VAI TRÒ TÍCH CỰC CỦA VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

CHỦ ĐỀ:VAI TRÒ TÍCH CỰC CỦA VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
PHỤ LỤC
I. Giới thiệu chung về vi sinh vật
1. Khái niệm
2. Đặc điểm chung
3. Các vai trò tích cực của vi sinh vật trong thực phẩm
II. Ứng dụng vi sinh vật trong quá trình sản xuất nước mắm.
1. Giới thiệu về sản phẩm nước mắm.
a. Sơ lược
b. Qui trình sản xuất nước mắm
2. Giới thiệu về nấm mốc aspergillus oryzae
a. Đặc điểm nấm mốc aspergillus oryzae
b. Điều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergillus oryzae
c. Phân lập nấm mốc aspergillus oryzae
III. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc aspergillus oryzae
1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
2. Phương pháp nuôi cấy chìm
3. Qui trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc asp.oryzae
I. Giới thiệu chung về vi sinh vật.
1. Khái niệm:
- VSV là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể nhỏ bé, muốn quan sát
chúng ta phải dung kính hiển vi.
2. Đặc điểm chung.
a Kích thước nhỏ bé.
- Kích thước của vi sinh vật thường được đo bằng micromet, virut thường được đo
bằng nanomet. 1µm= 1/1000 mm.
Chính vì VSV có kích thước nhỏ bé nên diện tích bề mặt của 1 tập đoàn
VSV là rất lớn.
b Hấp thụ nhiều, chuyển hóa nhanh.
- Vì kích thước nhỏ bé nên vận tốc hấp thụ và chuyển hóa của VSV vượt xa các sinh
vật khác.

1
- Năng lượng chuyển hóa sinh chất mạnh mẽ của VSV dẫn đến những tác dụng hết sức
to lớn của chúng trong thiên nhiên cũng như trong hoạt động sống của con người.
c Sinh trưởng nhanh.
- E.coli cứ 12-20 phút lại phân cắt 1 lần.
- Nấm men Saccharomysec cerevisiae thời gian thế hệ là 120 phút.
- Tảo Chlorella là 7h.
- Vi khuẩn lam Nostoc là 23h.
d Năng lực thích ứng mạnh và dễ phát sinh biến dị.
- VSV đa số là đơn bào, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi
trường sống…. do đó rất dễ phát sinh biến dị.
- Tần số biến dị thường ở mức , .
- Những biến dị có ích sẽ đưa lại hiệu quả rất lớn trong sản xuất.
- VSV sống được ở môi trường nóng đến 130 độ C, lạnh 0-5 độ C, mặn đến nồng độ
32% muối ăn, ngọt đến nồng độ mật ong.
e Phân bố rộng, chủng loại nhiều.
- Có mặt ở khắp nơi trên trái đất.
- VSV có rất nhiều kiểu dinh dưỡng khác nhau.
- Trong đường ruột của người thường không dưới 100-400 loài VSV khác nhau.
- Tùy vào môi trường khác nhau thì số lượng VSV sẽ khác nhau.
- Về chủng loại: VSV có trên 100.000 loài bao gồm 30.000 động vật nguyên sinh,
69000 loài nấm, 23.000 vi tảo, 2500 vi khuẩn lam…….
f Là sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đât.
- VSV hóa thạch cổ xưa nhất đã được phát hiện là những dạng rất giống với Vi khuẩn
lam ngày nay.
- Chúng có dạng đơn bào đơn giản, nối thành sợi dài đến vài chục mm với đường kính
khoảng 1-2mm và có thành tế bào khá dày.
3. Vai trò tích cực của VSV trong thực phẩm.
Trong CNTP, VSV có vai trò quan trọng trong các sản phẩm thực phẩm lên men.
Hiện nay, VSV được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều sản phẩm lên men như bia,

rượu, tương, chao, thủy sản lên men, rau quả lên men…….
 Trong công nghệ lên men:
+ Có nhiều qua trình lên men khác nhau và thường được gọi bằng tên sản phẩm
thu được.
Ví dụ: lên men rượu, bia, rượu vang, nước mắm, sữa, nem chua………
 Sản xuất rượu, bia: nấm men thuộc giống Saccharomyces cerevisine….
 Rượu vang: S. vini, S.ovifomis
2
 Bánh mỳ: Họ Saccharomycetace giống Sacchromyces, loài cerevisiae.
 Sữa: S.thermophilus, S.lactic, S.cremonis, Leus. Cremoris, L.casei, L.lactic…
 Nem chua: Vi khuẩn lactic thộc giống Streptococcus, Lactobaccillus….
 Nuớc mắm: aspergillus oryzae ,Microccus có M.alvatus, M.flavus, M.citrecus,
M.luteus…
o Vi khuẩn lactic: S.facclis, L.plantarum…
o Trực khuẩn Gr(-): Achomolbacter: A.venosum, A.reticulare…
- Vsv được ứng dụng tạo màng sinh học(màng chitosan) giúp bảo quản thực
phẩm: aspergilus niger Ex 2006-1, Rhizopus sp.BG,…
- VSV ứng dụng trong công nghiệp sản xuất chế phẩm enzyme. Các chế phẩm
enzyme này có ứng dụng lớn trong CNTP, y học…….
II. ứng dụng vi sinh vật trong quá trình sản xuất nước mắm.
1. Giới thiệu về sản phẩm nước mắm.
a. Sơ lược
Nước mắm là sản phẩm được lên men từ các loại cá. Chứa hàm
lượng đạm lớn.Nước mắm đã gắn liền với đời sống hằng ngày và là
một bản sắc rất riêng của dân tộc Việt Nam. Do đó chúng ta nên
hiểu biết về chúng và giữ gìn truyền thống lâu đời của quê hương
của dân tộc.
Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và công nghệ sản
xuất nước mắm được các nhà khoa học đưa ra các kết luận sau:
- Nước mắm là hỗn hợp acide amin. Các acide amin này được tạo

thành do sự thủy phân của protease. Các protease này là do vi sinh
vật tổng hợp nên.
- Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm có nguồn gốc:
+ Có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, môi trường ( nước, không khí )
+ Bổ sung hệ enzyme protease được sản xuất từ vi khuẩn Asp.oryzae,asp.niger
-Muối có tác dụng ức chế vi sinh vật gây thối, tỷ lệ muối thích hợp
là 20 – 25%. Tác dụng làm ngấu và tạo hương ngoài protease của
vi sinh vật còn có các enzyme tiêu hóa cơ trong nội tạng cá.
3
Nhiệt độ có tác dụng rất lớn đến hoạt động của các enzyme
trong quá trình sản xuất nước mắm. Nhiệt độ thích hợp là 36 –
440C.
-Trong quá trình thủy phân, độ acide tăng.
- Ban đầu của quá trình làm nước mắm, môi trường kiềm yếu có
tác dụng rất tốt.
b. Qui trình sản xuất nước mắm.
4
Muối
cá
Trộn (ướp)
Ủ
(2 ngày)
Lên men
(6-12 tháng)
Chiết rút
Bã
Nước
mắm cốt
Lên men
Chiết rút

Dịch
nước mắm
Phối trộn
Nước mắm thành phẩm
Nước muối
2. Giới thiệu về nấm mốc aspagillus oryzae
a. Đặc điểm của Aspergillus oryzae
-Nấm Aspergillus oryzaecó cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, thuộc họ
Plectascales, lớp Ascomycetes, cơ thể sinh trưởng là một hệ bao sợi
bao gồm những sợi mảnh, chiều ngang khoảng 7µmcác khuẩn ty có
5
nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu
xanh lợt có ít vàng.
- Nấm Aspergillus oryzaecó hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi
sang màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia.
-Nấm mốc Aspergillus oryzaesinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase,
protease và catalasecó khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin.
-Nấm mốc Aspergillus oryzaelà tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất theo
phương pháp vi sinh vật.
-Một trong số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae là
Protease
b. Điều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergilus oryzae
 Môi trường thạch PDA (Potato Dextro Agar).
 Độ ẩm của môi trường:
• Độ ẩm tốt nhất 55– 60%.
• Độ ẩm thích hợp cho sự hình thành bào tử là 45% .
 Độ ẩm tương đối của không khí:
• Độ ẩm từ 85- 95% là thích hợp cho nấm mốc.
• Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường
khỏi khô.

 Ảnh hưởng của không khí:
• Aspergillus oryzae là sinh vật hoàn toàn hiếu khí.
• Nồng độ CO
2
trong khí quyển 8%.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ:
• Nhiệt độ thích hợp khoảng 28 – 32
0
C.
• Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể bị nóng lên 40
0
C hoặc hơn. Cần giữ
cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27
0
C và không cao quá 36
0
C.
 Thời gian nuôi nấm mốc:
• Hầu hết các chủng Aspgillus oryzae có hoạt động cực đại sinh enzyme amylase ở
khoảng giờ thứ 30 – 36, rồi sau đó là cực đại của enzyme protease ở giờ thứ 36 – 42.
 pH:
• Môi trường acid yếu 5,5 – 6,0.
c. Phân lập nấm mốc aspergilus oryzae
 Quy trình lấy mẫu: có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem
chôn xuống đất. sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai ra, rửa sạch đất
cát bám trên bề mặt miếng khoai tây, cho vào túi nilon mang về phòng thí nghiệm.
 Thí nghiệm phân lập:
-Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây
-Lấy 10g mẫu khoai tây cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo mẫu.
-Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang một ống nghiệm khác

có chứa 90ml nước cất vô trùng.
-Tiếp tục pha loãng ở nồng độ 10
-3
,10
-4
6
-Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc
phát triển, môi trường PDA:
-Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ
phòng trong vòng 3 ngày.
-Nhận biết bằng cách thêm iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác dụng là
chất chỉ thị cho hồ tinh bột.
-Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trrong ống thạch nghiêng
với 1% tinh bột cho phếp mốc phát triển trong 72h.
III. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc asp.oryzae:
1. Nuôi cấy bề mặt:
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát
triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm. khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt
hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lòng môi trường
đã được tiệt trùng, làm ẩm. người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh,… Có
chất phụ gia là trấu. Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều,
không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các
chất phụ gia phải đảm bảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không
được thấp hơn 20% có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH
4
)
2
SO
4
, phospho, nitơ

hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu.
Với phương pháp này nồng độ emzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm
sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm
đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc
sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng,
thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mô gia đình. Nuôi cấy trong
điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào,
khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. Tuy nhiên, phương pháp bề mặt
có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các
mẻ không đồng đều.
2. Nuôi cấy chìm:
7
Khoai tây 20g
Dextrose 20g
Agar 20g
Nước 1000ml
pH 6,7-6,8
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với cơ chất chủ yếu trong đa số
trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon
là đường glucoza, saccharoza. Phương pháp nuôi cấy bề mặt sâu đòi hỏi phải được vô
trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao
tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn của quá trình
nuôi cấy chìm một bước gồm: Chuẩn bị môi trường môi cấy, nuôi cấy nấm men
giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất. Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự
động hóa năng suất cao, để tổ chức ssanr xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi
sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme và lựa chon tối ưu thành phần
môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết cao, đảm bảo điều
kiện vệ sinh vô trùng. Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp
nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu
không đảm bảo vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn.

3. Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc aspergillus oryzae:
Sơ đồ quy trình:
8
Môi trường
Nuôi cấy
Sử dụng
enzyme thô
Chế phẩm thô
Thức ăn chăn
nuôi
Bã
Trích ly
Kết tủa enzyme
Ly tâm
Thu nhận kết
tủa
Thuyết minh quy trình:
• Môi trường:
- Mục đích: chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phếp vi sinh vật phát triển tốt.
- Cách tiến hành: nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10-20%
chất béo, 10-14% protein, 8-16% cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 37-59%.
Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, không có vị chua hay đắng,
không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, có thể bổ
sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH
4
)
2
SO
4
, (NH

4
)
2
CO), phospho, nitơ hữu cơ và các
chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. cac phụ phẩm
thêm vào để thoáng khí cho môi trường nuôi cấy bề mặt như trấu, mùn cưa,…
• Nuôi cấy:
- Mục đích: tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh enzyme.
- Cách tiến hành: sau khi đã trộn giống, môi trường được rãi đều ra các khay với chiều
dài 2-3cm, rồi được vào phòng nuôi cấy, đặt trên các giá đỡ. Các giá đỡ này được
thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải
có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm
phát triển là từ 28 C-32 C, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự⁰ ⁰
phát triển của sợi nấm.
Trong quá trình nuôi cấy ta không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi
trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít ảnh hưởng đến cả khối môi
trường.
Thời gian nuôi sợi nấm thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ
thuộc vào chủng mốc asp.oryzae, điều kiện môi trường cũng như kĩ thuật nuôi cấy.
- Thiết bị: khay nuôi cấy bề mặt.
9
Nghiền và bảo
quản
Chế phẩm
enzyme
Sấy
Khay nuôi cấy
- Thông số kĩ thuật:
+ Dày 4-5cm
+ Cao 1-1,2m

- Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. ở
giai đoạn này có những thay đổi sau như nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình
thành có màu trắng hoặc màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng cũng bắt đầu thay đổi,
khôi môi trường còn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành. Trong giai đoạn
này không được đưa nhiệt độ cao quá 30 C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với⁰
nhiệt độ.
- Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài từ 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay
đổi cơ bản sau: toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và phát triển mạnh tạo
thành những mạng chằng chịt bao quanh các hạt môi trường, có thể nhìn rõ sợi nấm
màu trắng xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm
dần, nhiệt độ môi trường có thể tăng nhanh lên 40-50 C, các chất dinh dưỡng giảm⁰
nhanh do sự đồng hóa của sợi nấm, enzyme protease được tổng hợp mạnh, lượng O
2
trong không khí giảm và lượng CO
2
tăng dần, cần phải thông khí mạnh và duy trì
mức nhiệt độ từ 29-30 C là tốt nhất.⁰
- Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài từ 10-20 giờ. Trong giai đoạn này có những thay
đổi như sau: quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng
sẽ giảm lại, nhiệt độ của môi trường giảm, lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống. do đó
cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu quả nhất.
• Chế phẩm thô:
10
- Mục đích: thu được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là enzyme
thô vì ngoài thành phần enzyme chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần
môi trường và nước.
- Cách tiến hành: để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường
sấy enzyme đến một độ ẩm thấp (thường dùng là máy sấy chân không). Nhiệt độ sấy
vào khoảng 38-40 C, enzyme protease bị mất hoạt tính ở 60-76 C, độ ẩm sau khi kết⁰ ⁰
thúc sấy nhỏ hơn 10%.

Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không cần
phải tinh sạch. Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme để
bảo quản lâu hơn.
• Trích ly:
- Mục đích: tách enzyme ra khỏi khối môi trường.
- Cách tiến hành: sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme. Các
loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta sử dụng chúng như
dung môi hòa tan. Cứ 1 phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và lọc lấy
dịch, phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc.
- Thiết bị: thiết bị trích ly kiểu thùng quay
\
- Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ trích ly 25 C⁰
+ Thời gian 40-60 phút
• Kết tủa enzyme:
- Mục đích: thu nhận dung dịch enzyme.
- Cách tiến hành: trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn hoặc
sufatmon. Trong quá trình này người ta làm lạnh cả dung dịch thô và các tác nhân kết
tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Cứ một phần dung dịch enzyme thô cho
2-2,5 phần cồn hoặc sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh hiện tượng biến tính, khuấy
11
nhẹ và để trong điều kiện lạnh từ 4-7 C trong một thời gian, các enzyme tạo thành kết⁰
tủa và lắng xuống, người ta thu nhận kết tủa (độ ẩm >70%). Người ta tiếp tục sấy kết
tủa ở 40 C và độ ẩm giảm xuống 5-8%.⁰
- Thiết bị: thiết bị kết tủa.
Thiết bị kết tủa
- Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ tiến hành ở nhiệt độ phòng.
+ Muối: amoni sunfat 80%
+ Thời gian: 10-18 giờ
+ Hoạt độ riêng: 162 IU/mg
+ Hiệu suất 74%

• Ly tâm:
- Mục đích: tách sinh khối vi sinh vật và bã của canh trường.
- Các biến đổi: sự tahy đổi về thể tích, khối lương riêng, nhiệt độ của dung dịch, sự
thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn-lỏng, tách huỳnh phù ra
thành 2 pha rắn –lỏng.
- Các yếu tố ảnh hưởng: sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn-lỏng: chênh lệch
nhiều thì quá trình diễn ra dễ dàng hơn, tốc độ quay của roto: tốc độ càng nhanh thì
quá trình diễn ra càng tốt.
- Thiết bị: thiết bị li tâm lắng.
Thiết bị li tâm
12
• Hệ thống sấy phun:
- Mục đích: tách nước ra khỏi dung dịch mà không làm thay đổi tính chất của enzyme
nhằm bảo quản lâu hơn.
- Các yếu tố ảnh hưởng: nồng độ chất khô của nguyên liệu, nồng độ cao làm giảm thời
gian bốc hơi, tăng độ nhớt của nguyên liệu gây khó khăn cho quá trình sấy phun.
Nồng độ thấp làm tốn nhiều thời gian và năng lượng cho quá trình. Nhiệt độ sấy lưu ý
đến nhiệt độ biến tính của enzyme để điều chỉnh nhiệt độ sấy thích hợp.
- Thiết bị: thiết bị sấy phun.
- Thống số kĩ thuật: + Nhiệt độ: 30-300 C.⁰
+ Điện thế: 380V-50Hz- 3pha
+ Điều kiện: chống quá nhiệt
+ chế độ làm việc: liên tục.
13