HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG THỐT NỐT Ở QUY MÔ PILOT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẰN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG Bộ MÔN
CÔNG NGHỆ THỰC PHẢM
Luận văn tết nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẲM
np A J|À i V •
Tên đê tài:
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG THỐT
NỐT Ở QUY MÔ PILOT
Sinh viên thực hiện
Lê Anh Duy MSSV: 2071737
CẦN THƠ, 2011
Giáo viên hưóng
dẫn
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của Giáo viên hướng dẫn và nhóm
nghiên cứu. Các thông tin về số liệu, hình ảnh, kết quả đã được trình bày trong luận văn này
là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào trước
Sinh viên thực hiện
Lê Anh Duy
LỜI CẢM TẠ
Trước hết con xin gửi lời biết ơn chân thành đến cha mẹ và gia đình đã luôn quan tâm, ủng
hộ và động viên tinh thần con trong suốt thời gian qua.
Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Minh Thủy, đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt
những kiến thức quý báu đế em có thế hoàn thành tốt luận văn này.
Xin cảm ơn các anh, chị ở phòng thí nghiệm, quý thầy cô bộ môn Công nghệ thực phấm,
Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học ứng Dụng, đặc biệt là anh Nguyễn Phú Cường và chị
Nguyễn Thị Mỳ Tuyền đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình làm luận
văn.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đến anh Trần Thanh Hiền cùng tất cả các anh chị học viên cao học
khóa 15 và các bạn sinh viên Công nghệ thực phẩm khóa 33 đã giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện thí nghiệm.

Kính chúc quý thầy cô, các anh chị và các bạn dồi dào sức khỏe và thành công trong công
việc.
Xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 Sinh
viên thực hiện
Lê Anh Duy
TÓM LƯỢC
Với mục tiêu hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang thốt not chất lượng cao và ôn định từ
nguồn nấm men phân lập ở quy mô pilot, nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở khảo sát (i)
thời gian nhân giống nấm men đạt mật số yêu cầu (10
8
CFƯ/ml) ở các thể tích môi trường
nuôi cấy khác nhau (ÌO, 50, ì00, 200 mỉ), (ii) thực hiện quá trình lên men và so sánh chất
lượng rượu vang thốt nốt ở các thể tích lên men khác nhau (5 lít và 150 lít), (iii) khả năng
làm trong rượu vang thốt nốt băng tác động của enzyme pectinase với các nồng độ thay đoi
từ 0,02 đến 0,1% (v/v) và (iv) biến đoi chất lượng rượu vang thốt nốt tồn trữ ở nhiệt độ mát
(15±20°C).
Ket quả nghiên cứu cho thấy có thế nuôi cấy nấm men giong đạt mật so yêu cầu đê phục vụ
cho quá trình lên men rượu sau 22 giờ (cho tất cả các thê tích dịch nhân giống khác nhau).
Khi tăng thê tích dịch lên men ở mức độ lớn hơn (150 lít), sản phâm rượu vang thốt not có
sự thay đối về chất lượng với độ rượu đạt được khoảng 12,2° (v/v) (thấp hơn khoảng 1,4°)
so với mâu lên men với thê tích 5 lít ị13,67 v/v). Ngocũ ra cân kiêm soát rất chặt chẽ sự gia
tầng nhiệt độ bồn lên men do năng lượng sinh ra từ quá trình lên men. Tuy nhiên, phân tích
các chỉ tiêu hóa học (hàm lượng SƠ2, acid, ester, methanol) cho thấy sản phâm rượu vang
thốt nốt vân đảm bảo được chất lượng yêu cầu theo TCVN 7045:2002, sản phấm có mùi vị
hài hòa và duy trì được hương vị đặc trưng của nước thốt nốt. Sử dụng enzyme pectinase
với nồng độ 0,04% ịv/v) có thê làm trong rượu vang thốt nốt trong 7 tuần. Rượu vang thốt
nốt không thê hiện sự biến động vê chất lượng sau 2 tháng tôn trữ ở nhiệt độ mát ị 15-
2Ơ'C).
Từ khóa: Nhân giong nấm men, lên men, làm trong, chất lượng, rượu vang thốt nốt

MỤC LỤC
4.1.Khả năng sinh trưởng của nấm men khi nhân giống ở các thể tích khác nhau
DANH SÁCH HÌNH
DANH SÁCH BẢNG
CHƯƠNG I. ĐẶT VÁN ĐỀ
1.1.Tổng quan
Rượu vang Thốt nốt đã được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia: Nigeria, Ghana, Myanmar,
Mexico, Thailand, Lào, Cambodia và một số nước ở vùng Nam Ấn và Phi Châu. Riêng
Nigeria và Ghana có hơn 10 triệu người sử dụng loại thức uống lên men này.
Các sản phẩm rượu vang từ thốt nốt cũng đã được chế biến theo phương pháp cô truyến của
các quốc gia Thailand, Lào, Việt Nam và Myanmar. Tuy nhiên, chất lượng sản phẩm rượu
vang sản xuất ra thường chưa ốn định, màu sắc và độ trong của sản phấm chưa đáp ứng được
yêu cầu của sản phẩm rượu vang chất lượng cao với mùi vị thơm ngon, đặc trưng cho
nguyên liệu đặc sản của vùng.
ơ Việt Nam, Tịnh Biên và Tri Tôn thuộc tỉnh An Giang là nơi có tiềm năng rất lớn về trữ
lượng cây thốt nốt hàng năm. Với số lượng lớn cây thốt nốt hiện có tại điạ phương (hơn
100.1 cây) đã làm tăng sản lượng nước thốt nốt thu hoạch. Tuy nhiên với đặc điểm dễ lên
men và hư hỏng nhanh của nước thốt nốt trong quá trình thu hoạch hoặc sau thu hoạch thì
các hoạt động tiếp nối vẫn chưa được khai thác triệt đế nhằm tận dụng toàn bộ nguồn nguyên
liệu này cho quá trình chế biển đa dạng sản phấm từ chúng
Trên cơ sở các nghiên cứu về sản xuất rượu vang thốt nốt ở quy mô phòng thí nghiệm đã
bước đầu cải thiện được chất lượng sản phẩm rượu vang thốt nốt và giải quyết được bài toán
hư hỏng nước thốt nốt nguyên liệu, thì việc nghiên cứu đề tài “hoàn thiện và nâng cao
quy trình sản xuất rượu vang thốt nốt ở quy mô pilot” sẽ không chỉ góp phần làm đa
dạng hóa sản phẩm của vùng Bảy Núi mà còn đáp ứng nhu cầu phát triển kinh tế của tỉnh An
Giang nói riêng và đồng bằng sông Cửu Long nói chung.
1.2.Mục tiêu nghiên cứu
Xác định thời gian nhân giống nấm men (phân lập) thích hợp cho quá trình sản xuất rượu
vang thốt nốt ở quy mô pilot. Đồng thời chọn lựa nồng độ của tác nhân làm trong sản phẩm
và hiểu biết diễn biến của sự biến đối chất lượng rượu vang thốt nốt trong điều kiện tồn trữ ở

nhiệt độ mát.
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1.NGUYÊN LIỆU NƯỚC THỐT NỐT
2.1.1. So’ lược cây thốt nốt
a. Phân loại khoa học và đặc tính sinh học
Giới (regnum): Plantae Ngành (division): Angiospermae Lớp (class):
Monocots Bộ (ordo): Arecales Họ (familia): Arecaceae Chi (genus): Borassus L Tên hai
phần: Borassus flabellifer Thốt nốt (hình 2.1) có danh pháp khoa học là Borassus flabellifer
L, thuộc họ cau (Arecaceae) - Thốt nốt Châu Á (miền nam Châu Á) còn gọi đơn giản là thốt
nốt (Ấn Độ, Sri Lanka, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Malaysia và New Guinea).
Hình 2.1. Cây Thốt nốt
Tên gọi thốt nốt trong tiếng Việt có nguồn gốc từ tiếng Khmer th’not. Thốt nốt được xem là
biếu tượng linh hồn của người dân tộc Khmer. Đây là loài cây biếu tượng không chính thức
của Camphuchia.
Tại Việt Nam, cây Thốt nốt mọc và được trồng ở các tỉnh khu vực Nam Bộ, trồng nhiều nhất
là ở 2 huyện Tịnh Biên và Tri Tôn của tỉnh An Giang.
Chúng là các loại cây cao thắng đứng, có thế cao tới 30 m. Lá dài, hình chân vịt, dài 2 - 3 m.
Các lá chét dài 0,6-1,2 m. Cuống lá (mo) mở rộng. Hoa nhỏ, mọc thành cụm dày dặc, thuộc
loại đơn tính khác gốc. Hoa đực nhỏ, có 3 lá đài, 3 cánh rời xếp lợp, 6 nhị ngắn, bao phấn 2
ô. Iloa cái to, gốc có lá bắc, đài và tràng rời, bầu hình cầu, có 3 - 4 ô, 3 đầu nhị cong. Quả lớn
màu nâu hoặc nâu hạt dẻ hình dạng hơi tròn với 3 hạch, hạt thuôn chia 3 chùy ở đỉnh
(http://vi. Wikipedia, or s/wiki).
b. Giá trị của Thốt nốt
Nhiều loài thốt nốt có tầm quan trọng kinh tế đáng kể và được trồng rộng rãi trong các khu
vục nhiệt đới. Cây thốt nốt là một trong những cây có tầm quan trọng nhất của Àn Độ từ rất
lâu, tại đây người ta sử dụng thốt nốt theo trên 800 kiểu khác nhau. Lá của nó được dùng làm
mái che, thảm, giỏ, quạt, mũ, ô dù, cũng như làm vật liệu như giấy đế
Các cuống (bẹ) lá cũng có thế dùng làm hàng rào và có thế lấy ra sợi rắn chắc phù hợp cho
việc làm thừng, chão hay chổi. Gỗ màu đen là loại gỗ cứng, nặng và bền, có giá trị trong xây
dựng ( ).

Lá thốt nốt được chế tạo thành cái giỏ (“smock”) để bao những đường thành phẩm. Ngoài ra,
lá này cũng dùng chế tạo những sản phẩm thủ công do đó cho phép làm tăng giá trị hoạt
động của người nông dân (Rapp, 2004).
Ngoài thu hoạch trái đế chế biến đường thốt nốt (hình 2.2) và thạch thốt nốt, người ta còn tận
dụng các nguồn nguyên liệu từ lá, gỗ, để sản xuất hàng thủ công mỹ nghệ như làm tranh,
thảm, quạt, mũ, gỗ gia dụng,
(http.v/images . 800 gle. com, vn)
Hình 2.2. Sản phẩm đường thốt nốt
Từ cây này người ta cũng tạo ra nhiều loại thức ăn. Các cây non được đem nấu nướng như là
một loại rau hoặc nghiền, giã hay nướng đế làm thức ăn. Quả được ăn dưới dạng tươi hay
nướng, người ta còn ăn cả các hạt non tựa như thạch. Ngoài ra, nhựa từ thấn cây cũng được
dùng làm một loại thuốc nhuận tràng. Các giá trị y học cũng đã được quy cho các phân khác
của cây (http://vi. Mikipedia. org/mki).
Ớ Việt Nam thốt nốt mọc và được trồng ở các tỉnh khu vực Nam Bộ giáp với Campuchia.
Riêng vùng núi Thất Sơn (An Giang) hiện có hơn 100.000 cây thốt nốt trồng tập trung ở các
huyện Tri Tôn, Tịnh Biên, trong đó có gần 60.000 cây đang trong thời kỳ cho thu hoạch trái,
nước thốt nốt. Theo thống kê của ngành công nghiệp An Giang, mỗi năm rừng thốt nốt ở An
Giang cung cấp khoảng 5.600 tấn đường, trị giá khoảng 56 tỉ đồng. Neu triệt hạ rừng thốt nốt
đang cho thu hoạch để bán gỗ thì chỉ thu được 24 tỉ đồng ( .
vn).
2.1.2. Nguyên liệu nước Thốt nốt
a. Tiềm năng của nước Thot not
Sản phẩm chính của cây thốt nốt là mật còn gọi là arrack hay toddy được rút ra từ những vòi
hoa của cây. Thông thường nước thốt nốt sẽ tự lên men khi mặt trời mọc vì thế người ta
thường lấy một lượng mật lớn trước bình minh để dùng làm nước uống rất bố dường và tốt
cho sức khỏe vì tác dụng nhuận tràng của nó.
Dịch ngọt có thể thu được từ các bông mo non (kể cả hoa đực lẫn hoa cái). Nó được dùng lên
men đế làm một loại đồ uống, gọi là rượu arac, hoặc được cô đặc đế sản xuất một loại đường
thô gọi là đường thốt nốt. Tại Indonesia người ta gọi nó là Gula Java (đường Java) và được
sử dụng rộng rãi trong ấm thực của người dân Java.

Đường thô từ cọ có nhiều dinh dưỡng hơn so với đường làm từ mía, nó chứa 1,04% protein,
0,19% béo, 76,86% sucrose, 1,66% glucose, 3,15% tổng khoáng, 0,861% calcium, 0,052%
phosphore, và cũng có 10,01 mg sắt trên lOOg, 0,767 mg đồng trên lOOg. Nhựa tươi từ thốt
nốt là một nguồn phong phú vitamin B phức tạp (Morton, 1988).
Theo Nguyễn Minh Thủy (2001), cây thốt nốt trồng lâu năm thường cho nước có độ ngọt cao
hơn cây có thời gian sinh trưởng ít (cây mới), độ ngọt của chúng dao động trong khoảng 11
đến 14°Brix, mẫu thu hoạch trong mùa nắng độ ngọt có thế tăng lên đến 15 hoặc 16°Brix.
Tuy nhiên, giá trị này thường dao động và không cố định, ngay cả trên cùng một cây hoặc
các cây thốt nốt khác nhau.
Phần lớn thốt nốt của vùng Bảy Núi thuộc loài lai giữa Borassus flabellifer và Borassus
baethiopium. Giống cây này tạo ra một loại nước thốt nốt có mùi vị hấp dẫn và giàu giá trị
dinh dưỡng (Huỳnh Muổi Hên, 2005). Theo một số công trình nghiên cứu tại Việt Nam thì
thành phần hóa học của 100 ml mật thốt nốt được thể hiện ở bảng 2.1.
Số liệu trên cho thấy mật thốt nốt chứa rất nhiều các thành phần vi lượng khoáng, vitamin và
nhiều thành phần khác, có tác dụng tốt đối với sức khỏe.
Năng suất của những cây cái lớn hơn các cây đực; mỗi cây cho từ 370 đến 400 lít trong
một mùa, tương đương khoảng 60 kg đường). Một gia đình lấy nước trung bình 20 cây, thu
hằng năm từ 1000 đến 1200 kg đường thốt nốt.
Bảng 2.1 Thành phần dinh dưõng của nưóc thốt nốt
b. Thu hoạch nước Thốt nốt
Thốt nốt được trồng tối thiếu 15-^20 năm mới bắt đầu thu hoạch, thu hoạch thốt nốt phải
dùng cây tre gai đực buộc cặp vào thân cây làm điếm tựa (cây đài) mới có thế leo lên tới
ngọn (một cây thốt nốt phải sử dụng 2-5-3 cây đài nối với nhau), dùng dao rạch những đường
nhở ở phần đầu của những cụm hoa đã được kẹp bằng cái kẹp gỗ và hứng nước thốt nốt đã
chảy vào bình. Dụng cụ đựng nước thốt nốt thu hoạch được làm bằng ống tre hay ống nhựa.
Mỗi cây thốt nốt có thế cho từ 10-Ỉ-15 lít nước/ngày.
Chỉ tiêu Hàm lượng
°Brix 1 l-ỉ-14; 15-1-16 (mùa nắng)
pH 6,3-6,5
Vitamin c (mg%)

18,25-20,38
Khoáng (mg/lít)
- K 944,09-1304,30
- Fe 2,83-4,10
-Cu 0,35-0,56
- Zn 0,35-0,36
- Mn 0,83+1,07
-Ca 1,16-2,16
-Mg 44,32-53,73
(Nguồn: Nguyễn Minh Thủy, 2001).
Nước thốt nốt sau thu hoạch thường nhanh chóng có những biếu hiện hư hỏng trong điều
kiện bảo quản bình thường. Quá trình lên men nhanh chóng xảy ra do hàm lượng đường
saccharose hiện diện trong nguyên liệu tương đối cao, dao động từ 8,24 đến 19,9% (Giffard,
1967) làm giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm và còn làm cho sản phẩm không còn khả
năng sử dụng được.
Hiện nay, nước thốt sau khi thu hoạch được người dân xử lý bằng 2 biện pháp thường dùng là
thêm gỗ sến và hóa chất. Tuy nhiên nước sau khi thu hoạch chủ yếu đế nấu đường nếu được
xử lý bằng hóa chất, nhưng liều lượng sử dụng đó không thể xác định được, nếu lấy nước đã
xử lý theo cách của họ dùng đế chế biến rượu có thể ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Do
vậy nước thốt nốt sau khi thu hoạch được xử lý bằng metabisulíit sodium với hàm lượng từ
1,3 — 1»4 g/1 (Nguyễn Minh Thủy và cộng sự, 2001) và xử lý bằng gồ sến theo cách của
địa phương.
2.2.NẤM MEN
2.2.1. Cấu tạo tế bào nấm men
Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động, thực vật. So sánh cấu
tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhẩy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn.
a. Vỏ tế bào
Là một lớp màng mỏng, mềm mại có thế đàn hồi đế định hình cũng như bảo vệ tể bào chống
lại các tác động bên ngoài và chất độc. Vở tế bào nấm men mang điện. Nó còn có tác dụng
giữ áp suất thấm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử

lượng thấp và các muối khoáng đi qua các lồ nhỏ vào trong tế bào.
Thành phần hóa học của vỏ tế bào gồm các phức chất protein-polysacarit, phosphat và lipid.
Vỏ tế bào dày khoảng 25 nm chiếm khoảng 25% khối lượng tế bào, trong đó glucan và
mannan là hai chất trong thành phần polysacarit chiếm khoảng 90% khối lượng chất khô của
vỏ tế bào. Ngoài ra, vỏ tế bào nấm men còn có kitin, là loại hydratcarbon và là polymer của
N-axetyl-glucozamin, nằm sát vùng nấm men nấy chồi.
Te bào nấm men (hình 2.3.) có thành phần và cấu tạo phức tạp từ các thành phần chủ yếu
b. Màng tế bào chat
Xung quanh tế bào chất được bao quanh một lớp màng rất mỏng, chiều dày không quá 0,1
nm dính chặt với tế bào chất.
Màng tế bào chất có các chức năng cơ bản:
- Rào chắn thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và
ngược lại cho các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào.
- Sinh tống hợp một số hợp phần trong tế bào (các cấu tử của vỏ tế bào).
- Nơi khu trú của một so enzyme và cơ quan tử của tế bào.
c. Te bào chất
Te bào chất còn gọi là nguyên sinh chất. Nó có cấu trúc không đồng nhất và ở thế keo, chứa
tất cả các cấu trúc của tế bào: ti the, ribosome, mạng lưới nội chất, các chất dự trữ và các thế
vùi của hợp chất lipoit và hydratcacbon tự nhiên trong nội bào.
d. Không bào
Không bào là một cơ quan nội bào có dạng hang chứa đầy dịch bào và được tách ra từ tế bào
chất thành màng không bào. Hình dạng không bào thay đối liên tục, chuyển dịch và tiếp xúc
với tế bào chất. Trong dịch bào ngoài các chất điện ly hòa tan trong nước còn có các hợp chất
dạng keo như protein, chất béo, hydratcacbon và enzyme chứa trong bào quan này. Trong
dịch bào còn thấy có mặt Na, K, Ca, Mg, Cl, SO4 và PO4 ở dạng các nguyên tử riêng biệt
hoặc muối không làm cho nồng độ của chúng ở đây cao hơn nhiều lần hàm lượng muối môi
trường xung quanh. Các quá trình oxy hóa - khử đều xảy ra trong dịch bào.
e. Nhân tế bào
Nhân là cấu tử bất biến của tế bào nấm men. Nhân của tế bào nấm men có màng vỏ, hạch
nhân (thể nhiễm sắc-karyokon) và chất nhân (karyoplasma).

Đường kính nhân tế bào nấm men vào khoảng 2|im. Phần lớn nhân có hình cầu hoặc elip. Sự
phân bố của chúng trong nội bào có thế thay đối trong suốt quá trình sống của tế bào. Thành
phần hóa học cơ bản của nhân là acid dezoxinucleic (ADN). Hàm lượng ADN trong tể bào
bất kỳ là on định nghiêm ngặt và không phụ thuộc vào các điều kiện của môi trường bên
Nhân
Hạt phosphate
Hình 2.3. Cấu tạo tế bào nấm men
(Nguon: 09_augmented/images/4 ì/4189.png )
ngoài, vào dinh dưỡng cũng như vào tác động từ các yếu tố khác, mặc dù các yếu tố này
đang ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất của tế bào. Một chủng men rượu ở các giai đoạn
phát triển khác nhau đều có hàm lượng ADN là 0,17-0,18% sinh khối khô. Còn ở men rượu
vang sau khi gia nhiệt thì hàm lượng này cũng không thay đối (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.2.2. Hình dạng và kích thước
Nấm men thường có hình dáng khác nhau như hình cầu, hình elip, hình bầu dục và cả
hình dài.
Te bào nấm men thường có kích thước lớn gấp từ 5-Ỉ-10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước
trung bình của tế bào nấm men như sau:
- Chiều dài từ 9-Ỉ-10 |am; chiều rộng từ 2-Í-7 |am
Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện môi trường nuôi cấy,
theo tuối sinh lý của tế bào (Nguyễn Đức Lượng, 2006).
(a) Tế bào hình cầu (b) Tế bào hình elip
Hình 2.4. Hình thái tế bào nấm men
( )
2.2.3. Quá trình sinh trưỏng của nấm men
Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men, được
nhiều tác giả chia làm 4 pha: pha tiềm phát, pha phát triển chỉ số, pha ổn định và pha suy
thoái.
• Lag-pha (pha tiềm phát hay pha làm quen): Đây là giai đoạn nấm men mới
được cấy vào môi trường còn chưa sinh sản. Vận tốc sinh trưởng coi như bằng không. Đây là
pha tiềm phát, nấm men còn thích nghi môi trường mới, trong đó một số tế bào bị ức chế,

thậm chí có thế bị chết, số lượng nấm men ở giai đoạn này là không tăng hoặc tăng không
đáng kể, nhưng sự trao đổi chất của chúng lại diễn ra mạnh mẽ. Te bào có kích thước tăng lên
đáng kế, hàm lượng các chat protein, acid nucleic đều tăng lên, các enzyme thích ứng đều
được tổng hợp mạnh mẽ. Trong môi trường càng đầy đủ dinh dưỡng giống nấm men cấy vào
càng trẻ khỏe và lag-pha càng ngắn. Người ta có thể cấy một lượng giống lớn với các tế bào
trẻ khỏe làm cho lag-pha càng rút ngắn và giống có thể phát triển sau khi tiếp giống.
• Pha logarit (pha phát triển chỉ số hay pha phát triển theo cấp số nhân)
Trong pha này hầu hết thời gian nấm men hay giống vi sinh vật nào khác đã qua pha tiềm
phát sẽ phát triển số lượng tế bào theo cấp số nhân với tốc độ sinh trưởng là cực đại:
2°(1) —* 2'(2)—> 2
2
(4)—> 2
3
(8) —> 2"
Kích thước trung bình của tế bào giống nấm men ở pha này nói chung là nhở nhất, vì chúng
còn phải sinh sản (nảy chồi, phân chia tế bào) từ nguồn tế bào chất và vỏ tế bào. Đối với các
tế bào trong pha này chúng có hoạt tính sinh lý - sinh hóa rất đặc trưng và chúng rất nhạy
cảm với các nhân tố không thuận lợi hơn các tế bào đã trưởng thành và ở trạng thái on định.
Trong pha chỉ số tế bào phát triển ào ạt, khi đó các chất dinh dưỡng trong môi trường không
phải là vô tận, mà ngược lại ngày một giảm đi, hơn nữa trong môi trường xuất hiện và tích tụ
những sản phẩm trao đối chất không cần thiết đối với giống nuôi cấy. Như vậy, trong quá
trình chất dinh dưỡng cạn dần, các sản phẩm sinh ra làm cho các điều kiện mất đi sự thuận
lợi cho sinh trưởng và quá trình chuyển sang pha ổn định.
• Pha ổn định: Trong pha này tế bào sống là ổn định và mật độ quần thể là tối
đa. Cũng có nghĩa là số lượng tế bào sinh ra bằng số lượng tế bào chết
• Pha suy vong: Trong pha này các tế bào sống giảm dần và tế bào chết tăng dần, một
số tế bào chết bị tự phân do các enzyme proteaza nội bào. Các tế bào sống trở nên già đi, kích
thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chết xuất hiện dạng hạt (Lương Đức Phẩm, 2006).
Bất kỳ loài vi sinh vật nào cũng trải qua bốn giai đoạn phát triển trên. Tuy nhiên giữa các loài
vi sinh vật lại khác nhau ở thời gian dài, ngắn trong các giai đoạn. Có vi sinh vật cần thời

gian thích nghi, sinh trưởng ngắn, có vi sinh vật lại cần thời gian của những giai đoạn này dài
hơn.
Trong trường hợp môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng cùng loại nhưng mức độ tiêu thụ
khác nhau sẽ xảy ra hiện tượng hai hay nhiều giai đoạn thích nghi về sinh trưởng. Các giai
đoạn này sẽ lặp đi lặp lại cho đến khi hết các chất này mới đến giai đoạn cân bằng và giai
đoạn giảm sinh khối (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.3.Sơ LƯỢC QUÁ TRÌNH LÊN MEN
2.3.1. Co’ chế hóa sinh học của lên men rượu
Quá trình lên men rượu khá phức tạp, gồm 13 giai đoạn, mỗi giai đoạn được đạt trưng bằng
một phản ứng hóa sinh với 1 enzyme xúc tác. Hệ enzyme của quá trình trước đây và hiện nay
người ta vẫn sử dụng thuật ngữ Zima đế chỉ hệ enzyme lên len rượu của nấm men.
Quá trình gồm có:
1) Các este phosphoryl của đường được tạo thành. Dưới tác dụng của hexokinaza và axit
adenilic tạo ra chất nhận và cho axit phosphoric, glucoza biến thành glucoranozo-6-
phosphat. Các axit adenilic có trong nấm men ở dạng adenozinmonophosphat AMP,
adenozindiphosphat ADP, adenozintriphosphat ATP. Hexokinaza xúc tác chuyển một nhóm
phosphate từ ATP đến glucoza, khi đó ATP thành ADP còn gốc phosphat thì kết hợp với
cacbon thứ 6 của glucoza. Enzyme này được hoạt hóa bằng ion Mg
2+
. Đối với D-fructoza và
D-mannoza cũng xảy ra tương tự như vậy. Phản úng enzyme glucokinaza xác định tốc độ lên
men
2) Glucozo-6-phosphat sẽ chuyến đồng phân thành fructozo-6-phosphat dưới tác dụng của
enzyme glucozophosphat izomeraza. Phản ứng thuận nghịch nhưng dịch chuyển về hướng
tạo ra fructozo-6-phosphat.
3) Fructozo-6-phosphat dưới tác dụng của phosphofructokinaza được kết hợp với nguyên tử
cacbon thứ nhất nhờ gốc phosphat của ATP và thành fructozo-1,6- diphoshat. Phản ứng này
thực tế không phải là thuận nghịch. Phân tử đường chuyến sang dạng 0X0 (trong phân tử có
nhóm c=0) và trở thành kém bền, dễ dàng biến đổi tiếp theo, đặc biệt rất yếu ở mồi liên kết
giữa c

3
và c
4
.
4) Dưới tác dụng của enzyme aldolaza (được hoạt hóa bằng Zn
2+
, Co
2+
và Ca
2+
) fructozo-l,6-
diphosphat chia thành 2 phosphotrioza là 3-phosphoglyxerin aldehyt và phosphor
dioxyaceton. Phản ứng này là thuận nghịch.
5) Giữa hai phosphotrioza được đồng phân hóa nhờ xúc tác của triozo phosphatisomeraza. Phản
ứng được cân bằng ở 95% 3-phosphoglyxerin aldehyt và 5% phosphodioxyaxeton
6) Giai đoạn tiếp theo là 2 phân tử aldehyt phosphoglyxeric bị oxy hóa. Phản ứng có sự tham
gia của axit phosphoric trong canh trường nhò' xúc tác của enzyme triphosphatdehydronase,
coenzyme của nó là NAD (Nicotinamit-Adenin-Dinucleotit).
Phân tử 3-phosphoglyxeroaldehyt kết hợp với phosphate, còn hydro sẽ chuyến sang
coenzyme NAD. Năng lượng sẽ được giải phóng do oxy hóa 3-phosphoglyxeroaldehyt sẽ
tích tụ trong liên kết cao năng của axit 1,3-diphosphoglyxerinic mới tạo thành.
7) Với sự tham gia của phosphatransferaza gốc axit phosphoric được chứa trong mối liên kết
giàu năng lượng được chuyển từ 1,3-diphosphoglyxerinic axit cho ADP đế tạo thành ATP.
Năng lượng được giải phóng khi oxy hóa phosphogtyxerin aldehyt sẽ được lưu giữ trong
ATP
8) Dưới tác dụng của phosphoglyxeromutaza, axit 3-phosphoglyxerinic được đồng phân hóa
thành axit 2-phosphoglyxetinic.
9) Ket quả là nước được tái tạo và gây ra hiện tượng phân phối lại năng lượng bên trong nội
phân tử. Axit 2-phosphoglyxerinic chuyến thành axit phosphoenolpyruvic được chứa trong
mối liên kết năng lượng cao. Phản ứng được xúc tác do enolaza được hoạt hóa nhờ các ion

Mg
2+
, Mn
2+
, Zn
2+
.
10) Tác dụng cực đại của enolaza ở khoảng pH = 5,2-5,5, ở pH = 4,2 phân tử enolaza bị đông
vón, ở Ph = 3-4 bị biến tính không thuận nghịch.
11) Dưới tác dụng của phosphotransferaza với sự có mặt K
+
gốc axit phosphoric được chuyến từ
axit phosphoenolpyruvic cho ADP và năng lượng được lưu giữ lại ở ATP.
12) Axit enolpyruvic tạo thành được biến dạng sang dạng xeto ốn định hơn axit pyruvic.
13) Dưới tác dụng của cacboxylaza, C0
2
được tách ra từ axit pyruvic và tạo thành aldehyt axetic.
14) Enzyme alcoholdehydrogenaza chuyến H
+
từ NAD.H
2
cho aldehyt axetic. Ket quả là rượu
etylic được tạo thành và NAP và NAD được tái tạo.
Như chúng ta đã biết, nấm men là cơ thể kỵ khí tùy tiện. Chúng hô hấp như những cơ thể
hiếu khí bậc cao. Khi nấm men được gieo cấy vào môi trường có oxy hòa tan chúng hô hấp
và sinh trưởng, tăng sinh khối. Lượng oxy hòa tan trong môi trường dần cạn kiệt nấm men
chuyến sang hô hấp kỵ khí hay lên men (Lương Đức Pham, 2006).
2.3.2. Yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
a. Anh hưởng của oxỵ
Nấm men vang được xem là vi sinh vật sống hiểu khí tùy tiện. Trong điều kiện có oxy thì

hoạt động sinh sản của nấm men mạnh mẽ hơn, vì vậy lượng sinh khối tăng lên nhanh và trở
thành sản phấm chủ yểu trong môi trường lên men. Ngược lại, trong điều kiện thiểu hoặc
không có mặt oxy, nấm men sẽ chuyến từ hoạt động hô hấp hiếu khí sang lên men kỵ khí,
khi đó sản phẩm trong môi trường lên men là ethanol trở thành chủ yếu. Tuy nhiên hai kiểu
hô hấp trên đều có mối quan hệ chung với nguồn đường có trong môi trường. Qua thực tế
sản xuất rượu vang cho thấy lượng đường tiêu hao cho kiểu hô hấp hiếu khí chiếm khoảng
1/5; tiêu hao cho hô hấp kỵ khí là 4/5 (hay nói cách khác là lên men để tạo thành ethanol).
b. Anh hưởng của nhiệt độ
Nấm men khá bền ở nhiệt độ thấp, nó có thế sống trong băng nhiều tháng, thậm chí ở nhiệt
độ -190°c. Nấm men vang rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, trong môi trường lỏng ở nhiệt độ từ
40-ỉ-50
o
C nấm men hầu như ngưng hoạt động và sau 1,5 giờ sẽ bị chết; ở nhiệt độ 60-^65°C
chúng sẽ bị chết sau 5 phút. Trong môi trường khô với độ ấm tương đối 13% nấm men chịu
nhiệt tốt hơn, khả năng chịu nhiệt có thế đến 85-ỉ-105
o
C. Nấm men tạo bào tử cũng tương tự,
tuy có khá hơn nấm men không tạo bào tử, ví dụ như trong môi trường khô chúng có thể chịu
được đến 115-ỉ-125°c.
Nhiệt độ tối un cho nấm men vang là 25-r28°C, ở nhiệt độ thấp hơn nấm men vang hoạt
động chậm và yếu hơn. Có những dòng có thể lên men ở 4H-10°C, song rất chậm và yếu. Vì
vậy, lượng đường sót còn lại trong môi trường lên men khá lớn, và đây chính là môi trường
tốt cho những vi sinh vật gây bệnh rượu vang hoạt động. Nhiệt độ có thế tăng lên đến 36°c
thì nấm men bắt đầu bị ức chế, đến nhiệt độ 38°c thì gần như không hoạt động và đến 40°c
thì chúng bắt đầu chết dần. ơ điều kiện lớn hơn 40°c thì lại rất thuận lợi cho vi khuẩn sinh
acid acetic hoạt động, do đó trong sản xuất rượu vang cần phải kiếm soát không để cho nhiệt
độ lên men vượt quá 36°c.
c. Anh hưởng của ánh sáng
Ánh sáng là yếu tố kìm hãm hoạt động của nấm men vang, đặc biệt các tia cực tím trong ánh
sáng sẽ tiêu diệt tế bào nấm men. Vì vậy, quá trình lên men phụ thuộc vào thời tiết của từng

mùa.
d. Anh hưởng của các acid hữu cơ
Nấm men vang có thể hoạt động tốt trong môi trường có 8-Ỉ-10 g/1 acid (với môi trường này
thì hầu như các loài vi khuấn đều bị ức chế). Hoạt động của vi khuan acetic có ảnh hưởng lớn
đến quá trình lên men vang nho, ở pH<2,6 thì chúng không hoạt động được, ở pH từ 3,5-Ỉ-
4,5 là tối ưu cho vi khuấn acetic hoạt động, trong khi đó pH tối un cho những vi khuẩn khác
là 7. Vì vậy, môi trường nước nho càng chua (pH càng thấp) thì càng hạn chế được hoạt động
của nhiều loại vi khuẩn.
e. Anh hưởng của thê oxy hóa-khử
Nấm men có thế hoạt động tốt trong môi trường có thế oxy hóa-khử (rH) từ 10-ỉ-27,5. cần
lưu ý là, hoạt động sống của nấm men vang sẽ hạ thấp rH của môi trường, nếu rH hạ xuống
dưới 10, thì sẽ không có đủ 0
2
cho sự phát triển của nấm men. Điều này cũng có thế xảy ra
khi ta tiến hành sulfite hóa, rH sẽ giảm dần, nghĩa là trong môi trường sẽ thiếu dần 0
2
, từ đó
bắt buộc nấm men vang chuyển từ hô hấp hiếu khí sang hô hấp kỵ khí (nghĩa là lên men để
tạo ethanol).
f. Anh hưởng của đường
Quá trình lên men xảy ra nhanh, thuận lợi khi:
- Trong nước nho có hàm lượng đường từ 10-ỉ-25%, quá trình lên men vẫn bình thường.
- Trong nước nho có hàm lượng đường lớn hơn 25%, quá trình lên men bắt đầu bị chậm và
khó khăn.
- Trong nước nho có hàm lượng đường chiếm 35%, thì quá trình lên men xảy ra rất
yếu và chậm.
g. Anh hưởng của ethanol
Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men kỵ khí là ethanol. Ethanol kìm hãm (ức chế) hoạt
động sống của tế bào nấm men, tuy nhiên mức độ kìm hãm khác nhau đối với các chủng, nòi
nấm men khác nhau. Đối với Saccharomyces ellipsoideus có thể chịu đựng được 18%

(v/v) ethanol, nhưng với Kỉ. Apiculata chỉ chịu đựng được từ 4-ỉ-6% (v/v) ethanol. Khả
năng chịu đựng ethanol của nấm mốc, vi khuẩn còn kém hơn nhiều so với nấm men. Điều
này thật sự có ý nghĩa trong sản xuất, bởi vì khi quá trình lên men kỵ khí bắt đầu xảy ra thì
những sản phẩm ethanol hình thành trong môi trường có tác dụng kìm hãm mạnh mẽ nấm
mốc, vi khuẩn (hiện diện trong dịch nho) và sau đó ức chế những nấm men dại đi lẫn với s.
ellipsoideus, đế rồi phải nhường môi trường cho nấm men vang hoạt động.
h. Anh hưởng của CO2
Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sự sinh sản của
nấm men vang. Theo nghiên cứu của Muller-Thurgau, khi:
- Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt đến 0,25% trọng lượng thì sự sinh sản của nấm men bị
đình trệ.
- Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt đến 0,15% trọng lượng thì nấm men không còn sinh
sản được nữa.
- Với hàm lượng CO2 như trên, ở nhiệt độ 15°c sẽ có áp suất là 7,7 atm, nấm
men
vẫn sống và tiếp tục lên men kỵ khí.
Đây chính là những điều kiện kỹ thuật dùng đế áp dụng cho quátrìnhchampagne
hóa
trong công nghệ sản xuất rượu champagne (Bùi Ái, 2005).
2.4.ENZYME PECTINASE
2.4.1. Giói thiệu
Enzyme pectinase là nhóm enzyme thủy phân pectin, sản phẩm tạo thành là các acid
galacturonic, glactose, methanol. Ngày nay enzyme pectinase được sử dụng trong nhiều lĩnh
vực: chế biến nước quả, công nghiệp dệt, công nghệ sinh học.
2.4.2. Co’ chất của enzyme pectinase
Một trong các nguyên nhân chính gây ra sự thành lập chất có hại trong nước trái cây và rượu
vang do sự hiện diện các hợp chat pectin. Các chất này nằm ở thành tế bào được phóng thích
khi trái cây bị nghiền nhão ra.
Tính chất keo liên kết với pectin trong nước trái cây tác dụng một hiệu ứng bảo vệ ngăn cản
sự kết lắng. Dưới sự hiện diện của enzyme pectinase, phân tử pectin bị thủy phân, các sản

phẩm được tạo thành mất đi tính keo dễ dàng hơn quá trình lắng các hạt tử gây vẩn đục và dễ
tách ra bằng ly tâm, lọc hay lắng.
2.4.3. Phân loại và cơ chế tác dụng của enzyme pectinase
Theo quan điếm hiện đại, trong phức hệ enzyme pectinase có những enzyme sau:
- Pectinesterase (PE): Phân cắt liên kết giữa metanol và nhóm cacboxyl của acid
galacturonic. Pectinesterase sẽ thủy phân trước nhất là nhóm metyleste nằm giữa 2 nhóm
cacboxyl tự do, và sau đó sẽ thủy phân lần lượt các liên kết este dọc theo phân tử pectin. Ket
quả tạo thành acid pectinic, acid pectic và rượu metanol. pH và nhiệt độ tối un của
pectinesteras phụ thuộc vào nguồn thu nhận. PE của vi sinh vật có pH tối ưu từ 4.5 đến 5.5
trong khi đó PE từ nguồn thực vật có pH tối un tù’ 5 đến 8.
- Polygalacturonase (PG): Là enzyme tác dụng lên pectin, acid pectinic và acid pectic.
Các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân pectic bởi polygalacturonase có thế là các
acid penta, tetra, tri và digalacturonic. Dựa vào cơ chế tác dụng có thế chia
polygalacturonase thành 2 nhóm:
(i) Endopolygalacturonase phân cắt liên kết a-1,4 ở phía trong mạch phân tử
pectin cũng như ở phía trong phân tử acid polygalacturonic.
(ii) Exopolygalacturonase có khả năng cắt dần dần từngphân tử acid
galacturonic ở đầu mạch của pectin.
pH và nhiệt độ tối un của polygalacturonase cũng phụ thuộc vào nguồn thu nhận. Thông
thường bền vững ở' trong vùng pH từ 4 đến 6.
- Transeliminase (TE): Transeliminase có khả năng cắt đứt liên kết a-1,4 của phân tử pectin,
kết quả là tạo ra các đơn phân galacturonic có chứa nối đôi. Transeliminase tác dụng lên
pectin cũng như acid pectic. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng, có thể phân thành
những nhóm enzyme sau:
(i) Pectin transeliminase là những enzyme tác dụng lên pectin và acid pectinic.
Polygalacturonat transeliminase là những enzyme tác dụng lên acid pectinic và acid pectic.
2.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme pectinase
- Anh hưởng của tình trạng chất lượng của pectin: tình trạng chất lượng của pectin có
ảnh hưởng nhiều đến sự tạo độ nhớt và khả năng thủy phân của enzyme. Pectin có độ ester
hóa càng cao thì độ nhớt càng cao và hiệu quả tác dụng của polygalacturonase càng thấp.

Phân tử pectin đã deester hóa thủy phân gấp 60 lần so với phân tử pectin ester hóa. Đã có
những số liệu chứng tỏ acid pectic bị phân giải nhanh gấp 17 lần so với pectin đã ester hóa
một phần, và pectin đã ester hóa hoàn toàn thì chỉ bị phân giải rất ít.
- Anh hưởng của thành phần khoáng và pH của nước quả: theo nhiều tác giả, các
ion K
+
, Na
+
, Ca
2+
, Mg
2+
có ảnh hưởng tới hiệu quả tác dụng của enzyme pectinase. Người ta
thừa nhận rằng muối Ca
2+
, Mg
2+
nâng cao hoạt độ của enzyme, còn các ion Ca
2+
, Mg
2+
và
Cu
2+
là nhân tố ức chế các enzyme pectinase. Đã xác định được rằng KC1, HC1, HgCl, H
2
0
2
không có tác dụng tới hoạt độ của enyme pectinesterase trong cam. Acid ascorbic, NaHSOi
với nồng độ thấp, nâng cao hoạt độ của enzyme.

2.5.ĐƯỜNG VÀ HÓA CHẤT
2.5.1 Đưòng
Công thức cấu tạo của đường Saccharose được thể hiện ở hình 2.5. Đường là thực phẩm rất
quan trọng cho đời sống con người, là nguồn cung cấp năng lượng cần thiết cho cơ thể.
Đường có vị ngọt và ngon. Đường được sử dụng rộng rãi trong đời sống hằng ngày với nhiều
hình thức: nước giải khát, bánh kẹo, sử dụng trong công nghệ sản xuất đồ hộp, trong y học
đế chữa bệnh. Vì vậy, sản xuất đường là ngành công nghệ thực phẩm được coi là quan trọng
và phát triển.
Đường bao gồm nhiều loại và chủ yếu được sản xuất từ mía, củ cải đường hoặc cây thốt lốt.
Dù là loại nào, đường đều có thành phần chủ yếu là saccharose, song có tên gọi khác nhau
do nguồn gốc khác nhau. Ta thường gặp đường mía (các loại đường sản xuất từ mía); đường
củ cải (các loại đường sản xuất từ củ cải đường); đường thủ công (các loại đường sản xuất
bằng phương pháp truyền thống).
Đường còn được phân biệt chi tiết hơn dựa vào hình thức, gồm các loại: đường kính (hạt
đường óng ánh như kính vụn), đường cát (hạt đường giống hạt cát), đường bột (đường có
dạng bột), đường phổi (miếng đường có cơ cấu xốp tựa cấu tạo của phổi); dựa vào độ tinh
khiết người ta phân biệt đường thành 2 loại: đường thô (đường sơ chế dùng làm nguyên liệu
chế biến ra đường khác có chất lượng cao hơn) và đường tinh chế (đường có độ tinh khiết
cao hơn so với đường kính).
2.5.2 Hóa chất
a. Metabisulfìte sodium (Na
2
s
2
0
5
)
Metabisulfite sodium hay pyrosulfit sodium, công thức hóa học là Na
2
s

2
0
5
, có dạng bột từ
trắng đến vàng nhạt.
Nước thốt nốt có thế được xử lý bằng metabisulfit sodium với hàm lượng khoảng 1300^-
1400 mg/1 trong giai đoạn thu hoạch trên cây nhằm giảm hiện tượng lên men nước, duy trì
chất lượng thốt nốt trong quá trình thu hoạch. Khi sử dụng metabisulílt sodium để xử lý nước
thốt nốt trong thời điểm thu hoạch, điều có lợi là hợp chất này có tác dụng bảo quản rất tốt,
màu sắc của nước thốt nốt trắng đục tự nhiên, nước không xuất hiện mùi vị lạ với nồng độ
hóa chất thấp (Nguyễn Minh Thủy et al., 2001).
CHc
OH
H ÓH
Glucose
ÓH H
Fructos
e
Saccharose Hình 2.5. Công thức cấu tạo
của saccharose
Hình 2.6. Công thức cấu tạo của NaiSiOs

Sodium metabisulfít (hình 2.6) là một chất sát trùng lý tưởng đế điều khiến sự phát trien của
nấm mốc, nấm men dại và vi khuẩn. Nó giúp nấm men chọn lọc phát triển ưu thế hơn trong
môi trường lên men. S0
2
còn có tác dụng ngăn cản sự biến màu rượu vang, bảo vệ mùi vị, ảnh
hưởng tốt trong quá trình chín của rượu vang, thanh lọc và bảo quản.
b. NaHS03
Sodium bisulfite (hình 2.7) là một sản phẩm có giá trị đóng vai trò quan trọng trong công

nghệ sản xuất rượu vang. Hoá chất này có nhiều công dụng: làm sạch nước quả trước khi bắt
đầu lên men, khử trùng thiết bị với hàm lượng cao hơn và nó cũng được bố sung vào vang
trong công đoạn đóng chai đế giảm một số các hiệu quả có hại trong quá trình tồn trừ như sự
oxy hoá và giảm hương vị.
0
„ Ẳ
HO
QNa
Hình 2.7. Công thức cấu tạo của NaHS0
3
Sodium bisulfit cơ bản là một loại tinh thế mịn, tồn tại ở dạng khí S0
2
khi hoà tan vào nước.
Sau khi bổ sung S0
2
vào trong dung dịch thì sau vài giờ sẽ thoát ra khỏi dung dịch.
Khí S0
2
giải phóng từ sodium bisulfit hoạt động như một chất vệ sinh, giết chết các loại nấm
mốc, vi khuẩn dại cũng như các vi sinh vật không mong muốn khác trong quá trình lên men.
Nó cũng có tác dụng bảo vệ vang bằng cách thế chỗ cho không khí bão hoà trong rượu vang.
Có thể bổ sung một lượng nhỏ sodium bisulfit để thanh trùng bất cứ loại dịch quả nào trước
khi tiến hành lên men. Các loại nước quả tươi thường là nguồn nhiễm nhiều loại vi sinh vật
cùng với các loại men tự nhiên. Neu cho các loại vi sinh vật này phát triển thì đó là mối đe
dọa cho sự hư hỏng của rượu sau này. Ngoài ra, có thế sử dụng sodium bisulfit kèm với các
loại acid như acid citric, tartaric đế nâng cao hiệu quả sử dụng sodium bisulfit vì S0
2
sẽ
được giải phóng nhanh hơn trong môi trường acid ( />sodium-bisulfite.html).
Trong quá trình lên men có nhiều vi sinh vật lạ lên men sinh ra nhiều acid hữu cơ và các hợp

chất khác, do đó việc sử dụng NaHS0
3
để sát khuẩn trước khi lên men là cần thiết, với hàm
lượng cho phép nhỏ hơn 450 ppm (Jim Smith, 1991).
Sodium bisulfit cũng rất hữu ích trong việc bảo quản rượu vang suốt thời gian tồn trữ. Oxy là
kẻ thù chính của vang trong thời gian từ giai đoạn lên men đến tiêu thụ. Quá nhiều oxy có thể
làm cho vang bị chuyển màu thành nâu hoặc hơi cam. Một khi bố sung sodium bisulfit vào
vang trước khi đóng chai sẽ giúp loại bỏ đi phản ứng oxy hoá và có thể giữ lại được hầu hết
các phẩm chất của vang ( bisulfite.html).
c. Acid citric (C
6
H
8
0
7
)
Sử dụng nhằm mục đích tạo pH thích hợp cho quá trình lên men. Công thức cấu tạo của acid
citric được thế hiện ở hình 2.8.
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
3.1.Phưong tiện nghiên cửu
- Thời gian thực hiện: 12 tuần (từ ngày 03/01/2010 đến 22/04/2011).
- Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa
Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, trường Đại học cần Thơ.
3.2.Phương pháp
3.2.1. Vật liệu
- Nước thốt nốt (hình 3.1): Địa điểm lấy mẫu tại Tịnh Biên, tỉnh An Giang.
- Nấm men phân lập
- Đường saccharose sử dụng là đường tinh luyện.
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Máy đo pH (Martini, Romania)

Tủ hút (Dalton, Nhật)
Cân phân tích (JL 200 Chyo, Nhật)
H
Hình 2.8. Công thức cấu tạo của acid citric
Hình 3.1 Nước thốt nốt sau thu hoạch
(Nguồn: gle. com.vn/imglanding?q=nước thốt not)
Kính hiển vi (Nikon, Nhật)
Máy votex (Minishaker, Nhật)
Máy quang phố hấp thu Spectrophotometer (Ư2800 Hitachi, Nhật)
Tủ đông (Sanyo, Nhật)
Hệ thống chưng cất, hoàn lưu
Một số dụng cụ phân tích (cốc thủy tinh, bình định mức, buret, pipet, )
Hình ảnh một số thiết bị và dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm được biểu diễn trong
hình 3.2
4. Cân phân tích
7. Máy quang phổ hấp thu. 8. Tủ đông
Hình 3.2. Các thiết bị sử dụng cho các nghiên cứu
3.2.3. Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí theo kiếu hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Các thí nghiệm được thực hiện trên quy trình chế biến rượu vang thốt nốt tống quát (hình 3.3)
Nước thốt nốt sau thu hoạch
Thanh trùng (NaHS0
3
)
Nhân giống Phân lập
nấm men < nẩm men
Sản phẩm
Hình 3.3 Quy trình chế biến rượu vang thốt nốt tổng quát
- Nguyên liệu: nước thốt nốt được xử lý bằng Na
2

s
2
0
5
trong quá trình thu nhận trên
cây (liều lượng khoảng 1 g/1), nước phải nguyên chất và chưa bị biến đối chất lượng
(thế hiện qua °Brix và pH).
- Phối chế: Nước thốt nốt sau khi được vận chuyến từ huyện Tịnh Biên, tỉnh An
Giang về phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm sẽ được lọc và bố sung sulfate amon
((NH
4
)
2
SO4) (0,3 g/1), thiamin (tỷ lệ 5mg/l), điều chỉnh pH = 4,5 bằng acid citric và điều chỉnh độ
Brix về 24 bằng cách bổ sung thêm đường saccharose đế tạo môi trường thích hợp cho nấm men
phát trien.
Lên men <
+ Phương pháp tính và chuyển độ Brix về giá trị A (yêu cầu) có thể được thực hiện theo công
thức:
A/100 = (a + x)/(100 + x)
Trong đó: A là độ Brix của dịch quả yêu cầu, a là độ khô của dịch quả sau khi lọc và X là hàm
lượng đường cần thiết bố sung.
+ Phương pháp điều chỉnh pH: đo pH nước thốt nốt sau khi thu nhận. Sau đó điều chinh pH
của nước thốt nốt bằng cách giảm 0,1 mức pH thì sử dụng 1,8 g acid citric cho 1 lít nước thốt nốt
được chuẩn bị sẵn.
- Thanh trùng: mẫu sau khi phối chế được thanh trùng bằng hóa chất NaHS0
3
với liều lượng 120
mg/lít, thời gian thanh trùng 2 giờ và lên men ở nhiệt độ phòng.
- Lên men: sau khi thanh trùng, tiến hành cho nấm men đã được phân lập vào với mật số 1 o

5
CFU/ml, khuấy đều để tạo oxy cho nấm men phát triển sinh khối và sau đó đậy kín lại đế quá trình
lên men xảy ra. Quá trình này cần được thực hiện trong điều kiện thiếu ánh sáng, yếm khí và nhiệt
độ ổn định. Thời gian lên men kéo dài khoảng 10-12 ngày.
- Làm trong, bảo quản: khi kết thúc quá trình lên men chính, thực hiện làm trong bằng enzyme
pectinase và bảo quản ở các điều kiện khác nhau theo yêu cầu của từng thí nghiệm.
1) Thí nghiêm 1. Khả năng tăng mật sổ tế bào nấm men theo thời gian nhân giong cho các mâu
lên men khác nhau.
a. Mục đích: Xác định thời gian đế đạt được mật số tế bào nấm men thích hợp cho quá
trình lên men (10
5
CFƯ/ml).
b. Bố trí thí nghiệm:
Chuẩn bị môi trường tăng sinh cho nấm men:
Môi trường khoai tây: khoai tây 20%, glucose 2%, 0,2% (NH
4
)
2
S0
4
, 0,2% KH2PO4, nước vừa đủ
100%. Dung dịch được phân phối vào bình tam giác đậy bằng nút gòn, khử trùng ở 121°c trong 15
phút bằng hơi nước (Bùi thị Thúy Ngân, 2010).
Sau khi tiệt trùng, môi trường với các thể tích khác nhau được cấy nấm men với mật số tương ứng
là 10
5
CFƯ/ml và đặt trên máy lắc với tốc độ 140 vòng/ phút. Theo dõi khả năng tăng sinh của nấm
men ở các môi trường nhân giống. Mật số nấm men được xác định sau mồi 2 giờ bằng cách quan
sát số lượng nấm men bằng buồng đem Thomas. Kiểm soát chất lượng nấm men thông qua số
lượng tế bào/ml môi trường>120-149.10

6
, số lượng tế bào nẩy chồi 10-15%, lượng tế bào chết
không quá 2-4%.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố, 3 lần lặp lại.
Nhân tố A: thế tích mẫu (ml), với 4 mức độ Ai: 10
A
2
: 50 A
3
: 100 A
4
: 200