Tổng hợp và tiêu chuẩn hóa các dẫn xuất quang hoạt Cis-n-Alkyl Phthalazinon có tác dụng kháng viêm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH




CHƯƠNG NGỌC NÃI



TỔNG HP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CÁC DẪN XUẤT
QUANG HOẠT CIS-N-ALKYL PHTHALAZINON
CÓ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM



LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC






TP. Hồ Chí Minh - Năm 2015
i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG NGỌC NÃI


TỔNG HP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CÁC DẪN XUẤT
QUANG HOẠT CIS-N-ALKYL PHTHALAZINON
CÓ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM

Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc Chất
Mã số: 62720410

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. ĐẶNG VĂN TỊNH
PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN



TP. Hồ Chí Minh - Năm 2015
ii




LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa từng
được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Chương Ngọc Nãi
iii


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa i
Lời cam đoan ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng vii
Danh mục các hình x
Danh mục các sơ đồ xiii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Đồng phân quang học 3
1.2 Enzym phosphodiesterase và mô hình gây viêm thực nghiệm 10
1.3 Dẫn xuất phthalazinon 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1 Đối tượng nghiên cứu 31
2.2 Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bò 33
2.3 Phương pháp nghiên cứu 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 45
3.1 Tổng hợp các dẫn xuất cis-N-alkyl phthalazinon 45
3.2 Xác đònh độ tinh khiết quang học bằng phương pháp HPLC với pha tónh bất
đối 71
3.3 Thử tác dụng kháng viêm in vivo 85

3.4 Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật các dẫn xuất quang hoạt 96
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 103
4.1 Dẫn xuất cis-N-alkyl phthalazinon 103
iv


4.2 Tổng hợp các dẫn xuất cis-N-alkyl phthalazinon 105
4.3 Xác đònh độ tinh khiết quang học bằng phương pháp HPLC với pha tónh bất
đối 111
4.4 Thử tác dụng kháng viêm in vivo 116
4.5 Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật các dẫn xuất quang hoạt 123
KẾT LUẬN 126
KIẾN NGHỊ 129
Danh mục các công trình liên quan đến luận án
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
cAMP
Cyclic adenosine monophosphate
Adenosin monophosphat
vòng
cGMP

Cyclic guanosine monophosphate
Guanosin monophosphat
vòng
C
Concentration
Nồng độ
CE
Capillary electrophoresis
Điện di mao quản
COPD
Chronic Obstructive Pulmonary
Disease
Bệnh phổi tắc nghẽn
mạn tính
COSY
Correlation spectroscopy
Phổ tương quan giữa
proton-proton
CTCT

Công thức cấu tạo
CTPT

Công thức phân tử
DĐVN

Dược điển Việt Nam
DMF
Dimethylformamide
Dimethylformamid

DMSO-d
6

Deuterated Dimethylsulfoxide
Dimethylsulfoxid đã
được deutri hóa
e

Giới hạn tin cậy
ee
Enantiomeric excess
Độ dôi quang học
ESI
Electron Spray Ionization
Ion hóa phun điện tử
GC
Gas chromatography
Sắc ký khí
HMBC
Heteronuclear multiple bond
correlation
Phổ tương tác dò nhân
qua nhiều nối
vi


HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng

cao
HSQC
Heteronuclear single quantum
cohenrence
Phổ tương tác dò nhân
qua một lượng tử
IC
50

Half maximal inhibitory
concentration
Nồng độ ức chế 50%
ICH

International Conference on
Harmonization
Hội nghò quốc tế về hòa
hợp
IR
Infrared
Hồng ngoại
KLPT

Khối lượng phân tử
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of quantification
Giới hạn đònh lượng

MS
Mass spectrum
Phổ khối
NMR
Nuclear magnetic resonance
Cộng hưởng từ hạt nhân
NOESY
Nuclear overhauser effect
spectrocopy
Phổ hiệu ứng hạt nhân
overhauser
PDE
Phosphodiesterase
Phosphodiesterase
RSD
Relative standard deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
SD
Standard deviation
Độ lệch chuẩn
SEM
Standard error of mean
Sai số chuẩn trung bình
SKLM
Thin layer chromatography
Sắc ký lớp mỏng
TB

Trung bình
t

o
nc


Nhiệt độ nóng chảy
tt

Thể tích

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Một số tác nhân bất đối được sử dụng phổ biến 5
Bảng 1.2 Hoạt tính ức chế enzym PDE 4 của các dẫn xuất 4-(3,4-dimethoxy
phenyl)-2H-phthalazinon 17
Bảng 1.3 Dữ liệu phân giải acid cis-cyclohex(a)en -ceto 20
Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế enzym PDE 4 của các dẫn xuất thế 4-aryl hexahydro-
phthalazinon và tetrahydrophthalazinon 21
Bảng 1.5 Hoạt tính ức chế enzym PDE 4 và tác dụng kháng viêm in vivo của các
dẫn xuất thế N-H tetrahydrophthalazinon 22
Bảng 2.1 Danh mục các hợp chất nghiên cứu 31
Bảng 2.2 Các điều kiện sắc ký khảo sát 38
Bảng 3.1 Khảo sát hệ dung môi kết tinh lại hợp chất 3 sau 6 giờ 46
Bảng 3.2 Khảo sát thời gian kết tinh lại hợp chất 3 trong n-hexan - ethyl acetat
(1:1) 46
Bảng 3.3 So sánh khả năng tách các dẫn xuất 8a, 8b, 10a, 10b giữa hai tỉ lệ dung
môi n-hexan - isopropanol (90:10) và (95:5) với tốc độ dòng 0,5 ml/phút 72
Bảng 3.4 So sánh khả năng tách các dẫn xuất 8a, 8b, 10a, 10b giữa hai tỉ lệ dung

môi n-hexan - isopropanol (90:10) và (95:5) với tốc độ dòng 1 ml/phút 73
Bảng 3.5 Khả năng tách các dẫn xuất 8a, 8b, 10a, 10b ở tỉ lệ dung môi n-hexan -
isopropanol (90:10) với tốc độ dòng 0,8 ml/phút 74
Bảng 3.6 So sánh hệ số đối xứng của pic dẫn xuất 8a, 10a với các nồng độ mẫu
khác nhau 75
Bảng 3.7 Hiệu quả phân tách các dẫn xuất 8a, 8b, 10a, 10b khi thêm
diethylamin vào pha động 75
viii


Bảng 3.8 Hiệu quả phân tách các dẫn xuất 8a, 8b, 10a, 10b khi thêm
triethylamin vào pha động 76
Bảng 3.9 Khảo sát dung môi pha mẫu cho các dẫn xuất 8a, 8b, 10a, 10b 77
Bảng 3.10 Khả năng tách đồng phân của các dẫn xuất 7a, 7b, 9a, 9b với tốc độ
dòng 0,8 ml/phút 78
Bảng 3.11 Khả năng tách đồng phân của các dẫn xuất 7a, 7b, 9a, 9b với tốc độ
dòng 1,5 ml/phút 78
Bảng 3.12 Khả năng tách đồng phân của các dẫn xuất 7a, 7b, 9a, 9b với tốc độ
dòng 2 ml/phút 79
Bảng 3.13 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống 80
Bảng 3.14 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính từ 80% - 120% nồng độ đo 83
Bảng 3.15 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính từ giới hạn đònh lượng - 10%
nồng độ đo 84
Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ chính xác và độ đúng 84
Bảng 3.17 Độ sưng phù chân chuột của các lô thử nghiệm cis-N-alkyl
hexahydrophthalazinon 86
Bảng 3.18 Độ sưng phù chân chuột của các lô thử nghiệm cis-N-alkyl
tetrahydrophthalazinon 91
Bảng 3.19 Điểm chảy của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b 96
Bảng 3.20 Số sóng hấp thu đặc trưng của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b 96

Bảng 3.21 Góc quay cực riêng của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b 97
Bảng 3.22 Tỉ lệ tạp đồng phân quang học của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b tính
theo phần trăm diện tích pic 97
Bảng 3.23 Tỉû lệ tạp chất liên quan của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b tính theo
phần trăm diện tích pic 98
ix


Bảng 3.24 Kết quả xác đònh dung môi tồn dư của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b 98
Bảng 3.25 Kết quả xác đònh hàm lượng nước của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b, 10b . 98
Bảng 3.26 Độ tinh khiết quang học theo sắc ký của dẫn xuất 7b 99
Bảng 3.27 Độ tinh khiết quang học theo sắc ký của dẫn xuất 8b 99
Bảng 3.28 Độ tinh khiết quang học theo sắc ký của dẫn xuất 9b 100
Bảng 3.29 Độ tinh khiết quang học theo sắc ký của dẫn xuất 10b 100
Bảng 3.30 Kết quả xác đònh độ tinh khiết quang học của các dẫn xuất 7b, 8b, 9b,
10b 101
Bảng 3.31 Mức chất lượng đề nghò của các dẫn xuất quang hoạt 7b, 8b, 9b,
10b 101
x


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của enzym phosphodiesterase 11
Hình 1.2 Một số chất ức chế chọn lọc enzym PDE 4 12
Hình 1.3 Cấu trúc phân tử carrageenan 13
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của phthalazinon 15
Hình 1.5 Cấu trúc chung của hợp chất có hoạt tính ức chế kép PDE 3/ PDE 4 23
Hình 1.6 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu
Demirayak S. 23

Hình 1.7 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Đặng
Văn Tònh 24
Hình 1.8 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi Sterk G.J. 25
Hình 1.9 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Doğruer
D.S. 25
Hình 1.10 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu
Kagayama K. 26
Hình 1.11 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu
Grundler G. 26
Hình 1.12 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Ashraf
H.F. 26
Hình 1.13 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Biswas
K. 27
Hình 1.14 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu
Elagawany M. 27
xi


Hình 1.15 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Khalil
N.A. 27
Hình 1.16 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Yaseen
S. 28
Hình 1.17 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Liu
A. 28
Hình 1.18 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Derita
M. 28
Hình 1.19 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu El-
Shamy I.E. 29
Hình 1.20 Dẫn xuất phthalazinon đã được tổng hợp bởi nhóm nghiên cứu Huang
L. 29

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của các dẫn xuất quang hoạt cis-N-alkyl tetrahydro-
phthalazinon và cis-N-alkyl hexahydrophthalazinon 31
Hình 3.1 Sắc ký đồ hỗn hợp sau phản ứng khi so sánh lượng natri hydrid xúc tác
phản ứng N-alkyl hóa với heptyl bromid 56
Hình 3.2 Các tương tác chính của COSY (—) và HMBC () của dẫn xuất 7b 59
Hình 3.3 Các tương tác chính của COSY (—) và HMBC () của dẫn xuất 8b 62
Hình 3.4 Công thức cấu tạo của các dẫn xuất 7, 7a, 7b, 8, 8a, 8b 63
Hình 3.5 Các tương tác chính của COSY (—) và HMBC () của dẫn xuất 9b 67
Hình 3.6 Các tương tác chính của COSY (—) và HMBC () của dẫn xuất 10b70
Hình 3.7 Công thức cấu tạo của các dẫn xuất 9, 9a, 9b, 10, 10a, 10b 71
Hình 3.8 Phân tách 8b bằng pha động (a) n-hexan - ethanol (90:10), (b) n-hexan
- isopropanol (90:10) 71
Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng 81
xii


Hình 3.10 Sắc ký đồ của mẫu (a) 7a 100 g/ml (b) 7b 100 g/ml (c) 7 100
g/ml 81
Hình 3.11 Phổ UV tại thời gian lưu của mẫu (a) 7a (b) 7b 81
Hình 3.12 Sắc ký đồ của mẫu (a) 8a 100 g/ml (b) 8b 100 g/ml (c) 8 100
g/ml 81
Hình 3.13 Phổ UV tại thời gian lưu của mẫu (a) 8a (b) 8b 82
Hình 3.14 Sắc ký đồ của mẫu (a) 9a 100 g/ml (b) 9b 100 g/ml (c) 9 100
g/ml 82
Hình 3.15 Phổ UV tại thời gian lưu của mẫu (a) 9a (b) 9b 82
Hình 3.16 Sắc ký đồ của mẫu (a) 10a 100 g/ml (b) 10b 100 g/ml (c) 10 100
g/ml 82
Hình 3.17 Phổ UV tại thời gian lưu của mẫu (a) 10a (b) 10b 83
Hình 3.18 Độ sưng phù chân chuột của các lô chứng, đối chứng, dẫn xuất 8a, 8b,
8 ở liều 30 mol/kg và 60 mol/kg 85

Hình 3.19 Độ sưng phù chân chuột của các lô chứng, đối chứng, dẫn xuất 10a,
10b, 10 ở liều 30 mol/kg và 60 mol/kg 88
Hình 3.20 Độ sưng phù chân chuột của các lô trắng, lô chứng, lô đối chứng, lô
thử nghiệm 7a, 7b, 7 ở liều 30 mol/kg và 60 mol/kg 92
Hình 3.21 Độ sưng phù chân chuột của các lô trắng, lô chứng, lô đối chứng, lô
thử nghiệm 9a, 9b, 9 ở liều 30 mol/kg và 60 mol/kg 94
Hình 4.1 Cấu trúc tinh thể của hai muối đồng phân quang học không đối quang
trong phương pháp tách đối quang 108
Hình 4.2 Cấu trúc pha tónh bất đối tris(3,5-dimethylphenylcarbamat)cellulose 113


xiii


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1 Tổng hợp các dẫn xuất 4-(3,4-dimethoxyphenyl)-2H-phthalazinon 16
Sơ đồ 1.2 Tổng hợp các dẫn xuất quang hoạt cis-hexahydrophthalazinon và cis-
tetrahydrophthalazinon 19
Sơ đồ 1.3 Phương pháp tách riêng đối quang dùng tác nhân bất đối (4R)- hoặc
(4S)-IPTT 24
Sơ đồ 1.4 Phản ứng Gabriel-Michael tổng hợp các dẫn xuất phthalazinon 27
Sơ đồ 2.1 Tổng hợp các dẫn xuất cis-N-alkyl tetrahydrophthalazinon và cis-N-
alkyl hexahydrophthalazinon dạng racemic 36
Sơ đồ 2.2 Tổng hợp các dẫn xuất quang hoạt cis-N-alkyl tetrahydrophthalazinon
và cis-N-alkyl hexahydrophthalazinon 36
Sơ đồ 3.1 Phản ứng tổng hợp acid carboxylic dạng racemic 45
Sơ đồ 3.2 Phân tách đồng phân quang học acid carboxylic dạng racemic 47
Sơ đồ 3.3 Phản ứng đóng vòng acid carboxylic tạo phthalazinon 49
Sơ đồ 3.4 Phản ứng N-alkyl hóa phthalazinon với heptyl bromid 55

Sơ đồ 3.5 Phản ứng N-alkyl hóa phthalazinon với benzyl clorid 64
1


ĐẶT VẤN ĐỀ

Dược chất quang hoạt là một trong những quan tâm chính của ngành công
nghiệp dược trong hai thập kỷ qua. Tác dụng sinh học của thuốc đôi khi chỉ thể
hiện ở một trong những dạng đồng phân quang học riêng lẻ. Trong một vài
trường hợp, các tác dụng phụ không mong muốn hoặc thậm chí độc tính có thể
xảy ra với những đồng phân quang học không có hoạt tính. Điển hình như [29]:
thalidomid ở dạng hỗn hợp racemic nhưng chỉ có dạng (R)-thalidomid có tác
dụng an thần, còn (S)-thalidomid không có tác dụng an thần nhưng lại gây quái
thai. Cả hai đối quang cũng có thể có tác dụng sinh học giống nhau nhưng tỉ lệ
hoạt tính rất khác nhau. Chẳng hạn, các chế phẩm chứa (S)-amlodipin, (S)-
omeprazol, levofloxacin, levocetirizin… có hoạt tính mạnh hơn dạng racemic và
đối quang tương ứng [12], [29], [55], [83]. Để tránh những tác dụng không mong
muốn có thể có của một dược phẩm quang hoạt, thuốc dạng đồng phân quang
học tinh khiết có hoạt tính trò liệu nên được đưa ra thò trường. Tuy nhiên, một số
lượng lớn các loại thuốc chứa dược chất quang hoạt vẫn còn trên thò trường ở
dạng racemic. Do đó, nhu cầu để phát triển công nghệ cho phân tích và tách
riêng đồng phân quang học của các thuốc racemic là rất lớn. Đây cũng là
nguyên nhân làm cho các cơ quan quản lý ở các nước Châu Âu, Mỹ và Nhật yêu
cầu ngành công nghiệp dược phải đưa ra thò trường các thuốc mới ở dạng đồng
phân quang học riêng lẻ [29], [57]. Điều này dẫn đến sự phát triển đáng kể
trong nỗ lực nghiên cứu tổng hợp các chất đối quang mới, tìm kiếm những tác
nhân, tối ưu hóa qui trình tổng hợp để cho sản phẩm đồng phân chọn lọc đối
quang tinh khiết. Bên cạnh đó, công tác tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu sau
tổng hợp là vô cùng quan trọng để sản xuất thuốc có chất lượng tốt, hạn chế tối
đa những tác dụng phụ cho người sử dụng. Vì thế, việc nghiên cứu một cách hệ

2


thống các đồng phân quang học riêng lẻ và xác đònh độ tinh khiết quang học để
cải thiện việc sử dụng thuốc an toàn là cần thiết.
Nghiên cứu sản xuất thuốc mới là một trong những nhiệm vụ vô cùng quan trọng
của ngành Dược. Dẫn xuất phthlalazinon đã được nhiều nhóm tác giả trên thế
giới phát hiện hoạt tính ức chế chọn lọc enzym phosphodiesterase 4, có tác dụng
kháng viêm dùng trong điều trò bệnh hen suyễn và viêm khớp dạng thấp [18]
[34], [43], [48], [51], [65], [69], [70], [71], [72], [73], [81]. Các công trình nghiên
cứu đã công bố tác dụng sinh học của dẫn xuất cis-phthlalazinon mạnh hơn dẫn
xuất trans-phthlalazinon và hỗn hợp racemic rất nhiều [18], [72]. Trong một số
công trình nghiên cứu của chúng tôi trước đây cũng đã tổng hợp các dẫn xuất
quang hoạt cis-phthalazinon mới và đã được công bố trên tạp chí ngoài nước
[18].
Trên cơ sở đó, với mục tiêu tiếp tục nghiên cứu tổng hợp, ứng dụng các kỹ thuật
phân tích hiện đại trong phân tách đồng phân quang học đểø góp phần đưa ra các
dẫn xuất quang hoạt mới có tác dụng sinh học, đề tài “Tổng hợp và tiêu chuẩn
hóa các dẫn xuất quang hoạt cis-N-alkyl phthalazinon có tác dụng kháng viêm”,
được thực hiện gồm các nội dung cụ thể như sau:
- Tổng hợp ở qui mô phòng thí nghiệm các dẫn xuất quang hoạt cis-N-alkyl
phthalazinon, cụ thể là các dẫn xuất quang hoạt N-n-heptyl và N-benzyl của cis-
(); cis-(+)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)tetrahydrophthalazinon và hexahydrophthal-
azinon có độ tinh khiết quang học đối quang ee > 90%.
- Thử sơ bộ tác dụng kháng viêm in vivo của các dẫn xuất quang hoạt cis-N-alkyl
phthalazinon tổng hợp.
- Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho các dẫn xuất quang hoạt cis-N-alkyl
phthalazinon tổng hợp.
3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC
1.1.1 Đồng phân quang học
Các đối quang là hình phản chiếu của nhau, không chồng khít lên nhau, tính
chất vật lý (điểm chảy, điểm sôi, chỉ số khúc xạ, tính tan) và tính chất hóa học
giống nhau. Các đối quang có tính quang hoạt gọi là đồng phân quang học
(enantiomer). Nếu phân tử chỉ có một nguyên tử carbon bất đối thì chỉ tồn tại
một đôi đối quang, còn khi trong phân tử có ít nhất 2 carbon bất đối thì mới có
được đồng phân lập thể không đối quang (diastereoisomer). Khác với các đối
quang, đồng phân quang học không đối quang không cùng mức năng lượng,
hằng số vật lý (nhiệt độ kết tinh, nhiệt độ sôi, độ phân cực, các tính chất phổ)
cũng khác nhau. Những giá trò này là cơ sở để tách các đối quang [3], [61].
1.1.2 Phương pháp tách riêng đối quang
Đa số các phản ứng tổng hợp thường tạo ra hỗn hợp racemic. Đó là trường hợp
nếu chất phản ứng, tác nhân, chất xúc tác được sử dụng là một racemic và/ hoặc
chất không bất đối. Hỗn hợp racemic có thể tách thành hai đối quang. Quá trình
tách riêng các đối quang ra khỏi hỗn hợp racemic gọi là sự phân giải racemic.
Có nhiều phương pháp tách riêng đối quang.
1.1.2.1 Phương pháp vật lý
Dựa vào tính chất vật lý khác nhau của sự kết tinh riêng biệt hai tinh thể đối
quang như trường hợp muối natri amoni tartrat hoặc phương pháp kết tinh “tự
phát”. Phương pháp này rất đơn giản nhưng không phải luôn luôn áp dụng được
cho bất kỳ một racemic nào [29], [42], [53].
4


1.1.2.2 Phương pháp hóa học
Hiện nay, phương pháp này được sử dụng hữu hiệu nhất để có thể tổng hợp và

tách các đối quang của các racemic khác nhau ở qui mô phòng thí nghiệm và qui
mô công nghiệp.
Phương pháp này được thực hiện gồm các bước sau: [3], [29], [53]
- Hóa hợp dạng racemic với một tác nhân bất đối riêng lẻ (+)B hoặc ()B để tạo
thành các đồng phân quang học không đối quang, có thể là muối hoặc phức chất.
Tác nhân bất đối có thể là một acid hoặc một base nếu racemic có tính base
hoặc tính acid tương ứng. Tác nhân bất đối cũng có thể là hợp chất trung tính
nếu racemic trung tính và sẽ tạo thành dạng phức chất.
(±)A + 2 (+)B  (+)A  (+)B + ()A  (+)B
- Do hai đồng phân quang học không đối quang thường có tính chất vật lý khác
nhau như độ tan, nhiệt độ sôi, điểm chảy, hệ số hấp phụ nên có thể tách riêng
hai dạng đồng phân quang học không đối quang ra khỏi hỗn hợp bằng các
phương pháp hóa lý như kết tinh phân đoạn, chưng cất, sắc ký cột.
(+)A  (+)B + ()A  (+)B  (+)A  (+)B và ()A  (+)B
- Tái sinh riêng biệt hai dạng đối quang có trong đồng phân quang học không đối
quang tinh khiết.
Tác nhân bất đối dùng để phân tách phải đáp ứng các yêu cầu sau: [5], [42],
[46], [53]
- Tác nhân bất đối có thể là một acid hoặc base hữu cơ mạnh để đảm bảo tạo
thành muối đồng phân quang học không đối quang bền với racemic có tính base
yếu hoặc tính acid yếu. Muối đồng phân quang học không đối quang phải kết
tinh tốt và phải có một sự khác biệt đáng kể về khả năng hòa tan giữa hai muối.
5


- Trung tâm bất đối nên càng gần với các nhóm chức liên quan đến sự tạo thành
muối càng tốt để tạo ra sự khác biệt đáng kể cấu trúc không gian của các muối
đồng phân quang học không đối quang.
- Các tác nhân bất đối nên có sẵn ở cả hai dạng đối quang.
- Tác nhân bất đối phải ổn đònh về mặt hóa học và không bò racemic dưới các

điều kiện phân tách.
- Tác nhân bất đối phải tinh khiết quang học, dễ kiếm hoặc dễ điều chế, không
độc hại, rẻ tiền và dễ thu hồi sau khi đã hoàn thành sự phân đôi.
Việc lựa chọn dung môi thích hợp dùng để làm môi trường kết tinh là quan trọng
hàng đầu. Đa số dung môi thường sử dụng là nước, alcol, aceton và ethyl acetat
[28].
Bảng 1.1 Một số tác nhân bất đối được sử dụng phổ biến [5], [46]
Tác nhân bất đối acid
Tác nhân bất đối base
() Acid tartaric
(+) Acid tartaric
(+)-1-Phenylethylamin
()-1-Phenylethylamin
(+) Acid dibenzoyl tartaric
() Acid dibenzoyl tartaric
(+) Ephedrin
() Ephedrin
(+) Acid mandelic
() Acid mandelic
(+)-2-Amino-1-butanol
()-2-Amino-1-butanol
(+) Acid camphoric
() Acid camphoric
(+) Quinin
() Quinidin
(+) Acid malic
() Acid malic
() Cinchonidin
(+) Cinchonin
(+) Acid 1-camphor-10-sulphonic

() Acid 1-camphor-10-sulphonic
() Brucin
(+) Dehydroabiethylamin
(+) Acid pyroglutamic
() Acid pyroglutamic

(+) Acid α-methoxyphenylacetic
() Acid α-methoxyphenylacetic

(+) Acid α-methoxy-α-trifluoromethylphenylacetic
() Acid α-methoxy-α-trifluoromethylphenylacetic

6


Bên cạnh đó, phản ứng hóa học còn có khuynh hướng tạo ra một đối quang
nhiều hơn đối quang kia gọi là tổng hợp chọn lọc đối quang, chỉ thực hiện khi
nguyên liệu, thuốc thử, chất xúc tác được sử dụng là chất bất đối [3], [29].
1.1.2.3 Phương pháp sinh hóa
Enzym là phân tử bất đối thiên nhiên, được xem như là mạng lưới hoạt động
ràng buộc các tác nhân hóa học. Quan hệ giữa enzym và cơ chất giống như là
hình ảnh của ổ khóa và chìa khóa. Có thể sử dụng các enzym để tách riêng các
đối quang từ hỗn hợp racemic hoặc tổng hợp chọn lọc đối quang. Phương pháp
tách riêng bằng con đường sinh hóa cho phép nhận được sản phẩm có độ tinh
khiết quang học cao [3], [29].
1.1.3 Các phương pháp xác đònh độ tinh khiết quang học
1.1.3.1 Độ tinh khiết quang học
Độ tinh khiết quang học có nghóa là cho biết một đối quang có bò lẫn lộn với đối
quang kia không và mức độ lẫn lộn là bao nhiêu. Xác đònh độ tinh khiết quang
học là yêu cầu rất quan trọng trong nghiên cứu tổng hợp hóa học bất đối, đòi hỏi

phương pháp phải nhạy, đúng và tin cậy. Độ tinh khiết quang học có thể biểu thò
ở 3 khái niệm [9], [29], [66]:
- Độ tinh khiết quang học (optical purity)
Độ tinh khiết quang học
 
 
100
max
đo
20
D
20
D




(1.1)


Trong đó:
 
đo
20
D

: là góc quay cực riêng của đối quang cần xác đònh đo được

 
max

20
D

: là góc quay cực riêng của đối quang tinh khiết
Mối liên quan giữa góc quay cực riêng
 
20
D

và nồng độ là mối quan hệ tuyến
tính. Vì vậy, có thể tính độ tinh khiết quang học là phần trăm hiện diện của đối
quang này so với đối quang kia.
7


- Độ dôi quang học = Độ tinh khiết quang học đối quang (enantiomer excess,
ee)
ee
   
   
SR
SR
SR
%%100 



(1.2)
Trong đó: [R] và [S] là lượng đồng phân tương ứng R và S hiện diện trong hỗn
hợp.

- Độ tinh khiết quang học theo sắc ký (chromatography purity)
Độ tinh khiết quang học theo sắc ký
 
   
100


SR
R
(1.3)
1.1.3.2 Các phương pháp xác đònh độ tinh khiết quang học
Có thể xác đònh độ tinh khiết quang học bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Phương pháp đo góc quay cực riêng
Đo góc quay cực riêng chỉ được sử dụng để kiểm tra độ tinh khiết, đònh tính,
ngoài ra không thể sử dụng trong đònh lượng cũng như tách các đồng phân quang
học [14], [31].
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Để tách các đồng phân quang học bằng phương pháp SKLM, có thể sử dụng một
trong các cách sau: phân tách trên pha tónh bất đối, phân tách trên pha tónh thông
thường thêm tác nhân bất đối vào trong dung môi rửa giải và phân tách trên pha
tónh không bất đối tạo dẫn xuất không đối quang bằng cách cho phản ứng giữa
mẫu thử với tác nhân bất đối. So với các phương pháp sắc ký khác thì SKLM còn
nhiều hạn chế (độ lặp lại thấp của trò số R
f
do ảnh hưởng của điều kiện sắc ký
và không thể thực hiện chương trình rửa giải trong quá trình triển khai sắc ký),
không thuận lợi cho quá trình tách và đònh lượng các dạng đồng phân quang học
[4], [9], [14], [29].
8

Phương pháp sắc ký khí (GC)
Để tách các đồng phân quang học bằng phương pháp GC thường sử dụng cột
mao quản có bao tác nhân bất đối. Hiện nay, các pha tónh bất đối quan trọng
nhất sử dụng trong GC là các dẫn xuất của cyclodextrin như: 2,3-dimethyl-6-
silyl-

-cyclodextrin, permethyl-

-cyclodextrin. Hạn chế của phương pháp GC là
chỉ ứng dụng trên những hợp chất dễ bay hơi và không bền với nhiệt nên gặp
khó khăn trong quá trình phân tích [4], [9], [14], [29].
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp HPLC có thể tách các đồng phân quang học bằng hai cách: trực
tiếp và gián tiếp [4], [10], [29].
- Khi sử dụng pha tónh bất đối hoặc thêm tác nhân bất đối vào pha động trong
suốt quá trình sắc ký sẽ hình thành đồng phân không đối quang nhất thời
(transient diastereomer). Quá trình như thế gọi là phân tách trực tiếp.
- Khi phản ứng hóa học với các dẫn xuất của tác nhân bất đối trước khi sắc ký sẽ
hình thành đồng phân không đối quang bền (long-lived diastereomer). Quá trình
như thế gọi là phân tách gián tiếp.
Phân tách các đồng phân quang học không đối quang thường dễ dàng hơn các
đồng phân quang học tương ứng vì các đồng phân quang học không đối quang có
tính chất lý hóa khác nhau so với đồng phân quang học. Nếu năng lượng liên kết
của các phức này khác nhau thì thời gian lưu của chúng cũng khác nhau khi rửa
giải sắc ký [10], [61]. Các tác nhân bất đối thường dùng là pha tónh silica gắn với
dẫn xuất cellulose, dẫn xuất amylose, cyclodextrin và dẫn xuất, macrocyclic
glycopeptid… [10], [14], [66]. Tuy nhiên, khi phân tách các đồng phân quang học
không đối quang thường thời gian phân tích rất dài [15], [28]. Ngoài ra, những
pha tónh bất đối, tác nhân bất đối thường rất đắt và cũng không phải pha tónh nào

cũng tách được cho tất cả các dạng đồng phân [29], [31].
9


Hiện nay, Dược điển Mỹ 36, Dược điển Anh 2013 đã ứng dụng phương pháp
HPLC dùng pha tónh bất đối để xác đònh tạp đồng phân quang học trong một số
chuyên luận nguyên liệu như dexclorpheniramin, lamivudin, timodol,
clopidogrel… Trong điều kiện các phòng thí nghiệm ở nước ta, việc tách và phân
biệt các đồng phân đối quang còn là vấn đề mới, chưa được triển khai.
Phương pháp điện di mao quản (CE)
Mặc dù CE là một kỹ thuật phân tích hiện đại còn khá mới ở Việt Nam nhưng đã
phát triển mạnh ở các nước trên thế giới. Nhiều nhà nghiên cứu đã ứng dụng
phương pháp CE với các kỹ thuật như: điện di mao quản vùng, sắc ký mao quản
mixen điện động để tách đồng phân quang học của các hợp chất ibuprofen,
cloramphenicol, các corticoid, amlodipin, clorpheniramin… bằng cột mao quản có
bao tác nhân bất đối hoặc bằng cột mao quản silica nung chảy thông thường,
trong trường hợp này phải sử dụng các tác nhân bất đối thêm vào dung dòch điện
ly nền. Các tác nhân đó có thể là

,

,

-cyclodextrin, vòng ether đối quang,
muối mật, đồng (II) aspartat hay một số tác nhân bất đối chuyên biệt cho các
dạng đồng phân, thường là các dẫn xuất của cyclodextrin như: hydroxypropyl-

-
cyclodextrin, sulfobutyl ether-


-cyclodextrin, dimethyl-

-cyclodextrin…[4], [66].
So với phương pháp sắc ký, việc tách đối quang cần phải sử dụng một lượng lớn
những pha tónh bất đối để làm thay đổi tính chọn lọc. Trong khi đó, phương pháp
CE đã mang lại kết quả chỉ với một lượng khá ít tác nhân bất đối. Tính chọn lọc
có thể được điều chỉnh tùy vào loại và nồng độ tác nhân bất đối thêm vào, ngoài
ra còn do sự thêm vào các chất làm thay đổi khác như là alcol, chất hoạt động bề
mặt, urea và các ion kim loại [4]. Tuy nhiên, phương pháp CE cũng có những
hạn chế trong việc xác đònh độ tinh khiết quang học do độ nhạy kém nên khó
phát hiện tạp đồng phân quang học hơn so với phương pháp HPLC. Ngoài ra,
trước mỗi lần điện di phải chuẩn hóa lại cột mao quản bằng cách hoạt hóa cột
10


cho nên thời gian di chuyển của các pic đồng phân quang học thường không ổn
đònh, làm ảnh hưởng đến độ chính xác của phép đònh lượng [62].
Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
NMR là kỹ thuật rất phổ biến để phân tích nhanh các hợp chất đối quang. Vì các
đồng phân quang học không thể phân tách trong điều kiện không có chất phụ trợ
bất đối. Muốn xác đònh các hợp chất đối quang thì cần một lượng đủ lớn chất
phụ trợ bất đối không ở dạng racemic (nonracemic chiral auxiliary) để biến đổi
cùng lúc trung tâm đối quang (enantiotopic nuclei) thành trung tâm phi đối quang
không đều (anisochronous diastereotopic nuclei) và được đo trực tiếp bằng cách
lấy tích phân. Sau đó dữ liệu thu được có thể cung cấp những thông tin về hợp
chất đối quang. Có 3 loại chất phụ trợ bất đối thường sử dụng là: tác nhân solvat
bất đối, thuốc thử lanthanid bất đối và tác nhân tạo dẫn xuất bất đối. Hạn chế
chủ yếu của phương pháp là yêu cầu tạo dẫn xuất trước khi phân tích [29], [31].
Phương pháp quang phổ lưỡng sắc vòng (Circular Dichroism Spectrometer)
Nguyên tắc của phương pháp là đo một dãy phổ các chất đối quang, xác đònh độ

hấp thụ ánh sáng của vòng ánh sáng phân cực quay trái và vòng ánh sáng quay
phải. Độ hấp thụ ánh sáng quay phải sẽ lớn hơn (giá trò dương) độ hấp thụ ánh
sáng quay trái (giá trò âm) [29], [31].
1.2 ENZYM PHOSPHODIESTERASE VÀ MÔ HÌNH GÂY VIÊM THỰC
NGHIỆM
1.2.1 Sơ lược enzym phosphodiesterase (PDE)
PDE là enzym điều hòa nồng độ cAMP và cGMP thông qua quá trình thủy phân
của các chất truyền tin thứ cấp này trong tế bào, biểu thò bằng sự ức chế hay
cảm ứng đặc trưng (co hay giãn cơ). Cho đến nay, có 21 gen PDE ở động vật có
vú và được phân làm 11 họ gọi là PDE 1-11. Trong đó, các enzym PDE 4, PDE 7
và PDE 8 chọn lọc cho cAMP; các enzym PDE 5, PDE 6 và PDE 9 chọn lọc cho
11


cGMP. Những họ khác tác động không chọn lọc cho cả cAMP và cGMP [41],
[45], [64]. Nucleotid vòng đóng vai trò quan trọng trong vô số các chức năng tế
bào bao gồm sự miễn dòch và đáp ứng viêm, hoạt động tim như nhòp tim và co
bóp, năng lượng hằng đònh nội môi, chất lỏng cân bằng nội môi, kích thích thò
giác, trầm cảm, nhận thức, sự rụng trứng và sự chết tế bào [80]. Vì vậy, enzym
PDE là một trung tâm điều hòa nồng độ nội bào của những nucleotid vòng, được
coi là mục tiêu dược lý của những liệu pháp điều trò các bệnh khác nhau, như
suy tim xung huyết, chứng đau chân khập khiểng, rối loạn chức năng cương
dương, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), hen suyễn, trầm cảm và tâm thần
phân liệt [72], [82].
Ngày nay, nhiều nghiên cứu tập trung vào sự ức chế chọn lọc enzym PDE 4 vì
PDE 4 là enzym biểu hiện rõ trong những tế bào viêm [45], [71]. Trong đa số
các tế bào viêm và các tế bào miễn dòch, sự ức chế đáp ứng tế bào có liên quan
đến việc tăng mức độ của cAMP. Ức chế enzym PDE, đặc biệt là enzym PDE 4
sẽ làm tăng nồng độ cAMP, do đó làm tế bào mast giảm tiết các chất trung gian
gây viêm như histamin, cytokin, prostaglandin giúp làm giãn cơ trơn, từ đó

giúp kiểm soát tốt quá trình viêm. Vì vậy, các bệnh viêm cấp và mạn tính có thể
được điều trò hữu hiệu bằng các chất ức chế chọn lọc và hiệu quả trên enzym
PDE 4 [13], [40], [49].





Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của enzym phosphodiesterase
Trong hình 1.1, enzym PDE ức chế sự chuyển cAMP thành 5’-AMP làm lượng
cAMP tăng lên. Lượng cAMP tăng làm tế bào mast giảm tiết những chất trung
 Giãn phế quản
 Giãn mạch
 Ức chế phóng thích chất trung gian
ATP
Adenylat cyclase
Phosphodiesterase
cAMP
5’-AMP