tóm tắt luận án tiến sĩ nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm”

I HC QUC GIA HÀ NI
I HC KHOA HC T NHIÊN


Phng



NHÂN DÒNG VÀ BIU HIN TRÊN B MT BÀO T
BACILLUS SUBTILIS GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28
CA VIRUS GÂY BM TRNG  TÔM



Chuyên ngành: Hóa sinh hc
Mã s: 62 42 01 16




D THO TÓM TT LUN ÁN TIC





HÀ NI - 2014
2

c hoàn thành ti:
i hc Khoa hc T i hc Quc gia Hà Ni



ng dn khoa hc: GS.TS. Phan Tu
PGS.TS. Nguyn Th Vân Anh


Phn bin 1:
Phn bin 2:
Phn bin 3:




Lun án s c bo v ti Hng chm lun án ci hc
Quc gia hp ti: i hc Khoa hc T nhiên
vào hi gi5




Có th tìm hiu lun án ti:
- n Quc gia Vit Nam,
- Trung tâm thông tin - i hc Quc gia Hà Ni
1

M U
1. Tính cp thit c tài
Nuôi tôm  Vin mnh trong nh
và tr thành ngành kinh t quan trng. Tuy nhiên, ngành nuôi trng tôm 
Vit Nam hi   c nhi    ch bnh, cht
ng tôm ging sa sút. S bùng n ca các dch bnh nghiêm trng do
virus (WSSV), m
 sng tôm, gây thit hi ln v kinh t.
Nhiu nghiên cu trên th gic ti tìm ra gii pháp
hiu qu chng l   t qu  c còn hn ch. Mt
ng nghiên cc nhiu nhà khoa hc trên th gin là to
các vaccine da trên protein cu trúc c ng
min dch  tôm chng li bm trng. VP28 là mt loi protein v
chính ca WSSV,  o giúp virus gc hiu lên t bào
c khu cho quá trình lây nhim. Chính vì vy, VP28 là
c la ch to kháng th cho
vaccine cho tôm phòng b m trng (Rout và tp th, 2007;
Witteveldt và tp th, 2004). Tuy nhiên, nhng kt qu nghiên cu to
vaccine phòng bm trng do WSSV  mi dng li  mc
th nghim nh lc mt vaccine chính thc, hiu qu.
i “Nghiên cứu
nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa
kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” bào
t Bacillus subtilis biu hin kháng nguyên VP28 ca virus gây bm
trng làm  cho vic sn xut vaccine dng probiotic bn nhit giúp
phòng bm trng trên tôm.
2

2. Mc tiêu nghiên cu c tài
-

nh c trình t và mt s a gen VP28 t
các mu WSSV phân lc  a bàn nuôi tôm ch yu ca Vit Nam.
- T c chng Bacillus subtilis tái t hp biu hin gen mã hóa
protein kháng nguyên VP28 ca WSSV trên b mt bào t.
- c kh m trng trên tôm
th chân trng ca ch phm bào t B. subtilis biu hin VP28 trên b mt.
ng và ni dung nghiên cu c tài
ng nghiên cu c tài:
Gen mã hóa protein VP28 ca virus gây bm trng  tôm.
Ni dung nghiên cu c tài:
- nh trình t và mt s a gen vp28 t
các mu WSSV phân lc  Vit Nam.
- Xây dng quy trình biu hin gen mã hóa cho VP28 trên b mt bào
t Bacillus subtilis.
- Nghiên cu th nghim kh m trng trên tôm
th chân tr  n bào t Bacillus subtilis biu
hin VP28.
m thc hi tài
Các nghiên cu ca luc thc hin ch yu ti Phòng Thí
nghim trm Công ngh i hc Khoa
hc T i hc Quc gia Hà Ni.
Phn th nghim kh o h tôm th chân trng phòng bnh
m trc thc hin vi s h tr, hp tác ca Vin Nghiên
cu nuôi trng Thy sn I.

3

i c tài
- Công trình nghiên cu có tính h thng t vic nhân bn, nhân

dòng và biu hin gen mã hóa protein VP28 tái t hp  E. coli và Bacillus
subtilis nh trình t và mt s a gen VP28 t
các mu WSSV phân lc  Vit Nam.
- Nghiên cu biu hin thành công gen mã hóa protein VP28 ca
WSSV trên b mt bào t B. subtilis i dng các cu trúc protein dung
hp CotB-VP28 và CotB-GST-, CotB là protein v ca B.
subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhm
hn ch cn tr i vi VP28.
- tu kin thu nhn bào t tái t hp B. subtilis biu
hin tt kháng nguyên VP28 ca WSSV trên b mt bào t và nghiên cu
các tính cht ca bào t tái t hp B. subtilis CotB-VP28, CotB-GST-
VP28 trong mt s u king khác nhau.
- c ho ca các enzyme phenoloxidase
(PO), superoxide dismutase (SOD) phn ánh min dch ca tôm
th m trng trên tôm
70% ca bào t B. subtilis biu hin VP28
trên b mt.
6. ng dng thc tin c tài
- Kt qu nghiên cu c   to ch phm probiotic
dng bào t B. subtilis tái t hp bn nhit, biu hin VP28 trên bn mt,
có kh ng min dch và bo v tôm khi nhim bm
trng, giúp góp phn kim soát dch bnh trên tôm.
- Thành công c tài s là ti cho vic phát trin các vaccine
tái t hp dng bào t B. subtilis tái t hp có kh nh do các
vi sinh vt khác gây ra  tôm.
4

7. B cc ca lun án
Lun án gm 120 trang bao gm: Phn m u (3 trang); Tng quan
tài liu (40 trang); u (19 trang); Kt

qu và tho lun (39 trang); Kt lun và kin ngh (1 trang), Các công
trình khoa hc ca tác gi n lun án (1 trang), Tài liu tham
kho (16 trang122 tài liu gm 2 th ting ting Vit () và
ting Anh (). Lun án có 15 bng, 43 hình.


















5

NG QUAN TÀI LIU
1.1. Gii thiu chung v virus gây bm trng  tôm
Virus gây bm trng (White Spot Syndrome Virus
  ) thuc h Nimaviridae và chi Whispovirus
( VP28,  mã hóa   
(ORF) 421 bp (wsv421), là mt protein v quan trng,

t quan trng trong nhu tiên ca quá trình nhim
WSSV vào tôm (Van Hulten và tp th, 2001). i
pháp hiu qu  ngn nga s tn công ca loi virus này  tôm.
1.2. Nghiên cu to vaccine da trên kháng nguyên v WSSV
Tôm thu     min dch ,
t s nghiên cu gy có kh c
hic kích thích bi các dng kháng nguyên VP28. 
protein VP28
. c
biu hin thành công  E. coli (Zhang và tp th, 2002; Sathish và tp th,
2004; Witteveldt và tp th 2004; Jha và tp th, 2005; Caipang và tp th,
2008; Hou và tp th, 2011; Syed-Musthaq và tp th, 2011; Mu và tp th,
2012). S dng VP28 là mt bi ng
sót ci vi WSSV. , y có là khó
áp dng trên thc t do protein VP28 không bn vng nc cho
trc tim nuôi tôm
  sn xut cao.
 nghiên cu tp trung vào vic phát trin các
dng vaccine vi khun sng tái t hp biu hin VP28. 
cho thy rng các loi bào t tái t hp VP28 giúp bo v  l
6

sng ca tôm khi th nghim vi WSSV so vc dùng bào
t tái t hp VP28 (Fu và tp th, 2010; Ning và tp th, 2011). Tuy vy
các kt qu nghiên cu mi ch      t loi vaccine
chính thc to ra. Vì vy vic tip tc nghiên c tc
vaccine phòng bm trng là ht sc cn thit.

7

NG, NGUYÊN LIU VÀ
U
ng và nguyên liu
2.1.1. Đối tượng
23 mu tôm có biu hin nhim WSSV c thu thp t các m
nuôi tôm ti các   c nhau (Hi Phòng; Hu; Khánh Hòa;
Thành ph H Chí Minh; ; Ninh Thun; Bn Tre; nh,
Kiên Giang; Trà Vinh), c bo qun  -80
o
C hoc trong cn 95
o
C. Tôm

th chân trng (2-5g/con) dùng trong th nghim th thách kh o
h phòng nga WSSV c Phân viên nghiên cu nuôi trng Thy
sn Bc Trung b thuc Vin nghiên cu nuôi trng thy sn 1.
2.1.2. Nguyên liệu
Chng vi khun B. subtilis PY79 và vector pDG364, pDG364-CotB;
pDG364-CotB-GST là quà tng ca GS. Simon Cutting, i hc Hoàng
gia Holloway, London, Anh.
Các chng vi khun E. coli  E. coli   c
mua t hãng Novagen. Vector pET28b ca hãng Novagen (M); các
oligonucleotide ca hãng Life Technology, kit nhân dòng trc tip sn
phm PCR pGEM TA easy và   c mua t hãng
Promega; thang chun protein, thang chun DNA 1kb và 100 bp, hn hp
 c mua t hãng Fermentas; Hot-   c
mua t hãng Enzynomics; kit thôi gel c mua t Bioneer; MagPure
viral DNA/RNc mua t ANABIO R&D; Qiaprep-miniprep
c mua cc mua t hãng Biobasic.

Các cp m c thit k c hi   n gen mã hóa cho
VP28 ca virus gây bm trng WSSV, cotB; cp mc hiu cho v
8

trí amyE front, amyE back ca vector pDG 364, cp mi ca vector pGEM
T và cp mi T7 promoter Fw/T7 terminator Rv ca hãng Life Technology.
u
2.2.1. Thu nhn virus gây bm trng t mu tôm nhim bnh
2.2             
-time PCR
2.2.3. Nuôi cy to bào t B. subtilis  Nicholson và
Setlow (1990)
2.2.4. Tách chit, ANABIO R&D, ng

DNA 260 nm
2.2.5. vp28
2.2.6. ng (1976) và tinh sch
proteinVP28t Hisbind
2.2
(SDS-PGAGE) theo Laemmli (1970)
2.2        -   

2.2.9. Th nghim kh m trng ca bào t B. subtilis
tái t hp 
          , superoxide
dismutase.


9

T QU VÀ THO LUN
3.1 NHÂNH TRÌNH T VÀ MT S 
CA GEN VP28 T CÁC MU WSSV PHÂN LP  VIT NAM

23 mu tôm nhim WSSV ti 
nhau, DNA ca các mu tôm b nhim WSSV c tách chit và dùng làm
khuôn cho phn ng PCR28 .

Hình 3.1: Nhân bn vp28 bng PCR t các mu tôm nhim WSSV 
m khác nhau
M: - 
1-23: 

Kt qu PCR (hình 3.1) cho thy, c 23 m    i

u có cho mn duy nht v
tính toán lý thuyt (615 bp) ca vp28. 
 Kt qu này cho phép
khnh rn gen mã hóa cho
VP28 t DNA h gen ca tôm nhim vm trng
3.1.2nh trình t và nghiên ca gen mã hóa VP28

o-
10


 gen vp28 
trvp28 vp28 
 ( 2003) 
 AY168644 (3.2) 
  eotide         
                
(A125G ->D42G, A183G -> T76A, A403G-> T135A, T517C-> C173R).

Bng 3.2: Mt s sai khác ca v à acid amin ca
VP28 thu thp ti Vit Nam so vi trình t  (AY168644)
Tên mu
Sai khác
nucleotide
Sai khác mc axit
amin suy din
   n, Cam Ranh
1.2 Khánh Hòa và Cn Gi 1, 4, 7, 9,
10  thành ph H Chí Minh

Bn Tre, Bình nh 1
2, Phong Hi  Hu Cn Gi 2, 3, 5,
6, 8  thành ph H Chí Minh, Kiên
Giang, Hi Phòng, Trà Vinh
A125G
D42G
nh 2
A403G
T135A
Cn Gi 2
A125G
D42G
A183G
T76A
A226G

T517C
C173R
11

Các nghiên cu ca Wang và tp th (2008) cho thy các v trí quyt
nh kháng nguyên ca VP28 là các v trí t n
93 và 171      n s thay th aspartatic bng
glycine (D42G) và T517C d n s thay th cysteine bng arginine
(C173R) ca các mc t Bnh (1), Hu và Cn
Gi (2)  thành ph H Chí Minh là nhng sai khác trong v trí quynh
kháng nguyên ca VP28 và rt cc quan tâm trong các nghiên cu
tip theo. 3 trong s 23 trình t gen vp28 có nhng khác bi
vi các ký hiu 05VN.VP28.HCM2.12, 06VN.VP28.BD1.11,

       i các mã s
(accession number) ng là JX444992.1, JX444993.1 và JX444994.1.
3.2. NGHIÊN CU BIU HIN GEN MÃ HÓA VP28
3.2.1. B28 bng h thng vector pET28b trong E. coli
pGEM  
          Cp m c
hiu (VP28.2 Fw/c thit k da trên trình t u ca
gen vp28  nhn bit ca BamHI  u và HindIII
 cu thun tin cho ghép gen vào vector pET28b v sau.
  vp28      VP28.2 Fw/  x lý
HindIII và BamHI pET28b 
hai enzyme, bin
np vào chng E. coli BL21-RIL. Vector tái t hp pET28b-
c tách ra, tinh sch và gii trình t n gen vp28, s dng cp mi
T7Fw/Rv. Kt qu c trình t khnh chc chn gen vp28 c
g và v  
 khvp28 vào vector pET28b.

12

Kt qu biu hin gen vp28 c kim tra bng SDS-PAGE và thm
tách min dch (Hình 3.6) cho thy dch chit t bào BL21-RIL mang
vector pET28b-VP28 có chng chy 7, 8, 9,
 mi chng âm (t bào BL21-RIL không
mang vector pET28b-VP28) tein này. Kt qu thm tách
min dch, s dng kháng th c hiy s có
mt c      các m  ng vi mu trên SDS-
ng chy 7, 8, 9, Hình 3.6B). T t lun r
biu hic VP28  E. coli.

Hình 3.6: SDS-PAGE (A) và thm tách min dch (B) kim tra biu
hin VP28  E. coli
- 1: D ng nht ta t bào
BL21-RIL
- 7: Dng nht ta t bào BL21-
RI mang pET28b-VP28
- 2: Dch chit protein tng s t
bào BL21-RIL
- 8: Dch chit protein tng s t bào
BL21-RIL mang pET28b-VP28
- 3: D   n ta t
bào BL21-RIL
- 9: D   n ta t bào
BL21-RIL mang pET28b-VP28
- 4, 6: không tra mu
- 5: Protein marker
925
bp
13

Dch chit t bào có chi dng)
  c tinh sch bng cách cho sc ký qua ct His-bind. Kt qu
ki tinh sch ca protein VP28 (Hình 3.7A) cho thy vic s dng
ct His-bind trong tinh sc hiu qu tt bi hu
ht các thành phn protein phc tp b loi b hn
 chitc ch m
c khong vc ca protein VP28
. So sánh kt qu thm tách min dch (Hình 3.7B) vi kt qu SDS-
PAGE cho thy nht hin trên màng PDVF có cùng
c 28 kDa vn tinh sn di SDS-PAGE cho

phép khnh ch thành công protein VP28. Kt
qu ng protein cho thy t 100 ml dch nuôi c
c tng s 1,26 mg protein VP28-Histag. Protein VP28 tinh sc
s di chu v biu hin trên b
mt bào t tip theo.

Hình 3.7: Kt qu SDS-PAGE (A) và thm tách min dch (B) kim
 tinh sch ca VP28
1: Dch chit t bào có cha protein VP28lên ct His-bind
2: Dch ra ct His-bind bm A có imidazol 5 mM
3: Dch ra ct His-bind bm A có imidazol 80 mM
14

4: Dch ra ct His-bind bm A có imidazol 100 mM
5: 
6-9 Dch ra chit ct His-bind bm A có Imidazol 250 mM
3.2.2. Biu hin VP28 dng dung hp vi protein CotB trên b mt
bào t B. subtilis
Plasmid pDG364-cotB, pDG364-cotB-    
plasm-
 BamHI, HindIII. V    (26 kDa)  
               B.
subtilis    , 2008). Vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST

 B. subtilis. Trong
    pDG364cotB-VP28, pDG364cotB-GST-VP28 
 
 bp, 1325 otB  và
.

 gen vp28    -  
VP28.3 Fw và VP28.3 Rv có  trình t  HindIII  u Fw
và EcoRI   thun tin cho vector pDG364-cotB,
pDG364-cotB-GST  .    n gen vp28 vào vector
pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST c 
 pDG364-cotB và pDG364-cotB-c x lý bng HindIII và
Eco tu gn. b
T4 DNA ligase E. coli . Các khun lc
c sau quá trình bin nc kim tra bi
cp mi ca vp28 và ca vector pDG364. PCR, c trình
t cho thy gen mã hóa VP28 vào vector pDG364-cotB và
pDG364-cotB- và v 
15

     o thành công vector tái t hp pDG364-cotB-
vp28 và pDG364-cotB-GST-vp28.
 dung hn gen cotB-vp28, cotB-GST-vp28 vào h gen ca B.
subtilis PY79 d i chéo kép, 
s dng enzyme XhoI  m n hành bin np
vào t bào B. subtilis PY79. Kt qu kim tra bng 
trên a thch có 1% tinh bt  chloramphenicol 5µg/ml cho thy
các khun lc king hp amylase
, n gen cotB-vp28, cotB-GST-vp28 c
dung hp vào h gen B. subtilis PY793.10).

A B
Hình 3.10: Kim tra s có mt ca gen dung hp trong DNA h gen
B. subtilis
A)  ch LB cha các khun lc B.subtilis m c trên môi
ng có kháng sinh CM

B) a chn cy chuy

1-30: các khun lc kim tra 1-30

-): B. subtilis PY79 dng th di không chn gen dung hp

 kim tra chc chn s có mt ca gen cotB-vp28, CotB-GST-
vp28 trong h gen ca B. subtilis, chúng tôi tin hành nuôi  tách
DNA ca 02 khun lt qu phn ng PCR vi các cp
m   c nhng kt qu hoàn toàn phù
hp vi tính toán lý thuyt.
16

T kt qu này, có th kt lun rp thành công gen
cotB-vp28, CotB-GST-vp28 vào h gen ca B. subtilis và chng tái t hp
   là B. subtilis CotB-VP28 và B. subtilis CotB-GST-VP28.
Mt s khun lc ca 2 chng tái t hp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28
c chn nuôi, to bào t  kim tra s biu hin ca VP28. So sánh bào
t ca chng chun B. subtilis PY79 vi bào t ca chng CotB-VP28 và
CotB-GST-VP28, chúng tôi nhn thy không có s khác bit v mt hình
thái. Bào t to thành bi 3 chng 
 nh VP28 có biu hin trên lp áo ca bào t và
dung hp vi CotB hoc CotB-GST hay không, chúng tôi thu dch chit
tng s t 5× 10
9
bào t chng B. subtilis PY79, CotB-VP28 và CotB-
GST-VP28  phân tích    28 bng-  
 kháng th . Theo tính toán lý
thuyt, protein dung hp gia CotB-VP28 có KLPT khong 63 kDa (CotB
khong 35 kDa và VP28 28 kDa), p

CotB-GST-c khong 89 kDa GST (26 kDa).

Hình 3. 13: Kt qu SDS-PAGE (A) và thm tách min dch (B) kim
tra s biu hin VP28 trên bào t B. subtilis
17

i chch
M: Thang chun protein
1: Bào t B. subtilis cotB-vp28 biu hin protein CotB-VP28
2: Bào t B. subtilis PY79 chng chun
3: Bào t B. subtilis cotB-GSTvp28 biu hin CotB-GST-VP28
Kt qu SDS-PAGE và thm tách min dch (hình 3.13) cho thy
s xut hii KLPT khong 63 kDa trong dch chit bào t
CotB- ng chy     i kh ng phân t
khong 89 kDa trong dch chit áo bào t ng vc ca
CotB-GST-ng ch ng chy s 2 là mu
bào t hình thành t t bào B. subtilis chng PY79 không xut hi
protein nào.
Áp dn mm SCION IMAGE (Nguyn Th
Vân Anh và tp th, 2013),  ng VP28 chit xut t 5x10
9
bào t
CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 vào khong 225 ng, c  vào KLPT
ca VP28 (27,5 kDa), có th tính toán rng khong 1000 phân t
B. subtilis. Kt qu này,
u khnh bào t B. subtilis ca 2 chng tái t hp u hin
protein dung hp CotB-VP28, CotB-GST-VP28.
  kim tra kh  u hin protein VP28 và GST-VP28
trên b mt bào t bn dch hunh quang (hình 3.14
,  mi chng âm là mu bào t PY79 th di, các tín hiu

 c rt yu, h  cùng
u kin kích thích, mu bào t CotB-VP28, CotB-GST-VP28 cho thy
các tín hi sáng nét, rõ ràng, chng t bào t tái t hp biu hin
VP28 mu so vi dng bào t PY79. , protein dung
18

hp CotB-VP28, CotB-GST-VP28 trên b
mt bào t B. subtilis.

Hình 3.14: in dch hunh quang kim tra biu
hin CotB-VP28 và cotB-GST-VP28 trên b mt bào t
B. subtilis
Ning và (2011) u hin protein VP28 trên b mt ca
bào t B. subtilis s dng mt n DNA 825 bp mã hóa cho 275 acid
u tiên ca CotB làm yu t dung hp. Mc dù, m biu hin
ca protein VP28  kc kim
tra bt qu th
nghiu khnh ch phm to ra có kh 
li s tn công cm trng.
Các chng CotB-VP28, CotB-GST-VP28 c ly ra và nuôi cy to
bào t và nghiên cu mt s tính cht ca bào t cho thy bào t tái t hp B.
subtilis cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 c to thành t 
19

ng DSM sau 48 gi t m ng là 3,1 x 10
9
, 4,2 x 10
9
,
bn  nhi 80

o
C, n mui 4% và chc pH trong khong t
2-10, có th bo qun  u kin khô ráo  nhi ngoài tri (25-37
o
C)
trong vòng 3 tháng.


3.3.1 S tn ti ca bào t B. subtilis biu hin VP28 trong rut tôm
th chân trng
Thn vi bào t và du bao áo (cht kt dính) có cm
quan v màu si, không b dính bt và vn là dng ht nh
riêng r nhau. Kt qu m th hin các mu thn bào khi kim tra
chng vi khun n phm và có n gn vi
n d kiu khi trn, khong 1 x 10
9
CFU/gam. Kt qu 
 sng  n pha loãng 10
-2
, trong rut tôm
(hình 3.22)  thn bào t B. subtilis CotB-
B-GST-V28, m bào t n 
gian, chng t s tn ti ca bào t trong rut tôm.

Hình 3.22: S tn ti ca bào t
B. subtils
biu hin vp28 trong rut tôm th chân trng
20

 n dch trên tôm th chân trng

ca bào t tái t hp
  giá kh  n dch ca bào t tái t hp, 
  enzyme superoxide dismutase (SOD) và   phenoloxidase
(PO)     tôm
.  3.25) o PO  tt c các mu
c cho th sung hay có b sung bào t th di PY79,
bào t B. subtillis CotB-GST-VP28 và CotB-VP28 thp nht  thm 0
sau 7 hoc 14 ngày tùy theo tng lô.
B. subtilis- (30%) 
.

Hình 3.25. Ho phenoloxidase (PO) trong hemolymph ca tôm th
chân tr tái t hp
Kt qu phân O 3.26) cho thy
có s B. subtilis d

B. subtilis--
21

84,3% 
    B. subtilis
CotB-VP28 B. subtilis PY79.

Hình 3.26. Ho enzyme SOD trong mô tht ca tôm th chân trng
3.3.3.  o h trên tôm th chân trng ca bào t
tái t hp

            
   WSSV    . B 
pháp Real-time PCR c s bn copy ca WSSV

trong dch nghiên  là khong 7,73 x10
8
bn copy/ml. 
 nh liu gây cht 75% (LD
75
). Kt qu c t
thí nghim liu LD
75
là 1,3x10
4
/lít.
Nhnh kh m trng  tôm th chân trng
ca bào t B. subtilis CotB-VP28 --
: lô i chng âm, lô i chc
n công nghip, còn các lô PY79, cotB-VP28 và cotB-GST-c
22

nghi xung loi bào t ng vi mt  10
9
. Các lô
lp li 2 ln trong mi ln th nghim., tr i chng âm
tôm còn li c  WSSV vi nng
 1,3x10
4
Tôm tip t nghing
và theo dõi s ng tôm trong 14 ngày ngày tip theo. Kt qu
theo  thí nghim
(hình 3.32) cho thy 
u 
100% lô  cho tôm

s


  94,5% sau 14 ngày. Ti lô  trn bào t cotB-
VP28, cotB-GST-i chng âm t l cht sau 14 ngày theo
ghi nhng là 19,23%, 26,67% và 25,81%.


Hình 3.32 T l cha các lô tôm khi  o
h ca bào t B. subtilis tái t hp
23

 bo  chân trng
ca các dng bo t CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 ( m
bào t 1 x 10
9
CFU/g th) ng là 81% và 73,3%. Các giá tr này
u cao
c hiu qu nh hiu qu
bo v ca vaccine  thy sn và thu kin v 
hiu qu vaccine dng cho thy sn ca y ban châu Â
phm th nghim này có ti  o v tôm chng li bm
trng do WSSV gây ra
.
           B. subtilis
--GST-VP28 
, (2-10), 
 (4%)
 


(trên 70B. subtilis-
--
.