổi
trội của nucleocapsit và bao quanh ARN, có khoảng 20 nucleotit trong 1 tiểu
đơn vị NP. Liên kết với RNP là phức hợp ARN polymeraza phụ thuộc
ARN bao gồm 3 polymeraza protein PB1, PB2, PA và chỉ có mặt từ 20-30
bản sao trong một virion [6,7]. Các polymeraza protein chịu trách nhiệm gắn
mũ, endonucleaza, tổng hợp ARN, polyadenyl hóa [6, 7, 8, 9, 10].
Protein NS
2
là protein thứ hai do đoạn ARN 8 mã hóa, có khoảng 130-
200 phân tử trong 1 virion và tạo thành phức hợp với protein M1 [11,12] là
mối liên kết cần thiết trong chu trình sống của virỳt để giải phóng phức hợp
RNP từ nhân [13].

1.3. Cấu trúc hệ gen virút Cúm và các protein mã hóa
Hệ gen của virút Cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi virút Cúm C có
7 đoạn gen (không có gen NA). Cấu trúc hệ gen của virút Cúm đã đợc tìm
hiểu nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN virút trên gen polyacrylamit
[14, 15, 16, 17, 18, 19, 20]. Cấu trúc gen của virút Cúm nh sau: Đoạn gen 1
mã hóa cho PB2, đoạn 2 cho PB1, đoạn 3 cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5
cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2.
Trình tự nucleotit của ARN virút Cúm PR8/34 và rất nhiều phân týp khác đã
đợc công bố từ năm 1982 [21]. Virút Cúm PR8/34 có 13.588 nucleotit.

5
Bảng 1. Các đoạn ARN trong hệ gen virút Cúm A và các protein mã hóa
(Trích dẫn từ Fields Virology, Ed. David M. Knipe et al, Volume 1, Fourth
edition, 2001, Lippincott William &Wilkins)
Đoạn gen Chiều dài
(nucleotit)

Polypeptit
mã hóa
Chiều dài
chuỗi
polypeptit
(axit amin)
Trọng
lợng phân
tử ớc tính
(dalton)
Số phân tử
trên 1
virion
1 2341 PB2 759 85 700 30-60
2 2341 PB1 757 86 500 30-60
3 2233 PA 716 84 200 30-60
4 1778 HA 566 61 468 500
5 1565 NP 498 56 101 1000
6 1413 NA 454 50 087 100
7 1027 M1
M2
Peptit nhỏ 9-
10 axit amin
252
97
9 ( ?)
27 801
11 010
-
3000

20-60
-
8 890 NS1
NS2
230
121
26 815
14 216
-
130-200

Đoạn ARN đơn của virút Cúm C mã hóa cho protein liên kết
haemaglutinin-esteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor),
hoạt động hòa màng của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở virút
Cúm A và B những hoạt tính này do các đoạn gen riêng biệt mã hóa. Chiều
dài của các đoạn gen và các protein mã hóa đợc liệt kê trong bảng 1. Đoạn
gen ngắn không mã hóa ở mỗi đầu bao gồm chuỗi 11-13 nucleotit tại đầu 5
và 9-12 nucleotit tại đầu 3 có tính ổn định cao hơn so với các đoạn gen khác
và giống nhau ở cả 3 loại virút Cúm A, B và C [22, 23, 24].
Ba gen lớn nhất mã hóa cho các thành phần của ARN polymeraza
PB1, PB2 và PA của virút A [25] và virút Cúm B, C [26]. Đoạn gen 1 và 2
đều dài 2.341 nucleotit mã hóa cho protein PB2 gồm 759 axit amin và PB1
757 axit amin. Đoạn gen 3 dài 2.233 nucleotit mã hóa cho protein PA có 716
axit amin.
NP là protein cấu trúc chính phối hợp với các đoạn ARN tạo thành
RNP. NP còn là kháng nguyên đặc hiệu týp, khác nhau giữa virút Cúm A, B
và C. NP đợc đoạn ARN 5 dài 1.565 nucleotit mã hóa [27]. NP chứa 498
axit amin và có trọng lợng phân tử 56.101 dalton. NP của virút Cúm B chứa
560 axit amin và tơng đồng 47% so với virút Cúm A trong khi NP của virút
Cúm C có 565 axit amin và có một số vùng tơng đồng với virút Cúm A và B

[28].

6
Tên gọi của protein HA (haemagglutinin) xuất phát từ khả năng ngng
kết hồng cầu của virút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit
sialic. HA có 3 vai trò quan trọng trong quá trình sao chép virút:
1. HA gắn với thụ thể có chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và
tạo thành s gắn kết giữa virút và tế bào.
2. HA chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập của virút vào tế bào
bằng cách gián tiếp tạo nên sự hòa màng endocytosed của
virút và màng nội bào làm cho nucleocapsit virút giải phóng
vào trong bào tơng.
3. HA là kháng nguyên chính tạo nên kháng thể trung hòa và
các vụ dịch Cúm đều liên quan đến sự thay đổi cấu trúc
kháng nguyên.
Đoạn ARN 4 có chiều dài từ 1.742 đến 1.778 nucleotit và mã hóa cho
562 đến 566 axit amin. HA do đoạn ARN 4 mã hóa và đợc tổng hợp trên
ribosom gắn màng và di chuyển vào lumen của lới nội chất (ER) tế bào bị
nhiễm nh là polypeptit đơn HA
0
(trọng lợng phân tử 76.000 dalton). Phụ
thuộc vào phân týp virút, loại tế bào chủ và điều kiện nuôi cấy HA tồn tại cả
hai dạng: Dạng tiền thân không phân tách HA
0
hoặc dạng phân tách với hai
chuỗi có cầu nối disulfit (HA
1
có trọng lợng 47,000 dalton và HA
2
- 29.000

dalton). Qúa trình phân tách là điều kiện quyết định để virút có khả năng
gây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khả năng lây truyền [29].
HA chính là đoạn gen đầu tiên của virút Cúm đợc xác định trình tự [30].
HA
1
có từ 319 đến 326 axit amin và HA
2
có từ 221 đến 222 axit amin. Tùy
thuộc vào các phân týp HA, số lợng các axit amin bị phân tách giữa HA
1
và
HA
2
là 1 đến 6. HA nguyên vẹn có thể tách chiết từ hạt virion virút Cúm
hoặc từ tế bào bị nhiễm bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy bị loại bỏ,
vùng transmembrane kỵ nớc kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị. Tuy
nhiên, xử lý virút bằng promelin sẽ giải phóng ra HA bảo toàn tính kháng
nguyên và cấu trúc 3 chiều, có khả năng hòa tan trong nớc và chứa toàn bộ
HA
1
cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221 axit amin của HA
2
[31,
32]. Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu đơn vị phân
tử. Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân týp (Tyr -98, Trp -
153, His -183, Glu 190, Leu 194) [33, 34, 35]. Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ
thể khác nhau giữa khí quản ngời ( 2, 6), hệ tiêu hóa gia cầm ( 2, 3) và
khí quản lợn ( 2, 3 và 2, 6), số lợng các phân tử HA có thể chuyển từ
loài này sang loài khác có thể bị giới hạn [36]. Sự phân tách HA
o

thành HA
1

và HA
2
là cần thiết để chuyển dạng pH thấp và do vậy cần thiết đối với hoạt
tính gây nhiễm của virút [37, 38]. Những HA đó đều chứa chuỗi R-X-K/R-

7
R ở cầu nối peptit và đợc phân tách trong tế bào bằng furin, một proteaza
của mạng trans-Golgi [39, 40]. Đoạn HA chỉ có arginine đơn ở cầu nối
peptit không bị phân tách khi nuôi cấy trên tế bào (trừ chủng A/WSN/33)
nhng sẽ bị phân tách bởi trypsin ngoại sinh. Khi nuôi cấy trên trứng gà có
phôi, HA có arginine đơn ở cầu nối peptit sẽ bị phân tách có thể do yếu tố
proteaza giống Xa [41]. Nhiều nghiên cứu cho rằng vị trí phân tách có liên
quan đến độc tính virút và chủng virút độc lực có chứa kiểu nhận biết furin
trong khi chủng virút không độc lực chỉ chứa arginine đơn [42, 43, 44, 45].
Tuy nhiên cũng có một số chủng cúm H5 không độc lực có vị trí nhận biết
furin. Những chủng không độc lực này có chuỗi oligosaccharit ở gần vị trí
phân tách, điều này có thể ảnh hởng tới hoạt tính của proteaza khi phân
tách và chuỗi này không tìm thấy ở những chủng H5 độc lực [46, 47].
Trong các chủng virút Cúm ngời chỉ có A/WSN/33 có khả năng nuôi
cấy trên nhiều loại tế bào mà không cần có trypsin và các nghiên cứu về hệ
gen đã cho thấy NA của WSN cần thiết cho sự phân tách HA của WSN [48,
49].
NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân týp của virút Cúm A, B.
NA do đoạn gen ARN thứ 6 mã hóa. NA là một homotetramer. NA quan
trọng do cả hoạt tính sinh học loại bỏ axit sialic từ glycoprotein và là quyết
định nguyên chính ảnh hởng đến sự thay đổi tính kháng nguyên. NA có thể
cho phép vận chuyển virút qua màng mucin ở trên đờng hô hấp, giúp hỗ trợ

virút tấn công tế bào biểu mô đích. Đoạn gen ARN 6 của A/PR/8/34 đoạn
gen ARN 6 có 1413 nucleotit mã hóa cho 453 axit amin.
Đoạn ARN thứ bẩy mã hóa cho 2 protein M1 và M2. Đoạn có 1027
nucleotit mã hóa cho M1 có 252 axit amin, trọng lợng phân tử 27.801
dalton [50, 51, 52]. M1 là kháng nguyên đặc hiệu týp của virút Cúm và có
tính ổn định giữa các phân týp [53]. Protein M2 có hoạt động kênh trao đổi
ion nhờ hoạt hóa pH. Kênh này đợc chặn đặc hiệu bởi thuốc kháng virút
Cúm amantadin. Hoạt động của kênh ion cần thiết cho việc bỏ lớp ngoài của
virút trong khoang nội bào của tế bào bị nhiễm. Đột biến của vùng M2 liên
quan đến việc kháng amantadin [54].
Đoạn ARN 8 của virút Cúm A, B và đoạn ARN 7 của virút Cúm C mã
hóa cho 2 loại protein NS1 và NS2. NS1 protein có trọng lợng phân tử
26.000 dalton. NS1 là protein đa chức năng trong chu trình sống của virút
Cúm. NS2 protein có trọng lợng phân tử 11.000 tồn tại trong virion (130-
200 phân tử) và tạo thành phức hợp với M1.



8
1.4. Sự tái tổ hợp của virút Cúm
Virút Cúm A, B, C có thể tái tổ hợp trong tự nhiên giữa các thành viên
cùng týp nhng không xẩy ra giữa các týp khác nhau. Sự xuất hiện của
chủng đại dịch là hậu quả của việc tái tổ hợp tạo ra chủng phân týp mới có
NA hoặc HA khác hẳn với chủng lu hành trớc đó. Trong thế kỷ 20 có sự
xuất hiện của Cúm Tây Ban Nha năm 1918-1919 có HA liên quan đến
chủng virút của lợn và phân týp H1. Virút này lu hành đến năm 1957 cho
đến khi đợc thay thế bởi phân týp H2N2 (chủng châu á). Chủng H2N2 lu
hành trong 11 năm và đợc thay thế bởi phân týp H3 mới (chủng Hồng
Kông) trong đại dịch tiếp theo năm 1968 [55]. Năm 1976 chủng H1N1 lu
hành trở lại và năm 1997-1998 đã xuất hiện chủng Cúm gia cầm độc lực H5

lây truyền từ chim sang ngời tại Hồng Kông. Sự đột biến trong gen HA và
NA có thể gây ra các thay đổi nhỏ về đặc tính kháng nguyên.
Virút Cúm B khác với virút Cúm A là không có ổ chứa động vật. Mặc
dù virút Cúm B nguyên thủy thích ứng trên ngời dễ dàng hơn virút Cúm A
nhng tỷ lệ đột biến và thay đổi chỉ bằng một nửa virút Cúm A [56, 57, 58].
Có nhiều bằng chứng cho rằng virút Cúm trong loài thủy cầm lây
truyền cho lợn, ngựa, gia cầm và động vật có vú ở biển; gây nên những vụ
dịch nghiêm trọng [59]. Năm 1989 đã có một vụ dịch lớn xẩy ra trên đàn
ngựa của tỉnh Jilin và Heilongjiang, Trung Quốc do virút Cúm H3N8 có cấu
trúc kháng nguyên giống virút H3 của gia cầm. Có những bằng chứng cho
rằng các vụ đại dịch Cúm trên ngời ở thế kỷ này có nguồn gốc từ gia cầm
và lây truyền qua lợn sang ngời sau khi tái tổ hợp với chủng Cúm ngời
đang lu hành.
Cả hai chủng đại dịch Asian/57 (H2N2) và Hong Kong/68 (H3N2)
đều đợc tạo thành do tái tổ hợp. Chủng đại dịch 1957 có 3 gen (PB1, HA và
NA) từ hỗn hợp gen Cúm gia cầm do tái tổ hợp tạo thành trên vịt trời và giữ
nguyên 5 gen khác từ chủng Cúm ngời đang lu hành [60]. Sau khi chủng
Asian xuất hiện, chủng H1N1 biến mất trên ngời. Năm 1968 chủng đại dịch
Hồng Kông có 2 gen (PB1 và HA) từ vịt do tái tổ hợp và giữ 6 gen từ chủng
Cúm ngời đang lu hành.
Virút Cúm gia cầm không lan truyền trên quần thể ngời và ngợc lại,
virút của ngời không lây truyền sang quần thể chim, điều này cho thấy hàng
rào loài giữa chim và ngời rất chặt chẽ. Tuy nhiên, nhiều bằng chứng cho
thấy loài lợn có thể cảm nhiễm dễ dàng với cả hai loại virút Cúm ngời hoặc
gia cầm [61, 62] và hàng rào loài giữa lợn và gia cầm hoặc giữa lợn và ngời
lỏng lẻo hơn nhiều, vì vậy, lợn có thể đóng vai trò nh là vật chủ trung gian