Nghiên cứu qui trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull. Fr.) Pers.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh học (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=====***=====


CỒ THỊ THÙY VÂN


NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG
DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ
(HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.)
VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC





Hà Nội - 2015



Công trình đƣợc hoàn thành tại:

Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội





Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ MAI HƢƠNG
PGS.TS. TRẦN LIÊN HÀ




Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Thành Đạt
Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Trung Thành
Phản biện 3: PGS.TS. Phạm Quang Thu






Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp trƣờng;
Họp tại: Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội;
Vào hồi:…… giờ, ngày……, tháng……, năm……

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
2. Thư Viện Quốc gia Việt Nam

1

I. Giới thiệu
1. Đặt vấn đề
Nấm lớn có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống, chúng có vai trò trong nền kinh tế, khoa
học và tham gia vào các chu trình chuyển hóa vật chất - năng lượng trong tự nhiên. Nhiều loài nấm
lớn được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị
một số bệnh nguy hiểm như tim mạch, béo phì, giải độc và bảo vệ tế bào gan, phòng và điều trị
loãng xương…
Trên thế giới có khoảng hơn 2000 loại nấm có thể ăn và dùng làm thuốc, ngoài nguồn nấm
thu hái từ thiên nhiên, người ta đã trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công
nghiệp, công nghiệp với hiệu quả và năng suất cao. Nhiều nhà khoa học cho rằng nấm sẽ là một
trong những thực phẩm rất quan trọng và thông dụng của con người trong tương lai.
Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do đó nguồn phế thải từ
nông, lâm nghiệp (rơm, rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô…) rất dồi dào, đây là nguồn nguyên
liệu thích hợp để trồng nấm; bên cạnh đó điều kiện tự nhiên (nhiệt độ, độ ẩm…) của nước ta rất phù
hợp với việc nuôi trồng nấm. Trong mười năm trở lại đây ngành sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu ở
Việt Nam đã có những bước tiến đáng kể nhưng vẫn chậm phát triển hơn so với các nước trên thế
giới do ít đầu tư vào nghiên cứu các công nghệ tiên tiến, thiết bị hiện đại để áp dụng vào sản xuất
nấm ăn – nấm dược liệu.
Công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể đang là hướng nghiên cứu được các nhà
nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm vì giống nấm dạng dịch thể so với giống trên cơ chất tổng hợp
dạng rắn (mùn cưa, thóc, que sắn…) có rất nhiều ưu điểm vượt trội như:

+ Chu kỳ phát triển của giống nấm nhanh, qua đó rút ngắn được thời gian nhân giống các cấp
(trong điều kiện thuận lợi thì nuôi sợi trong môi trường lỏng khoảng 3 - 5 ngày là có thể sử dụng được,
khi cấy sang nguyên liệu nuôi trồng có thể rút ngắn được 1/2 đến 2/3 thời gian ươm sợi);
+ Tuổi giống đồng đều, chất lượng giống nấm ổn định;
+ Sinh lực giống khỏe, khi cấy giống vào giá thể nuôi trồng sợi nấm khôi phục nhanh, khả
năng hấp thụ dinh dưỡng và tốc độ lan sợi mạnh;
+ Giá thành sản xuất giống thấp do quá trình sản xuất tiết kiệm được nguyên nhiên vật liệu, nhân
công Ngoài ra, phương pháp này còn thuận lợi trong việc sản xuất nấm trên qui mô công nghiệp.
2. Đối tƣợng nghiên cứu và mục tiêu của Luận án
Đối tượng nghiên cứu của luận án là nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers., đây
là một loại nấm quí có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, được sử dụng để điều trị hiệu quả một số
bệnh ung thư, thậm chí với cả những trường hợp đã dùng hoá trị liệu mà không có tác dụng; Loại
nấm này cũng được biết đến thông qua các thử nghiệm về bệnh tim được triển khai rộng và thu
được kết quả tốt qua theo dõi trên điện tâm đồ và các triệu chứng lâm sàng; Với các lợi ích lớn về
giá trị dinh dưỡng, dược liệu và kinh tế mà loại nấm này mang lại, hiện nay các nhà khoa học trong
nước cũng như trên thế giới đang rất quan tâm nghiên cứu nhằm hoàn thiện qui trình nhân giống,
nuôi trồng, chế biến sau thu hoạch… để tạo ra các sản phẩm phục vụ công tác phòng chữa bệnh,
tăng cường sức khỏe cộng đồng.
Mục tiêu của Luận án
- Đưa ra được qui trình công nghệ phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus;
- Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus dạng dịch thể các
cấp với dung tích từ 200ml đến 120 lít;
- Đưa ra được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn cơ chất
tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể;
- Đưa ra được qui trình tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu khỉ H. erinaceus thành
phẩm, đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất này;
3. Những đóng góp mới của Luận án
Công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm không thực sự là
công nghệ mới trên thế giới nhưng trong bối cảnh sản xuất nấm tại Việt Nam hiện nay thì đây thực sự là
hướng nghiên cứu mới cần được ưu tiên nghiên cứu, phát triển nhằm từng bước thay đổi phương thức

sản xuất giống nấm, mang lại hiệu quả kinh tế cao theo hướng sản xuất qui mô công nghiệp, dần dần
2

đưa máy móc vào sản xuất nấm nhằm giảm thiểu lao động nặng nhọc cho người trồng nấm, kích thích
người lao động cũng như các doanh nghiệp tham gia sản xuất nấm nhằm tăng sản lượng nấm thương
phẩm một cách nhanh chóng, tạo nguồn thu cao và ổn định cho người trồng nấm; Hơn nữa còn tạo ra
một khối lượng lớn các sản phẩm nấm phục vụ cho tiêu dùng và cung cấp cho ngành công nghiệp chế
biến, sản xuất thực phẩm chức năng; Vậy những đóng góp mới của Luận án là:
- Đã tuyển chọn được chủng nấm Đầu khỉ He1 có khả năng phát triển tốt trong điều kiện
nuôi trồng ở Việt Nam; Hoàn thiện phương pháp phân lập lại chủng nấm này để làm cơ sở cho việc
bảo quản và sử dụng giống nấm lâu dài;
- Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể từ quy mô phòng thí nghiệm
đến quy mô 120 Lít để sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn cơ chất tổng
hợp; So sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể với giống nấm dạng rắn;
- Đưa ra được qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống
dạng dịch thể;
- Đã tách chiết và bước đầu khảo sát tác dụng của polysaccharide từ nấm Đầu khỉ bao gồm: hoạt
tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính gây độc tế bào nuôi cấy invitro, hoạt tính gây độc tế bào nuôi
cấy trên thạch mềm, kiểm tra độ an toàn và khả năng bảo vệ phóng xạ trên động vật thử nghiệm.
4. Bố cục của Luận án
Luận án gồm 147 trang với 58 bảng số liệu, 51 hình ảnh, 73 tài liệu tham khảo; Bố cục của
Luận án: Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan (28 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp
nghiên cứu (21 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (83 trang); Chương 4: Kết luận
(3 trang), Tài liệu tham khảo (6 trang); Danh mục các công trình đã công bố (1 trang).
II. Nội dung của Luận án

Mở đầu: Đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng và mục đích của Luận án

Chƣơng 1: Tổng quan
Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề:

- Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu trên thế giới và ở Việt Nam;
- Tình hình nghiên cứu tách chiết, chuyển hoá các chất có hoạt tính sinh học trong nấm ăn - nấm
dược liệu trên thế giới và ở Việt Nam;
- Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.; Phân loại nấm học; Đặc điểm
hình thái quả thể nấm Đầu khỉ; Giá trị dinh dưỡng - dược liệu của nấm Đầu khỉ; Tình hình nghiên
cứu về nhân giống, nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới và ở Việt Nam.
- Một số phương pháp tách chiết polysaccharide trong nấm lớn.
Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Tiếp cận phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật của một số tác giả trong nước và trên thế giới
bao gồm:
Phương pháp phân lập giống, lên men lỏng nhân giống dạng dịch thể, nuôi trồng nấm Đầu
khỉ trên nguồn nguyên liệu tổng hợp, theo các tác giả Nguyễn Lân Dũng, Đinh Xuân Linh, Lê Xuân
Thám, S.T. Chang;
Phương pháp nấm học trong nghiên cứu hình thái quả thể, bào tử, hệ sợi; theo tác giả Trịnh
Tam Kiệt;

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương
pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996).
Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy
invitro theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS(1993).
Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm của Abrham W.B.; Turner A.và theo
quy định của WHO và Bộ Y tế về an toàn và hiệu lực của chế phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên.
3

Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus
3.1.1. Kết quả tuyển chọn 4 giống nấm Đầu khỉ
Ở phần này trình bày chi tiết các kết quả của quá trình nuôi trồng khảo kiểm nghiệm 4 giống
nấm Đầu khỉ, mô tả đặc điểm hệ sợi, quả thể, đánh giá khả năng chống chịu sâu bệnh hại, thời gian
nuôi trồng của từng giống; Qua quá trình khảo nghiệm tuyển chọn được giống nấm ký hiệu He1 với

các đặc tính vượt trội hơn so với 3 giống còn lại như sau:
- Khả năng hình thành quả thể đồng loạt, hình thái quả thể đẹp, trọng lượng trung bình cao:
đạt 150-170g/ quả, phần thịt nấm chắc, đặc, chất lượng nấm thương phẩm đồng đều.
- Thời gian nuôi trồng ngắn: tổng thời gian từ khi cấy giống đến khi thu hái là 56 – 62 ngày.
- Có khả năng chống chịu với sâu bệnh hại tốt trong điều kiện nuôi trồng tự nhiên.
- Thành phần dinh dưỡng của nấm Đầu khỉ He1 cân đối, so với thành phần dinh dưỡng của
nấm Đầu khỉ đã được một số tác giả công bố là tương đương nhau. Kết quả phân tích giá trị dinh
dưỡng của chủng Đầu khỉ He1 được ghi nhận ở bảng sau
Bảng 3.4: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng và vitamin của He1
STT
Tên chỉ tiêu
ĐVT
Nấm tƣơi
Nấm khô tuyệt đối
1
Hàm lượng nước tổng số
%
56,40
-
2
Hàm lượng vật chất khô
%
43,60
-
3
Hàm lượng protein thô
%
15,6
27,7
4

Hàm lượng Chất béo tổng số
%
2,19
5,02
5
Hàm lượng Hydratcacbon
%
11,37
26,08
6
Hàm lượng Canxi (Ca)
%
0,035
0,08
7
Hàm lượng Phospho (P)
%
0,28
0,64
8
Hàm lượng Sắt (Fe)
mg/kg
15,99
36,67
9
Hàm lượng Vitamin C
mg/100g
8,05
18,46
10

Hàm lượng Vitamin A
mg/100g
0,01
0,02
11
Hàm lượng Vitamin B
1

mg/100g
0,30
0,69

Bảng 3.5: Kết quả phân tích thành phần axit amin của nấm Đầu khỉ He1
STT
Tên chỉ tiêu
ĐVT
Kết quả
1
Hàm lượng Aspartic acid
mg/g
2,17
2
Hàm lượng Threonine
mg/g
1,19
3
Hàm lượng Serine
mg/g
0,72
4

Hàm lượng Glutamic acid
mg/g
3,66
5
Hàm lượng Proline
mg/g
1,02
6
Hàm lượng Glycine
mg/g
0,98
7
Hàm lượng Alanine
mg/g
1,54
8
Hàm lượng Valine
mg/g
1,39
9
Hàm lượng Lysine
mg/g
1,35
10
Hàm lượng Methionine
mg/g
0,2
11
Hàm lượng Isoleucine
mg/g

1,03
12
Hàm lượng Leucine
mg/g
1,66
13
Hàm lượng Tyrosine
mg/g
0,44
14
Hàm lượng Phenylalanine
mg/g
0,78
15
Hàm lượng Histidine
mg/g
0,98
16
Hàm lượng Agrinine
mg/g
0,92
17
Hàm lượng Cystine
mg/g
0,07
Kết luận: lựa chọn giống He1 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trong Luận án.
4

3.1.2. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ.
Ở phần này trình bầy các kết quả nhằm xây dựng qui trình phân lập giống nấm Đầu khỉ bao gồm:

- Lựa chọn phương pháp phân lập: kết quả nghiên cứu kết hợp với quan sát thực nghiệm cho
thấy trong 2 phương pháp phân lập thì nấm Đầu khỉ phù hợp với phương pháp nuôi cấy mô quả thể vì
bằng phương pháp nuôi cấy mô hệ sợi có khả năng bung sợi nhanh, sức sống khoẻ, tỷ lệ nhiễm thấp
hơn so với phương pháp nuôi cấy từ bào tử; Xong phương pháp phân lập từ mô nấm lại có nhược điểm
là không bảo toàn được các đặc tính di truyền của giống gốc qua nhiều thế hệ nhân chuyển vì vậy để
đảm bảo giống không bị thoái hóa, suy biến thì nên lựa chọn sử dụng kết hợp cả hai phương pháp để
phân lập lại giống, tùy vào mục đích sử dụng giống. Trong sản xuất, để đáp ứng nhu cầu gấp rút và số
lượng lớn, chất lượng giống đồng đều thì nên sử dụng phương pháp phân lập từ mô quả thể; Song song
với quá trình sản xuất, để đảm bảo lưu giữ được nguồn giống trong thời gian dài mà không bị suy biến
cần tiến hành phân lập giống từ bào tử để bảo quản ở điều kiện lạnh sâu trong thời gian dài.
- Xác định thời điểm phân lập: việc lựa chọn đúng thời điểm để phân lập hệ sợi từ quả thể
bằng phương pháp nuôi cấy mô có ảnh hưởng lớn đến chất lượng giống nấm. Tốc độ sinh trưởng
của giống nấm Đầu khỉ phân lập ở 4 giai đoạn quả thể khác nhau có sự khác biệt rõ rệt cả về đặc
điểm giống lẫn chất lượng giống; Ở giai đoạn mầm quả thể và quả thể còn non đưa ra phân lập thì
hệ sợi nấm không phát triển, mô nấm bị teo dần; Ở giai đoạn quả thể già, bắt đầu phát tán bào tử
đưa ra phân lập thì chất lượng giống kém, sớm xuất hiện quả thể ngay trên môi trường nuôi cấy
thuần khiết; Ở giai đoạn quả thể trưởng thành đưa ra phân lập cho chất lượng giống tốt, chậm xuất
hiện quả thể, thấy xuất hiện nhiều bào tử phấn trên bề mặt thạch, đây là biểu hiện của giống Đầu khỉ
có chất lượng cao.
- Xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp để phân lập giống nấm Đầu khỉ
+ Nguồn cacbon thích hợp: Trong các loại đường bổ sung thì đường glucose là thích hợp,
cho tốc độ sinh trưởng của hệ sợi lớn nhất đạt 6,25 mm/ ngày, đồng thời đặc điểm hệ sợi tốt nhất.
Việc bổ sung các phụ gia nguồn gốc tự nhiên như cám gạo, bột ngô hoặc mầm malt cũng có tác
động tốt đối với sự phát triển của hệ sợi nấm đầu khỉ. Như vậy, nguồn đường thích hợp để bổ sung
vào môi trường phân lập giống gốc là đường glucose.
+ Nguồn nitơ thích hợp: trong các nguồn nitơ sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm
Đầu khỉ thì nguồn nitơ hữu cơ cho tốc độ sinh trưởng của hệ sợi cao hơn so với nguồn nitơ vô cơ.
Bổ sung NaNO
3
; (NH

4
)
2
SO
4
và NH
4
NO
3
vào nuôi cấy nấm Đầu khỉ cho sinh khối sợi cao hơn
không bổ sung nhưng hệ sợi phát triển loang lổ không đều, sợi nấm trắng đục, thô sợi. Trong khi đó
bổ sung cao nấm men, pepston sinh khối sợi nấm Đầu khỉ cao, đạt 4,8-5,2 mm/ngày, so với đối
chứng chỉ đạt 3,0 mm/ngày; Các phụ gia nên lựa chọn là cám gạo, bột ngô hoặc mầm malt.
+ Môi trường thích hợp để phân lập giống nấm Đầu khỉ: kết quả nghiên cứu kết hợp với quan sát
thực tế cho thấy ở công thức môi trường CT3: khoai tây: 200g; glucose: 20g; pepton: 1,5g; cao nấm
men: 1,5g; MgSO
4
.7H
2
O: 1g; KH
2
PO
4
: 1 g; thiamin: 30 µg; nấm sò tươi: 100g; cám gạo: 10g; cám
ngô: 10g; agar: 20g; nước cất: 1000 ml có đầy đủ chất khoáng đồng thời có bổ sung cám ngô, cám gạo
nên hệ sợi sinh trưởng tốt hơn, hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng khoẻ, tốc độ mọc nhanh đạt 8,4
mm/ngày; như vậy, CT3 là công thức môi trường phù hợp để phân lập giống nấm Đầu khỉ.
- Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ: kết quả cho thấy, giống gốc nấm Đầu
khỉ sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 24 ± 2
o

C; Hệ sợi dày, trắng đậm, sợi mượt bám sát bề
mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể rất muộn; Tốc độ sinh trưởng đạt 8,5 mm/ ngày. Ở nhiệt 28 ± 2
o
C
hệ sợi phát triển nhanh hơn, tốc độ sinh trưởng đạt 8,9 mm/ngày nhưng hệ sợi mảnh, trắng mờ, sợi
khô bám sát bề mặt thạch, xuất hiện mầm quả thể khi hệ sợi chưa ăn kín bề mặt thạch; Lựa chọn
nhiệt độ 24 ± 2
o
C để nuôi giống nấm nấm Đầu khỉ trong các thí nghiệm tiếp theo.
5

Từ kết quả khảo sát các điều kiện phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ đã trình bày, NCS xin đề
xuất sơ đồ tóm tắt qui trình phân lập lại giống gốc nấm Đầu khỉ như hình 3.12 dưới đây.

Hình 3.12: Sơ đồ tóm tắt qui trình phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ
3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể.
Ở phần này trình bày kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp để nhân giống Đầu khỉ dạng
dịch thể các cấp trung gian cấp 1 dung tích 200 ml, giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000
ml và giống sử dụng trong nuôi trồng dung tích 120 lít, từ đó xây dựng được qui trình công nghệ
nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các cấp.
3.2.1. Nhân giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus trung gian cấp 1 dạng dịch thể dung tích 200ml
- Xác định chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng: kết quả cho thấy khử trùng ở nhiệt độ
115
o
C trong 30 – 35 phút là thích hợp nhất vì ở điều kiện khử trùng này môi trường dinh dưỡng vừa đảm
bảo vô trùng vừa không bị mất dinh dưỡng.
- Xác định công thức môi trường thích hợp để nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung
gian cấp 1: Kết quả nghiên cứu kết hợp với quan sát thực tế cho thấy nấm Đầu khỉ phát triển tốt
trong công thức môi trường CT 8 có thành phần: Glucose: 15g; Pepton: 2,5g; CNM: 2g; MgSO
4

.7H
2
O: 1g; KH
2
PO
4
: 1g; K
2
HPO
4
: 1g; (NH
4
)
2
HPO
4
: 1g; Thiamin: 20 µg; Nước:1000 ml; hệ sợi
nấm Đầu khỉ sinh trưởng khoẻ, lượng sinh khối tăng nhanh đạt 0,54 g/100ml/ 7 ngày nuôi.
- Xác định pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể thích hợp: kết quả cho thấy giống nấm Đầu
khỉ có sinh khối sợi lớn nhất khi pH ở mức 6,5 là 0,56g/100ml/7 ngày nuôi, ở pH 4 và pH 8 hệ sợi
phát triển kém chỉ đạt 0,12 – 0,35g/100ml/7 ngày nuôi cấy;Như vậy ngưỡng pH thích hợp cho hệ
sợi nấm Đầu khỉ phát triển là từ 6 – 7, phát triển tối ưu ở pH 6,5.
Quả thể nấm Đầu khỉ đang
trong giai đoạn phát triển 7-9
ngày tuổi, hình thái quả thể cân
đối, không nhiễm bệnh
Chuẩn bị môi trường với thành phần:
200g/l khoai tây; 20g/l glucose; 1,5g/l
pepton; 1,5 g/l CNM; 0,5g/l MgSO
4

; 1g/l
KH
2
PO
4
;1g/l K
2
HPO
4
; 30µg/l thiamin;
100 g/l nấm sò tươi; 10 g/l cám gạo; 10g/l
bột ngô; 20g Agar; pH 6,5. Khử trùng.

Đổ môi trường ra đĩa petri vô trùng,
để nguội
Xử lý sơ bộ, đưa vào box cấy vô
trùng, thu bào tử hoặc mô nấm
Nuôi sợi trong điều kiện nhiệt độ
24±2
o
C, ánh sáng mờ hoặc không có
ánh sáng.
Loại bỏ những mẫu nhiễm, sợi phát
triển yếu, chậm hơn so với những mẫu
cấy cùng đợt.
Kiểm tra chất lượng giống sau 2 ngày cấy,
định kỳ kiểm tra 2-3 ngày 1 lần. Thời gian
nuôi 12 - 14 ngày.
Giống gốc đạt
tiêu chuẩn

6

- Xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể: Tỷ lệ giống
cấy có ảnh hưởng rõ rệt tới tốc độ sinh trưởng của giống nấm và đặc điểm hệ sợi trong môi trường
dịch thể. Tỷ lệ giống cấy quá cao hay quá thấp đều làm giảm tốc độ sinh trưởng của giống cũng như
làm thay đổi kích thước của khuẩn lạc cầu; Theo một số nghiên cứu đã được công bố thì kích thước
khuẩn lạc cầu không nên quá to hay quá nhỏ, kích thước thích hợp trong khoảng 1,2 – 1,7 mm.

Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi trường CT8
Với tỷ lệ giống cấy thích hợp hợp khi nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể là 4%
cho kết quả lượng sinh khối đạt 0,58 g/100ml/7 ngày nuôi cấy, kính thước KLC đạt 1,3 – 1,5 mm.
- Xác định nhiệt độ giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể: Nhiệt độ có ảnh hưởng
rất rõ rệt đến sự sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường dịch thể; Ở điều kiện nhiệt độ
dưới 20
o
C hệ sợi phát triển rất kém, thậm chí không có hiện tượng nẩy mầm của sợi nấm gốc; Hệ
sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ 21 – 24
o
C, phát triển tối ưu ở điều kiện
24
o
C. Ở điều kiện từ 27
o
C hệ sợi phát triển kém dần và ngừng phát triển khi nhiệt độ tăng đến 33
o
C.
NCS chọn điều kiện nhiệt độ 24±2
o
C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
- Xác định chế độ nuôi giống: Chế độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch

thể khác nhau có ảnh hưởng khá lớn đến sinh khối sợi nấm đồng thời có vai trò quyết định hình thái
hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể. Trong công tác nhân giống điều tối kị là để xuất hiện quả thể
ngày trong quá trình nhân chuyển các cấp giống; Vì vậy không thể nuôi giống trung gian cấp 1 ở
chế độ nuôi tĩnh mà phải lựa chọn một trong hai chế độ khuấy hoặc lắc để nuôi giống nhằm làm
tăng lượng sinh khối trong dịch nuôi. Tùy vào mục đích nhân giống mà lựa chọn chế độ nuôi dùng
khuấy từ hoặc dùng bàn lắc để đạt được hiệu quả cao nhất; Dưới đây là hình ảnh khi nuôi giống
Đầu khỉ dạng dịch thể ở các chế độ khác nhau;



a. Hệ sợi nấm Đầu khỉ
nuôi tĩnh
b. Hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi
chế độ khuấy từ
c. Hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi chế độ
khuấy từ lắc
Hình 3.18: Hình thái hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 ở từng điều kiện nuôi
7

+ Xác định chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 khi nuôi trên máy lắc: Khi nuôi giống nấm
Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể trên máy lắc với tốc độ lắc phù hợp (140 - 160 v/p) sẽ thu
được giống nấm chất lượng tốt với các đặc điểm: lượng sinh khối sợi lớn, đạt 0,58 - 0,6 g/100ml/7
ngày nuôi, hệ sợi kết lại với nhau tạo thành các khuẩn lạc cầu có kích thước đồng đều, kích thước
khuẩn lạc cầu không quá to hoặc quá nhỏ, đạt 1,3 - 1,5 mm, xung quanh khuẩn lạc cầu có nhiều tua
gai có xu hướng nhân lên rồi đứt gãy khỏi khuẩn lạc cầu mẹ để tạo khuẩn lạc cầu mới.
+ Xác định chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 khi nuôi trên máy khuấy từ: Khi nuôi giống
nấm trung gian cấp 1 dạng dịch thể với con khuấy từ kích thước 2cm; tốc độ khuấy 140 - 160v/p
cho sinh khối sợi đạt 0,56 g/100ml/7ngày nuôi; Hệ sợi dưới tác động của con khuấy từ bị đánh tan
không có khả năng cuộn lại với nhau tạo dạng khuẩn lạc cầu.
- Xác định đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể.

Hình 3.20: Đường cong sinh trưởng của giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8
Nhìn vào đường cong sinh trưởng của giống nấm nấm Đầu khỉ cho thấy:
+ Giai đoạn thích nghi của giống ngắn, xuất phát từ thời điển cấy giống cho đến 48 giờ sau khi
cấy. Trong giai đoạn này không thấy có sự thay đổi rõ về hình thái cũng như kích thước hệ sợi nấm.
+ Giai đoạn tăng sinh kéo dài từ sau 24 giờ nuôi cho đến hết 144 giờ kể từ khi cấy giống; Đây
là giai đoạn phát triển tối đa của giống; Hình thái hệ sợi cũng thể hiện rất rõ sinh lực giống đang trong
giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ nhất thể hiện như sau: hệ sợi phát triển đồng đều, các khuẩn lạc cầu tăng
kích thước nhanh chóng, xung quanh khuẩn lạc cầu xuất hiện nhiều tua gai, các tua gai liên tục đứt gãy
khỏi khuẩn lạc cầu ban đầu để tiếp tục nhân lên, xoắn lại với nhau để tạo thành khuẩn lạc cầu mới do đó
trong giai đoạn này khuẩn lạc cầu vừa tăng sinh về kích thước lẫn số lượng.
+ Giai đoạn cân bằng của giống kéo dài từ 144 giờ nuôi trở đi, đây là đặc điểm khác biệt của
giống nấm Đầu khỉ nói riêng và giống nấm lớn nói chung so với vi nấm; Pha cân bằng có thể kéo
dài hàng chục ngày, tiếp đó hệ sợi nấm không chết đi mà chuyển sang một trạng thái mới, hệ sợi
bện kết lại với nhau tạo mảng, tạo khối dày, dai, sau đó hình thành quả thể ngay trong môi trường
dịch thể; Quả thể phát triển và lụi tàn dần khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt. Pha suy vọng bắt đầu diễn
ra sau 30 - 35 ngày nuôi cấy.
Trong công tác nhân giống, chúng tôi không quan tâm nhiều đến giai đoạn cân bằng và suy
vong của giống mà chỉ nghiên cứu để nắm được đặc điểm phát triển của giống; điều quan trọng nhất
trong nhân giống dạng dịch thể là tìm được giai đoạn tăng sinh của giống để khai thác sử dụng; Đối với
giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 giai đoạn này kéo dài từ sau 72 đến 144 giờ nuôi cấy (3 - 6 ngày).
8

Như vậy, sau khi đã khảo sát các điều kiện nhân giống trung gian cấp 1 nấm Đầu khỉ, NCS
xin đề suất sơ đồ qui trình tóm tắt như sau:


Hình 3.21: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể,
dung tích 200ml
3.2.2. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể (thể tích 2000ml – 5000ml)

Qua quá trình nghiên cứu đã xác định được các điều kiện thích hợp để nhân giống nấm Đầu
khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 lít, bao gồm các điều kiện:
- Thành phần môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2
thích hợp: Glucose: 15g; Pepton TQ: 4g; MgSO
4
.7H
2
O: 1g; KH
2
PO
4
: 1g; K
2
HPO
4
: 1g; (NH
4
)
2
HPO
4
: 1g;
thiamin: 20 µg; nước cất: 1000 ml, pH 6,5; dầu đậu tương 0,5 ml/1 lít môi trường;
Nấm tươi, cắt chân, rửa
sạch

Khoai tây gọt vỏ, thái lát
mỏng 1,5 cm

Trộn hai dịch chiết với nhau, bổ

sung nước cho đủ 800 ml

Cấy giống

Luộc trong 300 ml nước sạch/ 10-
15 phút, lọc lấy nước chiết

Đổ dịch vào chai 500ml, làm nút
bông, hấp khử trùng, để nguội.

Nuôi sợi trên máy lắc 150
vòng/ phút

Hỗn hợp dịch nuôi

Bổ sung 500 ml nước; Đun sôi 10
- 15 phút, lọc lấy nước chiết

Glucose: 15g; Pepton: 2,5g;
CNM: 2g; MgSO
4
.7H
2
O: 1g;
KH
2
PO
4
: 1g; K
2

HPO
4
: 1g;
(NH
4
)
2
HPO
4
: 1g; Thiamin: 20
µg
Hòa tan hoàn toàn
trong 200ml nước

Chuẩn bị phòng
cấy, dụng cụ cấy,
giống gốc.

Nhiệt độ nuôi 24± 2
o
C.
Thời gian nuôi 3-6 ngày

Quan sát hệ sợi, đánh giá chất
lượng giống dạng dịch thể.

Giống nấm dạng dịch thể
trung gian cấp 1
Tỷ lệ giống 4% so với thể tích

9

- Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng nhân giống: 115
o
C/50 phút;
- Tỉ lệ giống cấy chuyển: 5-7%,
- Tuổi giống sử dụng để cấy chuyển: 3 - 6 ngày tuổi, tốt nhất ở 5 ngày tuổi;
- Nhiệt độ nuôi giống 24±2
o
C
- Chế chế độ sục khí: 0,4 – 0,5 lít khí/lít môi trường/phút
- Thời gian nuôi: 5 ngày
Từ đó NCS xin đề xuất sơ đồ tóm tắt qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể trung
gian cấp 2 dung tích 2000 - 5000 ml như sau:

Hình 3.30: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể,
dung tích 5000ml

3.2.3. Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dụng tích 120 lít
Qua quá trình nghiên cứu đã xác định được các điều kiện thích hợp để nhân giống nấm Đầu
khỉ dạng dịch thể dung tích 120 lít phục vụ nuôi trồng, bao gồm:
Cân Glucose: 15g/l; Pepton TQ:
4g/l; MgSO
4
.7H
2
O: 1g/l; KH
2
PO
4

:
1g/l; K
2
HPO
4
: 1g/l; (NH
4
)
2
HPO
4
:
1g/l; thiamin: 20 µg; pH 6,5
Cấy giống, tỉ lệ 5-7% thể tích

Đổ dịch vào bình lên men, lắp ống dẫn, màng
lọc khí; Khử trùng ở 115
o
C/50 phút, để nguội
trong phòng sạch


Lắp vào hệ thống cấp khí, thể tích
khí 0,4 - 0,5lit/1lit dịch nuôi/phút


Hòa tan hoàn toàn vào nước sạch

Chuẩn bị phòng
cấy, dụng cụ cấy,

giống trung gian
cấp 1nuôi lắc trong
5 ngày liên tục

Nhiệt độ nuôi 24± 2
o
C,
thời gian nuôi 5 ngày

Quan sát hệ sợi, đánh giá chất
lượng giống dạng dịch thể.

Giống nấm dạng dịch
thể trung gian cấp 2
10

- Thành phần môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp
2: Glucose: 10g/l; Saccarose: 10g/l; Bột dinh dưỡng cô đặc: 20g/l; MgSO
4
.7H
2
O: 1g/l; KH
2
PO
4
:
1g/l; K
2
HPO
4

: 1g/l; NaNO
3
: 1g/l; NH
4
NO
3
: 1g/l; B
1
: 3 viên/l; pH 6,5; dầu đậu tương 0,5 ml/1 lít
môi trường;
- Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng nhân giống: 121
o
C/80 phút;
- Tỉ lệ giống cấy chuyển: 15%,
- Tuổi giống sử dụng để cấy chuyển: 4 - 6 ngày tuổi, tốt nhất ở 5 ngày tuổi;
- Nhiệt độ nuôi giống 24±2
o
C
- Chế chế độ sục khí: 0,4 – 0,5 lít khí/lít môi trường/phút
- Thời gian nuôi: 5 ngày
NCS xin đề xuất sơ đồ tóm tắt qui trình sản xuất giống nấm các cấp và sơ đồ tóm tắt QTCN
lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120lit như hình 3.36, 3.37 dưới đây.

Hình 3.36: Qui trình sản xuất giống nấm các cấp.


Nhân giống gốc,
bảo quản giống sản
xuất

Nhân giống
trung gian cấp
1, cấp 2


Nhân giống
sản xuất


Phân tích chất lượng, giám sát QTSX

Chuẩn bị
môi
trường
Lên men sản
xuất

Thanh trùng,
làm nguội


Nguyên
liệu

Cấy sang cơ chất
tổng hợp nuôi trồng

Xử lý dịch lên
men

Vệ sinh
thiết bị
Ươm sợi, chăm
sóc, thu hái quả
thể.
11

Hình 3.37: Qui trình lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120lit

3.3. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng
giống dạng dịch thể.
Để nghiên cứu xây dựng được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống
nấm dạng dịch thể đồng thời khẳng được các ưu điểm của qui trình khi sử dụng giống dạng dịch thể
so với qui trình khi sử dụng giống dạng hạt, tiến hành các thí nghiệm song song sử dụng cả giống
hạt và giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ, các thí nghiệm được thực hiện trong cùng
một điều kiện, với các tiêu chuẩn giống nấm đưa vào sử dụng như sau:
Glucose: 10g/l;
Saccharose: 10g/l; Bột
dinh dưỡng cô đặc:
20g/l; MgSO
4
.7H
2
O:
1g/l; KH
2

PO
4
: 1g/l;
K
2
HPO
4
: 1g/l; NaNO
3
:
1g/l; B
1
: 3 viên; Dầu
đậu tương; pH 6,5

Vệ sinh,
khử trùng nồi lên men

Pha môi trƣờng,
khử trùng MT

121
o
C trong 80 phút

121
o
C trong 4 giờ

Lấy mẫu kiểm tra sau

24 - 36 giờ kể từ khi
cấy giống, kiểm tra
mùi dịch lên men, cấy
chuyển sang MT PGA.



Lên men


Để nguội, cấy giống,
tỷ lệ 15% thể tích

Kết thúc lên men, kiểm
tra chất lƣợng giống

Cấy ra bịch nguyên
liệu nuôi trồng

Giống đạt tiêu
chuẩn
- Nhiệt độ: 24±2
o
C
- pH: 6 - 7
- Sục khí: 0,4 – 0,5lít khí/ 1lít
dịch nuôi/phút.
- Thời gian lên men: 5 ngày

Giống trung
gian cấp 2
đạt tiêu
chuẩn
12

* Tiêu chuẩn giống dạng hạt đưa vào sử dụng: giống được nhân trên thóc, đóng trong chai
thủy tinh khối lượng 300 gam/ chai; giống sử dụng đúng độ tuổi (hệ sợi mọc kín đáy chai giống
nhưng chưa xuất hiện mầm quả thể ở bề mặt chai và thành chai); giống nấm phải có sinh lực khỏe
thể hiện ở các đặc điểm: hệ sợi trắng muốt, màu sắc đồng nhất, khả năng phục hồi nhanh sau quá
trình bảo quản, khả năng thích ứng cao với môi trường dinh dưỡng nuôi trồng. Giống nấm không bị
nhiễm mốc, nhiễm khuẩn.
* Tiêu chuẩn giống dạng dịch thể đưa vào sử dụng:
- Giống dạng dịch thể được nuôi trong bình lên men 5 lít có sục khí, thời gian nuôi 4 - 6
ngày; trước khi đưa ra sử dụng được kiểm tra độ thuần khiết của giống, đảm bảo giống không
nhiễm khuẩn, nhiễm mốc, sinh lực giống khỏe.
- Giống dạng dịch có màu vàng đậm của môi trường nhân giống; dịch nuôi trong, có mùi
thơm đặc trưng của nấm Đầu khỉ, không phân tầng, mật độ hệ sợi dạng cầu (khuẩn lạc cầu) dày đặc,
sinh khối sợi đạt 0,7 – 0,8 g/ 100 ml giống dịch thể; kích cỡ khuẩn lạc cầu đồng đều đạt từ 1,2 –
1,5mm, soi kiểm tra xung quanh bề mặt khuẩn lạc cầu thấy sợi nấm phân nhánh dày tạo thành dạng
tua gai xung quanh khuẩn lạc cầu, pH dịch nuôi đạt 5,5 – 6. -
3.3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến khả năng nhiễm bệnh trong môi trường
nuôi cấy và sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ
Độ ẩm nguyên liệu nuôi trồng là một trong các yếu tố quan trọng có ảnh hưởng rất lớn tới sự
sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm, với độ ẩm thích hợp sẽ kích thích sự tăng trưởng, trong
khi với độ ẩm cao hơn hoặc thấp hơn sẽ có ảnh hưởng tiêu cực đến tăng trưởng của hệ sợi. Kết quả

nghiên cứu cho thấy, độ ẩm của nguyên liệu có ảnh hưởng rất lớn tới tỉ lệ nhiễm trong quá trình
nuôi trồng nấm Đầu khỉ do ảnh hưởng tới quá trình khử trùng nguyên liệu; Ở độ ẩm nguyên liệu
50% tỉ lệ nhiễm cao, chiếm 50% (ở độ ẩm nguyên liệu 50 %) đối với cả hai mẫu cấy giống dạng hạt
và cấy giống dạng dịch thể; thậm chí mẫu lưu (không cấy giống) cũng nhiễm khuẩn và nhiễm mốc
sau 2 – 4 ngày lưu mẫu; Khi độ ẩm nguyên liệu tăng dần thì tỉ lệ nhiễm cũng giảm và giảm xuống
thấp nhất khi độ ẩm nguyên liệu đạt 60 - 70 %.
Song song với quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu đến tỉ lệ nhiễm bệnh
của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong giai đoạn nuôi trồng, ảnh hưởng của độ ẩm nguyên liệu tới sự sinh
trưởng, phát triển của hệ sợi được cũng được ghi nhận; Ở độ ẩm 50%, 55%, 60% hệ sợi phát triển
kém; Ở độ ẩm 65% sợi nấm phát triển tốt nhất ở cả hai mẫu thí nghiệm đạt 8,2 mm/ngày đối với
mẫu cấy giống dạng hạt, đạt 9,5 mm/ngày đối với mẫu cấy giống dạng dịch thể; Khi độ ẩm nguyên
liệu tăng đến 70% thì tốc độ sinh trưởng của hệ sợi giảm ở cả hai mẫu thí nghiệm, trong đó mẫu cấy
giống dạng dịch thể giảm mạnh hơn (đạt 5,8 mm/ngày).
Từ kết quả thu được cho thấy độ ẩm nguyên liệu thích hợp nhất để nuôi trồng nấm Đâu khỉ
là 65%. NCS lựa chọn độ ẩm nguyên liệu 65 % để tiếp tục tiến hành thí nghiệm khảo sát thành phần
môi trường tổng hợp nuôi trồng nấm Đầu khỉ tiếp theo.
3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử trùng đến sự sinh
trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá trình nuôi trồng thu quả thể.
- Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử trùng đến tỉ lệ
nhiễm: Kết quả khi lưu mẫu trong điều kiện phòng, thời gian lưu 10 ngày cho thấy không có sự
khác biệt lớn giữa hai phương thức khử trùng mà chỉ có sự khác biệt giữa các công thức phối trộn;
Cùng khối lượng là 800 g/ bịch nguyên liệu khi khử trùng bằng lò hấp thủ công trong thời gian 6
giờ và khử trùng bằng nồi hấp áp lực trong 3giờ thì tỷ lệ nhiễm ở công thức CTNT 3, CTNT 4 cao
hơn hẳn so với công thức CTNT 1, CTNT 2; Với công thức CTNT 3 nguyên nhân nhiễm chủ yếu là
do thủng túi trong quá trình đóng nguyên liệu do lõi ngô nghiền không mịn được như mùn cưa; kích
13

thước nguyên liệu quá to và không đồng đều cũng là nguyên nhân gây nhiễm vì khi khử trùng
nguyên liệu chín không đều. Với công thức CTNT 4 nguyên nhân nhiễm chủ yếu do nguyên liệu bị
chua, bị nhiễm khuẩn vì có thể ở công thức CTNT 4 sử dụng bã mía là nguồn nguyên liệu giàu dinh

dưỡng, hàm lượng đường còn lại trong nguyên liệu cao, dễ bị nhiễm mốc trong thời gian bảo quản
nguyên liệu và khi khử trùng chưa đủ thời gian để diệt bào tử của các tác nhân gây nhiễm có sẵn
trong nguyên liệu nên tỷ lệ nhiễm khuẩn ở công thức này cao hơn so với các công thức còn lại, kết
quả được trình bày trong bảng 3.29.
Bảng 3.29: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu và phương pháp
khử trùng đến tỷ lệ nhiễm
Công thức

Chế độ hấp
CTNT 1
CTNT 2
CTNT 3
CTNT 4
Lò thủ
công
Nồi
áp lực
Lò thủ
công
Nồi áp
lực
Lò thủ
công
Nồi áp
lực
Lò thủ
công
Nồi áp
lực
Tổng số bịch

150
150
150
150
150
150
150
150
Số mẫu lƣu
30
30
30
30
30
30
30
30
Số bịch nhiễm
0
0
0
0
3
3
6
6
Tỷ lệ nhiễm (%)
0
0
0

0
10
10
20
20

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần cơ chất phối trộn đến tốc độ sinh trưởng của hệ
sợi nấm Đầu khỉ được ghi ở hình 3.40;

Hình 3.40: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên các công thức nuôi trồng khác nhau
khi sử dụng giống cấy dạng hạt và giống cấy dạng dịch thể.
Kết quả nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên cả bốn công thức đều cho thấy tốc độ phát triển của hệ
sợi khi cấy giống dạng dịch thể phát triển nhanh hơn so với cấy giống dạng hạt; Kết quả cũng cho
thấy hệ sợi nấm phát triển tốt hơn khi sử dụng kết hợp các nguồn nguyên liệu với nhau so với chỉ sử
dụng mỗi mùn cưa, trong đó hệ sợi phát triển tốt nhất ở công thức CTNT 2 (45% mùn cưa + 40%
bông hạt + 6% cám gạo + 8% bột ngô + 1% CaCO
3
), tiếp đó là CTNT 3 (45% mùn cưa + 40% lõi
ngô + 6% cám gạo + 8% bột ngô + 1% CaCO
3
); trên công thức CTNT 4 (45% mùn cưa + 40% bã
mía + 6% cám gạo + 8% bột ngô + 1% CaCO
3
) tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ chậm
hơn so với trên CTNT 2, CTNT 3 nhưng hệ sợi dày đặc, phân bố đều; trên CTNT 1 (85% mùn cưa
+ 6% cám gạo + 8% bột ngô + 1% CaCO
3
) hệ sợi Đầu khỉ trắng mờ, tốc độ sinh trưởng chậm.
Tiếp tục theo dõi khả năng tạo mầm quả thể, tỉ lệ quả thể trưởng thành hữu hiệu và năng suất nấm
Đầu khỉ thương phẩm ở các công thức nuôi trồng khác nhau; Kết quả ở bảng 3.30 dưới đây.

Tiếp tục theo dõi năng suất nấm trên các công thức cho thấy, ở cả ba công thức nuôi trồng
CTNT 2, CTNT 3, CTNT 4 đều cho năng suất nấm cao 29,7 – 34,7%, trong đó CTNT 2 cho năng
suất cao nhất đạt 34,7 % do ở công thức này sử dụng bông hạt kết hợp với mùn cưa mà bông hạt là
14

nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng với hàm lượng protein, lipit thực vật khá cao, rất phù hợp để
nuôi trồng nấm; nhưng nguyên liệu bông hạt khá khó mua và giá thành cũng khá cao, quá trình xử
lý bông hạt trước khi đưa vào nuôi trồng khá phức tạp, tốn sức lao động và khó khăn trong việc cơ
giới hóa các công đoạn nuôi trồng nấm, do đó có thể sử dụng các nguyên liệu thay thế như lõi ngô,
bã mía để giảm giá thành sản xuất, giảm thiểu công lao động và phù hợp với nguồn nguyên liệu sẵn
có ở từng địa phương. Trong các thí nghiệm tiếp theo, NCS lựa chọn CTNT 3

để tiếp tục xây dựng
qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể.
3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi
nấm Đầu khỉ.
Bảng 3.31: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển
của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3.
Thể tích giống
Chỉ tiêu
ĐC
(5g/bịch)
10ml
15ml
20ml
25ml
30ml
35ml
Tốc độ mọc
(mm/ngày)

12
6,7
8,5
15,0
17,4
17,5
17,5
Đặc điểm sợi
Hệ sợi
đậm, màu
trắng đồng
nhất.
Hệ sợi trắng mảnh,
phát triển loang lổ
quanh bề mặt bịch
nguyên liệu, xuất hiện
quả thể khi hệ sợi
chưa ăn kín đáy bịch
nguyên liệu
Hệ sợi trắng đậm, phát triển đều
quanh bề mặt bịch nguyên liệu, xuất
hiện quả thể khi hệ sợi đã ăn kín
đáy bịch nguyên liệu.
Kết quả cho thấy lượng giống cấy thích hợp nhất là 25ml dịch/ bịch nguyên liệu, nếu cấy
lượng giống ít hơn sẽ làm giảm tốc độ phát triển của hệ sợi, nếu cấy lượng giống nhiều hơn cũng
không làm tăng tốc độ phát triển của hệ sợi. Lựa chọn tỷ lệ giống 25ml/bịch nguyên liệu 800gam để
tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong nuôi trồng trên cơ
chất tổng hợp.
Bảng 3.32: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3

Nhiệt độ (
o
C)
18 - 21
22 - 25
26 - 29
30 -34
Đặc điểm sợi
Hệ trắng đậm,
sinh trưởng
chậm.
Hệ sợi dày, khoẻ,
trắng muốt, sinh
trưởng nhanh, xuất
hiện quả thể khi
sợi đã lan kín bịch
nguyên liệu.
Hệ sợi trắng, sợi to
đậm, sinh trưởng
nhanh, phân bố
không đều, xuất
hiện quả thể khi sợi
chưa lan kín bịch
Hệ sợi chuyển
dần sang mầu
vàng, bung sợi
kém, gần như
không bám vào
nguyên liệu.

Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, chủng nấm He1 sinh trưởng chậm trong khoảng nhiệt độ
18-21
o
C; Ở điều kiện nhiệt độ này hệ sợi nấm mượt, trắng đậm nhưng sinh trưởng chậm; Trong
khoảng nhiệt độ 22-25
o
C hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng tốt, hệ sợi nấm trắng mượt, dày đậm, tốc
độ sinh trưởng nhanh, quả thể xuất hiện đồng đều khi sợi đã lan kín bịch nguyên liệu. Trong khoảng
nhiệt độ 26-29
o
C hệ sợi sinh trưởng nhanh nhưng hệ sợi có mầu trắng mờ không đồng đều, có xuất
hiện những vùng sợi to thô như rễ tre, hệ sợi phân bố không đều trong bịch nguyên liệu, xuất hiện
quả thể ngay khi hệ sợi mới ăn kín 3/4 diện tích bịch nguyên liệu nuôi trồng; Điều này không có lợi
cho quá trình nuôi trồng vì hiệu quả sử dụng nguyên liệu không đạt 100%. Trong khoảng nhiệt độ
30 - 34
o
C hệ sợi chuyển dần sang mầu vàng và bị tàn lụi dần, không bám vào nguyên liệu.
Như vậy có thể kết luận khoảng nhiệt độ 22-25
o
C là thích hợp nhất cho hệ sợi Đầu khỉ phát triển;
15

3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể
Bảng 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự hình thành và phát triển quả thể
nấm Đầu khỉ trên CTNT3

Chỉ tiêu
Nhiệt độ (
o
C)

16 -18
20-22
24-26
28-30
Thời gian xuất
hiện mầm quả
(ngày) (*)
32-35
25 - 27
22 - 25
Xuất hiện
mầm quả thể
sau đó bị
vàng, teo dần.
Thời gian thu hái
(ngày) (**)
15-20
10-12
7-10
Tổng thời gian
nuôi trồng
47-55
35-39
29-35
Đặc điểm quả
Quả thể nhỏ, chắc,
tròn, phân nhiều
thùy, tua gai ngắn
2-3 mm, trắng ngà,
có khi chuyển mầu

trắng hồng
Quả thể to, tròn,
chắc, phân nhiều
thùy, tua gai dài
3-5 mm, mầu
trắng muốt.
Quả thể phân thuỳ,
xốp, gai dài, màu
vàng nhạt, xuất
hiện quả thể khi sợi
nấm chưa lan hết
bịch nguyên liệu
Trọng lƣợng quả
trung bình
62 - 95g
150 - 170g
80 - 120g
0
Năng suất trung
bình (%)
25,7
35
28,5
(*) Tính từ lúc cấy giống cho đến khi hình thành mầm quả thể
(**) Tính từ lúc hình thành mầm quả thể đến khi quả thể trưởng thành
Nhiệt độ ảnh hưởng rõ rệt đến hình thái và màu sắc quả thể; Trong phạm vi nhiệt độ từ 20-
22
o
C quả thể nấm phát triển tốt nhất, quả thể to, tròn, chắc, không bị phân thuỳ, màu trắng muốt, gai
dài rủ xuống mượt đẹp theo phương thẳng đứng; Trong khoảng nhiệt độ 16-18

o
C nấm Đầu khỉ hình
thành quả thể chậm, ở khoảng nhiệt độ này một số quả thể dễ bị teo dần, nhiễm mốc xanh; Trong
khoảng nhiệt độ 24-26
o
C quả thể có màu vàng nhạt, tua gai dài, phân thuỳ nhiều, phần thịt quả xốp,
trọng lượng trung bình của quả thể thấp; Khi nhiệt độ cao hơn 30
o
C quả thể bị teo hoặc nhiễm mốc
xanh trên bề mặt quả thể, thậm chí không ra quả thể.



a, Quả thể nuôi ở nhiệt độ từ 20-22
o
C
b, Quả thể nuôi ở nhiệt độ 24-26
o
C
Hình 3.43: Quả thể nấm Đầu khỉ trên công thức CTNT 3, cho ra quả thể ở các khoảng
nhiệt độ khác nhau
16

Như vậy kết quả nghiên cứu kết hợp quan sát thực nghiệm cho thấy nhiệt độ thích hợp cho
ra quả thể nấm Đầu khỉ He1 là 20 - 22
o
C; Ở nhiệt độ 24 – 26
o
C vẫn có thể trồng nấm Đầu khỉ
nhưng nên đóng bịch nhỏ hơn để thu hái một lần sẽ hiệu quả hơn khi đóng bịch 800g thu hái hai lần.

Sau khi đã khảo sát các yếu tố thích hợp cho nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm
dạng dịch thể; NCS xin đề xuất quy trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm
dạng dịch thể tóm tắt như hình 3.44 dưới đây;


Hình 3.44: QTCN nuôi trông nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể
* Hiệu quả kinh tế mang lại khi áp dụng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng
giống dạng dịch thể
Qua quá trình nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống dạng dịch thể các cấp và qui trình
nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể, cho thấy việc nuôi trồng nấm Đầu khỉ sử
dụng giống nấm dạng dịch thể là rất khả thi, mang lại hiệu quả kinh tế cao do: Rút ngắn được tổng
thời gian cho một chu kỳ nhân giống và nuôi trồng nấm; Tăng hệ số nhân giống; Giảm tỷ lệ nhiễm
và tăng năng suất nấm thương phẩm; Tiết kiệm được các chi phí về nguồn nguyên liệu sản xuất
giống nấm, nhân công, điện năng, khấu hao nhà xưởng;
Mùn cưa tạo ẩm bằng nước
vôi trong; Thời gian ủ 5 - 7
ngày; Độ ẩm 65%; pH=
7,5 - 8

Lõi ngô nghiền tạo ẩm bằng
nước vôi trong; Thời gian ủ
từ 24 giờ; Độ ẩm 65%; pH=
7,5 - 8
Phối trộn nguyên liệu, bổ sung dinh dưỡng chỉnh độ ẩm
65%; Đóng túi nguyên liệu, khử trùng.


Cấy giống (25 ml / bịch 800g)

Ươm sợi

Chăm sóc cho ra quả thể,
thu hái.

Nấm Đầu khỉ
thương phẩm
Giống nấm đạt tiêu
chuẩn, đúng độ tuổi.
- Nhiệt độ 22 - 25
o

- Độ ẩm 65 - 70%
- Không cần ánh sáng

- Nhiệt độ 20 – 22
o
C
- Độ ẩm 85 - 95%
- Ánh sáng mờ

Quả thể nấm thu hái
đúng độ tuổi, được
bảo quản lạnh hoặc
phơi khô, bảo quản
đúng qui cách.

17


Giống gốc, giống cấp 1 trên môi trường thạch

Giống cấp 1 trên môi trường thạch
Giống trung gian cấp 1 dung tích 200 - 500 ml




Giống cấp 2 trên thóc
Giống trung gian cấp 2 dung tích 2 - 5 lít




Giống cấp 3 trên thóc và que sắn
Giống sử dụng để nuôi trồng, dung tích 100 lít – 300 lít




Giống nấm dạng rắn phát triển trong cơ
chất tổng hợp
Giống nấm dạng dịch thể phát triển trong cơ chất
tổng hợp

Quả thể nấm Đầu khỉ thương phẩm nuôi trồng trên nguồn cơ chất tổng hợp
Hình 3.45: So sánh QT sử dụng giống dạng hạt và QT sử dụng giống dạng dịch thể trong nuôi
trồng nấm Đầu khỉ

18

3.4. Kết quả tách chiết polysaccharide từ nấm Đầu khỉ
3.4.1. Nghiên cứu quy trình tách chiết
Bảng 3.38: Khả năng chiết của các loại dung dịch kiềm khác nhau
Hóa chất
Dung dịch đối chứng
Dịch chiết
Mẫu
Thời gian chảy của nhớt
kế (giây)
Mẫu
Thời gian chảy của
nhớt kế (giây)
KOH 2%
M
01
11
M
1
12
Na
2
CO
3
2%
M
02
11,4
M

2
12,8
NaOH 2%
M
03
12
M
3
15

Kết quả cho thấy KOH 2%, Na
2
CO
3
2% có tác dụng chiết một ít, không đáng kể. Còn
NaOH 2% có tác dụng chiết rõ rệt. Trong số 3 loại kiềm mà chúng tôi sử dụng ở cùng nồng độ %
như nhau thì dung dịch NaOH có cường lực ion là mạnh nhất (0,5N), còn KOH và Na
2
CO
3
tương
ứng là 0,35 N và 0,4 N. Vì vậy NaOH là hóa chất kiềm thích hợp nhất để chiết tách polysacharide
từ nấm Đầu khỉ, bởi vì sử dụng NaOH sẽ tốn lượng hóa chất ít nhất so với các loại kiềm khác khi
chúng ở cùng một cường lực ion.
Bảng 3.39: Độ chiết (tương ứng với độ nhớt) thay đổi theo nồng độ của NaOH.
STT
Mẫu chiết
Nồng độ NaOH (%)
Thời gian chảy của nhớt kế
(giây)

1
M
0
(đối chứng)
0
*
13
2
M
3
2
15
3
M
4
3
30
4
M
5
3.5
34.2
5
M
6
4
36
6
M
7

4.5
36
7
M
8
5
35.8

Thông qua kết quả nghiên cứu chiết tách polysacharide và tối ưu hóa điều kiện chiết, chúng
tôi kiến nghị quy trình công nghệ chiết tách polysacharide theo 3 giai đoạn như sau: cho 200g nấm
khô đã nghiền nhỏ có độ ẩm 4% và 1600ml cồn 80% vào một bình cầu 2 lít có lắp sinh hàn ngược,
ở nhiệt độ dưới 60
0
C. Sau 20 giờ lọc lấy dịch cồn, cất quay chân không không thu hồi cồn và được
sản phẩm W1. Phần không tan, cho thêm 1500 ml nước nóng, lắc đều rồi chiết ở 100
0
C trong 2
giờ.Lọc lấy dịch chiết, sau đó dùng cồn tỷ lệ 3:1 (v/w), tách được W2. Phần không tan tiếp tục cho
thêm NaOH 4%, tỷ lệ 10:1 (v/w), khuấy đều ở nhiệt độ 50
0
C, trong 90 phút, lọc lấy dịch (lặp lại 2
lần). Dịch lọc thu gom lại chỉnh về pH = 7 – 8 bằng axit axetic, để yên tĩnh trong 30 phút, tủa cồn tỉ
lệ 3:1 rồi lọc lấy phần kết tủa W3. Hiệu suất tổng sản phẩm thu được khoảng 23 – 25%.

19

3.4.2. Xác định hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ He1 trong từng thời điểm nuôi

Hình 3.46: Sự tích lũy polysaccharide theo thời gian của quả thể nấm Đầu khỉ He1
* Ghi chú:

Mẫu 1: Quả thể 1 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể)
Mẫu 2: Quả thể 3 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể)
Mẫu 3: Quả thể 5 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể)
Mẫu 4: Quả thể 7 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể)
Mẫu 5: Quả thể 9 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể)
Mẫu 6: Quả thể 11 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể)
Mẫu 7: Quả thể 13 ngày tuổi (tính từ thời điểm xuất hiện mầm quả thể)
Kết quả tách chiết và xác định hàm lượng polysaccharide trong 7 mẫu nấm Đầu khỉ ở các độ
tuổi từ 1 ngày tuổi đến 13 ngày tuổi cho thấy tổng hàm lượng polysaccharide trong 5 mẫu nấm từ 1
đến 9 ngày tuổi tăng dần, các mẫu từ 11 đến 13 tuổi giảm so với mẫu 9 ngày tuổi. Như vậy hàm
lượng polysaccacharide tổng số trong quả thể nấm tăng theo thời gian, từ khi quả thể mới hình
thành cho tới khi quả thể trưởng thành; khi quả thể bước sang giai đoạn già, bắt đầu phát tán bào tử
thì hàm lượng polysaccharide giảm dần, đồng thời trọng lượng quả thể cũng giảm mạnh; do đó khi
nuôi trồng nấm Đầu khỉ cần thu hái đúng độ tuổi, khi quả thể nấm đạt 9 ngày tuổi (tính từ thời điểm
xuất hiện mầm quả thể) để sản phẩm nấm có chất lượng tốt, đảm bảo được các thành phần dinh
dưỡng và dược liệu trong nấm cao.
Sản phẩm polysaccharide W3 sau khi sấy phun được chụp phổ MS (Mass spectrum) tại Viện Hóa
học – Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam; Kết quả được thể hiện ở hình 3.47 dưới đây;

Hình 3.47: Phổ MS của Polysaccharide thu được
20

3.4.3. Kết quả kiểm tra hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ khô mới thu hái
và sau thời gian bảo quản 6 tháng
Bảng 3.41: Hàm lượng polysaccharide trong hai mẫu Đầu khỉ mới thu hái và qua bảo quản
(gam/ 100gam nấm khô)

Kết quả kiểm tra cho thấy sau thời gian bảo quản 6 ở nhiệt độ phòng tổng hàm lượng
polysaccharide giảm còn 1/3 so với mẫu mới thu hái, chất lượng nấm Đầu khỉ giảm mạnh, mầu sắc
sản phẩm sậm mầu hơn so với khi mới sấy; như vậy sau khi thu hái và sấy nấm cần có các biện

pháp bảo quản tốt nhằm đảm bảo chất lượng sản phẩm, thời gian bảo quản không nên kéo dài.
3.4.4. Kết quả thử hoạt tính của polysaccharide thu nhận được
3.4.5.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial assay)
Bảng 3.42: Hoạt tính kháng vi khuẩn của hai phân đoạn polysaccharide thu được
STT
Ký hiệu
mẫu

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml)
Kết quả
Nồng độ
mẫu
Vi khuẩn Gr(-)
Vi khuẩn Gr(+)
(µg/ml)
E. coli
P.
aeruginosa
B.
subtillis
S.
aureus

1
Mẫu 1
400
(-)
(-)
(-)
(-)

Âm tính

2
Mẫu 2
400
(-)
(-)
(-)
(-)
Âm tính

Bảng 3.43: Hoạt tính kháng nấm của hai phân đoạn polysaccharide thu được
STT
Ký hiệu
mẫu

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml)
Kết quả
Nồng độ
mẫu
(µg/ml)
Nấm mốc
Nấm men
A.
niger
F.
oxysporum
S.
cerevisiae
C.

albicans
1
Mẫu 1
400
(-)
(-)
(-)
(-)
Âm tính
2
Mẫu 2
400
(-)
(-)
(-)
(-)
Âm tính
* Ghi chú:
+ Mẫu 1: Polysaccharide chiết nước nóng
+ Mẫu 2: Polysaccharide chiết NaOH
Các phân đoạn polysaccharide không biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ở nồng
độ thử 400 µg/ml.
Mẫu
Phân đoạn
Mẫu mới thu hái
Mẫu bảo quản sau 6 tháng
Polysaccharide chiết nước nóng
5,30
2,26
Polysaccharide chiết NaOH

5,03
1,21
Tổng lƣợng polysaccharide
10,33
3,47
21


3.4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay)
Bảng 3.44: Hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng ung thư người của hai phân đoạn
polysaccharide thu được

STT
Ký hiệu
mẫu
Nồng độ
mẫu
( g/ml)
Dòng tế bào
Cell survival (%)
Kết luận



Hep-G2
Lu
MCF7
RD

DMSO

100,0 0,0
100,0 0,0
100,0 0,0
100,0 0,0


Chứng(+)
5
0,2 0,03
1,5 0,2
0,9 0,1
0,0 0,0
Dương tính
1
Mẫu 1
40
99,2 0,4
92,4 1,4
98,5 0,6
80,6 0,5
Âm tính
2
Mẫu 2
40
98,7 1,2
95,5 0,7
97,9 1,5
98,2 0,9

Âm tính

Các phân đoạn polysaccharide không biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào khi nuôi
cấy invitro. Theo một số công bố trước đây thì các polysaccharide phân lập từ nấm Đầu khỉ không
có hoạt tính với tế bào ung thý nuôi cấy invitro, chủ yếu là giúp tăng cường miễn dịch và ức chế
khối u trên động vật thực nghiệm.
3.4.4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm của các phân đoạn
polisaccarid
Bảng 3.45: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccaride
Ký hiệu mẫu
Nồng độ thử
mẫu ( g/ml)
Kích thƣớc trung bình của khối u
Độ giảm mật độ
khối u so với đối
chứng (%)
Đƣờng kính
( l)
% giảm so với
đối chứng
Đối chứng âm (DMSO
1%)

22,1
0
100
Mẫu chiết kiềm
40
21,5
2,75 0,21

26,2 0,53
Mẫu chiết nƣớc nóng
40
18,7
15,38 0,92
41,2 1,02

Kết quả kiểm tra cho thấy mặc dù polysacharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ He1 không có
hoạt tính gây độc tế bào khi nuôi cấy invitro, nhưng khi thử hoạt tính ức chế hình thành khối u 3
chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo thì lại cho kết quả dương tính rõ rệt. Kết
quả trình bầy trong bảng 3.45 và hình 3.48 cho thấy cả hai phân đoạn polysacharide chiết bằng
nước nóng và chiết kiềm đều cho kết quả làm giảm kích thước trung bình của khối u cũng như mật
độ khối u so với đối chứng; Trong đó đường kính khối u giảm nhiều nhất là 15,38 0,92%, mật độ
khối u giảm 41,2 1,02% so với đối chứng.
3.4.4.4. Kết quả thử nghiệm in vivo tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm polysaccharide tổng HT1
trên động vật thực nghiệm
a. Kết quả nghiên cứu an toàn của chế phẩm HT1
a1. Tác dụng của HT1 đối với trọng lượng cơ thể thỏ:
Khi cho thỏ uống HT1 trong thời gian thử 6 tuần cho thấy thỏ ở các nhóm ăn uống bình
thường, không có sự khác biệt lớn về trọng lượng thỏ giữa các nhóm thử và nhóm chứng tại thời
điểm nghiên cứu.
a2. Tác dụng của HT1 trên điện tim của thỏ khi dùng chế phẩm HT1 6 tuần:
Thử nghiệm tác dụng của HT1 tới sự thay đổi tần số tim thỏ (chu kỳ/phút) ở đạo trình D
II
ở
các thời điểm xuất phát điểm, 3 và 6 tuần (n = 8); kết quả cho thấy so với nhóm chứng, tại tất cả các
thời điểm: xuất phát điểm, sau 3 tuần, sau 6 tuần trên các băng điện tim, đọc ở đạo trình DII, biên
độ QRS của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm
(chứng, thử), tại các thời điểm, sự khác biệt cũng không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05)
Ở đạo trình D

II
khi dùng HT1 ở các thời điểm xuất phát điểm, 3 và 6 tuần (n = 8) cho kết
quả: So với nhóm chứng, tại tất cả các thời điểm: xuất phát điểm, sau 3 tuần, sau 6 tuần trên các
22

băng điện tim, đọc ở đạo trình D
II
, biên độ QRS của nhóm thử biến đổi không có ý nghĩa thống kê
(p> 0,05); So sánh riêng từng nhóm (chứng, thử), tại các thời điểm, sự khác biệt cũng không có ý
nghĩa thống kê (p> 0,05). Không thấy xuất hiện các sóng bệnh lý trên điện tim đồ thỏ các sóng bệnh
lý trên điện tim đồ thỏ ở đạo trình D
II
ở cả 2 nhóm nghiên cứu tại tất cả các thời điểm khảo sát.
a3. Tác dụng của HT1 đến một số chỉ số huyết học trên thỏ khi dùng HT1 6 tuần
So sánh sự khác biệt về chỉ số huyết học tại các thời điểm xuất phát điểm, sau 3 tuần, sau 6
tuần giữa nhóm chứng và nhóm thử cho thấy số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, hàm lượng
hemoglobin, số lượng tiểu cầu đều không có ý nghĩ thống kê.
a4. Tác dụng của HT1 đối với hoạt độ enzym SGOT, SGPT của thỏ
Tại tất cả các thời điểm, hoạt độ enzym SGOT, hoạt độ enzym SGPT của nhóm thử và giữa
nhóm thử với nhóm chứng biến đổi không có ý nghĩa thống kê.
a5. Tác dụng HT1 đối với hàm lượng Creatinin của thỏ
Tại tất cả các thời điểm thử hàm lượng Creatinin của thỏ biến đổi không có ý nghĩa thống kê.
b. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ của chế phẩm HT1
Tác dụng bảo vệ phóng xạ của HT1 được xác định thông qua các chỉ tiêu:
- Thời gian sống trung bình
- Tỷ lệ (%) sống sót
- Hệ số bảo vệ ỏ, õ của các nhóm CNT
Bảng 3.57: Tác dụng bảo vệ phóng xạ của HT1 khi dùng 30 ngày liều 0,5g/kg/24 giờ

Nhóm

NC
Liều CX
Đối chứng chiếu xạ
Chiếu xạ + HT
1
0,5g/kg
Hệ số bảo vệ
n
TGSTB
(ngày)
% sống
sót
n
TGSTB
(ngày)
% sống
sót
α
β
5,5
10
21,5
40
10
25,2
70
0,50
0,48
6,5
10

17,7
30
10
24,8
70
0,52
0,50
7,5
10
14,6
20
10
18,8
40
0,24
0,30
8,5
10
9,7
0
10
12,4
20
0,20
0,10
- Tính hệ số giảm liều của HT1: HSGL = 7,4/5,8 =1,27
c. Tác dụng của HT1 đối với quá trình tạo máu
Dưới tác dụng của bức xạ ion hoá, tủy xương, lách, đến rất nhạy cảm và bị tổn thương. Các
tổn thương này thể hiện ở sự suy giảm số lượng tế bào hữu hình trong máu ngoại vi: Cả 3 loại tế
bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, đến giảm mạnh; phù hợp với đời sống của từng loại tế bào máu

ngoại vi mà BC giảm mạnh nhất sau đó là TC và HC. Dưới tác dụng của HT1, sự biến đổi của số
lượng tế bào máu ngoại vi được trình bày ở bảng 3.58 dưới đây.
Bảng 3.58: Số lượng tế bào ở nhóm chuột nhắt trắng dưới tác dụng của
chiếu xạ và chiếu xạ + HT1
Thời điểm sau chiếu xạ
Số lƣợng HC (x 10
12/L
)
P
Nhóm CX (n=10 )
CX + HT1 (n=10)

Ngày thứ I
Ngày thứ IV
Ngày thứ IX
7,20 ± 0,80
6,6 ± 0,60
6,20 ± 0,50
7,50 ± 0,70
7,30 ± 0,40
7,10 ± 0,10
>0,05
<0,05
<0,05

Số lượng bạch cầu (x 10
9/L
)

Nhóm CX (n=10 )
CX + HT1 (n=10)

Ngày thứ I
Ngày thứ IV
Ngày thứ IX
1,50 ± 0,30
0,60 ± 0,20
0,88 ± 0,30
1,80 ± 0,30
1,3 ± 0,20
1,6 ± 0,40
>0,05
<0,05
<0,05

Số lượng tiểu cầu (x 10
9/L
)


Nhóm CX (n=10 )
CX + HT1 (n=10)

Ngày thứ I
Ngày thứ IV
Ngày thứ IX
4,30 ± 0,20
3,80 ± 0,30
4,10 ± 0,30

4,90 ± 0,60
5,10 ± 0,70
4,80 ± 0,50
>0,05
<0,05
>0,05
23

Số lượng các phần tử hữu hình của máu bao gồm hồng cầu, tiểu cầu, bạch cầu có sự thay đổi
theo chiều hướng giống nhau, giảm mạnh ở ngày thứ nhất sau chiếu xạ; đến ngày thứ IV, sự hồi
phục ở nhóm có HT1 tốt hơn; đến ngày thứ IX, sự hồi phục này càng tốt hơn.
Như vậy, kết quả thử nghiệm in vivo tại Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng
cho thấy: Polysaccharide tổng số tách chiết tử nấm Đầu khỉ an toàn ở nồng độ thử nghiệm trên thỏ,
thời gian thử nghiệm 6 tuần; Polysaccharide tổng số tách chiết tử nấm Đầu khỉ được đánh giá tác
dụng bảo vệ phóng xạ trên thực nghiệm và cho kết quả dương tính rõ rệt.

Chƣơng 4. KẾT LUẬN

Sau quá trình nghiên cứu về nấm Đầu khỉ H. erinaceus từ khâu nuôi trồng khảo nghiệm,
tuyển chọn giống; Phân lập lại giống gốc; Nhân giống, sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi
trồng nấm thương phẩm; Tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm và thử hoạt tính sinh học của
polysaccharide thu được, NCS xin đưa ra một số kết luận sau:
1. Đã nuôi trồng khảo nghiệm 4 chủng nấm Đầu khỉ H. erinaceus và tuyển chọn được chủng
ký hiệu He1 có chất lượng tốt, thành phần dinh dưỡng trong quả thể nấm thành phẩm cân đối, năng
suất cao, có đặc tính sinh học phù hợp với điều kiện nuôi trồng tại Việt Nam.
2. Đã đề xuất được qui trình phân lập, thuần khiết lại giống nấm Đầu khỉ He, chủ động trong
việc nhân giống, duy trì, bảo tồn nguồn giống ổn định cung cấp cho sản xuất; Các điều kiện thích
hợp để phân lập lại giống gốc nấm Đầu khỉ như sau:
- Quả thể chọn để phân lập lại giống gốc đang ở giai đoạn 7-9 ngày tuổi, khi quả thể nấm trưởng
thành, chưa phát sinh bào tử; Quả thể có hình thái cân đối, không bị dị tật, không nhiễm bệnh.

- Phương pháp phân lập: dùng phương pháp nuôi cấy mô tế bào (mô nấm) để phân lập lại
giống gốc với lượng lớn phục vụ sản xuất; Dùng phương pháp nuôi cấy bào tử để phân lập giống
gốc phục vụ quá trình lưu giữ, bảo quản nguồn giống trong thời gian dài.
- Môi trường thích hợp để phân lập giống nấm Đầu khỉ: khoai tây: 200g/l; pepton: 1,5 g/l;
CNM: 1,5 g/l; MgSO
4
.7H
2
O: 1 g/l; KH
2
PO
4
: 2,5 g/l; thiamin: 30 µg/l; nấm sò tươi: 100 g/l; cám
gạo: 10 g/l; bột ngô: 10 g/l; glucose: 20 g/l; agar: 20 g/l;. pH 6,5.
- Nhiệt độ nuôi sợi giống gốc thích hợp: 24±2
o
C.
- Hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trong nuôi cấy thuần khiết đạt cực đại và ổn định từ ngày
12 đến ngày 14 sau khi cấy giống.
3. Đã xác định được các điều kiện thích hợp để nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể các
cấp: giống trung gian cấp 1 dung tích 200 ml, giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 lít,
giống sử dụng trong nuôi trồng dung tích 120 lít; Từ đó đề xuất được qui trình công nghệ nhân
giống dạng dịch thể trung gian cấp 1 dung tích 200 ml; Qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch
thể trung gian cấp 2 dung tích 5000 ml; Qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể dung tích 120
lít sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp. Với các điều kiện nhân
giống như sau:
- Nhân giống trung gian cấp 1 dung tích 200ml: Thành phần môi trường dinh dưỡng: sử
dụng môi trường CT8 với thành phần: Khoai tây 200g/l; nấm sò tươi: 100g/l; Glucose: 15g; Pepton:
2,5g; CNM: 2g; MgSO
4

.7H
2
O: 1g; KH
2
PO
4
: 1g; K
2
HPO
4
: 1g; (NH
4
)
2
HPO
4
: 1g; Thiamin: 20 µg;
Nước: 1000 ml; pH môi trường dinh dưỡng 6,5; Chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng: 115
o
C
trong 30-35 phút; Tỉ lệ giống cấy chuyển 4% theo thể tích; Chế độ nuôi lắc 150 vòng/ phút liên tục
trong suốt quá trình nuôi; nhiệt độ nuôi giống: 24±2
o
C.
- Nhân giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000 ml: Thành phần môi trường dinh
dưỡng nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2: Glucose: 15g; Pepton: 4g; MgSO
4