Nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử ADN nhằm xác định gen CMS, gen duy trì, gen phục hồi phục vụ chọn tạo giống lúa lai ba dòng

Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Lúa lai là một trong những thành tựu to lớn của các nhà khoa học trong
việc tăng năng suất cây trồng giải quyết vấn đề an ninh lương thực.
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học thì lúa lai có thể tăng năng suất lên
20% - 30% so với lúa thường. Vì vậy nhiều nước trên thế giới đã đưa lúa lai vào
sản xuất đại trà. Trung Quốc là nước đầu tiên đưa lúa lai vào sản xuất và đã đạt
được những thành tựu đáng kể. Nhận thấy được vai trò của việc sản xuất lúa lai
nên trong những năm gần đây các nhà khoa học nước ta đã đầu tư rất nhiều công
sức nghiên cứu và phát triển lúa lai. Sản xuất và phát triển lúa lai đã trở thành
một chương trình chiến lược trong việc tăng năng suất lúa ở nước ta.
Hiện nay trên thế giới cũng như ở nước ta có hai hệ thống sản xuất lúa lai
chủ yếu là: hệ thống lúa lai hai dòng mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và hệ thống
lúa lai ba dòng bất dục đực tế bào chất. So với lúa lai hai dòng thì lúa lai ba dòng
ổn định hơn ít biến động với điều kiện môi trường. Nó rất thuận lợi đối với một
nước có điều kiện tự nhiên như nước ta. Chính vì vậy từ lâu hệ thống lúa lai ba
dòng đã được nghiên cứu và sản xuất rộng rãi trên thế giới.
Để có được những tổ hợp có ưu thế lai cao thì cần có sự đa dạng về các
dòng bất dục, dòng duy trì, dòng phục hồi.
Để chọn tạo được các dòng này bằng các phương pháp truyền thống như:
Lai chuyển gen, đánh giá đời con…thì tốn rất nhiều thời gian và công sức và
thường đem lại hiểu qủa không cao.
Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học đặc biệt là
kỹ thuật phân tử ADN (Chỉ thị phân tử) đã đem lại hiệu quả cao trong công tác
chọn tạo giống.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
1
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
Xuất phát từ thực tiễn là nhanh chóng tạo đựơc các dòng bất dục, dòng
duy trì, dòng phục hồi chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu, ứng dụng chỉ

thị phân tử ADN nhằm xác định gen CMS, gen duy trì, gen phục hồi phục vụ
chọn tạo giống lúa lai ba dòng ”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
- Xác định gen duy trì, gen phục hồi, gen CMS trong các dòng, giống lúa
địa phương.
- Xác định marker – PCR cho một số gen CMS, gen duy trì, gen phục hồi
nhất định.
1.2.2. Yêu cầu
- Tạo được nhiều tổ hợp lai giữa các dòng lúa bất dục với các giống lúa
địa phương.
- Nghiên cứu khả năng bất dục, hữu dục hạt phấn của các tổ hợp F1 để
chọn dòng có khả năng duy trì, phục hồi hữu dục.
- Tìm được các marker nghiên cứu.
- Đo đếm đánh giá một số tính trạng, chỉ tiêu nông sinh học.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
2
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hiện tượng ưu thế lai ở lúa
2.1.1. Khái niệm
Ưu thế lai là hiện tượng quần thể con lai F1 thu được khai lai hai bố mẹ
không giống nhau về mặt di truyền tỏ ra hơn hẳn so với cả hai bố mẹ về sức sinh
trưởng, sức sống, khả năng sinh sản khả năng chống chịu với các điều kiện bất
thường, khả năng thích nghi, năng suất hạt, chất lượng hạt và các đặc tính khác
nữa [10].
2.1.2. Cơ sở di truyền của ưu thế lai
Từ khi biết đến ưu thế lai các nhà di truyền học đã bắt tay ngay vào việc
tìm hiểu cơ sở di truyền của nó. Đến nay đã có rất nhiều giả thuyết được đưa ra
để giải thích hiện tượng ưu thế lai và các giả thuyết được nhiều người thừa nhận

nhất đó là:
Giả thuyết tính trội
Theo giả thuyết này thì trong quá trình tiến hoá, các tính trạng có lợi
thường do gen trội quy định, còn các tính trạng không có lợi do gen lặn quy định.
Ở con lai F1 chứa nhiều gen trội có lợi nhất hơn cả bố mẹ vì F1 có độ dị hợp tử
cao nhất về các cặp gen, nên các gen trội lấn át hoàn toàn các gen lặn trong cùng
locus trên NST tương đồng làm cho con lai F1 có ưu thế lai hơn hẳn hai bố mẹ.
VD: Khi lai AAbbCCdd với aaBBccDD cho con lai có kiểu gen
AaBbCcDd nên cho ưu thế lai hơn bố mẹ rõ rệt.
Giả thuyết siêu trội
Theo giả thuyết này thì không có hiệu ứng trội cũng như hiệu ứng lặn giữa
các alen.Do vậy, biểu hiện của ưu thế lai không phải do hiệu ứng trội mà là do sự
phân hoá khác nguồn của các alen. Giữa alen trội và lặn trong cặp gen dị hợp có
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
3
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
sự tác động tương hỗ lẫn nhau. Điều này làm cho cơ thể có kiểu gen dị hợp sẽ có
sức sống hơn hẳn cơ thể mang kiểu gen đồng hợp tử trội lẫn đồng hợp tử lặn
(AA < Aa > aa).
Giả thuyết cân bằng di truyền
Theo giả thuyết này thì mỗi cơ thể sinh vật có một trạng thái cân bằng di
truyền do các gen trong nhân quy định và có vai trò tác động của tế bào chất. Khi
lai giữa hai cơ thể khác nhau sẽ tạo nên một cân bằng mới thích ứng hơn cân
bằng cũ nên có nhiều tính trạng mới tốt hơn ở bố mẹ.
2.1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa lai ba dòng trên thế giới
Hiện tượng con lai hơn hẳn bố mẹ đã được loài người biết đến từ lâu.
Khoảng 584 năm trước Công nguyên người ta đã biết lai lừa với ngựa để tạo ra
con la có sức khoẻ như ngựa và dẻo dai như lừa. Nhân dân vùng Trung du Bắc
bộ từ thời Lê đã biết tạo con lai giữa vịt và ngan lớn nhanh có thịt thơm ngon.
Theo tài liệu chính thức thì ưu thế lai đã được I. G. Kolreiter phát hiện mô tả và

ứng dụng ở cây thuốc lá vào năm 1760, ở cây ngô đã được Beall (1878) mô tả và
Shull (1904) ứng dụng thành công [2].
Ở cây lúa J. W. Jones là người đầu tiên báo cáo về sựu xuất hiện ưu thế lai
trên các tính trạn số lượng và năng suất. Sau Jones có rất nhiều công trình nghiên
cứu xác nhận sự xuất hiện ưu thế lai về năng suất và các yếu tố cấu thành năng
suất (Anomymous- 1977, Li- 1977) về tích luỹ chất khô (Rao- 1965, Jenning-
1967 ) về các đặc tính sinh lý (cường độ quang hợp, diện tích lá ) và về các
đặc tính chống chịu (chịu rét, hạn, chống bệnh, chịu sâu ). Các công trình
nghiên cứu này khẳng định khai thác ưu thế lai ở lúa là một hướng rất có triển
vọng [3].
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
4
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
Lúa là cây tự thụ phấn điển hình, khả năng nhận phấn ngoài rất thấp, bởi
vậy việc sản xuất hạt lai gặp rất nhiều khó khăn. Đã có rất nhiều nhà khoa học
nghiên cứu vấn đề sản xuất hạt lai thương phẩm như: Các nhà khoa học Ấn Độ
(Kadam- 1937, Richaria- 1962 ), các nhà chọn giống người Mỹ (Stansel và
Craigmiles- 1966, Cranahan và cộng sự- 1972), Nhật Bản (Shinjyo và Omura-
1966), Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI có (Athwall và Virmani- 1972). Tuy
nhiên vẫn chưa có phương pháp thích hợp để sản xuất hạt lai [22].
Trung Quốc bắt đầu nghiên cứu với lúa lai muộn hơn nhưng là nước đầu
tiên trên thế giới áp dụng thành công ưu thế lai trong sản xuất đại trà.
Những năm đầu thập niên 60 của thế kỷ trước Yuan Long Ping và cộng sự
đã phát hiện được cây lúa bất dục trong loài lúa dại: Oryza fatua spontanea tại
đảo Hải Nam. Sau 9 năm lai lại liên tục với các dạng lúa trồng họ đã thành công
trong việc chuyển gen bất dục đực tế bào chất vào lúa trồng (Oryza sativa) và tạo
ra đựơc các dòng bất dục đực di truyền tế bào chất có các đặc điểm nông sinh
học quý tương đối ổn định. Năm 1973 đã sản xuất được lô hạt giống F1 đầu tiên
với sự tham gia của 3 dòng bố mẹ là: Dòng bất dục đực tế bào chất (Cytoplasmic
Male Sterile- CMS, dòng A), dòng duy trì bất dục (Maintaiiner line, dòng B),

dòng phục hồi hữu dục (Restores line, dòng R). Năm 1974, Trung Quốc đã đưa
ra nhiều tổ hợp lúa lai có ưu thế lai cao; năm 1975, đưa ra quy trình sản xuất hạt
lai “3 dòng”; năm 1976 đã sane xuất đủ lượng hạt lai F1 để gieo cấy trên diện
tích 140.000 ha. Năm 1990, đã cấy thêm được 5 triệu ha lúa lai thương phẩm và
năm 1996, đã đưa diện tích lên tới 17,6 triệu ha chiếm 55% tổng diện tích gieo
cấy cả nứơc. Năng suất lúa lai cao hơn lúa thuần khoảng 30%. Trên diện tích hẹp
(0,1 ha) lúa lai đạt năng suất kỷ lục là 16,8 tấn/ha/vụ và 23 tấn/ha/2 vụ [2].
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
5
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
Hiện nay, kỹ thuật sản xuất lúa lai của Trung Quốc đã phát triển ở mực độ
cao. Năng suất hạt lai F1 trung bình 2,5 tấn/ha trên phạm vi cả nước. Nhiều dòng
CMS có tỷ lệ thụ phấn chéo cao từ 85-90% như II-32A, ZhiA, You-IA và có
phẩm chất tốt đã được tạo ra [23]. Kể từ khi tổ hợp lúa lai đầu tiên là Nan You
được tạo ra năm 1974 và được đưa vào sản xuất đại trà năm 1976 đến nay đã có
hơn 100 tổ hợp được trồng với diện tích lớn. Các tổ hợp lúa lai ba dòng Indica
của Trung Quốc chủ yếu thuộc vào các hệ như Wei You (dòng mẹ là V20A)
gồm Wei You 64, Wei You 77, hệ Shan You, Quế You 99 ,hệ Bo You (dòng
mẹ là BoA) gồm Bo You 64, Bo You Quế 99B; Hệ Kim You (dòng mẹ là Kim
32 A) bao gồm Kim You 77, Kim You Quế 99, ngoài ra còn một số hệ mẹ khác
như ZhiA, XieA, You IA.
Nhiều dòng CMS tốt đã được tạo ra trên nền di truyền của các giống thuộc
Viện nghiên cứu lúa IRRI, các giống có nguồn gốc từ Hàn Quốc và Ấn Độ. Các
dòng IR54752A, IR54753A và IR54754A thích ứng tốt với điều kiện nhiệt đới ,
có khả nằng kết hợp cao và tỷ lệ thụ phấn chéo đảm bảo. Các dòng này đã được
sủ dụng để tạo ra hạt lai F1.
Qua hơn 30 năm nghiên cứu và phát triển Trung Quốc đã tạo ra được hơn
600 dòng bất dục đực tế bào chất (dòng A) và dòng duy trì tương ứng (dòng B),
hơn 3000 dòng phục hồi để tạo ra nhiều tổ hợp lai trong đó có hơn 200 tổ hợp
được gieo trồng phổ biến ngoài sản xuất.

Ở Hàn Quốc (theo Moon-1998; Moon và cộng sự- 1994) dự án hợp tác
nghiên cứu với IRRI đã đóng vai trò đáng kể trong sự phát triển lúa lai. Nhiều tổ
hợp lúa lai ba dòng đã được tạo ra và đạt năng suất từ 9-12 tấn/ha vượt trung
bình 21% so với lúa thuần tốt nhất. Ví dụ như tổ hợp V20A/Miyang 46,
V20A/Suweon 294, HR1619A/Iri362, IR54756A/ Iri362
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
6
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
Ấn Độ bắt đầu nghiên cứu lúa lai từ những năm 1970. Tuy nhiên phải đến
năm 1989, nhờ sự ủng hộ của Nhà nước và các tổ chức quốc tế (IRRI, FAO)
chương trình nghiên cứu, phát triển lúa lai mới được tăng cường. Vụ mùa năm
1996, Ấn Độ trồng được trên 60.000 ha lúa lai. Từ 1994 - 1996, 6 giống lúa lai
ba dòng của các cơ quan nghiên cứu thuộc khu vực nhà nước đã được công nhận
và đưa vào sản xuất đại trà. Đó là các giống: APHR-1, APHR-2, MGR-1, KRH-
1, CNRH-3 và DRRH-1. Các tổ hợp này cho năng suất cao hơn lúa thường từ 16
- 44% (Siddiq- 1996). Năm tổ hợp lúa lai của các công ty tư nhân cũng đã được
chấp nhận và được trồng trên diện tích rộng, đó là các tổ hợp: PHB71, 6201,
6027, MPH516 và MPH517. trong đó tổ hợp 6201 đã được trồng thử nghiệm ở
miền Bắc Việt Nam và đạt năng suất 7,2 tấn/ha. Hiện nay kỹ thuật sản xuất hạt
giống lúa lai ở F1 của Ấn Độ đã đạt được những thành tựu bước đầu. Năng suất
hạt F1 là 1,5 – 2,0 tấn/ha trên diện tích rộng.
Theo Suprihatno và cộng sự (1994), Indonesia bắt đầu nghiên cứu lúa lai
từ năm 1983. Đầu tiên là việc đánh giá và sử dụng nhiều dòng CMS vào chương
trình chọn tạo giống lúa lai ba dòng. Các tổ hợp lúa lai IR58025A/BR827,
IR58025A/IR53942, IR58025A/IR54852 đã được tạo ra và thử nghiệm ở
Kuningham, tổ hợp IR62829/BR736 đạt 8,09 tấn/ha, cao hơn IR64 là 18%. Năm
1996, ở Tegalgondo (Trung Java) và Kuningan (Tây Java), tổ hợp
IR58025A/IR53942 cao hơn giống lúa thuần mới công nhận Membaramo tương
ứng là 17 và 27%. Ngoài ra, ở một số nước khác như Nhật Bản, CHDCND
Triều Tiên, Philipin, Malaisia, Thái Lan

2.1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa lai ba dòng ở Việt Nam
Việt Nam bắt đầu nghiên cứu lúa lai vào năm 1980 tại Viện Khoa học kỹ
thuật Nông nghiệp, Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long và Viện Di truyền Nông
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
7
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
Nghiệp. Nguồn vật liệu bố mẹ chủ yếu nhập nội từ IRRI, tuy nhiên những nghiên
cứu này mới ở giai đoạn tìm hiểu. Bước đầu chúng ta chỉ đánh giá các dòng
CMS, xây dựng các quy trình sản xuất hạt lai F1 và đánh giá ưu thế lai để tìm
những tổ hợp lai có triển vọng. Đến năm 1992, chương trình nghiên cứu lúa lai
quốc gia mới thực sự được hình thành [2].
Năm 1990, bộ Nông nghiệp đã nhập một số tổ hợp lúa lai từ Trung Quốc
gieo trồng thử trong vụ xuân ở đồng bằng Bắc bộ. Cụ thể từ năm 1989 đến năm
1991 đã có một số tổ hợp cao hơn lúa thường từ 15 – 40% như IR62829/Pusan
đạt 9,05 tấn/ha. Một số giống lúa lai hệ 3 dòng nhập nội từ Trung Quốc như
Shan ưu 63, Bắc ưu 903, Nhị ưu 63 đã cho năng suất cao hơn lúa thuần từ 13 –
30 %. Một số dòng CMS được đánh giá có tính bất dục hoàn toàn và gần như là
ổn định là V20A, IR58025A, BoA. Các dong phục hồi cho các dòng trên cũng
đựơc chọn lọc như Minh khôi 63, Trắc 64, Quế 99 [5].
Tại Viện di truyền Nông nghiệp, một số tổ hợp lai cho năng suất cao cũng
được tạo ra. Tiêu biểu là tổ hợp BoA/DT12 cho năng suất 7,5-10 tấn/ha có tính
thích ứng cao và đã được chọn lọc để để đưa ra sản xuất thử [10].
Ngoài việc thu thập các dòng CMS chúng ta còn tiến hành nghiên cứu để
tạo dòng CMS mới. Chúng ta đã tạo ra được 8 dòng CMS mới từ 5 nguồn lúa
dại, 4 trong số 8 dòng đó có nguồn tế bào chất bất dục từ lúa dại Đồng Tháp kết
hợp với nhân của các giống IR66, IR70, PMS23, V20B; 4 dòng còn lại là:
OMS1, OMS2, OMS4, RPMS2 có kiểu bất dục giao tử thể rất khác với dạng bất
dục đực “WA” của Trung Quốc [6].
Trung tâm nghiên cứu và phát triển lúa lai thuộc Viện Khoa học Kỹ Thuật
Nông nghiệp Việt Nam đã tạo ra được nhiều tổ hợp 3 dòng có triển vọng như:

HYT56, HYT57, HYT82, HYT83 trong đó HYT57 và HYT83 đã được công
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
8
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
nhận cho khu vực hoá. Các tổ hợp này có đặc điểm nổi bật là: năng suất cao, chất
lượng tốt, chống chịu được với sâu bệnh và điều kiện bất thuận ở Việt Nam [8].
Theo Phạm Đồng Quảng (2006) tính đến năm 2003-2004 Việt Nam đã sản
xuất được trên 600.000 ha lúa lai, chủ yếu là lúa lai ba dòng, sản lượng thu được
là gần 4000 tấn/năm, chiếm 25% nhu cầu giống trong nước. Vì vậy FAO coi
Việt Nam là nước áp dụng thành công công nghệ sản xuất lúa lai vào đại trà và
Việt Nam là nước có diện tích lúa lai thương phẩm đứng thứ 2 trên thế giới chỉ
sau Trung Quốc [9].
Tuy nhiên các giống lúa lai được trồng ở Việt Nam thì có đến hơn 80%
được nhập nội từ Trung Quốc. Việt Nam vẫn chưa có một tổ hợp lai 3 dòng nào
hoàn toàn do Việt Nam tạo ra được đưa váo sản xuất trên diện rộng thực sự đem
lại hiệu quả cao. (Tạp chí nông thôn mới, số ra 179/20065).
Với mục tiêu năm 2010 nước ta chủ động sản xuất hạt giống cho khoảng 1
triệu ha lúa lai thì buộc các nhà chọn giống phải tích cực hơn nữa trong việc tạo
ra nhiều tổ hợp lúa lai ba dòng nội địa cho năng suất cao, chất lượng tốt, thích
ứng rộng, chống chịu tốt. Đây là vấn đề cấp bách đòi hỏi các nhà chọn giống
cùng bắt nhau nhau tích cực thực hiện.
2.2. Hệ thống lúa lai ba dòng
2.2.1. Khái niệm
Hệ thống lúa lai ba dòng là hệ thống sản xuất hạt lai F1 dựa vào 3 dòng có
bản chất di truyền khác nhau đó là: Dòng bất dục đực tế bào chất (Cytoplasmic
Male Sterile- CMS, dòng A), dòng duy trì bất dục (Maintainer line, dòng B),
dòng phục hồi hữu dục (Restores line, dòng R).
2.2.2. Dòng bất dục đực tế bào chất
a) Bản chất di truyền dòng bất dục
Khoa Nông học Trường ĐHNN I

9
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
Sự bất dục là do sự tương tác giữa gen nhân và gen trong tế bào chất gây
ra. Cây bất dục này thì có tế bào chất bất dục dạng (S) và trong nhân có chứa gen
bất dục là (rfrf). Cây bất dục có kiểu gen là Srfrf. Những cây này thì ty thể không
cung cấp đủ năng lượng cho các hoạt động của tế bào trong khi đó các sản phẩm
của các gen trong nhân lại không bù đắp được. Chính điều này làm cho hạt phấn
của những cây này bị bất dục do không tích luỹ được năng lượng, hạt phấn lép,
méo mó biến dạng, không có khả năng nảy mầm thụ tinh.
b) Đặc điểm
Dòng này thì có nhụy phát triển bình thường nhưng hạt phấn bị thui chột.
Nên dòng này không có khả năng tự thụ phấn tạo hạt nhưng có khả năng nhận
phấn của các dòng khác có chúa gen phục hồi để tạo hạt [19].
Chúng ta có thể nhận biết được những dòng này bằng cách nhuộm hạt
phấn bằng dung dịch I-KI1% và soi trên kính hiển vi thì các hạt phấn này không
nhuộm màu, có hình dạng méo mó. Hoặc nhận bằng cách bao cách ly dòng này
thì dòng này không cho hạt, các hạt bị lép hoàn toàn.
c) Một số dạng bất dục phổ biến
+ Bất dục đực hoang dại (Wild Abortion: WA)
Đây là dạng bất dục bào tử thể nó đựơc tạo ra bằng cách lai giữa lúa dại và
lúa trồng là các giống thuộc loài phụ Indica chín sớm như như: V20, V41, Zhen
Shan 97…Các giống Indica ngắn ngày của Trung Quốc có thể được dùng làm
dòng duy trì còn các giống Indica chín muộn và các giống trồng ở vùng Đông
Nam Á có thể dùng làm các dòng phục hồi như: IR24, IR26, Zhu Ai, Tai Yin1…
Hiện nay dạng bất dục “WA” được sử dụng rộng rãi nhất, nó chiếm 95%
tổng số lượng hạt giống F1 được đưa vào sản xuất.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
10
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
+ Dạng bất dục đực kiểu Hồng Liên

Thuộc hệ bất dục giao tử thể được hình thành do việc lai trở lại liên tục
giữa lúa đỏ dại có râu (mẹ) với giống Lien Tang Zao (bố). Ở dạng này thì các
dòng duy trì thuộc dạng “WA” như: Zhen Shan 97, Jin Nan Te 43 và Xian Feng1
lại trở thành dòng phục hồi cho các dòng bất dục thuộc dạng Hồng Liên. Và các
dòng phục hồi mạnh thuộc dạng “WA” như Tai Yin1 là các dòng duy trì tốt với
dạng Hồng Liên.
+ Dạng bất dục đực kiểu “BT”
Dòng bất dục Taichuang 65 và các dòng bất dục Li Ming và Feng Jin được
truyền từ BT-C, và các dòng bất dục của lúa Sinica Tien 1 và Tien 3 thuộc dạng
này. Phần lớn các giống Sinica là các dòng duy trì của chúng. Các gen phục hồi
của lúa Sinica đều được bắt nguồn từ lúa Indica. Lúa Indica được trồng ở chỗ đất
cao tỉnh Yunnan, Trung Quốc và ở Đông Nam Á cũng như nhiều dòng của IRRI
mang gen phục hồi.
d) Chọn tạo dòng CMS
Có 3 phương pháp cơ bản để chọn tạo dòng bất CMS
+ Nhập nội
Hàng trăm dòng lúa CMS thuộc nhiều dạng khác nhau đã được gây tạo ở
Trung Quốc. Chúng chỉ khác nhau về các tính trạng nông học, thời gian sinh
trưởng, khả năng kết hợp, sức chống chịu với các điều kiện bất thường, chất
lượng hạt, phổ phục hồi Chính vì vậy nhập nội các dòng CMS có sẵn này và
chọn lọc trong số đó các dòng ưu tú nhất thích hợp với điều kiện địa phương để
sử dụng trực tiếp là phương pháp hiệu quả nhất trong chương trình gây tạo dòng
CMS.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
11
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
+ Lai xa giữa các loài phụ hoặc lai lúa dại với lúa trồng
Trong khi lai xa người ta thường thấy con lai bất dục ngay từ thế hệ F1 và
quần thể F2 thì có sự phân ky về sự bất dục. Sự bất dục này do nhiều nguyên
nhân khác nhau gây nên. Để có được dạng bất dục di truyền tế bào chất thì theo

kinh nghiệm tổng kết của các chuyên gia chọn giống Trung Quốc thì cần chọn
các dạng Indica nguyên thuỷ làm mẹ lai với một số dạng cải tiến trong nhóm
Indica chín sớm, chín trung bình và các giống Japonica cải tiến sẽ xuất hiện
nhiều cá thể bất dục. Chọn trong đó những cá thể có nhiều tính trạng nông sinh
học tốt lai thử với dòng bố khởi đầu. Nếu con lai bất dục thì tiến hành lai lại rồi
đánh giá độ thuần, cuối cùng sẽ thu được dòng bất dục và dòng duy trì tương
ứng.
+ Phương pháp gây đột biến
Người ta có thể dùng các tác nhân đột biến (hoá học, vật lý) để tạo ra các
dạng bất dục khác nhau trong quần thể. Để tìm được dòng CMS trong số đó
chúng ta phải tiến hành lai thử các cá thể bất dục được tạo ra với dòng vật liệu
khởi đầu chưa có xử lý đột biến hoặc các giống lúa thường khác nhau có những
tính trạng mong đợi. Sau đó tiến hành đánh giá con lai F1 và lựa chọn những tổ
hợp lai bất dục, cặp nào có độ ổn định bất dục cao thì đó chính là dòng CMS và
dòng duy trì mới.
e) Yêu cầu đối với một dòng A tốt để sản xuất hạt lai F1
- Hạt phấn phải bất dục hoàn toàn và ổn định qua các vụ.
- Phải tương đối dễ phục hồi:
• Phổ phục hồi rộng có nghĩa là nhiều giống lúa thường khi lai với dòng
A cho con lai F1 hữu dục cao trên 80%, trên cơ sở đó có thể chọn ra nhiều tổ hợp
lai tốt.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
12
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
• Cấu tạo hoa phù hợp với đặc điểm nhận phấn ngoài: Góc mở vòi trấu
rộng, thời gian mở dài, thời gian sống của vòi nhụy kéo dài. Có tập tính nở hoa
tốt: nở tập trung.
• Độ trỗ thoát cổ bông càng nhiều càng tốt và nhạy cảm với GA
3
.

2.2.3. Dòng duy trì bất dục
a) Bản chất di truyền
Các cây thuộc dòng duy trì có tế bào chất hữu dục (tế bào chất dạng F),
gen trong nhân là gen lặn kiểm soát tính bất dục hạt phấn. Kiểu gen của những
cây thuộc dòng này là (Frfrf).
b) Đặc điểm
Dòng duy trì có bộ gen nhân giống hệt bộ gen nhân của dòng CMS chỉ
khác là tế bào chất của dòng này là hữu dục nên dòng này vẫn cho hạt phấn hữu
dục và quá trình thụ phấn thụ tinh xảy ra bình thường, tỷ lệ kết hạt cao. Và khi
lấy hạt phấn của dòng này thụ phấn cho dòng A thì ta sẽ thu được chính dòng A.
Vì vậy dòng B làm nhiệm vụ duy trì tính bất dục của dòng A. Và mỗi dòng A chỉ
có một dòng B tương ứng.
c) Chọn tạo dòng duy trì bất dục
Trong tập đoàn lúa tồn tại một số dòng duy trì, tuy nhiên không thể phân
biệt giữa dòng duy trì với các giống lúa thường khác bằng quan sát hình thái.
Muốn tìm được dòng B trong tập đoàn lúa phải có dòng A bất dục. Ta sẽ tiến
hành lai thử các giống trong tập đoàn lúa thu hạt lai. Sau đó gieo các tổ hợp lai
đó để đánh giá độ hữu dục của tổ hợp đó bằng cách soi hạt phấn và bao cách ly
cho tự thụ. Nếu soi hạt phấn có tỷ lệ hạt phấn bất dục > 80% thì dòng đó có thể
chọn được làm dòng B. Trong tập đoàn lúa thì dòng B chiếm tỉ lệ không cao và
thông thường mỗi dòng B chỉ duy trì tốt nhất cho một dòng A. Khi muốn cải tạo
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
13
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
dòng A mới đồng tế bào chất thì mới sử dụng dòng duy trì khác. Khi cần cải tiến
một tính trạng nào đó của dòng A thì trước hết phải cải tạo một tính trạng tương
ứng trên dòng B. Sau đó chọn lọc các cá thể phân ly trong quần thể F2 có nhiều
đặc điểm mong muốn, lai cá thể được chọn với dòng A. Cây lai lại nếu cho hạt
phấn bất dục chứng tỏ cặp gen lặn của cây B khởi đầu đã được truyền sang con
cháu. Khi đó vừa tiến hành chọn lọc cá thể ở dòng bố vừa tiến hành lai trở lại để

chuyển toàn bộ các đặc điểm mong muốn sang cây A, như vậy sẽ thu được cặp
A/B cải tiến. Ngoài ra có thể sử dụng đột biến hoá học để cải tiến những tính
trạng của dòng B.
2.2.4. Dòng phục hồi bất dục
a) Bản chất di truyền.
Các cây trong dòng phục hồi thì tế bào chất có thể chứa gen phục hồi hoặc
gen bất dục (F hoặc S) nhưng gen trong nhân là gen đồng hợp tử trội (RfRf) hoặc
ở dạng dị hợp (Rfrf) kiểm soát tính hữu dục của hạt phấn do gen phục hồi ở
trong nhân có thể là đồng hợp hoặc dị hợp nên khi lai với dòng CMS sẽ gây nên
hiện tượng phục hồi hoàn toàn hoặc phục hội một phần.
b) Đặc điểm
Dòng phục hồi có hạt phấn hữu dục và dùng để thụ phấn cho dòng A để
sản xuất hạt lai F1. Hạt lai F1 khi gieo sẽ cho các cây F1 đồng nhất về đa số các
tính trạng và cho ưu thế lai cao.
c) Chọn tạo dòng phục hồi hữu dục
Có 3 phương pháp để gây tạo dòng phục hồi
+ Phân lập dòng phục hồi trong quần thể tự nhiên bằng lai thử
Để phát hiện dòng phục hồi trong quần thể tự nhiên các nhà chọn giống sử
dụng dòng A để lai thử với các giống trong tập đoàn giống tự nhiên. Sau đó gieo
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
14
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
các tổ hợp thu được cùng hàng với các giống bố. Khi lúa trỗ tiến hành quan sát
hạt phấn để đánh giá độ hữu dục của hạt phấn. Những tổ hợp có tỷ lệ hạt phấn
hữu dục > 80% thì dòng bố có khả năng được chọn tạo làm dòng phục hồi.
Ngoài việc đánh giá độ hữu dục của hạt phấn cần chọn lọc những tổ hợp có tỷ lệ
hạt chắc cao, khối lượng hạt lớn
+ Tạo dòng phục hồi bằng phương pháp lai hữu tính
Lai hai dòng phục hồi có các đặc tính nông sinh học tương phản có thể bổ
sung cho nhau. Chọn các cá thể phân ly ở F2 và tiến hành lai với các dòng CMS

để đánh giá khả năng phục hồi. Lặp lại liên tục đến khi dòng bố ổn định cả về
khả năng phục hồi, cả về tính trạng nông sinh học, đó là dòng R mới.
Lai dòng phục hồi với những dòng không có khả năng phục hồi nhưng có
những đặc điểm tốt có thể bổ sung cho dòng phục hồi như: có tiềm năng năng
suất cao, chống chịu tốt với sâu bệnh Các tổ hợp lai thu được sẽ được gieo
trồng và tiến hành chọn lọc phả hệ ở các thế hệ phân ly. Chọn lọc những cá thể
có nhiều đặc tính mong muốn lai thử với dòng A để đánh giá khả năng phục hồi.
Những dòng có khả năng phục hồi tốt sẽ tiếp tục được chọn thuần.
+ Tạo dòng phục hồi bằng phương pháp sử lý đột biến
Người ta có thể tạo ra các dòng phục hồi hữu dục mới hoặc làm tăng khả
năng phục hồi của các dòng sẵn có bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến
(vật lý, hoá học). Những nghiên đây cho thấy phương pháp gây đột biến vừa tạo
ra được dòng R mới, vừa góp phần cải tạo tính trạng của các dòng R sẵn có,
đồng thời bổ sung được các tính trạng tốt.
d) Yêu cầu đối với một dòng R tốt
• Một dòng phục hồi tốt cần sinh trưởng phát triển mạnh cao hơn dòng mẹ,
phải có độ thuần cao.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
15
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
• Thời gian gian sinh trưởng dài hơn dòng A.
• Có nhiều tính trạng quý có thể di truyền cho con lai F1.
• Bao phấn to mẩy chứa nhiều hạt phấn, khi nở hoa bao phấn mở, tung
phấn mạnh, tập trung, khả năng bám dính của hạt phấn tốt, nảy mầm nhanh và
khả năng thụ tinh mạnh.
• Có khả năng phục hồi mạnh, cho con lai F1 đậu hạt cao trên 80%.
• Có khả năng tương hợp rộng.
2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa lai
2.3.1. Khái niệm
Chỉ thị phân tử là đoạn ADN bất kỳ được dùng để phân biệt sự khác nhau

về kiểu hình (tính trạng) giữa các cá thể, dòng, giống và giữa các loài khác nhau.
2.3.2. Một số chỉ thị phân tử thường được áp dụng
a) Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
RFLP là kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic. Bản chất của
kỹ thuật này là dựa trên sự phân cắt ADN bằng enzyme giới hạn và sự lai (liên
kết) giữa các bazơ bổ sung trên hai sợi đơn axit nucleic (sợi ADN hoặc mARN).
Khi xử lý bằng enzym giới hạn sẽ thu được những mảnh ADN nhỏ hơn có kích
thước khác nhau, những mảnh này sau đó được điện di và cho lai với mẫu dò,
nếu chúng bổ sung với mẫu dò thì sẽ có phản ứng lai. Kết quả của phản ứng lai
là chúng ta có thể xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau [13].
Để tiến hành phương pháp này trước hết cần chiết tách ADN của bộ
genome. Sau đó sử dụng một hoặc vài enzym cắt giới hạn, chúng ta sẽ thu được
những đoạn ADN có kích thước nhỏ hơn, những đoạn này được phân tách bằng
cách chạy điện di trên gel agarose. Tùy theo kích thước của mỗi đoạn này mà nó
sẽ di chuyển đến các vị trí khác nhau trên gel. Sau đó chuyển nguyên vẹn các vệt
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
16
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
này lên trên màng lai. Loại màng lai được ưa dùng hiện nay là hybond N
+
, nó sẽ
giữ chặt ADN trên đó. Trước khi chuyển lên màng lai các mảnh ADN được xử
lý bằng axit (HCl) nhằm bẻ gẫy những mảnh ADN thành những mảnh nhỏ hơn
nữa để chúng dễ dàng di chuyển lên màng lai, đồng thời vì lai ADN chỉ tiến hành
được giữa sợi đơn và sợi đơn nên những mảnh ADN trong gel tiếp tục được xử
lý bằng kiềm (NaOH) để làm biến tính tách ADN thành sợi đơn [7]. Các vệt đó
được lai với các mẫu dò mục tiêu, đã được đánh dấu phóng xạ, màng lai sau khi
được rửa và chụp hình trên phim X quang, trong những điều kiện nhất định như
vệt lai trên màng lai sẽ chuyển thành vết đen trong phim X quang.
b) Chỉ thị PCR (Polymerase Chain Reaction)

Bản chất của kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp, phản ứng chuỗi
polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh chưa
từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu trình nhiệt.
Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và tiếp tục được
hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzyme tổng
hợp ADN chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành công
các máy chu trình nhiệt cho phép thay đổi nhanh chóng và chính xác nhiệt độ
cho từng giai đoạn phản ứng. Cho đến nay kỹ thuật PCR được coi như một
phương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại [11].
Nguyên tắc của phương pháp này là tạo lượng lớn các đoạn ADN đặc thù
từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của ADN-polymerase để tổng hợp sợi
mới bổ sung.
Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:
- Các sợi khuôn ADN chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm
cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
17
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
- Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, là tín
hiệu chỉ hướng đi (5’-3’) của enzyme ADN-polymerase. Mồi dài khoảng 20 đến
30 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp bổ sung với
nhau.
- Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
- Môi trường đệm cung cấp ion Mg
2+
và nước tinh khiết không có enzyme
DNase.
- Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq).
Các nguyên liệu này được trộn theo một tỷ lệ nhất định với dung tích từ
20àl đến 50àl. Sau đó tiến hành phản ứng trong máy chu trình nhiệt với chu kỳ

định trước (30-60 chu kỳ). Sản phẩm thu được sau khi thực hiện phản ứng PCR
sẽ được điện di trên gel agarose 1% sau đó đựơc nhuộm Ethidium Bromide. Cuối
cùng các vết băng đựơc phát hiện bằng máy chiếu UV [16].
c) Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADN)
Phương pháp RAPD được William, Welsh, McClelland đề xuất vào năm
1990. Bản chất của phương pháp này là quá trình nhân bản các đoạn ADN bằng
kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi này sẽ bắt
cặp ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở vị trí bất kỳ nào mà tại đó có trình tự bổ sung
với nó. Đoạn mồi được thiết kế có kích thước từ 8-12 nu (thông thường là 10
nu). Sau phản ứng sẽ có vô số các đoạn ADN được nhân lên với những tính trạng
nhất định [11].
d) Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
Phương pháp này được Zabeau và Vos cùng cộng sự đề xuất vào những
năm 1993-1995. Bản chất của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật PCR để
nhân bản các đoạn ADN đã được cắt bởi enzyme giới hạn. Khâu then chốt của
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
18
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
kỹ thuật này là việc thiết kế các mồi đặc trưng. Dựa vào trình tự nucleotide ở hai
đầu bị cắt người ta thiết kế các đoạn gắn (adaptor) và gắn chúng vào các đầu cắt.
Dựa vào trình tự adaptor ta có thể thiết kế mồi PCR gồm hai phần: phần trình tự
bổ sung với adaptor và phần bổ sung những nu tùy thích thường từ 1-3 nu. Với
mồi thiết kế như vậy chỉ có các đoạn ADN có trình tự 2 đầu bắt cặp với trình tự
mồi mới được nhân lên. Đây là phương pháp kết hợp giữa RFLP và RAPD nên
có nhiều ưu điểm: đơn giản, ổn định, dễ thiết kế mồi ở lượng lớn, khả năng ứng
dụng lớn [7].
2.3.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống
lúa lai
Từ khi phát hiện ra kỹ thuật PCR năm 1985 nó đã trở thành một kỹ thuật
quan trọng đựơc sử dụng trọng nghiên cứu và chọn tạo giống cây trồng. Cho đến

nay đã có nhiều chỉ thị được phát hiện ra dựa trên kỹ thuật PCR như: AFLP,
RAPD, SSR, STS, CAPS nó đã trợ giúp đắc lực trong công tác chọn tạo giống
cây trồng nói chung và chọn tạo giống lúa lai nói riêng.
Các chỉ thị phân tử liên kết chặt với nhiều tính trạng kiểu hình được sử
dụng để xác định các đặc trưng của bố mẹ trong nghiên cứu lúa lai và để xác
định tiêm năng ưu thế lai. Chỉ thị phân tử đã được sử dụng để lập bản đồ một số
gen quan trọng và định vị một số gen số lượng thông qua liên kết di truyền. Một
số gen vô cùng quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúa lai như gen kiểm
soát tính trạng phục hồi hữu dục, gen tương hợp rộng, gen kiểm soát tính trạng
bất dục đực tế bào chất đã được định vị. Nhiều chỉ thị liên quan đến các tính
trạng nói trên cũng đã được tìm ra như:
- Đánh dấu gen tương hợp rộng bằng chỉ thị RFLP dùng mẫu dò RG138,
RG164, RG456 (Zhang et al. 1992).
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
19
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
- Đánh dấu gen phục hồi hữu dục cho dạng CMS-WA của giống IR24
dùng chỉ thị RFLP và RAPD (Ning Huang 1998).
Yu (1991) đã định vị được hai chỉ thị là RG561 và Cdo94 nằm trên NST
số 10 liên kết chặt với gen phục hồi Rf và Zhang et al (1994) đã phát hiện ra hai
chỉ thị khác là RZ392 và RG458 liên kết với gen Rf3 nằm trên NST số 1 với
khoảng cách là khoảng 3cM.
Arli, Shenoy và Sharma (1996) đã công bố kết quả phân tích xác định tính
di truyền của hai dòng bất dục kiểu CMS (IR58025A và IR62829A) bằng phản
ứng PCR và kỹ thuật RAPD với 20 mẫu dò có ký hiệu là PA b-7, PA O-12, PB
O-19, P OP-17 và P17-4 .
Năm 2004, Ashiola et al đã tìm được PCR marker dựa trên trình tự của ty
thể nhằm để phân biệt sự khác nhua giữa dòng duy trì và dòng phục hồi cho dạng
bất dục đực “WA”.
Sane et al (1997), jena and Pandey (1999), Chii et al (2000) đã sử dụng

phương pháp RAPD nhằm phân biệt dòng duy trì và dòng bất dục đực tế bào
chất dạng “WA”. Kubo and Kadowaki (1997), Ashitola et alY(2004) đã sử dụng
marker RMT6 để khuyếch đại một trình tự lặp lại (AT6) ở phía trước gen mã hóa
cho tiểu phần nad5 nhằm phát hiện được các dòng duy trì và dòng bất dục đực
“WA”.
Theo P. Rajendrakumar et al (2006) đã sử dụng một marker prcms nhằm
nhân đoạn lặp lại đặc biệt trên ty thể để phát hiện dòng duy trì và dòng bất dục
đực tế bào chất dạng “WA”.
Như vậy từ những thành tựu nghiên cứu đạt được trên thế giới chúng ta
có thể vận dụng và thiết kế được các cặp mồi và sử dụng các chỉ thị phân tử thích
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
20
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
hợp để tìm nguồn gen trong các giống lúa địa phương, cụ thể là các gen bất dục,
gen duy trì, gen phục hồi để phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa lai ba dòng.
2.3.4. Ưu điểm của việc sử dụng chỉ thị phân tử
Việc sử dụng chỉ thị phân tử và bản đồ di truyền giúp cho các nhà chọn
giống thấy rõ được mối quan hệ giữa: Tính trạng-Gen-Môi trường. Điều này
giúp cho các nhà chọn giống có những biện pháp thích hợp trong chương trình
chọn giống với các tính trạng.
Chỉ thị phân tử còn giúp cho các nhà chọn giống chọn được chính xác gen
quy định tính trạng mong muốn và trong thời gian rất ngắn. Từ đó rút ngắn được
thời gian và công sức nâng cao hiệu quả chọn lọc.
Ngoài ra nó còn có nhiều ưu điểm nữa, chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề
tài này để tìm ra những chỉ thị thích hợp nhất phục vụ cho công tác chọn tạo
giống ở Việt Nam.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
21
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
3.1.Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Trên cây lúa (Oryza sativa L.)
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
3.1.2.1. Trong phòng thí nghiệm
- Máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh điện di, máy li tâm, máy
voltex, tủ lạnh, lò vi sóng
- Các loại ống eppendoff, các loại pipet, đầu típ, các loại cối chày sứ
- Các cặp mồi sử dụng cho trong phản ứng PCR để phát hiện các gen: gen
cms, gen rf, gen Rf4.
- ADN mẫu, các loại hoá chất dùng chạy PCR (dNTP, MgCl
2
, Taq ADN
polymerase, nucleaza-free water).
- Hoá chất dùng để chiết tách ADN
Thành phần dung dịch đệm chiết tách
Thành phần
Nồng độ dung
dịch mẹ
Nồng độ dung
dịch làm việc
Hỗn hợp 10ml
dung dịch chiết
tách
Tris-HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5ml
EDTA (pH=8) 0,5M 0,25mM 0,5ml
SDS 10% 1% 1,0ml
NaCl 5M 300mM 0,6ml
H

2
O 7,4ml
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
22
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
Dung dịch đệm TE
Thành phần
Nồng độ dung
dịch mẹ
Nồng độ dung
dịch làm việc
50ml dung dịch
TE làm việc
Tris-HCl (pH=8) 1M 10mM 0,5ml
EDTA (pH=8) 0,5M 1mM 1,0ml
H
2
O 49,4ml
* Ngoài ra còn có:
+ Hỗn hợp phenol : chlorofom : Isoamylancohol (25:24:1)
+ Ethanol 70%, 96%, đá lạnh.
- Hoá chất dùng cho chạy điện di trên gen agarose 1,5%, Ethidium
bromide 10mg/ml, Loading Buffer (Bromophenol blue, Xylene cyanol,
Succarose).
+ TAE (Tris base, glacial aceric acide, EDTA) 1X.
- Dung dịch KI 1% dùng để nhuộm soi hạt phấn
3.1.2.2. Ngoài đồng ruộng
- Gồm 137 tổ hợp lai giữa các dòng bất dục với các giống lúa địa phương,
những giống lúa cải tiến,
- Ngoài ra còn có các vật liệu khác như : Bao nilon, cọc tre, phân bón

3.2. Thời gian nghiên cứu
Từ ngày 15/7/2007 đến ngày 15/1/2008
3.3. Địa điểm nghiên cứu
Tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử và khu thí nghiệm đồng ruộng của
bộn môn Công nghệ sinh học khoa Nông học trường Đại học Nông nghiệp I -
Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội.
3.4. Bố trí thí nghiệm
- Các tổ hợp F1 được bố trí tuần tự không nhắc lại.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
23
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
- Mỗi tổ hợp F1 cấy trong 2m
2
cùng dòng bố.
- Địa điểm : Khu ruộng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học trường
Đại học nông nghiệp I - Hà Nội.
* Biện pháp kỹ thuật :
- Thời vụ: Vụ mùa năm 2007
- Ngày gieo: 20/6/2007
- Ngày cấy: 15/7/2007
- Cấy 1 dảnh, mật độ 42 dảnh/m
2
Cây x Cây: 11cm
Hàng x Hàng: 20cm
Ô x Ô: 30cm
- Lượng phân bón: (90kgN + 90kgP
2
O
5
+ 60kgK

2
O)/ha.
- Cách bón:
+ Bón lót: Toàn bộ P
2
O
5
+ 20%N bón sau lần cày bừa cuối cùng,
giữ mực nước thấp.
+ Bón thúc 1: 50%N + 40%K
2
O vào lúc lúa đẻ nhánh ( rút nước
thấp 1-2 cm, bón đều kết hợp với làm cỏ).
+ Bón thúc 2: Toàn bộ lượng phân còn lại, bón vào lúc lúa bước vào
giai đoạn phân hoá, làm đòng.
3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Nghiên cứu phát hiện các dòng có khả năng duy trì, phục hồi cho các
dòng bất dục CMS.
* Phương pháp:
- Lai cưỡng bức giữa các giống lúa địa phương với các dòng bất dục để
thu hạt F1: Bằng cách bứng cây mẹ đặt cạnh cây bố, sau đó cắm cọc tre nghiêng
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
24
Báo cáo tốt nghiệp Trần Bảo Ngọc - CNSH49
một góc 45
0
và bao nilon lại, ghi thẻ đánh dấu tổ hợp lai, ngày lai. Dòng mẹ phải
đảm bảo chưa mở vỏ trấu, có thời gian trỗ trùng khớp với cây bố. Cây mẹ cần
được tỉa bớt lá và các nhánh trổ quá sớm, các nhánh còn non. Cây mẹ phải đặt
thấp hơn cây bố để đảm bảo khả năng nhận phấn tốt nhất. Thời gian lai tiến hành

vào buổi chiều.
- Trồng hạt F1 và quan sát hạt phấn:
+ Soi hạt phấn
Hạt phấn được lấy ở những bông đang tung phấn. Đem đi nhuộm trong
dung dịch KI 1% sau đó đem đi soi dưới kính hiển vi. Những hạt phấn có màu
đen là hạt phấn hữu dục. Đếm trên hiển vi trường nếu thấy có hơn 80% số hạt
phấn hữu dục thì cây đó hữu dục. Nếu có hơn 80% số hạt phấn bất dục thì cây đó
bất dục.
+ Tự thụ F1
Bao cách ly bông F1 (lúc chưa phơi màu), đến khi thu hoạch đếm tỷ lệ hạt
chắc, hạt lép. Nếu tỷ lệ hạt lép > 70% thì cây đó bất dục. Nếu tỷ lệ hạt chắc >
70% thì cây đó hữu dục.
- Những tổ hợp nào bất dục thì dòng bố của chúng có thể chứa gen duy trì.
- Những tổ hợp nào hữu dục thì dòng bố của chúng có thể chứa gen phục
hồi.
3.5.2. Xác định khả năng chứa gen duy trì, gen phục hồi bằng PCR.
* Phương pháp:
- Chiết tách ADN tổng số của tất cả các dòng bố của các tổ hợp F1 theo quy trình
cải tiến của bộ môn Công nghệ sinh học.
Bước 1: Thu mẫu lá khoẻ, cắt dài khoảng 2cm bỏ vào ống nghiệm có dung tích
1,5 ml, đánh dấu tên giống rồi bỏ vào đá lạnh.
Khoa Nông học Trường ĐHNN I
25