Lai chuyển gen và chọn lọc gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu xa-5, Xa-7, Xa-21 vào một số giống lúa tốt bằng chỉ thị phân tử DNA

trờng đạI học nông nghiệp hà nội
Khoa Công nghệ sinh học
-------------***-------------

Khoá luận tốt nghiệp
đề tài:
Lai chuyn gen v chn lc gen kháng bệnh bạc lá
hữu hiệu xa-5, Xa-7, Xa-21 vào một số giống lúa tốt
bằng chỉ thị phân tử DNA”

Ngêi hớng dẫn

: 1. pgs.ts. phan hữu tôn
2. KS. Tống văn hải
Bộ môn: Công nghệ sinh học ứng dụng
Khoa Công nghệ sinh học - Trờng ĐHNN

Ngời thực hiện

: NGUYễN THị HIÊN

Lớp

: CNSH K3 hồng đức

hà nội - 2009


Lời cảm ơn!
Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp, ngoài sự nỗ
lực và cố gắng của bản thân, tôi đà nhận đợc sự giúp đỡ quý báu của rất

nhiều thầy cô, gia đình cùng bạn bè.
Trớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu
Tôn, thầy đà trực tiêp hớng dẫn, nhiệt tình chỉ bảo và truyền đạt cho tôi
những phơng pháp, bài học quý báu trong công việc cũng nh trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn K.S Tống Văn Hải, ngời đà trực tiếp hớng
dẫn, dìu dắt tôi trong thời gian thực tập tại trờng.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cung cấp cho tôi những
kiến thức bổ ích trong quá trình thực tập.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những ngời thân
trong gia đình cùng bạn bè đà giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học
tập và thực hiện đề tài.

Hà Nội, ngày 10 tháng 8 năm 2009
Sinh viên

Nguyễn Thị Hiên

i


MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU..................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề...............................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu..............................................................................3
1.2.1. Mục đích..........................................................................................3
1.2.2. Yêu cầu..............................................................................................3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................4
2.1. Tổng quan về bệnh bạc lá lúa................................................................4
2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa...........................................4
2.1.2. Nguyên nhân, triệu chứng và tác hại của bệnh bạc lá................6

2.1.3. Quy luật phát sinh, phát triển và các yếu tố ảnh hưởng tới sự
phát sinh phát triển của bệnh bạc lá.........................................................9
2.2. Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bệnh bạc lá bằng phương
pháp chỉ thị phân tử DNA.............................................................................12
2.2.1. Cơ sở sinh hoá và sinh thái............................................................12
2.2.2. Cơ sở phân tử..................................................................................13
2.2.3. Di truyền tính kháng bệnh bạc lá.................................................15
2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh
bạc lá..............................................................................................................16
2.4.1. Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA................................................16
2.4.2. Chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh bạc lá lúa......19
2.4.3. Kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh..................20
2.5. Các phương pháp chuyển gen kháng bệnh bạc lá..............................23
2.5.1. Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen..............................24
2.5.2. Phương pháp lai hữu tính kết hợp với việc sử dụng chỉ thị phân
tử.................................................................................................................24
PHẦN 3.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................26
3.1. Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu............................................26
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................26
3.1.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu....................................................26
3.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................26
3.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................27
3.3.1. Thí nghiệm ngồi đồng ruộng khảo sát tập đồn....................27
3.3.2. Thí nghiệm trong phịng................................................................31
PHẦN 4.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................36
4.1. Đặc điểm nông sinh học của các giống..............................................36
ii

4.1.1. Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng......................................36
4.1.2. Một số đặc điểm nông sinh học của các giống bố, mẹ sử dụng
để lai Backcross........................................................................................40
4.1.3. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất...........................41
4.2. Phản ứng của các giống bố, mẹ và các tổ hợp lai F1 với chủng vi
khuẩn gây bệnh bạc lá.................................................................................44
4.3. Kết quả tiến hành phản ứng PCR.......................................................47
PHẦN 5.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..........................................................52
5.1. Kết luận..................................................................................................52
5.2. Đề nghị...................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................54

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Kí hiệu các tổ hợp lai F1 dùng làm cây mẹ để lai lại
với giống cần chuyển gen................................................................26
Bảng 2: Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng của các giống
bố, mẹ sử dụng lai Backross..........................................................37
Bảng 3: Một số đặc điểm nông sinh học của các giống sử dụng
làm bố, mẹ để lai Backcross...........................................................40
Bảng 4: Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất...............41
Bảng 5: Phản ứng của các giống bố, mẹ và các tổ hợp lai F1 với
chủng vi khuẩn số 10.......................................................................44

DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo chủng 10 trên gen Xa-7

của tổ hợp lai F1 (T23xIRBB7)...................................................46
Hình 2: Hình ảnh lây nhiễm nhân tạo chủng 10 trên gen Xa-21
của tổ hợp lai F1 (IR64xIRBB21)................................................46
Hình 3: Ảnh điện di sản phẩm gen xa-5 sau khi tiến hành phản
ứng PCR của tổ hợp lai (N91xIRBB5)........................................48
Hình 4: Ảnh điện di sản phẩm gen xa-5 sau khi ủ bằng Enzyme
DraI của tổ hợp lai (N91xIRBB5)................................................49
Hình 5: Ảnh điện di sản phẩm Xa-7 sau khi tiến hành phản ứng
PCR của tổ hợp lai (T23xIRBB7)................................................50
Hình 6: Ảnh điện di sản phẩm gen Xa-21 sau khi tiến hành
phản ứng PCR của tổ hợp lai (IR64xIRBB21)...........................51

iv


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây ra là
một trong những bệnh hại nguy hiểm cho ngành sản xuất lúa của nhiều quốc
gia trên thế giới, đặc biệt đối với vùng nhiệt đới có trình độ thâm canh cao.
Trong những năm gần đây, ở miền Bắc Việt Nam bệnh trở nên nghiêm trọng
và gây hại ở cả hai vụ. Tác hại chủ yếu của bệnh là làm cho bộ lá đặc biệt lá
đòng xơ xác, sớm tàn và nhanh chóng khơ chết ảnh hưởng tới cường độ
quang hợp, tỷ lệ hạt lép cao, gạo nát, dẫn tới năng suất, phẩm chất lúa gạo
giảm. Theo thống kê của Mew (1989), hàng năm năng suất lúa trên thế giới
giảm từ 10-20% vì các bệnh vi khuẩn, trong đó có tới 50% do bệnh bạc lá
gây ra.
Đối với bệnh bạc lá, hiện nay chưa có loại thuốc hóa học nào đặc trị
bệnh này, mặt khác sử dụng nhiều thuốc hóa học cịn gây ô nhiễm môi trường,
mất cân bằng sinh thái. Biện pháp phòng trừ chủ yếu là biện pháp canh tác

nhưng biện pháp này khơng có khả năng dập tắt dịch nhanh chóng. Do vậy,
việc tạo ra các giống lúa có khả năng kháng bệnh bền vững được xem là hiệu
quả nhất. Giống lúa có khả năng kháng bệnh bền vững là giống có nhiều gen
kháng khác nhau. Do mỗi gen kháng chỉ kháng được một hay một số chủng vi
khuẩn nhất định, trong khi đó mỗi vùng trồng lúa lại tồn tại nhiều chủng vi
khuẩn khác nhau nên nếu giống chỉ chứa một gen kháng thì sau một thời gian
ngắn sẽ bị nhiễm bệnh. Vì vậy cần phải quy tụ nhiều gen kháng vào một giống
để giống đó có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn khác nhau.
Người ta đã phát hiện được 29 gen kháng bệnh ký hiệu từ Xa-1 đến Xa29 (K.S Lee và CS, 2003) gồm 22 gen trội và 7 gen lặn. Theo kết quả nghiên
cứu của Phan Hữu Tơn thì các gen Xa-4, xa-5, Xa-7, Xa-21 kháng được hầu
hết các chủng vi khuẩn ở miền Bắc Việt Nam. Để đưa gen kháng bệnh bạc lá

1


hữu hiệu vào một giống, theo phương pháp truyền thống người ta lai
Backcross, sau đó chọn cây có gen kháng lai lại với giống bố tốt. Bằng lây
nhiễm nhân tạo người ta phát hiện sự có mặt của gen kháng. Tuy nhiên,
phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức, thậm chí khơng chính xác
do tác động của mơi trường. Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh
học đặc biệt là sinh học phân tử các nhà chọn giống đã kết hợp lai hữu tính
với sử dụng chỉ thị phân tử DNA để chọn lọc gen kháng. Áp dụng chỉ thị
phân tử DNA có thể phát hiện sự hiện diện của gen kháng thơng qua đoạn
DNA dị đặc hiệu liên kết với gen đó với khoảng cách liên kết nhất định. Hiện
nay, đã xác định được vị trí của một số gen kháng quan trọng như: gen Xa-4
liên kết với REPL ở Locus Npb181 và Npb76 trên NST số 11, với khoảng
cách di truyền là 1.7cM (Yoshida et al, 1992). Gen xa-5 liên kết với chỉ thị
phân tử RZ390, RG556, RG207 trên NST số 5, với khoảng cách di truyền 01cM (Mc Couch et al, 1991). Gen Xa-7 liên kết với chỉ thị P3 trên NST số 6,
với khoảng cách di truyền 2.5cM (Taura et al, 2003). Gen Xa-21 liên kết với
chỉ thị pTA248 với khoảng cách di truyền 0-1cM (Ronal et al, 1992). Việc

xác định chính xác các gen kháng, nhiễm sắc thể chứa gen kháng và vị trí sắp
xếp các gen đó trên nhiễm sắc thể đã phục vụ đắc lực trong công tác chọn tạo
giống kháng bệnh và việc quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào một giống trở
nên dễ dàng hơn.
Với mục đích quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào các giống lúa tốt,
trong thời gian qua nhóm nghiên cứu lúa bộ môn CNSH ứng dụng - Khoa
CNSH - Trường ĐHNN Hà Nội đã tiến hành lai một số tổ hợp. Nhằm chọn
lọc những giống tốt có chứa gen kháng hữu hiệu làm vật liệu cho vụ sau,
chúng tôi tiến hành đề tài:
“Lai chuyển gen và chọn lọc gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu xa-5,
Xa-7, Xa-21 vào một số giống lúa tốt bằng chỉ thị phân tử DNA”

2


1.2. Mục đích và u cầu
1.2.1. Mục đích
Chuyển thành cơng gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu xa-5, Xa-7, Xa-21
vào những giống lúa có đặc điểm nơng sinh học tốt bằng phương pháp lai
Backcross kết hợp với chọn lọc phân tử.
Sử dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc dạng đồng hợp tử gen kháng ở
quần thể phân ly F2.
1.2.2. Yêu cầu
- Theo dõi và đánh giá một số đặc điểm nông sinh học quan trọng của các
cây bố, mẹ sử dụng để lai Backcross.
- Lai Backcross để chuyển gen kháng bệnh bạc lá hữu hệu xa-5, Xa-7,
Xa-21 vào các dòng lúa mới chọn lọc và thu hạt tự thụ từ các tổ hợp lai F1 để
duy trì gen kháng.
- Lây nhiễm nhân tạo để đánh giá kháng-nhiễm của các giống bố, mẹ và
các tổ hợp lai.

- Tiến hành phản ứng PCR để chọn lọc gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu
xa-5, Xa-7, Xa-21.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về bệnh bạc lá lúa
2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa
2.1.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa trên thế giới
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây ra là
một trong những bệnh hại nghiêm trọng đối với các vùng thâm canh lúa trên
thế giới, đặc biệt là ở các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam…Vì
vậy, việc nghiên cứu nguyên nhân, biện pháp phòng trừ bệnh được các nhà
khoa học đặc biệt quan tâm.
Bệnh bạc lá lúa được phát hiện lần đầu tiên trên cánh đồng lúa Fukuora
(Nhật Bản) vào năm 1884-1885. Ban đầu, các nhà khoa học Nhật Bản nhầm
tưởng rằng đó là bệnh sinh lý do đất chua gây ra. Năm 1908, Takaishi đã tìm
thấy vi khuẩn trong giọt dịch và lây lại được. Dựa trên kết quả phân lập năm
1991, Bokura đã kết luận triệu chứng bệnh bạc lá do vi khuẩn gây nên chứ
không phải do sinh lý[2]. Từ năm 1950-1970, bệnh bạc lá lúa phát triển mạnh
ở Nhật Bản trừ miền Bắc đảo Hokaido (Tagami và Miukami, 1960;
Srivartawa, 1972)[5].
Ở Ấn Độ, bệnh bạc lá lúa được phát hiện năm 1940 (Raina và CS,
1981), với tên địa phương là Dansukh (có nghĩa là trắng hay khơ lá)[5]. Đến
năm 1965, người ta mới xác định được đúng nguyên nhân gây bệnh là do vi
khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây ra.
Ở Philippine, Raiking đã miêu tả triệu chứng bệnh bạc lá do vi khuẩn
gây nên nhưng lại nhầm với bệnh đốm sọc do vi khuẩn Xanthomonas
oryzicola. Mãi đến năm 1957, hai bệnh này mới được phân biệt rõ rệt.

Bệnh bạc lá lúa cũng được phát hiện ở Indonexia vào năm 1950 khi
nghiên cứu các triệu chứng héo. Reisma và Schure gọi tên bệnh bạc lá là
Krese và xác định do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây ra.
4


Năm 1957, các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện thấy bệnh bạc lá
trên cánh đồng lúa phía Tây và Nam (Wu, 1980, 1989). Năm 1976, bệnh này
được thông báo ở Pakistan.
Theo Yoshi và CS tổng kết năm 1983-1984, ở hầu hết các nước Châu Á
(trừ Tây Á) đều xuất hiện bệnh bạc lá. Năm 1973, bệnh xuất hiện ở miền Bắc
Châu Úc (Khush, 1976)[25]. Tại Châu Mỹ La Tinh ở một số khu thí nghiệm
lúa thuộc Colombia, Panama, Mexico đã phát hiện bệnh bạc lá lúa vào những
năm 1957 (Buddenhagen và CS, 1979). Năm 1979 người ta cũng quan sát
thấy bệnh bạc lá lúa ở một số trại thí nghiệm thuộc Châu Phi (Buddenhagen
và CS, 1979-1982). Năm 1980, bệnh xuất hiện trên các giống lúa lùn Châu Á,
sau đó người ta quan sát thấy bệnh xuất hiện trên lúa dại Oryzae bathii,
Oryzae longistaminata (Buddenhagen và CS,1982).
2.1.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh bạc lá được phát hiện vào năm 1954 trên các giống
lúa mùa cũ nhưng không gây thiệt hại nghiêm trọng. Trong những năm gần
đây, do phong trào thâm canh phát triển cùng với việc sử dụng quá nhiều
phân bón đặc biệt là đạm vô cơ và các giống lúa mới chống chịu bệnh kém
được trồng trên diện tích rộng đã làm cho bệnh bạc lá lan rộng và phá hoại
nặng ở cả vụ xuân lẫn vụ mùa[8].
Gần đây, bệnh tiếp tục gây hại trên diện tích lớn do các giống lúa nhập
nội từ Trung Quốc chưa qua khâu kiểm dịch[9]. Theo thống kê báo cáo một
số kết quả nghiên cứu lúa lai có những năm có tới 350000ha bị bệnh nặng ở
cả hai vụ, trong đó hàng trăm ha bị mất trắng như ở Đan Phượng, Phú Xuyên,
Bắc Ninh…[14]. Năm 1968-1975 bệnh gây dịch lớn ở đồng bằng sông Hồng.

Ở Việt Nam, có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về bệnh bạc lá như:
Nguyễn Bá Trinh (1973), Nguyễn Thừa Thụy (1980), Lê Lương Tề (1980,
1985, 1987), Tạ Minh Sơn (1987)…Hầu hết các cơng trình đều tập trung

5


nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái, dịch tễ học và tính chống chịu của
các giống lúa.
Trong 3 năm 2001-2003, nhóm nghiên cứu bạc lá trường ĐHNN Hà
Nội đã phân lập và bảo quản được 154 isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae
pv. Oryzae ở 11 tỉnh phía Bắc Việt Nam trên 27 giống. Đồng thời, xác định
được các gen kháng hữu hiệu bệnh bạc lá ở các tỉnh phía bắc là Xa-4, xa-5,
Xa-7, Xa-21. Khả năng kháng của gen xa-5 tương đương với các giống chứa
gen xa-5/10, xa-5/7, vì vậy thay vào việc chuyển đồng thời 2 gen kháng ta chỉ
cần tìm cách chuyển gen xa-5 cũng đủ khả năng kháng.
Trường ĐHNN, từ năm 2001-2002 đã thu được 385 mẫu lá bệnh từ 28
giống lúa trồng ở 11 tỉnh, thành phố các hệ thống sông Hồng, Lô, Gấm, Đà và
sơng Lam thuộc miền Bắc Việt Nam.
Cơng trình nghiên cứu của Yoshimura, Bùi Trọng Thuỷ (2003) đã xác
định được ở miền Bắc Việt Nam tồn tại ít nhất 10 chủng vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. Oryzae. Bằng phương pháp nghiên cứu đơn tế bào
kết hợp với kỹ thuật PCR để nhận diện loại vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
Oryzae, phân lập được 154 isolate và xác định được chúng thuộc 10 chủng vi
khuẩn gây bệnh bạc lá khác nhau ký hiệu từ 1 đến 10. Trong đó chủng 2 gồm
3 chủng phụ: 2A, 2A’, 2B; chủng 3 gồm 3 chủng phụ: 3A, 3A’, 3B; chủng 5
gồm 2 chủng phụ: 5A, 5B; chủng 7 gồm 2 chủng phụ: 7, 7’ (Phan Hữu Tôn,
2006)[29]. Đến nay, bằng phương pháp phân lập mẫu bệnh và ứng dụng sinh
học phân tử đã ni cấy, sau đó bằng kỹ thuật PCR xác định được 16 chủng
vi khuẩn gây bệnh bạc lá.

2.1.2. Nguyên nhân, triệu chứng và tác hại của bệnh bạc lá
2.1.2.1. Nguyên nhân
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây ra. Vi
khuẩn hình gậy, hai đầu hơi trịn, có một lơng roi ở một đầu, kích thước 16


2ì0.5-0.9àm. Trờn mụi trng nhõn to cú khun lc hỡnh trịn, màu vàng
xốp, rìa nhẵn, là vi khuẩn Gram âm, khơng có khả năng khử NO 3-, khơng dịch
hố gelatin, khơng tạo NH3, indol, có khả năng tạo H2S[8].
Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26-30 0C, nhiệt độ
tối thiểu từ 0-50C, tối đa 400C. Nhiệt độ gây chết là 530C trong 10 phút, có thể
sống trong phạm vi pH bằng 5.7-8.5, thích hợp nhất là pH bằng 6.8-7.2[8].
Vi khuẩn xâm nhiễm qua thuỷ khổng, lỗ khí trên mép lá, mút lá và đặc
biệt qua vết thương sây sát trên lá. Khi đã tiếp xúc với bề mặt lá có màng
nước, vi khuẩn dễ dàng di động bên trong các lỗ khí hay qua các vết thương
mà sinh sản và nhân lên về số lượng rồi qua các bó mạch dẫn lan rộng đi.
Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên bề
mặt lá bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn, thông qua sự va chạm giữa các lá
lúa nhờ mưa gió mà lan tới các lá, cây khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại
nhiều đợt trong thời kì sinh trưởng của cây lúa[8].
Về nguồn bệnh bạc lá có nhiều ý kiến khác nhau. Các nhà nghiên cứu
Nhật Bản cho rằng: một số loài cỏ dại thuộc họ hoà thảo (Leersia oryzoides
và Leersia sayanaka) là ký chủ phụ của vi khuẩn bạc lá lúa, cho nên cỏ dại là
nguồn dự trữ bệnh qua đông rất quan trọng. Mặt khác, đất và nước ruộng là
một phần dự trữ bệnh ban đầu. Ở Trung Quốc, những cơng trình nghiên cứu
của Phương Trung Đạt khẳng định nguồn bệnh chủ yếu là ở hạt giống.
Ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu của bộ môn bệnh cây - ĐHNN Hà Nội
đã kết luận: nguồn bệnh bạc lá lúa tồn tại ở hạt giống và tàn dư cây bệnh là
chủ yếu, ngoài ra nguồn bệnh tồn tại ở dạng hạt keo vi khuẩn trong các ký chủ
cỏ dại (cỏ lồng vực, cỏ môi, cỏ gừng bò…)[8].

2.1.2.2. Triệu chứng
Bệnh bạc lá phát sinh phá hoại từ thời kì mạ đến chín nhưng có triệu
chứng điển hình là ở thời kì lúa cấy từ sau khi đẻ nhánh đến chín sữa.
7


Trên mạ triệu chứng không đặc trưng như trên lúa, do đó dễ nhầm lẫn
với các loại bệnh sinh lý khác. Triệu chứng biểu hiện ở mép lá tạo thành
những vết dài, ngắn khác nhau, màu xanh vàng rồi nâu bạc, lá dễ bị khô.
Trên lá lúa triệu chứng thể hiện rõ rệt hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều
theo giống lúa, điều kiện bên ngồi nhưng nói chung bệnh có đặc điểm điển
hình sau: vết bệnh xuất hiện ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá, hoặc lan
thẳng xuống gân chính, một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ngay giữa
phiến lá. Vết bệnh lan rộng theo đường lượn sóng hoặc thẳng. Mơ bệnh tái
xanh, vàng lục và cuối cùng cháy khơ có màu nâu xám. Trên một số giống lúa
mới ngắn ngày, chịu phân, được bón nhiều phân đạm thì vết bệnh biểu hiện
nhanh, phiến lá đột ngột xanh sẫm, khô tái đi, lá mất sắc bóng, có màu xanh
mờ đục, mơ bệnh không kịp chuyển sang màu vàng mà đã khô xác, nâu bạc,
chết lụi, khô táp.
Trong điều kiện ẩm, nhiệt độ tương đối cao, vết bệnh dễ xuất hiện giọt
dịch vi khuẩn hình trịn, nhỏ, keo đặc lại, có màu hơi vàng lục, khi rắn cứng
có màu nâu hổ phách, màu mật ong[8].
2.1.2.3. Tác hại
Bệnh bạc lá tìm thấy ở khắp các vùng trồng lúa trên thế giới. Bệnh gây
ra những thiệt hại đáng kể về năng suất và phẩm chất lúa gạo. Hàng năm, theo
thống kê năng suất lúa trên toàn thế giới giảm từ 10-20% do bệnh vi khuẩn,
trong đó có tới 50% là do bệnh bạc lá gây nên (Mew, 1989). Tại Ấn Độ, bệnh
có thể làm giảm năng suất đến 60% (Mew và CS, 1981), có năm có tới hàng
triệu ha bị bệnh nặng làm năng suất giảm từ 6-60% (Srivasta, 1972). Ở Nhật
Bản, theo những nghiên cứu của Tagami và Mizukumi cho thấy trong những

năm gần đây có năm có từ 300000-400000ha lúa bị bệnh nặng làm giảm 2030% năng suất, có nơi lên tới 50%.Theo thống kê của Mofot và Ramey, tại
Australia năm 1986 bệnh làm giảm 30-50% năng suất lúa.

8


Ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa được phát hiện từ lâu trên các giống lúa
mùa cũ. Hiện nay, bệnh gây hại ở cả lúa lai và lúa thuần, đặc biệt gây hại
nặng trên các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc. Theo tổng kết một số nghiên
cứu về giống lúa lai có những năm nước ta có khoảng hơn 350000ha lúa bị
nhiễm nặng ở cả vụ mùa và vụ xuân, trong đó hàng trăm ha mất trắng như vụ
mùa năm 2002 tại Đan Phượng, Phú Xuyên, Hà Tây, Bắc Ninh, Ninh Bình.
Cũng theo số liệu năm 2004 trên tạp chí BVTV số 03, bệnh bạc lá lúa xuất
hiện ở tỉnh Hà Nam, Hải Phòng, Phú Thọ, Điện Biên, Bắc Giang, Nghệ An,
Thanh Hố với tổng diện tích là 3770ha, trong đó diện tích nhiễm nặng là
560ha. Tỷ lệ bệnh phổ biến là 8-20% số lá, nơi cao là 50-70% số lá.
Tác hại của bệnh phụ thuộc: giống, thời điểm cây bị nhiễm bệnh và
nhiễm bệnh nặng hay nhẹ. Theo nghiên cứu của Tika, Mew và CS (1999) thì
năng suất lúa giảm chủ yếu do sự thay đổi về số nhánh, số hạt chắc/bông và
khối lượng 1000 hạt.
2.1.3. Quy luật phát sinh, phát triển và các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát
sinh phát triển của bệnh bạc lá
2.1.3.1 Quy luật phát sinh, phát triển của bệnh bạc lá
Ở mỗi nước tồn tại một số chủng gây bệnh nhất định, như ở Philippin 6
chủng, Ấn Độ 9 chủng, Nhật Bản 12 chủng. Gần đây, trong nghiên cứu về
bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc, Nguyễn Văn Viết và CS (2005) đã nhận thấy
các nhóm chủng Xanthomonas oryzae pv. Oryzae thường xuất hiện đan xen, ở
một địa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng
có thể xuất hiện ở nhiều địa phương.
Ở miền Bắc Việt Nam, bệnh bạc lá có thể phát triển ở cả vụ xuân và vụ

mùa. Vụ đông xuân bệnh thường phát sinh phát triển vào tháng 3-4, nhưng
phát triển mạnh hơn vào cuối giai đoạn sinh trưởng của cây lúa vào tháng 5-6
(dương lịch) khi lúa xuân đã trỗ và chín. Vụ mùa bệnh phát sinh sớm từ trung

9


tuần tháng 8 lúc lúa đang đẻ nhánh và tiếp tục phát triển mạnh vào thời kỳ
làm đòng, trỗ đến chín.
Diễn biến của bệnh trên đồng ruộng nhiều năm đều theo một quy luật
tương đối rõ: bệnh phát sinh phát triển trong điều kiện nhiệt độ khơng khí
tương đối cao 26-300C, ẩm độ cao và nhất là trong những đợt mưa, gió bão,
và lúc lúa ở giai đoạn địng, trỗ trở đi. Trong suốt thời gian mà nhiệt độ thích
hợp cho sự phát triển của bệnh, thì ẩm độ cao lượng mưa lớn, rải đều liên tiếp
sẽ làm cho bệnh phát triển mạnh[8].
2.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh
Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định đến sự phát sinh, phát triển
của bệnh bạc lá. Những đợt mưa to gió lớn không những gây nên những vết
thương cho lá mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn phát sinh, phát triển mạnh. Số
lượng dịch vi khuẩn tiết ra trên lá không những tạo thêm nhiều cơ hội cho bệnh
xâm nhiễm dễ dàng mà nó cịn là yếu tố trực tiếp giúp bệnh truyền lan đi nhanh
và xa cùng với sự tác động của nước chảy trên các cánh đồng[8].
Ảnh hưởng của kỹ thuật trồng trọt đối với sự phát sinh, phát triển của
bệnh tương đối phức tạp. Một mặt ảnh hưởng trực tiếp tới tình hình sinh
trưởng làm tăng hay giảm sức chống chịu bệnh, mặt khác cũng ảnh hưởng tới
tiểu khí hậu của ruộng. Trong các yếu tố kỹ thuật thì phân bón (nhất là phân
đạm vơ cơ) có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh, phát triển của bệnh. Căn cứ
vào các nhận xét nhiều năm thí nghiệm ở Viện bảo vệ thực vật, Trường
ĐHNN Hà Nội thì bón đạm với số lượng nhiều, cây lúa xanh tốt, thân lá mềm
yếu, hàm lượng đạm tự do tích lũy khá cao đều làm cho cây lúa bị bệnh nặng

hơn so với bón ít đạm. Với cùng một lượng đạm nhưng cách bón, thời kì bón
khác nhau cũng có ảnh hưởng khá rõ tới mức độ bị bệnh. Việc bón phân sớm
và tập trung sẽ giảm khả năng nhiễm bệnh hơn bón phân muộn và rải rác. Bón
đạm cân đối với lân và kali thì bệnh nhẹ hơn nhiều so với bón đạm đơn thuần,
tuy nhiên nếu bón đạm vô cơ với hàm lượng quá cao (100kg N/ha hoặc 120kg
10


N/ha trở lên) đối với các giống lúa nhiễm thì dù có bón thêm lân và kali tác
dụng cũng khơng rõ rệt, bệnh vẫn có thể phát triển nặng.
Ở những chân đất màu mỡ, nhiều chất hữu cơ thì bệnh thường phát
triển nhiều hơn ở những chân đất xấu, bón ít phân, đất cằn cỗi. Trong điều
kiện đất chua, úng, ngập nước hoặc mực nước sâu, đặc biệt lúa ở vùng đất
hẩu, nhiều mùn, hàng lúa bị che khuất thì bệnh có thể phát sinh sớm và mạnh
hơn. Mực nước ruộng ngập sâu cây dễ bị bệnh nặng hơn khi giữ mực nước
cạn (5cm).
Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng tới sự phát sinh, phát triển của
bệnh bạc lá. Hiện nay, các giống lúa thuần và lúa lai có nguồn gốc từ Trung
Quốc (Khang Dân, Sán Ưu, Nhị Ưu 838, Q5) được trồng ở nhiều vùng đều
nhiễm bệnh bạc lá rất nghiêm trọng. Còn các giống lúa khác đang được trồng
hiện nay nói chung khơng có giống nào miễn dịch với bệnh bạc lá nhưng mức
độ chống bệnh có khác nhau. Phần lớn các giống lúa mới, thấp cây hoặc cao
cây, thời gian sinh trưởng dài hay ngắn đều có thể bị bệnh. Các giống lúa cũ,
lúa địa phương (Di Hương, Tám Thơm, Tám Xoan, Tẻ Tép, Ngân Tuyết…)
nhiễm bệnh nhẹ hơn. Theo điều tra của Viện bảo vệ thực vật thì các giống lúa
lai Trung Quốc nhập nội từ năm 1993-1997 hầu hết bị nhiễm bệnh bạc lá, với
mức tỷ lệ bệnh từ 50-80%, cấp bệnh phổ biến là 5-7, nếu bệnh nặng năng suất
giảm 20-50%[6]. Tuy nhiên một số giống mới năng suất khá, chịu phân, bón
phân nhiều nhưng có khả năng chịu bệnh tốt (IR22, IR579, IR5161, C71, X21,
X22…), các giống có một vài gen kháng xa-5, Xa-7, Xa-21…chống chịu với ít

nhất một trong số các chủng vi khuẩn bạc lá đã phát hiện ở nước ta[8].
2.1.3.3. Biện pháp phòng trừ
Đối với bệnh bạc lá biện pháp cơ bản nhất để phòng trừ bệnh là dùng
giống kháng bệnh, xây dựng ruộng nhân giống không bệnh và điều chỉnh sinh
trưởng của cây lúa bằng các biện pháp kỹ thuật canh tác nhất là kỹ thuật bón

11


phân và tưới nước. Đồng thời, trên cơ sở các biện pháp đó trong các trường
hợp cụ thể cần làm tốt công tác xử lý hạt giống và dùng vôi, kali, phân hữu cơ
bón lót, bón thúc sớm, giữ mực nước nơng, phun thuốc hố học để phịng trừ
bệnh bạc lá và các bệnh khác. Trong đó sử dụng giống kháng bệnh là biện
pháp chủ động, hiệu quả và khả thi nhất, không gây ô nhiễm môi trường lại
tạo ra sản phẩm sạch.
2.2. Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp
chỉ thị phân tử DNA
2.2.1. Cơ sở sinh hoá và sinh thái
Theo Kiryu và Mizuta (1995), khi phân tích các đặc trưng hình thái của
giống kháng, giống trung gian và giống nhiễm nhận thấy các giống có bản lá
hẹp, ngắn, đứng thường có bản chất kháng[26].
Thành phần dinh dưỡng bên trong của cây ký chủ cũng là một yếu tố
rất quan trọng trong việc xác định tính kháng và nhiễm.Theo Fang và CS
(1963), các giống nhiễm có hàm lượng amino acid tự do cao hơn giống
kháng, hàm lượng polyphenols thấp hơn và hàm lượng đường giảm xuống.
Những phân tích của IRRI ở Philippin cho thấy, hàm lượng đường giảm đi ở
mức độ cao đối với đạm tổng số ở các giống nhiễm[23]. Theo Uchara (1960),
sự tạo ra phytoalexin (chất kim hãm sự nhân lên của vi khuẩn) được xác định
ở các giống kháng nhưng khơng xác định ở các giống nhiễm. Ngồi ra có sự
thay đổi về hàm lượng các hợp chất Cacbonhydrates, Nitrogenous và Phospho

trong lá bệnh (Misawa và miyazaki, 1972)[28].
Khi nghiên cứu về tính kháng, Watanabe và CS (1976, 1977) thấy rằng
khi lây nhiễm vi khuẩn vào ký chủ nếu khơng có sự tương hợp giữa ký sinh
và ký chủ thì ký chủ sẽ tiết ra các hợp chất để chống lại vi khuẩn. Các tác giả
đã xác định được các hợp chất kìm hãm chỉ trong 24 giờ ở các giống kháng,
trong khi đó phải sau lây nhiễm 5 ngày chất này mới được xác định ở các

12


giống nhiễm khi vết bệnh thể hiện rõ ràng. Gần đây, những nghiên cứu của
Reimers và Leach (1991) cho thấy, trong phản ứng không tương hợp giữa vi
khuẩn gây bệnh và cây lúa thì chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn tương
quan với chất tích luỹ ban đầu của các hợp chất huỳnh quang và phản ứng tự
chết của tế bào ký chủ[30]. Bên cạnh đó, trong phản ứng khơng tương hợp,
chất kìm hãm được hình thành rất nhanh ở các giống kháng nhưng khơng
được hình thành ở các giống nhiễm. Ngoài ra hoạt động của Peroxidase, các
hợp chất Phenolic,…được hình thành trong quá trình sinh tổng hợp Ligin
cũng đóng vai trị quan trọng trong q trình chống lại sự xâm nhập cũng như
sự nhân lên của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae.
2.2.2. Cơ sở phân tử
Trong phản ứng với bệnh, cây kí chủ biểu hiện mức độ khác nhau đối với
sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh. Hầu hết các ghi nhận về tính kháng của
các giống lúa đối với vi khuẩn bạc lá ít nhiều thay đổi theo tính kháng ngang
và kháng dọc.
* Tính kháng ngang, kháng dọc
Theo J.E Vander Plank (1963): tính kháng dọc (vertical resistance) biểu
hiện khi nhiều giống cây trồng có tính kháng hồn tồn với vài nịi gây bệnh,
trong khi đó chúng có thể nhiễm vài nịi sinh lý khác. Nhiều giống có tính
kháng rất cao và cũng có thể nhiễm vài nịi khác ở điều kiện mơi trường khác

nhau. Tính kháng dọc cịn được gọi là tính kháng cao, kháng chính, kháng
chuyên biệt, kháng định tính, kháng chỉ thị. Tính kháng dọc do một hoặc vài
gen kiểm sốt nên cịn gọi là kháng đơn gen. Những gen này gọi là R gen, đóng
vai trị chính cho sự biểu hiện tính kháng. Kháng dọc ở kí chủ thường cho phản
ứng siêu nhậy hoặc miễn nhiễm, hoặc làm giảm dần sự sinh sản của kí sinh,
ngăn chặn bước phát triển khởi đầu của kí sinh xâm nhập. Tính kháng dọc giúp
ngăn chặn sự phát triển của dịch hại do giới hạn nguồn bệnh ban đầu.

13


Tính kháng ngang (horizontal resistance): biểu hiện khi tất cả các cây
trồng đều có khả năng kháng khơng chun biệt chống lại tất cả các vi sinh
vật gây bệnh hoặc tấn cơng cây đó. Tính kháng ngang cịn được gọi là kháng
không chuyên biệt, kháng tổng quát hoặc kháng thành thục. Tính kháng
ngang do nhiều gen kiểm sốt, vì vậy người ta gọi là kháng đa gen. Mỗi một
gen đơn độc có thể chống lại kí sinh một cách khơng hiệu quả hoặc đóng vai
trị tối thiểu trong tổng số tính kháng ngang. Các gen kháng đều có vai trị
quan trọng để kiểm soát nhiều bước xảy ra trong tiến trình có liên quan đến
bệnh lý cây trồng nhằm cung cấp vật liệu cũng như cấu trúc cho hoạt động
của cơ chế tự bảo vệ. Bên cạnh đó, dưới tác động của mơi trường, tính kháng
ngang bị ảnh hưởng và có thể dễ thay đổi hơn tính kháng dọc. Một cách tổng
qt, tính kháng ngang khơng bảo vệ cây trồng khi cây nhiễm nhưng giảm
dần sự phát triển của kí sinh tại điểm xâm nhập. Do đó tính kháng ngang
khơng làm giảm bớt nguồn bệnh ban đầu như tính kháng dọc nhưng làm giảm
tốc độ phát triển của dịch bệnh và thời gian tồn tại của tính kháng ngang là
lâu dài hơn. Như vậy, tính kháng ngang bền vững hơn tính kháng dọc.
* Tính kháng bền vững, tính kháng khơng hồn tồn
Theo Johnson (1984) tính kháng bệnh bền vững là khả năng duy trì tính
kháng một thời gian dài trong mơi trường sống thuận lợi cho kí sinh gây bệnh.

Khả năng kháng bền vững có thể có được ở những giống chứa hai hay nhiều
gen kháng đặc thù với từng nòi sinh lý. Chỉ khi các nòi này đồng loạt tạo nên
nhiều đột biến độc lập mới có thể phá vỡ hàng rào kháng bệnh của giống đó.
Trên thực tế tính kháng bền vững thường kết hợp với tính kháng khơng
chun tính và có tính chất số lượng, nhưng sự hiểu biết về mối quan hệ này
vẫn chưa rõ ràng về mặt sinh hố. Thơng qua phân tích di truyền Wang và
cộng tác viên kết luận rằng có thể dựa trên kiểu hình của tính kháng bệnh bền
vững để giải thích tính di truyền của nó. Do đó, để tạo ra giống kháng bệnh
bền vững người ta chú ý đến việc tìm kiếm nguồn gen kháng phong phú với
14


mỗi chủng, mỗi nòi, mỗi vùng sinh thái khác nhau sau đó tổ hợp vào một
giống. Đây là mục tiêu chiến lược đang được quan tâm hiện nay.
Tính kháng khơng hoàn toàn được định nghĩa đầu tiên do J.E Parlevliet
(1979). Biểu hiện của tính kháng bệnh khơng hồn tồn là sự sinh bào tử bị
giảm, mặc dù kí chủ nhiễm nhưng thời kì ủ bệnh kéo dài, thời kì nhiễm bệnh
của kí chủ ngắn đi. Gần đây người ta gọi tính kháng khơng hồn tồn là tính
kháng số lượng (quatitativeloci resistance_QR).
2.2.3. Di truyền tính kháng bệnh bạc lá
Bản chất di truyền tính kháng bệnh bạc lá là do gen quy định, các gen
có thể nằm trên cùng một NST hay trên các NST khác nhau. Việc xác định
chính xác vị trí của các gen kháng trên các NST phục vụ đắc lực cho công tác
chọn tạo giống. Đến nay đã có 29 gen kháng bệnh bạc lá được xác định ký hiệu
từ Xa-1 đến Xa-29 (K.S Lee và CS, 2003) gồm 22 gen trội và 7 gen lặn là xa-5,
xa-8, xa-13, xa-15, xa-19, xa-20, xa-24 (N.Furuya, S.Taura và CS, 2003). Hiện
nay, đã xác định được vị trí của một số gen kháng quan trọng như: gen Xa-4
liên kết với REPL ở Locus Npb181 và Npb76 trên NST số 11, với khoảng cách
di truyền là 1,7cM (Yoshida et al, 1992). Gen xa-5 liên kết với chỉ thị phân tử
RZ390, RG556, RG207 trên NST số 5, với khoảng cách di truyền 0-1cM (Mc

Couch et al, 1991). Gen Xa-7 liên kết với chỉ thị P3 trên NST số 6, với khoảng
cách di truyền 2,5cM (Taura et al, 2003). Gen Xa-21 liên kết với chỉ thị
pTA248 với khoảng cách di truyền 0-1cM (Ronal et al, 1992).
Khả năng kháng bệnh bạc lá có thể do một gen trội, một gen lặn, một
gen trội khơng hồn toàn hay do nhiều gen liên kết cùng quy định[31]. Các
gen kháng bệnh bạc lá là gen trội hay gen lặn đều có ý nghĩa. Trong đó gen
trội có ý nghĩa trong chọn tạo giống lúa lai và lúa thuần cịn gen lặn chỉ có ý
nghĩa trong chọn tạo giống lúa thuần.
Di truyền tính kháng bệnh bạc lá tuân theo thuyết “gen đối gen” của

15


Flor. Ông cho rằng “ đối với một gen kiểm sốt tính kháng bệnh ở ký chủ thì
có một gen đặc thù kiểm sốt tính gây bệnh ở ký sinh”. Do mỗi vùng địa lý
khác nhau tồn tại những nòi sinh lý khác nhau. Nên có những giống kháng
bệnh rất hiệu quả ở vùng này nhưng lại nhiễm bệnh nặng ở vùng khác. Vì
vậy, để tạo ra giống kháng bệnh phù hợp cho từng vùng sinh thái cần xác định
được nòi sinh lý, khu vực phân bố và khả năng kháng của gen đối với nịi đó.
Viện lúa quốc tế IRRI đã tạo ra các dòng đẳng gen chứa các gen kháng bệnh
bạc lá khác nhau bằng phương pháp lai lại giữa giống IR24 và giống chứa gen
kháng bệnh bạc lá khác nhau. Các dịng đẳng gen có nền gen chung là IR24,
chỉ khác nhau ở gen kháng bệnh bạc lá. Do đó có thể phân biệt được các nịi
sinh lý dựa vào phổ kháng-nhiễm đặc trưng của từng gen kháng. Đây là
phương pháp có ý nghĩa lớn trong việc phát triển giống kháng bệnh bạc lá.
2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh
bạc lá
2.4.1. Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA
Bất kỳ đoạn DNA nào được sử dụng để phân biệt sự khác nhau về kiểu
hình (tính trạng) giữa các cá thể, dịng, giống và giữa các lồi đều được gọi là

chỉ thị phân tử DNA đánh dấu gen[16]. Hiện nay chỉ thị phân tử DNA được sử
dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền và chọn giống. Chỉ thị DNA đánh dấu
gen gồm 9 phương pháp, sắp xếp theo thứ tự thường được sử dụng như sau:
Marker
RFLP
ALP
AFLP
RAPD
DA F
SSR
AP-PCR
SSCP
MRDHV-DNA

Các loại DNA markers thông dụng
Tên đầy đủ
Restriction fragment length polymorphism
Amplicon length polymorphism
Amplified fragment length polymorphism
Random amplified polymorphic DNA
DNA amplification fingerprinting
Simple sequence repeat (microsatellite)
Arbitrary primer-PCR
Single strand conformation polymorphism
Moderately repeated, dispersed, and highly variable
16


DNA(minisatellite)
* Chỉ thị RFLP (sự đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn, lai

DNA/DNA). Phương pháp lai DNA là một kỹ thuật nhằm gắn kết với chọn
lọc những mẫu đặc thù của sợi DNA đơn hoặc RNA dựa trên cơ sở ghép cặp
bổ sung những đoạn DNA sợi đơn tương ứng đã được chuyển dính vào màng
lọc Nitrocellulose hoặc màng Nilon. Để tiến hành phương pháp này, trước hết
DNA của bộ genom được tách chiết, sau đó tiến hành cắt bằng một hoặc vài
emzym cắt hạn chế, để tạo ra các đoạn DNA khác nhau, những mẫu này được
phân tách trên gel Agarose. Tuỳ theo các đoạn DNA dài, ngắn khác nhau mà
sự di chuyển trên gel là khác nhau. Sau đó người ta chuyển các vạch DNA lên
màng Nitrocellulse hoặc màng Nilon và dính chặt vào đó, như vậy ở gel có
bao nhiêu vạch DNA thì trên màng có bấy nhiêu vạch. Màng lai được lai với
các mẫu dị mục tiêu, đã được đánh dấu phóng xạ. Màng sau khi lai được rửa
và chụp hình trên phim X-quang.
Chỉ thị RFLP thường được sử dụng để nghiên cứu độ phong phú về di
truyền, sự phân hoá trong di truyền huyết thống (phylgenetics), lập bản đồ
gen. Hiện nay, người ta đã lập được bản đồ di truyền liên kết rất chặt giữa các
chỉ thị phân tử RFLP với nhiều gen quy định các tính trạng nơng sinh học
quan trọng, tạo cơ sở di truyền cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử đánh dấu
gen trong chọn lọc gián tiếp.
* Chỉ thị ALP (Amplicon Length Polymorphism): đa hình về chiều dài
những đoạn DNA được nhân lên trên cơ sở nhân gen PCR. Sự đa hình được
phát hiện ngay bằng cách điện di sản phẩm nhân gen PCR trên gel Agarose
hoặc Acrylamide.
* Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): phương
pháp AFLP được Zabeau và Vos cùng CS đề xuất vào năm 1993-1995. Bản
chất của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản các đoạn
DNA đã được cắt bởi emzym cắt giới hạn. Phương pháp này được tiến hành
17


trên cơ sở đầu tiên người ta dùng Enzym cắt hạn chế để cắt DNA genom, sau

đó đính đoạn DNA adapter tương ứng với từng Enzym một, rồi thiết kế đoạn
mồi trên cơ sở các adapter có bổ sung thêm 1-2 nucleotid ngẫu nhiên gắn vào
đầu 3’của adapter, dùng kỹ nghệ PCR để nhân các đoạn DNA được cắt lên sẽ
tạo ra sự đa hình phong phú. Chỉ thị AFLP là một kĩ thuật hữu ích trong
nghiên cứu di truyền và chọn giống, được ứng dụng để nghiên cứu đa dạng di
truyền và lập bản đồ liên kết.
* Chỉ thi RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): phương pháp
này được William, Wegsh McClelland đề xuất năm 1990. Phương pháp
RAPD - Sự đa hình các đoạn DNA được nhân lên ngẫu nhiên trên cơ sở
phương pháp PCR nhưng chỉ dùng một đoạn mồi. Chỉ thị RAPD cho phép
đánh giá được tính đa hình của DNA các mẫu nghiên cứu, xem xét được sự
đồng dạng và sai khác về mặt di truyền của các đối tượng nghiên cứu.
* Chỉ thị DAF (DNA Amplification Fingerprinting): phương pháp nhân
DNA in vân tay, dùng rất nhiều đoạn mồi đơn ngắn. Sử dụng chỉ thị DAF để
xây dựng bản đồ liên kết, phân lập các kiểu gen, xác định quan hệ họ hàng
của sinh vật, nghiên cứu đa hình của các đoạn lặp lại đơn giản trong genom,
tìm chọn các dịng bất dục, duy trì phục hồi TGMS và PGMS trong nghiên
cứu và sản xuất lúa lai, xác định đa dạng di truyền giữa hai bố, mẹ trên cơ sở
đó dự đốn được ưu thế lai, xác định các gen số lượng, các gen chủ đạo tạo ra
ưu thế lai và dự đoán khả năng phối hợp.
* Chỉ thị SSR (Single Sequence Repeats): phương pháp nhân hoặc lai
những đoạn DNA lặp lại trong genom để tìm sự đa hình. Cho đến nay chỉ thị
này đang được sử dụng rộng rãi hơn trong lĩnh vực di truyền phân tử của
nhiều đối tượng khác nhau như đánh dấu gen, xác định giống, chuẩn đoán
bệnh di truyền.
*Chỉ thị AP-PCR (Arbitrary Primer – PCR): phương pháp dùng hai đoạn
mồi tùy hứng để nhân gen DNA bằng PCR nhằm xác định sự đa hình của các
18

kiểu gen.
* Chỉ thi SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism): đa hình về
cấu trúc sợi đơn DNA tại đó mở xoắn tạo thành hai sợi đơn. Những nơi mở
xoắn này được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng của genom sinh vật .
* Chỉ thị MRDHV-DNA (Moderately Repeat, Dispersed DNA Highly
Variable DNA ): phương pháp dùng kỹ nghệ DNA để nghiên cứu sự đa dạng
của những đoạn DNA ngẫu nhiên, mẫu vệ tinh nhỏ dễ biến động , phân tán và
lặp đi lặp lại trong bộ genom của sinh vật.
Việc áp dụng DNA trong đánh dấu gen cho phép tìm và phát hiện những
cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể phân ly, trên cơ sở
tìm sự có mặt của một mẫu DNA đánh dấu nào đó liên kết chặt với gen đó
chứ khơng phải dựa vào kiểu hình của nó. Chính vì thế mà có thể đánh giá
từng cá thể trong quần thể ở bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào, trong bất kỳ
môi trường hay điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng một lúc đánh giá
được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật. Dùng phương pháp
chọn lọc DNA đánh dấu gen có thể loại trừ được ảnh hưởng của mối tương
tác giữa các alen khác nhau của một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên
sự biểu hiện của các tính trạng. Áp dụng phương pháp này có thể tăng hiệu
quả và độ chính xác trong chọn lọc, đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu
hiện ra kiểu hình. Vì tính đa hình của các DNA rất cao, nên đã tạo khả năng
cho các nhà chọn giống phân biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể
sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc
cây tái tổ hợp, phân biệt được các alen các chủng sinh lý gây bệnh…
2.4.2. Chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh bạc lá lúa
Hiện nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, người ta đã xác định
được các chỉ thị phân tử liên quan đến nhiều tính trạng quan trọng ở cây lúa
mà đặc biệt là các chỉ thị liên quan đến tính kháng bệnh. Đối với bệnh bạc lá,

19

theo Phan Hữu Tôn tổng hợp năm 2001, xác định 7 gen kháng bệnh bạc lá và
đánh dấu bằng phương pháp RFLP, kết quả tổng hợp ở bảng sau:
Bản đồ liên kết di truyền giữa gen quy định tính trạng nơng sinh học
quan trọng với RFLP đánh dấu
Gen Tính trạng
Nguồn
NST
RFLP và độ Tài liệu tham
cho
liên kết
khảo
Xa-1
Chống bạc Kogyoku
4
Npb235
Yoshimura et
lá
3.3cM
al. 1992
Npb197
7.2 cM
Xa-2
Chống bạc
Tetep
4
Npb235
Yoshimura et
lá
3.4cM

al. 1992
Npb197
9.4 cM
Xa-3
Chống bạc Chugoku4
11
Npb181
Yoshimura et
lá
5
2.3cM
al. 1992
Npb78
3.5cM
Xa-4
Chống bạc
IR20
11
Npb181
Yoshimura et
lá
1.7cM
al. 1992
Npb78
1.7cM
Xa-5
Chống bạc
IR15455
RG556
McCouch et

lá
339
0-1cM
al.1991
Xa-13 Chống bạc
Long
8
RZ28
Zhang et al.
lá
grain
5.1cM
1994
Xa-21 Chống bạc
O.
11
pTA818,pTA2 Ronald et al.
lá
longistami
48
1992
nata
0-1 cM
RG103
2.4.3. Kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh
2.4.3.1. Giới thiệu chung về kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo ngoài cơ thể các đoạn
DNA với tốc độ nhanh chưa từng thấy và độ chính xác gần như tuyệt đối
được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR).
Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và tiếp tục

được hồn thiện, phát triển thơng qua việc sản xuất thành công Enzyme tổng
20