Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, 2009 - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG



NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG





MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC
CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH
TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013




LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC






HÀ NỘI – 2015
i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƢƠNG


NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG


MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC
CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH
TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013

Chuyên ngành: Vi sinh Y học
Mã số: 62.72.01.15


LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC




Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai
2. PGS.TS. Trần Hải Anh


HÀ NỘI – 2015
ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận án này là công trình nghiên cứu nghiêm túc,

trung thực. Tất cả số liệu và kết quả trong luận án chƣa từng đƣợc ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.




Nghiên cứu sinh



Nguyễn Thị Kim Phương

iii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng
- Ban Giám đốc, Trung tâm cúm Quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng
- Ban Giám đốc Bệnh viện, Khoa Vi sinh vật – Bệnh viện TWQĐ 108
Đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới nhà khoa học
PGS.TS.Lê Thị Quỳnh Mai ngƣời Thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt
kinh nghiệm quý báu cho tôi từ những bƣớc đi đầu tiên trong lĩnh vực vi rút học và
luôn khuyến khích tôi tích cực nghiên cứu tiếp cận những kiến thức nâng cao để tôi
hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Thầy PGS.TS.Trần Hải
Anh đã sửa chữa chi tiết, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Chủ nhiệm và các thành viên nghiên cứu trong đề
tài cấp nhà nƣớc về Cúm A/H1N1/09 đại dịch (Mã số ĐTĐL2009G/55), Phòng Thí
nghiệm Cúm Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng đã giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của TS. Tsutomu Kageyama Trung tâm
Cúm thuộc Viện Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản (NIID) hỗ trợ kỹ thuật
ban đầu của nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, TS. Hoàng Vũ Mai
Phương, ThS. Nguyễn Cơ Thạch, ThS. Lê Thị Thanh cùng các bạn đồng nghiệp
công tác tại Phòng Thí nghiệm cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung

ƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án.
Tôi xin gửi đến mọi thành viên trong gia đình, những người thân yêu, những
bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên chia sẻ về mọi mặt để tôi vƣợt qua mọi khó
khăn trong quá trình nghiên cứu đạt đƣợc thành quả ngày hôm nay.

Hà Nội, tháng 01 năm 2015

NGUYỄN THỊ KIM PHƢƠNG
iv

MỤC LỤC

Trang phụ bìa i
Lời cam đoan ii
Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii
Danh mục các bảng ix
Danh mục các hình vẽ, biểu đồ, sơ đồ x
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG I – TỔNG QUAN 3
1.1. Vi rút cúm 3
1.1.1. Đặc điểm vi rút học 3
1.1.2. Quá trình nhân lên của vi rút cúm A 10
1.2. Đại dịch cúm A/H1N1/09 13
1.2.1. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới 13
1.2.2. Phản ứng của TCYTTG trƣớc diễn biến của đại dịch A/H1N1/09. . 19
1.2.3. Tình hình đại dịch cúm A/H1N1/09 tại Việt Nam 20
1.2.4. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 21
1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi rút cúm A(H1N1)pdm09 PTN 24

1.3.1. Phân lập vi rút. 24
1.3.2. Phƣơng pháp phát hiện vật liệu di truyền 26
1.3.3. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 30
1.4. Vắc xin 32
1.4.1. Các loại vắc xin cúm 33
1.4.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm 37
1.4.3. Phản ứng phụ của vắc xin cúm mùa và cúm đại dịch 38
Trang
v

1.4.4. Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin 38
CHƢƠNG II – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 41
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 41
2.1.2 . Tiêu chuẩn lựa chọn chủng cúm A(H1N1)pdm09 41
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: 41
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: 41
2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 41
2.2.3. Cỡ mẫu trong nghiên cứu 42
2.2.4. Các biến số nghiên cứu 42
2.2.5. Vật liệu và kĩ thuật xét nghiệm 43
2.2.6. Trang thiết bị và dụng cụ tiêu hao. 60
2.3. Vấn đề Y đức trong nghiên cứu 60
CHƢƠNG III – KẾT QUẢ 61
3.1. Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu. 61
3.2. Kết quả PCR phân tách và khuếch đại 6 phân đoạn gen. 62
3.2.1. Đặc điểm di truyền gen HA(Haemagglutinin) 63
3.2.2. Đặc điểm di truyền gen NA(Neuraminidase). 69
3.2.3. Đặc điểm di truyền các gen M, NS, PB1 và PB2. 74
3.3. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 84

3.3.1. Kết quả thử nghiệm HI trên các vi rút phân lập trong nghiên cứu. 84
3.3.2. Phân bố sự thay đổi đặc tính kháng nguyên theo thời gian và các thay
đổi axit amin trong protein HA liên quan. 85
3.4. Các đột biến liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên hoặc giảm độ
nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir. 86
3.4.1. Phát hiện đột biến bằng phân tích trình tự nucleotide. 87
vi

3.4.2. Kết quả thử nghiệm sinh học đánh giá ảnh hƣởng của đột biến đến
biểu hiện kiểu hình của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. 89
3.5. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin 90
3.6. Thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu (Haemagglutinin Assay –HA) 93
CHƢƠNG IV – BÀN LUẬN. 95
4.1. Sự lƣu hành của cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009 -2013. 95
4.2. Lựa chọn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. 96
4.3. Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen 97
4.4. Kết quả phân tích cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 98
4.5. Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1, PB2 101
4.5.1 . Protein HA 101
4.5.2 . Protein NA. 106
4.5.3 . Các protein M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2. 108
4.6. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 109
4.7. Kết quả thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI). 112
4.8. Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin 113
KẾT LUẬN 118
KIẾN NGHỊ 120
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A(H1N1)pdm09 (Danh pháp chuẩn quốc tế) – A/H1N1/09 đại dịch
(The novel influenza A(H1N1)vi rút which is causing of human influenza pandemic in 2009)
ADN
Axit Deoxyribonucleic
ARN
Axit Ribonucleic
CDC
Centers for Disease Control
(Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ)
CPE
Cytopathogenic effect (Gây hủy hoại tế bào)
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assays
(Phản ứng hấp thụ miễn dịch gắn enzyme)
FAO
Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm thế giới)
GISRS
Global Influenza Surveillance and Response System
(Hệ thống giám sát cúm toàn cầu)
HA
Haemaglutinin
HI
Hemagglutinin Inhibition Assay (Phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu)
IC
50

Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%)
IFA
Immunofluorescent Assay (Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang)
ILI
Influenza Like Illness (Bệnh giống cúm)
IQR
Interquartile Range (Khoảng tứ phân vị)
ISIRV
International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases
(Hiệp hội quốc tế về bệnh cúm và các bệnh vi rút gây viêm đƣờng hô hấp
khác)
IVAC
Institute of Vaccines And Medical Biological
(Viện vắc xin và sinh phẩm Y tế, Nha trang)
MDCK
Mardin Darby Canin Kidney cell (Tế bào thận chó thƣờng trực)
MN
Microneutralization Assay (Phản ứng trung hoà vi lƣợng)
NA
Neuramindase
NAI
Neuraminidase Inhibition Assay
( Thử nghiệm ức chế enzyme Neuraminidase)
NIBSC
Nationnal Institute for Biological Standards and Control
(Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm soát sinh học Vƣơng quốc Anh)
viii

NLS
Nuclear Localization Signal (Tín hiệu định vị nhân)

NP
Nucleoprotein
NS
Non-structural
OIE
World Organisation for Animal Health (Tổ chức thú y thế giới)
PA
Polymerase acid
PB
Polymerase basic
PCR
Polymerase Chain Reaction (Phƣơng pháp khuếch đại gen)
Polivac
Viện nghiên cứu sản xuất vắc xin, Hà Nội
RNP
Ribonucleoprotein
RT- PCR
Reserve Transcriptase - Polymerase Chain Reaction
(Phƣơng pháp khuếch đại gen phiên mã ngƣợc)
RT-LAMP
Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification
(Phƣơng pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngƣợc)
SARS
Severe Acute Respiratory Syndrome
(Hội chứng hô hấp cấp tính nặng)
Sequence
Phƣơng pháp xác định trình tự gen
VABIOTECH
Company for vaccine and biologycal production No1
(Công ty TNHH một thành viên vắc xin và sinh phẩm số 1)

WHO
TCYTTG
World Health Organization
Tổ chức Y tế Thế giới
PTN
Phòng thí nghiệm









ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm 8
Bảng 1.2 Diễn biến dịch liên quan đến phát hiện, kiểm soát hoạt động của
trƣờng học trong giai đoạn A(H1N1)pdm09 tại Mexico 14
Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 42
Bảng 2.2 Bảng nhận định kết quả IC
50
của vi rút cúm 56
Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu. ……61
Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09
bằng phản ứng PCR 63
Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA 67
Bảng 3.4 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein HA 68

Bảng 3.5 Sự thay đổi (đột biến ) axit amin trên protein NA 72
Bảng 3.6 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein NA 73
Bảng 3.7 So sánh sự tƣơng đồng về axit amin trong các protein M1,M2, NS1,
NS2, PB1 và PB2 của vi rút trong nghiên cứu 82
Bảng 3.8 Tần suất thay đổi axit amin thƣờng gặp trong protein 83
Bảng 3.9 Kết quả hiệu giá HI của các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt
Nam, 2009-2013. 84
Bảng 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian. 85
Bảng 3.11 Hiệu giá HI của các vi rút mang đột biến G155E và N156K. 89
Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm NAI với vi rút mang đột biến H275Y 90
Bảng 3.13 Kết quả lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin bằng đánh giá độ tƣơng
đồng về di truyền học trên gen HA và NA. 91
Bảng 3.14 Độ tƣơng đồng nucleotide trong gen HA của vi rút cúm
A(H1N1)pdm09 nhóm 6C 92
Bảng 3.15 Kết quả HA và HI của các vi rút trong nhóm lựa chọn 93

Trang
x

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm 5
Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của vi rút cúm. 6
Hình 1.3 Quá trình phiên mã của Polymerase 9
Hình 1.4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm. 13
Hình 1.5 Diễn biến dịch tại khu vực các bang thuộc Bắc, Trung và Tây nam
Mexico từ 1/4/2009 – 31/12/2009 15
Hình 1.6 Phân bố dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mỹ (7/5/2009) 16
Hình 1.7 Các quốc gia chịu ảnh hƣởng của đại dịch và sự phân bố các trƣờng
hợp tử vong 18
Hình 1.8 Biểu đồ dịch tễ học cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu 19

Hình 1.9 Cấu trúc bộ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. 22
Hình 1.10 Nguyên lý giải trình tự gen 29
Hình 2.1 Quy trình giải trình tự gen 47
Hình 2.2 Thang trọng lƣợng phân tử chuẩn 1 kb- Invitrogen 52
Hình 2.3 Kết quả HI xác định hiệu giá vi rút A(H1N1)pdm09 với kháng huyết
thanh chuẩn A/California/07/09. 59
Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen HA và NA sử dụng cặp mồi
khuếch đại phù hợp cho giải trình tự gen 62
Hình 3.2 Cây gia hệ HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt
Nam, 2009-2013. 65
Hình 3.3 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen HA của các nhóm vi rút
cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin A/California/07/09
(Mega 5 sofwave) . 66
Hình 3.4 Cây gia hệ NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt
Nam, 2009-2013 70
Trang
xi

Hình 3.5 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen NA của các nhóm vi rút
cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin . 71
Hình 3.6 Cây gia hệ M của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt
Nam, 2009-2013 75
Hình 3.7 Cây gia hệ NS của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt
Nam, 2009-2013 77
Hình 3.8 Cây gia hệ PB1 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt
Nam, 2009-2013 79
Hình 3.9 Cây gia hệ PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt
Nam, 2009-2013 81
Hình 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian 86
Hình 3.11 Đột biến G155E, N156K và D222N trên protein HA của vi rút cúm

A(H1N1)pdm09. 88
Hình 3.12 Đột biến H275Y trên protein NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm0988
Hình 3.13 Kết quả khuếch đại của vi rút trong nhóm lựa chọn vắc xin dự
tuyển. 94
Hình 4.1 Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. 110


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1 Quy trình lựa chọn vi rút vắc xin dự tuyển 40




1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào đầu tháng 3
năm 2009 tại Mexico nhanh chóng lan rộng ra phạm vi toàn cầu và đã phát triển
thành đại dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21[80], [109]. Theo số liệu thống kê của
TCYTTG, ngày 06/08/2010 đại dịch cúm đã lan rộng 214 quốc gia và vùng lãnh
thổ, gây tử vong cho 18.449 trƣờng hợp [120], [121]. Tƣơng tự các đại dịch cúm
đã xảy ra ở giai đoạn trƣớc, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục lƣu hành cùng
với các vi rút cúm A/H3N2 và vi rút cúm B gây ra các dịch cúm mùa hàng năm
[109], [119].
Việt Nam là nƣớc thứ 54 trên thế giới thông báo các trƣờng hợp nhiễm vi
rút cúm A(H1N1)pdm09, trƣờng hợp nhiễm đầu tiên đƣợc ghi nhận vào ngày
31/5/2009 [2]. Dịch cúm bắt đầu lan rộng trong cộng đồng vào tháng 7/2009 và
trong giai đoạn tháng 8 đến tháng 9/2009 có 85 – 95% tổng số các trƣờng hợp
nhiễm cúm đƣợc ghi nhận tại Việt Nam là căn nguyên do cúm A(H1N1)pdm09.
Theo thống kê của Bộ Y tế, tổng số 11.104 trƣờng hợp nhiễm với 53 trƣờng hợp
tử vong báo cáo tại Việt Nam (28/12/2009) [4].

Trong giai đoạn 2010 – 2013, theo số liệu của chƣơng trình giám sát cúm
quốc gia (NISS) tại các điểm nghiên cứu vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc ghi
nhận với tỷ lệ là 46,6 % trong tổng số các trƣờng hợp nhiễm vi rút cúm năm
2009 và giảm với tỷ lệ 28 % trong năm 2010 khi có sự đồng lƣu hành của vi rút
cúm A/H3N2. Tại năm 2011, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục gây dịch với tỷ
lệ 74,1% và đạt 30% trong năm 2013. Kể từ khi xuất hiện đại dịch cúm năm
2009 và tiếp tục trong gây dịch các năm tiếp theo, những phân tích về di truyền
học đã phát hiện một số thay đổi (đột biến) liên quan đến sự đa dạng của biểu
hiện lâm sàng, độc lực và đáp ứng miễn dịch [8], [22].
Những sự thay đổi đƣợc ghi nhận nhƣ tăng tiến triển viêm phổi nặng, có thể
gây tử vong liên quan đến sự thay đổi của axit amin tại vị trí 222 trên protein HA
(D222/G/E/N), đột biến I129K tại khu vực thụ cảm thể bám trên gai HA sẽ làm




2
tăng ái lực gắn bám của vi rút vào tế bào biểu mô đƣờng hô hấp [8], [11]. Các
đột biến I117V, I223R và H275Y trên protein NA là nguyên nhân của hiện
tƣợng vi rút giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc oseltamivir cũng đƣợc ghi nhận
[68], [71]. Ngoài ra, một số thay đổi trên các protein NP, PA và PB2 đã ảnh
hƣởng tới độc tính của vi rút hoặc làm tăng khả năng nhân lên của vi rút trong tế
bào chủ. Hơn thế nữa, khả năng tiềm tàng của hiện tƣợng trao đổi và tích hợp
(reassortment) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác có thể
sẽ tăng độc tính hoặc nguy cơ tạo ra một vi rút cúm mới [5], [14], [18].
Hiện tại, vắc xin cúm mùa thƣơng mại có khả năng phòng nhiễm vi rút cúm
A(H1N1)pdm09 và các thông tin về dịch tễ học, vi rút học vẫn đƣợc yêu cầu cập
nhật thƣờng xuyên trong hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS) của
TCYTTG. Tại Việt Nam, vắc xin phòng chống cúm mùa đang đƣợc phát triển tại
một số đơn vị sản xuất vắc xin và sử dụng các vi rút dự tuyển theo khuyến cáo

của TCYTTG, trong khi đó một số nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc,
Australia lựa chọn các vi rút cúm lƣu hành tại nƣớc mình để phát triển vắc xin để
đảm bảo sự tƣơng đồng cao về di truyền, đặc tính kháng nguyên nâng cao hiệu
quả cao của vắc xin phòng bệnh [24], [39], [117].
Để chủ động trong công tác phòng chống cúm đồng thời góp phần vào
chiến lƣợc phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
“Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt
Nam, 2009 – 2013” với các mục tiêu:
1. Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09
lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013.
2. Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09.
3. Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại
Việt Nam.




3
CHƯƠNG I – TỔNG QUAN
1.1. Vi rút cúm
Vi rút cúm là một vi rút đặc biệt trong nhóm vi rút gây bệnh đƣờng hô
hấp cho ngƣời liên quan đến sự đa dạng về kháng nguyên, gây bệnh có tính
chất mùa và ảnh hƣởng trên một phạm vi toàn cầu với sự xuất hiện của đại
dịch.
1.1.1. Đặc điểm vi rút học
1.1.1.1 Phân loại
Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm vi rút: Vi rút
cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó vi
rút cúm A, B, C gây bệnh cho ngƣời. Vi rút cúm A lƣu hành phổ biến trên gia
cầm, ngƣời và các động vật khác nhƣ lợn, ngựa là căn nguyên gây nên các

đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B thƣờng gây bệnh nhẹ thƣờng chỉ gây
nên các vụ dịch vừa và nhỏ, đặc biệt trẻ em. Vi rút cúm C có gây bệnh, ghi
nhận với số lƣợng nhỏ [6], [18], [61], [122], [123].
Vi rút cúm A đƣợc chia thành các phân týp dựa vào cấu trúc kháng
nguyên bề mặt HA (Haemagglutinin) và NA (Neuramindase). Sử dụng HA để
xác định phân týp của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định đƣợc 17
loại hemagglutinin khác nhau từ H1 đến H17, trong đó H17 đƣợc xác định từ
vi rút phân lập từ dơi [101]. Kháng nguyên NA đƣợc chia thành 9 phân týp
khác nhau từ N1 đến N9. Nhƣ vậy nếu ghép cặp 17 phân týp HA với 9 cặp
phân týp NA thì sẽ đƣợc 153 phân týp cúm A khác nhau [18], [122], [123].
Vi rút cúm A gây bệnh cho ngƣời chủ yếu là vi rút cúm có kháng nguyên
bề mặt là H1, H2, H3 và N1 hoặc N2. Gần đây, một số phân týp cúm mới, có
nguồn gốc từ gia cầm đã gây bệnh cho ngƣời đó là vi rút cúm A/H5N1ghi
nhận tại Hồng Kông 1997 và một loạt các trƣờng hợp nhiễm cúm tại Trung




4
Quốc, Đài Loan và Hồng Kông đƣợc báo cáo là phân týp vi rút mới A/H7N9
đƣợc ghi nhận năm 2013-2014 [32], [33], [49].
1.1.1.2 Cấu tạo chung
Dƣới kính hiển vi điện tử vi rút cúm có dạng hình cầu, hình trứng hoặc
một số ít có dạng hình sợi đƣờng kính 20nm và dài từ 200-300nm, đƣờng
kính trung bình 80-120nm. Bên trong vi rút có cấu tạo phức tạp gồm protein
capsid và các sợi ARN liên kết với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc
đối xứng xoắn. Vỏ của vi rút đƣợc cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt 2 lớp
vỏ lipid này là khoảng 500 chồi gai khác nhau nhú lên từ bề mặt của vi rút,
mỗi chồi gai có độ dài từ 10-14nm. Các chồi gai này đƣợc cấu tạo bởi các
glycoprotein, là hai loại kháng nguyên quan trọng là Haemagglutinin (HA) và

Neuraminidase (NA). Hai kháng nguyên HA và NA quyết định đến khả năng
gây bệnh của vi rút cúm, có bản chất là glycoprotein (HA) hoặc enzyme (NA)
[6], [116], [122], [123].
Protein HA còn gọi là tố ngƣng kết hồng cầu (NKHC): giúp vi rút bám
vào thụ cảm thể niêm mạc đƣờng hô hấp, phân tách thành protein HA1 và
HA2, trở thành vi rút hoạt động và xâm nhập vào trong tế bào [29].
Hemagglutinin có thể bám vào màng hồng cầu của một số loài động vật (gà
tây, chuột lang…), gây ra hiện tƣợng kết dính hồng cầu, có thể nhìn thấy đƣợc
bằng mắt thƣờng. Kỹ thuật ngƣng kết hồng cầu (Haemaglutinine Assay) dựa
trên nguyên lý này để phát hiện vi rút cúm. Kháng thể kháng HA có tầm quan
trọng trong cơ chế miễn dịch bảo vệ cơ thể. Sự có mặt của kháng thể này làm
bất hoạt protein HA, đồng nghĩa với việc trung hòa vi rút làm cho vi rút
không còn khả năng bám vào niêm mạc đƣờng hô hấp, do đó mất khả năng
gây bệnh. Protein NA có bản chất là enzyme, có tác dụng làm loãng chất nhầy
ở đƣờng hô hấp, nhờ đó làm cho vi rút tiếp xúc với tế bào niêm mạc và xâm
nhập vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Hơn nữa, enzyme này còn giúp cho




5
việc giải phóng các virion trong quá trình nhân lên trong tế bào. Kháng thể
tƣơng ứng với kháng nguyên NA cũng có tác dụng bảo vệ cơ thể nhƣng yếu
hơn kháng thể tƣơng ứng kháng nguyên HA.
Protein M bao gồm M1 nằm dƣới lớp lipit kép và liên kết với RNP của
lõi vi rút, là protein có nhiều nhất trong virion. Protein M1 có vai trò quan
trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút, tạo điều kiện cho
vi rút nảy chồi. Phần xuyên màng là protein M2 hoạt động nhƣ một kênh ion
xuyên màng có trách nhiệm bơm ion H
+

từ nội bào vào trong vi rút làm phá
vỡ mối liên kết protein-protein trên protein nền M1, giải phóng các RNP của
vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm (Hình 1.1). Protein NS2 tạo
thành phức hợp với protein M1 là mối liên hệ cần thiết trong chu trình sống
của vi rút để giải phóng phức hợp RNP từ nhân.

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm

Bên trong vi rút có cấu tạo gồm các sợi ARN đơn âm, liên kết với các
protein NP và 3 enzyme polymerase PA, PB1, PB2 tạo thành phức hệ
ribonucleoprotein có chức năng sao chép và phiên mã. Nucleoprotein (NP) và
3 enzyme polymerase (PB1, PB2, PA) là thành phần chủ yếu của phức hợp
Ribonucleoprotein (RNP) xoắn ở bên trong của vi rút (Hình 1.2).
NS
NA
HA




6

Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của vi rút cúm.
Nguồn: Paul Digard, Dept Pathology, University of Camb
1.1.1.3 Cấu trúc phân tử và chức năng
Genome của vi rút A, B là ARN sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn, riêng vi
rút cúm C gồm 7 phân đoạn, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb. Hệ gen của vi
rút cúm gồm 8 phân đoạn ARN mã hoá cho 10 protein đã biết. Mỗi phân đoạn
mã hóa cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: 7 protein cấu trúc
PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc

(Nonstructureral) NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NB đối với vi rút
cúm B[63], [76].
Protein HA là glycoprotein gồm 562-566 axit amin đƣợc mã hóa bởi
1742-1778 nucleotide, có trọng lƣợng phân tử khoảng 76.000 Dalton.
Haemagglutinin đóng vai trò nhƣ thụ thể bằng cách gắn vào sialic acid (N-
acetyl-neuraminic acid) trên bề mặt tế bào cảm nhiễm và vào bên trong tế bào
bằng quá trình thực bào. Protein HA đƣợc tổng hợp ở dạng tiền thân là chuỗi
polypeptide HA0. Điều kiện pH thấp các enzyme phân tách protein dạng
trysin và fusin, cấu trúc của HA0 thành HA1 và HA2, kết với nhau qua cầu
nối disulphua. Protein HA2 (gồm 221-222 axit amin) vẫn gắn với màng vi rút
và protein HA1 (gồm 319-326 axit amin) có các khu vực thụ cảm thể
(receptor binding) tạo điều kiện cho màng tế bào cảm nhiễm và màng vi rút
hòa vào nhau, vi rút có thể bám gắn trên bề mặt tế bào cảm nhiễm bắt đầu cho




7
quá trình thâm nhập vào tế bào [29]. Protein HA là một trong thành phần
kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm, những thay đổi trên protein HA gây ra
hiện tƣợng chuyển dịch - trôi kháng nguyên (antigenic drift) là nguyên nhân
gây những vụ dịch cúm theo mùa. Những biến đổi lớn (antigennic shift) ở
protein HA làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A, hệ quả là
giảm hoặc ức chế sự gắn kết với các kháng thể trung hòa đƣợc tạo ra từ các
kháng nguyên trƣớc đó (miễn dịch tự nhiên hoặc vắc xin). Sự trao đổi và tích
hợp các phân đoạn gen xảy ra khi một tế bào bị nhiễm 2 vi rút cúm A khác
nhau, dẫn đến sự hình thành của một loại vi rút mới mà quần thể không có
miễn dịch có thể gây đại dịch trong tƣơng lai.
Protein NA đƣợc mã hóa bởi 1413 nucleotide (453 axit amin) có cấu trúc
tứ đồng phân (tetramer), trọng lƣợng phân tử trung bình 220.000 Dalton. Phần

chính của phân tử NA đều nằm ở mặt ngoài vi rút, neuraminidase hoạt động
giống nhƣ một enzyme, nó cắt axit sialic ra khỏi các phân tử glycoprotein,
glycolipid ở bề mặt tế bào chủ, giúp cho vi rút cúm bám vào tế bảo chủ để
thực hiện quá trình thâm nhiễm. Khi vi rút đƣợc nhân lên trong tế bào chủ,
hoạt động ezyme của Neuraminidase sẽ tác động và axit sialic của
glycoprotein tế bào chủ, giúp giải phóng vi rút. Những thay đổi nhỏ cũng có
thể xảy ra với NA, một số đột biến có liên quan đến hiện tƣợng giảm độ nhạy
hoặc kháng các thuốc kháng vi rút theo cơ chế ức chế Neuramidase. Các đột
biến đã đƣợc xác định gồm: I117V, H274Y, H275Y, I222K, E119V, N294S
(R - arginine; K - lysine; H - histidine; Y- tyrosine; E - glutamic acid; V -
valine) có thể dẫn đến sự kháng không chỉ đối với oseltamivir mà còn đối với
zanamivir và thuốc khác mới [15], [50], [51], [59]. Để xác định ảnh hƣởng
của đột biến này, các thử nghiệm sinh học trong phòng thí nghiệm nhƣ thử
nghiệm ức chế Neuraminidase (Neuraminidase Inhibition assay - NAI) hoặc
thử nghiệm trên động vật (in vivo) đƣợc áp dụng.




8
Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm [94].
Phân
đoạn
Kích thƣớc
(bp)
Polypeptide
Chức năng
1
2341
PB2

Tìm thấy trong quá trình tổng hợp ARN
thông tin (mARN)
2
2341
PB1
Đóng vai trò enzyme phiên mã, sao chép,
kéo dài, tham gia quá trình sinh tổng hợp
vi rút thế hệ mới trong tế bào chủ
3
2233
PA
Là thành phần chủ yếu của phức hợp
ribonucleoprotein (RNP), tìm thấy trong
quá trình tổng hợp ARN virion (vARN)


4
1778
HA
Haemagglutinin: mang tính đặc hiệu týp,
kháng nguyên HA gây ngƣng kết hồng
cầu, có vai trò quyết định trong việc gắn vi
rút vào tế bào chủ, dung hợp giải phóng
phức hợp ribonucleoprotein, mở đầu quá
trình nhân lên của vi rút
5
1565
NP
Nucleoprotein: là thành phần protein chủ
yếu của phức hợp RNP, chứa 1 trong các

kháng nguyên đặc hiệu týp
6
1413
NA
Neuraminidase: phá vỡ liên kết giữa vi rút
và tế bào chủ để giải phóng vi rút ra khỏi
tế bào nhiễm.
7
1027
M1
Matrix protein: là protein nhiều nhất trong
virion tạo thành bộ khung, là kháng
nguyên đặc hiệu týp, có chức năng ổn định
cấu trúc vi rút
M2
Tích màng protein M2 hoạt động nhƣ 1
kênh bơm ion để làm giảm hoặc để duy trì
pH của thể nội bào (endosome)
8
890
NS1
Là protein không cấu trúc, điều hòa để
thúc đẩy sự tổng hợp các thành phần của
vi rút trong tế bào bị nhiễm
NS2




9

Protein M2 và M1 đƣợc mã hóa từ phân đoạn gen M, khi vi rút thâm
nhập vào tế bào thông qua thể thực bào, hoạt tính của kênh ion M2 đƣợc gia
tăng để cho các ion tràn vào bên trong, dẫn đến pH thấp tạo điều kiện cho
protein HA hòa với lớp màng trong của màng nội bào. Các ribonucleoprotein
đƣợc phóng thích vào trong bào tƣơng của tế bào và đƣợc vận chuyển tới
nhân khởi đầu cho sự tổng hợp RNA vi rút. Hoạt tính của protein M2 bị ức
chế bởi amantadine, rimantadine [66].
Protein NS1 có vai trò trong hoạt động của vi rút cúm đƣợc cho là ức chế
sự chuyển ra ngoài nhân phần poly-A, làm cho mRNA ƣu tiên đƣợc chuyển
vận vào ty thể (ribosome) và sau đó dịch mã. NS1 cũng ức chế sự cắt dán tiền
mRNA (pre-mRNA) và ức chế sự đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm
vi rút, làm cho quá trình nhân lên của vi rút đƣợc dễ dàng. NS2 là một phân tử
nhỏ có trọng lƣợng 11.000. Trong hạt vi rút, NS2 có thể gắn kết với protein
M1. Ngƣời ta cho rằng nó có chức năng là giúp đỡ cho sự vận chuyển các
RNP vừa đƣợc tổng hợp từ nhân đi vào bào tƣơng để làm cho vi rút sinh sản
nhanh hơn [123], [127]. Các protein NS1 và NS2 có chức năng điều hòa để
thúc đẩy sự tổng hợp các thành phần của vi rút trong tế bào bị nhiễm.

Hình 1.3 Quá trình phiên mã của Polymerase
Nguồn:




10
Các protein PB1, PB2 và PA là các polymerase đƣợc mã hoá từ các phân
đoạn gen PB1, PB2, PA chịu trách nhiệm tạo ra các RNA và RNA
polymerase. Phức hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm
vụ khởi đầu và kích hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút (Hình 1.2). Khi

khởi đầu quá trình tổng hợp mRNA của vi rút, PB2 gắn vào đầu 5’ của
mRNA của tế bào chủ, PA endonuclease cắt một đoạn 10 - 15 nucleotide để
sử dụng làm mồi tổng hợp mRNA để sau đó mRNA di chuyển ra tế bào chất
thực hiện quá trình phiên mã (Hình 1.3). Trong quá trình hoạt động của vi rút
cúm, một số đột biến xác định xảy ra trên gen PB2 có liên quan chặt chẽ với
khả năng thích nghi của vi rút, điều này đặc biệt với vi rút cúm gia cầm
H5N1. Vị trí 627 trên vi rút cúm ngƣời là Lysin trong khi trên vi rút cúm gia
cầm là Glutamin, đột biến E627K trên vi rút cúm gia cầm làm tăng khả năng
thích nghi với điều kiện sống của vi rút. Trên gia cầm, vi rút tồn tại và nhân
lên ở nhiệt độ tối ƣu là 37
o
C, khi mang gen đột biến, vi rút cúm gia cầm có
khả năng thích nghi và phát triển đƣợc trên tế bào đƣờng hô hấp trên của
ngƣời với nhiệt độ tối ƣu là 33
o
C, làm tăng khả năng cảm nhiễm của vi rút
cúm gia cầm với vật chủ mới [96]. Ngoài ra, PB2 đƣợc cho là có liên hệ mật
thiết với các thụ cảm thể trên bề mặt nhân của tế bào chủ, tạo điều kiện tốt
cho sự di chuyển của RNA vi rút vào trong nhân tế bào. Riêng với vi rút cúm
A, đoạn RNA số 2 mã hoá cho hai protein: PB1có kích thƣớc 757 axit amin
và một protein có kích thƣớc nhỏ PB1-F2 87 axit amin có chức năng thúc đẩy
quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tƣơng tự trong hệ gen
của vi rút cúm B và C [74], [127].
1.1.2. Quá trình nhân lên của vi rút cúm A
Quá trình nhân lên của vi rút cúm A có thể chia thành các giai đoạn sau:
(1) gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ, (2) phiên mã và sao chép genome

11
vi rút, (3) giải phóng vRNP ra khỏi nhân và (4) quá trình đóng gói, nảy chồi
và giải phóng vi rút thế hệ mới [57], [62], [90].
1.1.2.1 Quá trình gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ
Gai HA của vi rút sẽ phát hiện và bám gắn vào thụ cảm thể tƣơng ứng
của tế bào chủ. Phân tử HA tiền thân, HA0 đƣợc tạo thành từ hai tiểu đơn vị:
HA1, có vùng gắn thụ cảm thể và HA2 có peptide dung hợp; HA1 và HA2
liên kết với nhau bằng liên kết disulfua. Thụ cảm thể của vi rút cúm có cấu
trúc axitsialic liên kết với đƣờng galactose của glycoprotein/glycolipid của tế
bào chủ bằng liên kết alpha 2, 3 (vi rút cúm ngƣời) hoặc alpha 2, 6 (vi rút
cúm gia cầm). Hai dạng liên kết này rất quan trọng đối với tính đặc hiệu của
liên kết HA – thụ cảm thể ở những loài khác nhau. Sau quá trình gắn bám vào
màng tế bào chủ, vi rút sẽ xâm nhập vào tế bào bằng cách tạo bọng. Trong
endosome, ở điều kiện pH thấp (khoảng 5,5), phân tử HA0 sẽ bị thay đổi cấu
trúc giúp bộc lộ peptide dung hợp HA2. Peptide dung hợp gắn vào màng
endosome khiến cho màng vi rút và màng endosome hoà vào nhau. Môi
trƣờng axit trong endosome không những tạo điều kiện để quá trình dung hợp
diễn ra mà còn tác động đến kênh ion M2. Ion H
+
sẽ đi vào vi rút qua kênh
M2, làm axit hoá lõi vi rút, giải phóng vRNP khỏi M1, các phân tử vRNP tự
do này đƣợc giải phóng vào tế bào chất của tế bào chủ [28].
Các protein cấu thành vRNP là NP, PA, PB1 và PB2 đồng thời là các tín
hiệu định vị nhân [81]. Các tín hiệu định vị nhân này của vi rút liên kết với
các thành phần của hệ thống xâm nhập vào nhân tế bào và do đó vRNP đi vào
nhân tế bào chủ.
1.1.2.2 Quá trình phiên mã vào sao chép ARN vi rút (vRNA)
Khác với nhiều vi rút khác có hệ gen là sợi ARN âm, quá trình phiên mã
ARN vi rút cúm diễn ra trong nhân. Ngƣời ta nhận thấy rằng trong quá trình
phiên mã của vi rút cúm có cơ chế đƣợc gọi là cap-snatching: PB2 của vi rút

12
có hoạt tính endonuclease sẽ cắt các sợi ARN đã đƣợc gắn mũ (7-
methylguanosine) của tế bào chủ ở một gốc purin cách đầu tận cùng 5’ 10 –
13 nucleotide, đoạn ARN này sẽ đƣợc sử dụng để khởi đầu quá trình phiên
mã. Quá trình khởi đầu, kéo dài, kết thúc và gắn polyA đều đƣợc xúc tác bởi
phức hệ protein PB2, PB1, PA và NP. Các sợi mRNA có chiều dài ngắn hơn
các đoạn vRNA, mRNA sau khi đƣợc tổng hợp trong nhân tế bào sẽ đƣợc vận
chuyển ra tế bào chất để tổng hợp các protein của vi rút. Các protein màng
HA, NA, M1 và M2 sẽ đƣợc vận chuyển đến màng sinh chất của tế bào trong
khi các protein NP, PA, PB1 và PB2 đƣợc chuyển vào trong nhân để cùng với
các vRNA(-) tạo thành các vRNP(-) mới [90].
1.1.2.3 Giải phóng vRNP ra khỏi nhân tế bào
Trong nhân tế bào, chỉ các vRNP (-) đƣợc vận chuyển qua lỗ màng nhân
ra tế bào chất thông qua con đƣờng vận chuyển phụ thuộc CRM1. Đầu tận
cùng C của protein M1 liên kết với vRNP, đầu tận cùng N của M1 có một
NLS và liên kết với NS2, NS2 liên kết với CRM1. Phức hệ gồm M1, vRNP(-)
và NS2 sẽ đƣợc vận chuyển từ nhân ra tế bào chất nhờ khả năng liên kết của
NS2 với CRM1.
1.1.2.4 Đóng gói, nảy chồi và giải phóng vi rút thế hệ mới.
Vi rút cúm sử dụng màng sinh chất của tế bào chủ để tạo thành các hạt vi
rút hoàn chỉnh rồi rời khỏi tế bào và tiếp tục gây nhiễm các tế bào lân cận.
Quá trình đóng gói vi rút diễn ra tại vị trí màng sinh chất có các protein HA,
NA và M2 của vi rút.
Ngƣời ta đƣa ra hai mô hình giả thuyết cho quá trình đóng gói các phân
đoạn ARN vi rút: mô hình đóng gói ngẫu nhiên và mô hình đóng gói đặc hiệu.
Theo mô hình đóng gói ngẫu nhiên, các đoạn vRNA sẽ đƣợc đóng gói một

cách ngẫu nhiên bên trong virion. Mô hình đóng gói đặc hiệu dựa trên cơ sở
các tín hiệu đóng gói vi rút đƣợc xác định là các vùng mã hoá và không mã




13
hoá ở đầu 5’ và 3’ trên một số đoạn vRNA và do đó quá trình đóng gói vi rút
là đặc hiệu. Protein M1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình đóng gói và
nảy chồi hạt vi rút. Hạt vi rút chỉ đƣợc giải phóng ra ngoài màng sinh chất tế
bào chủ khi liên kết giữa acid sialic và glycoprotein/glycolipid đƣợc cắt đứt.
Quá trình này đƣợc thực hiện nhờ neuraminidase trên bề mặt vi rút.

Hình 1.4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm.
Nguồn :
1.2. Đại dịch cúm A/H1N1/09
1.2.1. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới
1.2.1.1 Nguồn gốc đại dịch
Cuối tháng 3 năm 2009 các nhà khoa học ghi nhận sự tăng đột biến các
trƣờng hợp nhiễm trùng đƣờng hô hấp cấp tính có liên quan đến cúm tại
Veracruz, Mexico. Đầu tháng 4 năm 2009, Trung tâm kiểm soát bệnh dịch
Hoa Kỳ xác định các ca nói trên đã nhiễm một loại cúm A có nguồn gốc từ
lợn phân týp H1N1 [19].