Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Nông

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng nâng
cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suất
thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát
triển nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta
vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô
sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó, nghiên cứu
để hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết.
Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và
quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [5].
Hướng đến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái bền vững, trong vài
chục năm gần đây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích khu trú
trong rễ cây trồng không thuộc cây họ đậu, đặc biệt ở cây ngũ cốc. Theo
Doebereiner, vi khuẩn Azospirillum ở trong rễ cây không gặp phải sự cạnh tranh
nguồn Carbon như vi khuẩn khu trú trên bề mặt rễ và có thể cung cấp đạm cho
cây trồng mà không phải nhờ đến khi tế bào chết [35].
Nhóm Azospirillum là vi khuẩn sống trong rễ các loại cây ngũ cốc như
lúa, ngô. Nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định N, tổng hợp nhiều chất kích
thích sinh trưởng thực vật IAA, GA
3
… góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất,
kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và
phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [35]
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn thuộc
chi Azospirillum trong rễ lúa. Bên cạnh đó, ngô là một đối tượng có vòng đời
sinh trưởng và phát triển tương đối ngắn, ít đầu tư, hiệu quả kinh tế cao, được
trồng phổ biến. Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm
Azospirillum trong rễ cây ngô còn rất ít. Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên
1
cứu nào về thành phần loài của chi Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa

phương của tỉnh Đăk Nông.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập,
tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trong rễ cây ngô
tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Nông”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng Azospirillum cố định đạm
trong rễ cây ngô.
- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủng Azospirillum có hoạt
tính cố định đạm làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô.
3. Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học
Xác định được một số chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm, sống
nội sinh trong rễ cây ngô.
Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azospirillum sống
nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm để sản xuất phân vi sinh có
hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng
suất cây ngô và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.
2
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về cây ngô
1.1.1 Phân loại thực vật
Ngô có tên khoa học là Zea mays L (Zea: Từ Hi Lạp để chỉ cây ngũ cốc và
từ Mays là từ “Mahix” tên gọi cây ngô của người bản địa da đỏ [7]. Cũng có thể
Mays là từ “Maya” tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của cây
ngô) [18].
Cây ngô thuộc: Ngành : Maopholiophyta
Lớp : Liliopsida
Bộ : Poales
Chi : Zea

Loài : Mays
1.1.2 Đặc điểm hình thái cây ngô [7],[15],[16]
Rễ ngô: trong quá trình sinh trưởng phát triển, cây ngô có 3 loại rễ. Đó là:
rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng.
Thân ngô: thân đặc, đường kính thân khoảng 2 – 4cm tùy thuộc vào
giống, mùa vụ và trình độ thâm canh, thân có nhiều lóng. Trong điều kiện
bình thường ngô cao từ 1,8 – 2m, từ khi mọc đến khi cây có 6 – 7 lá thân phát
triển chậm, từ lúc 8 – 9 lá đến nhú cờ, nở hoa cây phát triển nhanh và đến khi
hoa đực phơi màu, bắp phun râu cây vẫn tiếp tục lớn. Sau khi thụ phấn thì
thân ngừng phát triển.
Lá ngô: gồm có lá mầm, lá thân, lá ngọn và lá bẹ. Lá được chia thành
các bộ phận như: bẹ lá, phiến lá và thìa lá. Phiến lá rộng và dài, mép lá gợn
sóng, có nhiều lông tơ. Gân lá song song. Lá mang bắp có chiều dài dài nhất.
Hoa ngô: gồm hoa đực ( bông cờ) và hoa cái. Bông cờ có nhiều nhánh,
mỗi nhánh có nhiều hoa xếp thành từng chùm, mỗi chùm có hai hoa, mỗi hoa
có 3 nhị đực, mỗi nhị đực có 1 bao phấn, một bao phấn có hai ô, một ô chứa
từ 1000 – 2500 hạt phấn. Hoa cái sinh ra từ nách lá gồm có lõi bắp có nhiều
3
đốt ngắn có lá bao bi, mỗi hoa cái có một râu. Hoa cái mọc từng đôi trên hoa
tự. Mỗi chùm hoa có hai hàng hoa nhưng hoa thứ hai bị thoái hóa chỉ một
hoa hình thành hạt, một đôi chùm hoa cho hai hàng hạt nên hàng hạt ở trên
bắp luôn luôn chẵn.
Hạt ngô: thuộc loại quả dĩnh, gồm các bộ phận chính là vỏ hạt, lớp
alơron, phôi và nội nhũ, phía dưới của hạt có gốc hạt là phần dính liền hạt
với lõi ngô. Hạt ngô được hình thành gồm các giai đoạn: từ thụ phấn đến
chín sữa là 10 – 15 ngày, từ chín sữa đến chín sáp là 15 – 20 ngày và từ chín
sáp đến chín hoàn toàn là 10 – 15 ngày.
1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô [18],[22]
1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt độ
Ngô là cây trồng ưa khí hậu ẩm, nhiệt độ thích hợp vào khoảng 20

0
C -
28
0
C. Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của cây ngô.
Trong cả chu kỳ sống cũng như trong từng thời kỳ sinh trưởng phát triển của
cây ngô cần một lượng tích nhiệt nhất định. Đủ lượng nhiệt cây mới sinh
trưởng phát triển bình thường. Tùy vào từng giống khác nhau mà cần một
lượng nhiệt khác nhau. Giống càng chín muộn thì cần lượng tích nhiệt càng
cao.
1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng
Ngô là cây có nguồn gốc nhiệt đới thuộc nhóm cây ngày ngắn. Ánh
sáng là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của cây ngô, tạo điều
kiện thuận lợi cho quá trình tích luỹ chất dinh dưỡng và ảnh hưởng đến độ dài
của quá trình sinh trưởng. Trung bình cần 12 giờ chiếu sáng/ngày.
Nghiên cứu phản ứng của cây ngô với độ dài ngày cho thấy cây ngô
hình thành các kiểu hình thái khác nhau. D.Azit đã chỉ ra rằng: Các giống
ngô ở châu Âu do kết quả chọn lọc đã hoàn thành được chu kỳ ánh sáng
trong điều kiện ngày dài, loại trừ được yêu cầu ngày ngắn. Cuperman và
Razumov cho rằng rút ngắn thời gian chiếu sáng ban ngày đến 12 giời sẽ thúc
đẩy sự trổ cờ và hình thành bắp.
4
Ánh sáng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây ngô ở hai mặt là số giờ
chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Những tia sáng dài đã kìm hãm sự sinh
trưởng của cây ngô, các tia sáng ngắn lại thúc đẩy sự phát triển. Nghiên cứu
của Cuperman đã xác định thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng đã
gây ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của bắp và bông cờ của cây ngô.
Trong điều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng trắng và xanh lam thì sự phát triển
của cây diễn ra nhanh nhất. Trong diều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng đỏ thì
sự phát triển của bông cờ hầu như không bị ảnh hưởng nhưng sự hình thành

của bắp chậm lại. Ánh sáng lục kìm chế sự sinh trưởng và phát dục của bắp.
1.1.3.3 Yêu cầu về nước
Ngô là cây trồng cạn, bộ rễ ngô phát triển rất mạnh, hút nước khỏe và
sử dụng tiết kiệm nước. Cây ngô sinh trưởng nhanh tạo ra sinh khối lớn. Do
vậy cây cần một lượng nước rất lớn. Trung bình cây ngô trong một chu kỳ
sống cần khoảng 200 lít nước để sinh trưởng và phát triển. Ở các thời kì sinh
trưởng khác nhau cây ngô yêu cầu lượng mưa và lượng nước tưới khác nhau.
Cây ngô không chịu được úng, độ ẩm của đất quá cao, lớn hơn 80% có ảnh
hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây ngô, đặc biệt là từ lúc cây mọc
đến khi cây được 8 lá. Vào giai đoạn này chỉ cần ngập nước 1 – 2 ngày cây ngô
cũng có thể bị chết úng. Ẩm độ thích hợp khoảng 70%.
1.1.3.4 Yêu cầu về đất
Đất rất quan trọng trong sản xuất ngô, đất trồng ngô phải tơi xốp,
nhiều mùn, hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ thoát nước, tầng canh tác dày, pH
từ 6 – 7, thuận lợi cho việc tưới nước vào mùa khô và tiêu nước vào mùa
mưa. Hầu hết, ngô được trồng ở trên đất cạn, không ngập nước, đất có thành
phần cơ giới nhẹ, đất cát pha, trên các loại đất vụ trước trồng các cây họ đậu,
hoặc các cây phân xanh cải tạo đất.
1.1.3.5 Yêu cầu chế độ không khí trong đất
Để thu hoạch sản lượng ngô cao, ngoài việc cung cấp nước và dinh
dưỡng còn phải chú ý đến chế độ không khí ở trong đất. Chế độ không khí
5
ảnh hưởng gián tiếp thông qua nhiều khâu khác nhau như là vi sinh vật, quá
trình biến đổi hóa học trong đất. Cây ngô đặc biệt là rễ ngô phát triển tốt
trong điều kiện háo khí, nếu đất chặt bí thiếu tơi xốp thì rễ ngô phát triển
kém, ăn nông, rễ ngắn ít lông hút, khả năng hút dinh dưỡng khoáng và nước
kém. Dẫn đến tình trạng cây ngô thiếu dinh dưỡng sẽ sinh trưởng, phát triển
kém.
1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô[17],[21]
1.1.4.1 Vai trò của đạm

Đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng nhất, đóng vai trò tạo năng suất
và chất lượng của ngô, 66% đạm được tích luỹ trong hạt. Cây ngô hút đạm
tăng dần từ khi cây có 3 – 4 lá tới trước trổ cờ. Ở nước ta, một số kết quả
nghiên cứu cho thấy thời kỳ hút đạm mạnh nhất là 6 – 12 lá và trước khi trổ
cờ, nếu các giai đoạn này mà thiếu đạm thì năng suất giảm rõ rệt.
Triệu chứng thiếu đạm ở ngô: cây thấp, lá nhỏ có màu vàng, các lá già
có vệt xém đỏ, cây sinh trưởng chậm, cằn cỗi, cờ ít, bắp nhỏ, năng suất thấp.
1.1.4.2 Vai trò của lân
Lân có vai trò quan trọng với cây ngô tuy nhiên khả năng hút lân ở giai
đoạn cây non lại rất yếu. Thời kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không được nhiều lân,
đó là thời kỳ khủng hoảng lân của ngô, nếu thiếu lân trong giai đoạn này sẽ
làm giảm năng suất nghiêm trọng. Cây ngô hút nhiều lân nhất ( khoảng 62%
tổng lượng lân yêu cầu) ở thời kỳ 6 – 12 lá sau đó giảm đi ở các thời kỳ sau.
Triệu chứng thiếu lân của ngô biểu hiện bằng màu huyết dụ trên bẹ lá
và gốc cây, trái cong queo. Trường hợp thiếu nặng lá sẽ chuyển vàng và chết.
Hiện tượng này xảy ra ở lá già trước, sau đó chuyển sang lá non và phổ biến
ở ngô vụ đông trong điều kiện thời tiết khắc nghiệt.
1.1.4.3 Vai trò của kali
Kali có vai trò rất quan trọng tới sự sinh trưởng, phát triển và năng
suất của ngô. Kali tích luỹ nhiều ở thân, lá (khoảng 80%) và tích luỹ trong hạt
6
ít hơn. Cây ngô hút kali mạnh ngay từ giai đoạn sinh trưởng ban đầu. Từ khi
cây mọc tới trổ cờ ngô đã hút khoảng 70% lượng kali cây cần.
Thiếu kali, protein và sắt sẽ tích tụ gây cản trở quá trình vận chuyển
chất hữu cơ. Thiếu kali là nguyên nhân rễ ngang phát triển mạnh, rễ ăn sâu
kém phát triển, do đó cây dễ đổ. Thiếu kali thể hiện ở các triệu chứng như
chuyển nâu và khô dọc theo mép và chóp lá, bắp nhỏ, nhiều hạt lép ở đầu bắp
(bắp đuôi chuột) và năng suất thấp.
1.1.4.4 Vai trò các nguyên tố vi lượng
Đối với cây ngô, các chất vi lượng thường thiếu là kẽm và molypđen.

Thiếu kẽm lá có màu trắng (bệnh bạch tạng), giữa các gân lá có những dải
màu vàng sáng, các lóng ngắn lại. Hiện tượng thiếu kẽm thường xảy ra trên
đất kiềm, nghèo mùn, đất giàu lân dễ tiêu hay bón quá nhiều lân. Thiếu
molypđen lá chuyển xanh nhạt, lá non teo lại và héo, nặng hơn lá ngọn không
bung ra được, có nhiều vết xém vàng.
1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ (N )
Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn
N
2
và cung cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng. Theo tính toán của các nhà
khoa học, các nhóm vi sinh vật cố định N BNF (Biological nitrogen fixation) có
thể cung cấp tới 240 x 10
6
tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả
thế giới sản xuất bằng con đường hóa học.
Vi sinh vật cố định N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí
N
2
dồi dào trong không khí (79%) thành dạng NH
4
+
cung cấp cho cây. Vi khuẩn
cố định N gồm có hai nhóm lớn:[5].
- Vi khuẩn cố định N tự do gồm:
+ Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp.
+ Vi khuẩn cố định N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium.
7
- Vi khuẩn cố định N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ đậu
Rhizobium, cộng sinh với rễ lúa Azoarcus,
1.2.1 Vi khuẩn cố định N tự do

1.2.1.1 Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí
Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp.[5]
- Beijerinskia sp.
Được phân lập bởi Starkey (1939), là loại có đặc điểm giống với Azotobacter
sp. Tế bào có hình dạng thay đổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục.
Beijerinski là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử. Có khả năng sống tốt trong
môi trường axit ( pH=3). Vi khuẩn có khả năng cố định được 16 - 20 mg N khi
đồng hóa hết 1g dinh dưỡng Carbon. Ngoài khả năng cố định N chúng còn có
khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng.
- Azotobacter sp.
Là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố định N tự do. Khi
chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, sinh sản bằng cách phân cắt, di
chuyển nhờ tiêm mao. Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu
nhỏ thành dạng cầu được bao bọc bởi một lớp nhầy.
Khuẩn lạc của Azotobacter có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo.
Các nòi phân lập từ tự nhiên có khả năng cố định 10 - 15mg N khi tiêu thụ hết 1g
dinh dưỡng Carbon. Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố định tới 30mg/1g
dinh dưỡng Carbon.
Trong đất, Azotobacter tập trung ở vùng đất xung quanh rễ cây. Ngoài khả
năng cung cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm,
kích thích sinh trưởng. Trong đất, Azotobacter thường phổ biến các nòi sau:
8
+ Azotobacter chrococum: kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả
năng di động khi còn non. Khi già hình thành nang xác. Khuẩn lạc có màu nâu
hoặc đen khi về già, không khuếch tán ra môi trường.
+ Azotobacter beijerinckii: có kích thước 2,4 x 4,6 micromet. Không có
khả năng di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng,
sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy.
+ Azotobacter vinelandii: tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả
năng di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố

khuếch tán vào môi trường.
+ Azotobacter agilis: tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả
năng di động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang,
sắc tố khuếch tán vào môi trường [5].
1.2.1.2 Vi khuẩn cố định N tự do kỵ khí Clostridium
Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Vi khuẩn
Clostridium có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, có thể đứng riêng rẽ
hoặc kẹp đôi thành chuỗi ngắn. Bào tử hình bầu dục, có khả năng chịu được
nhiệt độ cao và khô hạn. Clostridium có khả năng tích lũy được 10 - 15mg N
phân tử khi đồng hóa hết 1g đường Carbon [5].
1.2.2 Vi khuẩn cố định N cộng sinh
1.2.2.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu
Vi khuẩn cố định N cộng sinh với cây họ đậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần.
Chúng hình thành các nốt sần với rễ cây họ đậu như cây đậu tương, lạc, điền
thanh, muồng, cốt khí, trinh nữ, chúng sử dụng dinh dưỡng carbon của cây và
cố định N không khí để sử dụng và cung cấp một phần cho cây chủ.
Gồm có: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium và Sinorhizobium[9].
- Rhizobium
9
Năm 1868, nhà khoa học Hà Lan M.W.Beijrinck đã phân lập được loài vi
khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu, ông đã đặt tên là
Basilusradicicola.
Năm 1889, vi khuẩn này được xếp vào chi Rhizobium ( B.Frank, 1989).
Trên môi trường đặc, chúng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, khi còn non có khả
năng di động nhờ tiêm mao, khi tế bào già trở nên bất động.
Rhizobium thuộc loại hảo khí ưa pH trung tính hoặc kiềm ( pH từ 6,5 -
7,5), nhiệt độ thích hợp 24 – 26
0
C. Chúng xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông
qua lông hút, đôi khi qua vết thương ở vỏ rễ. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ

tiết ra enzyme polyalacturonase phân huỷ thành lông hút tạo điều kiện cho vi
khuẩn xâm nhập vào rễ. Theo tính toán của các nhà khoa học nhóm vi khuẩn này
có khả năng cung cấp cho cây 80 -120kg N/ ha.
- Bradyrhizobium
Vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm, thường
chứa chất dự trữ PHB. Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn,
bóng, nhầy, không màu.
Bradyrhizobium là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển
được ngay trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm.
Chúng phát triển thích hợp ở pH= 6,5 - 7,5. Nhiệt độ phát triển thích hợp là 24 –
26
0
C, nhiệt độ 37
0
C sự phát triển của chúng bị cản trở một cách rõ rệt.
- Azorhizobium
Azorhizobium là một giống mới được đề nghị với một loài là
Azorhizobium caulinodans chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của
Sesbania rostrata
- Sinorhizobium
Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây đậu nành được
phân lập từ Trung Quốc. Giống Sinorhizobium gồm có 2 loài là Sinorhizobium
fredii và Sinorhizobium xinjiangensis.
1.2.2.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu
10
- Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): Một số vi khuẩn lam tự dưỡng đạm hay
thanh tảo sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho đến
các thực vật hạt kín [5].
- Azospirillum
Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, đường

kính 1µm, dài 2,1 - 3,8µm chuyển động trong môi trường lỏng bởi một tiêm mao
dài ở đầu ( polan flagellum), trong môi trường đặc ở 30
0
C nhiều tiêm mao bên
(lateral flagellum) ngắn hơn cũng được thành lập.
Trong những năm gần đây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn này
sống ở trong vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ đậu
như lúa, bắp, mía, sorghum, và một số loại cỏ.
Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở điều kiện nhà lưới
(Mirza và ctv, 2000; Malik và ctv, 2002). Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vi
khuẩn nầy chỉ làm tăng năng suất lúa được 10 - 30% [9].
Azospirillum tăng sinh ở cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện
diện hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếu
khí. Nhiệt độ tối hảo từ 35 - 37
0
C. Một số dòng Azospirillum là những vi sinh vật
tự dưỡng không bắt buộc. Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên muối của
những acid hữu cơ như malate, succinate, hay pyruvate. Fructore và những
đường đôi khác cũng có thể được vi khuẩn sử dụng như là nguồn carbon . Một
số dòng Azospirillum cần biotin cho sự phát triển của chúng [5], [9].
Ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có khả năng khử nitrat, chống lại
vi khuẩn gây bệnh thối lá ở cây dâu tằm. Theo Eckert (2001) chi Azospirillum
có 7 loài là: A. brasilense; A. lipoferum ; A. amazonense; A. irakense; A.
halopraeferens; A. largimobile và A. doebereineae [35].
Một số báo cáo gần đây cho thấy vi khuẩn này có thể tiết ra những kích
thích tố tăng trưởng như: IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric
acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins. Những kích thích tố đó làm tăng chiều
dài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ. Từ đó, chúng làm tăng khả năng hấp thu
11
khoáng chất và nước, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng

năng suất của cây. Ngoài ra, chúng còn giúp cho cây chống chịu được điều kiện
khô hạn.
- Gluconacetobacter diazotrophicus [9].
Năm 1988, được Cavalcante V. A và Dobereiner J phân lập lần đầu tiên từ
rễ và thân cây mía trồng ở nhiều khu vực khác nhau trên khắp Brazil.
G. diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm; ưa acid; vi hiếu khí bắt buộc; tế
bào dạng que thẳng tròn đầu ( 0,7 - 0,9µm đến khoảng 1 - 2µm) tồn tại ở dạng
đơn, đôi hoặc chuỗi mà không có nội bào tử; sử dụng đường (glucose, fructose,
sucrose…) ở nồng độ khác nhau làm nguồn C nhưng tăng trưởng tốt nhất là ở
nồng độ sucrose 10% và pH = 5,5.
G. diazotrophicus có khả năng cố định đạm và sản xuất ra hormone thực
vật ( auxin, gibberellin), có thể hoà tan Zn và phosphorus nên G. diazotrophicus
được xem là một loài vi khuẩn đầy hứa hẹn, với khả năng cung cấp gần một nửa
nitơ cố định được ở dạng hữu ích cho cây [9].
- Herbaspirillum [9].
Herbaspirillum là các vi khuẩn hình que, Gram âm, rộng khoảng 0,5 -
0,6µm. Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp nitơ
trong một khoảng pH biến thiên từ 5,3 - 8. Trong môi trường bán đặc vi khuẩn
Herbaspirillum tạo thành một lớp màng mỏng, trắng, mịn ( pellicle). Khi cấy
chuyển lên môi trường đặc JNFb thì lớp màng này phát triển thành khuẩn lạc
nhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường đặc BMS thu được khuẩn lạc màu trắng
sữa.
Herbaspirillum có khả năng cố định đạm cộng sinh trong mô của những
cây thân cỏ như: Lúa, bắp, mía, sorghum, chuối và khóm. Ngoài ra chúng còn
tạo ra những sản phẩm của phytohormones như auxins và gibberillins rất tốt cho
sự tăng trưởng của cây.
- Burkholderia [9].
12
Vi khuẩn Burkholderia thuộc vi khuẩn Gram âm, có hình dạng hình que,
đường kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu

( Jesús et al, 2004).
Burkholderia sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu
khí, nhưng trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu
trong môi trường nuôi cấy từ 1 - 4mm (Paulina et al, 2001). Trong môi trường
nuôi cấy chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính
khoảng 2 - 4mm, tròn, phẳng hoặc dài (Jesús et al, 2004).
Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm.Ví
dụ như khi các vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây luá sẽ cố định
đạm khoảng 19% tổng lượng đạm cần thiết cho nhu cầu của cây lúa. Năng suất
của cây lúa có chủng loài Burkholderia vietnamiensis tương đương với năng suất
của cây lúa không chủng loài Burkholderia vietnamiensis nhưng có bón phân
đạm 25 - 30kg/ha (Van et al, 2000).
1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc
Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter sp cho đất và hạt giống,
cây con đã được chứng minh trên các thí nghiệm đồng ruộng. Theo nghiên cứu
của Puneet (1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của
hạt, kích thích ra rễ và sinh trưởng, năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với đối
chứng [32].
Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn
Độ cho thấy sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ 30-
60 kg N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể
đạt đến 240 triệu tấn/năm. Vi khuẩn cố định N tự do Azotobacter còn có khả
năng tổng hợp B1, giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng [35].
Fulchieri (1993) nghiên cứu sử dụng 3 chủng Azospirillum để xử lý hạt
cho ngô. Kết quả cho thấy đã làm tăng chiều cao cây, tăng sinh khối và tăng
13
năng suất ngô lên 59% so với đối chứng, các chủng này có thể cung cấp khoảng
60 kg N/ha [35].
Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp
Azotobacter sp. với các chủng phân giải P như Aspergillus niger sẽ làm tăng

năng suất lúa mì tăng 17,7%, trong khi Azotobacter chỉ tăng 9% . Kapoor cũng
cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải
phosphat như Bacillus sp, Pseudomonas sp. Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa,
bông vải lên 10-20% [32].
El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố định N Azospirillum
và phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì. Kết quả cho thấy hàm
lượng N trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 37-
53%; hàm lượng P trong thân tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10-14,3% so với
đối chứng không xử lý. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai
chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý đơn chủng [35].
Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng A. lipoferum cho ngô. Kết quả
cho thấy khi sử dụng chủng này đã làm giảm 50% lượng N cho cây mà năng suất
ngô vẫn đảm bảo [35].
Abbas Akbari và cộng sự (2007) đã phân lập và tuyển chọn được một số
chủng Azospirillum sp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng của
cây lúa mì. Kết quả là sự nhiễm các chủng Azospirillum ssp đã làm tăng đường
kính gốc lúa, chiều dài rễ, trọng lượng khô và số lượng lông rễ so với đối chứng
[29].
Elazar Fallik and Yaacov Okon ( 1996) nghiên cứu sử dụng Azospirillum
brasilense kết hợp với than bùn cho Setaria italica và ngô. Kết quả cho thấy
chiều dài thân, trọng lượng khô, năng suất tăng đáng kể. Sinh khối vi khuẩn là
10
8
CFU/1g than bùn có hiệu quả gây nhiễm hạt giống cao nhất [26].
14
Fabricio Cassa´n và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu phối hợp hai chủng
Azospirillum brasilense Az39 và Bradyrhizobium japonicum E109 xử lí cho ngô
và đậu tương. Kết quả cho thấy xử lí phối hợp hai chủng cho hiệu quả cao hơn so
với xử lí đơn chủng. Tỉ lệ nảy mầm, chiều cao cây, chiều dài rễ, trong lượng khô
đều tăng so với đối chứng [27].

Cristiana Felici và cộng sự (2008) đã nghiên cứu phối hợp hai chủng
Bacillus subtilis và Azospirillum brasilense xử lý cho cà chua. Kết quả cho thấy
khi phối hợp hai chủng cho hiệu quả kém hơn so với xử lý đơn chủng [24].
G. Holguin, C. L. Patten, B. R. Glick (1999) đã tổng hợp nghiên cứu về di
truyền và sinh học phân tử của vi khuẩn Azospirillum, cho thấy các gen nif H, nif
DK quy định tổng hợp nitrogennase cần cho quá trình cố định đạm của vi khuẩn
[28].
Martı´n Dı´az-Zorita và cộng sự (2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi
khuẩn Azospirillum cho lúa mì, trong điều kiện trồng khô hạn. Kết quả cho thấy
cây tăng trưởng tốt, tăng chiều cao, đường kính gốc, hàm lượng tích lũy chất khô
tăng, năng suất hạt khô tăng 260kg/ha, tương đương sản lượng tăng 8% (so với
đối chứng [30].
Andres D. Naiman và cộng sự ( 2009) đã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi
khuẩn Azospirillum brasilense và Pseudomonas fluorescens cho lúa mì. Kết quả
cho thấy chiều cao cây tăng 12%, đường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng
16% [23].
1.4 Nghiên cứu trong nước
Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng
CNSH vào nông nghiệp, trong những năm gần đây Việt Nam có khá nhiều
nghiên cứu về Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh học.
Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) đã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter
của Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả
15
năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA. Nhiệt độ thích hợp của các
chủng này là 25-30
0
C, pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0 [8].
Phạm Ngọc Lan (1999) đã phân lập được 37 chủng Azotobacter trên đất
gò đồi vùng Thừa Thiên - Huế. Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn được hai
chủng có khả năng kháng kháng sinh, tồn tại được ở pH kiềm ( pH = 8). Kết quả

thử nghiệm gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm đã làm tăng tỷ lệ
sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng N trong lá cũng cao hơn so với đối
chứng [13].
Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố
định N tự do Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter,
Pseudomonas aeruginosa. Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh
trưởng chiều cao mạ 7,47 - 16,93% và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85% [3].
Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phân
bón đơn chủng, đa chủng cho cây trồng. Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là
Azotobacter bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus
polymyxa. Thử nghiệm trên khoai tây làm tăng năng suất từ 100 - 300% so với
đối chứng [20].
Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm được 20% phân
bón vô cơ N, P, K nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với đối chứng 15-50%,
cà chua tăng 12-34%, lạc tăng 30% và giảm đáng kể bệnh héo xanh [19].
Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của
các chủng cố định N trong rễ lúa đến sinh trưởng của mầm lúa CR 203. Nhóm
tác giả đã phân lập được 78 chủng cộng sinh với rễ lúa. Các chủng này có đặc
điểm của chi Azospirillum. Các chủng này kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa
CR 203 [1].
Lăng Ngọc Dậu (2004) đã nghiên cứu khả năng tạo IAA của vi khuẩn
Azospirillum lipoferum, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường
16
Nfb có bổ sung Tryptophan, theo dõi tại những thời điểm khác nhau. Kết quả
cho thấy tại thời điểm 10 ngày sau khi cấy ủ khả năng tao IAA cao nhất [4].
17
PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội
dung sau:

1. Phân lập và mô tả đặc điểm sinh học một số chủng Azospirillum.
2. Tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm bằng
nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô.
3. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng
Azospirillum được tuyển chọn.
2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
* Vật liệu:
- Các chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum được phân lập từ rễ cây
ngô trong giai đoạn trổ cờ tại huyện Krông Nô, Cư Jut, Đăk Mil thuộc tỉnh Đăk
Nông.
- Giống ngô lai C919 cung cấp bởi Công ty Monsanto Việt Nam.
- Vi khuẩn Azospirillum lipoferum AL10 do viện nghiên cứu và phát triển
Công Nghệ Sinh học - Đại học Cần Thơ cấp.
- Cặp mồi chuyên biệt để nhận diện Azospirillum lipoferum được Viện
nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ thiết kế
dựa theo trình tự gen nif H của vi khuẩn Azospirillum lipoferum gồm:
+ Mồi xuôi: 5
’
-GTA AAT CCA CCA CCT CCC

-3
’
và
+ Mồi ngược: 5
’
-TGT AGA TTT CCT GGG CCT-3
’
.
* Hóa chất: Acid Malic, KH

2
PO
4
, Na
2
MoO
4
, CuSO
4
, ZnSO
4
, Saccarose,
Agar, Biotin, Pyridoxine
* Thiết bị nghiên cứu: Đĩa petri, micropipette, que cấy, box cấy vô trùng,
máy quang phổ spectrophotometer Plus 100 (Nhật Bản), máy ủ nhiệt, nồi hấp
18
khử trùng, PCR C1000 (Biorad, Mỹ); GelDoc (Biorad, Mỹ); Điện di Biorad
(Mỹ).
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm thu mẫu: được thực hiện tại các huyện Krông Nô, Cư Jut, Đăk
Mil thuộc tỉnh Đăk Nông.
- Địa điểm thí nghiệm: được thực hiện tại Bộ môn Sinh học thực vật,
Khoa Nông Lâm nghiệp, Phòng thí nghiệm CNSH & MT, Trường Đại học Tây
Nguyên.
- Địa điểm thực nghiệm: tại Trại thực nghiệm Khoa Nông Lâm nghiệp,
trường Đại học Tây Nguyên.
2.2.3 Thời gian nghiên cứu
Đề tài thực hiện từ tháng 08/2010 tới tháng 08/2011.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu mẫu

Rễ cây ngô trong giai đoạn trổ cờ thuộc các giống khác nhau được thu
thập một cách ngẫu nhiên, mỗi ruộng lấy năm cây (4 cây ở 4 góc và 1 cây ở giữa
ruộng) tại các huyện Krông Nô, Cư Jut, Đăk Mil thuộc tỉnh Đăk Nông. Toàn bộ
bộ rễ được đựng trong túi nilon đã khử trùng. Các mẫu sau khi lấy được ghi nhãn
nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu. Mẫu rễ cây ngô sau khi thu được đem tới
phòng thí nghiệm, rửa thật sạch đất bám ở rễ dưới vòi nước chảy, để ráo tự
nhiên, để riêng từng mẫu rồi tiến hành phân lập hoặc bọc riêng từng mẫu trong
túi nilon đã khử trùng buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (5
0
C) nếu chưa phân
lập ngay [5], [17].
2.3.2 Phương pháp phân lập
Cắt rễ thành những khúc nhỏ 2 - 3cm. Các mẫu rễ được để riêng trong các
bình tam giác tiến hành khử trùng bề mặt. Rễ được khử trùng bằng dung dịch
chloromine 1% trong 30 phút, tiếp tục khử trùng bằng cồn 70
0
5 phút, H
2
O
2
3
phút rồi rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (6 lần). Sau đó lấy khoảng 2g mẫu
19
cho vào cối giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10
phút và hút lấy phần trong cho vào eppendorf, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng
xuống và lấy phần nước trong để tiến hành phân lập. Lấy 0,5ml dịch nghiền rễ
cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường NFb bán đặc (không đạm). Ủ ở nhiệt
độ 32
0
C trong vòng 4 - 5 ngày, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Quan sát những ống nghiệm có vòng đậm (vòng pellicle), cách bề mặt
môi trường 2 – 5 mm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum. Chuyển
vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc tiến hành làm thuần giống
[21].
Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri
chứa môi trường NFb đặc để thu khuẩn lạc đơn. Quá trình làm thuần được tiến
hành 2 - 3 lần. Chọn khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy chuyền vào ống thạch
nghiêng để giữ giống [5], [21].
* Môi trường Nfb không đạm: [25], [34].
- Acid Malic: 5g
- K
2
HPO
4
: 0,5g
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,2g
- NaCl: 0,1g
- CaCl
2
: 0,02g
- KOH: 4g
- 1 ml dung dịch stock vitamin (10 mg biotin và 20mg pyridoxine trong 100
ml nước cất).
- 2ml dung dịch vi lượng (200mg Na
2
MoO

4
.2H
2
O, 235mg MnSO
4
.H
2
O,
280 mg H
3
BO
3
, 8 mg CuSO
4
.5H
2
O, 24 mg ZnSO
4
.7H
2
O hòa tan trong 200
ml nước cất).
- Agar: 1,75 g/ lít
- 2ml Bromthymol blue 0,5%
- Thêm nước cất vừa đủ 1 lít.
- pH điều chỉnh đến 6,8.
20
* Môi trường đặc có chứa 15g/lít agar (Dobreigner, 1995)
2.3.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các
chủng Azospirillum

Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác định
đặc điểm sinh học và định danh theo khoá phân loại của Bergey 1994.
2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum
Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum dựa trên nồng độ
IAA có trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn. Nồng độ IAA có trong dịch
chiết càng cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh. Nồng
độ IAA được xác định bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530
nm.
* Phương pháp xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quan
giữa chỉ số OD
530nm
và nồng độ IAA.
- Chuẩn bị dung dịch đệm phosphat ( 200ml)
A: KH
2
PO
4
0,136g/100ml nước cất;
B: K
2
HPO
4
0,174g/100ml nước cất;
Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH 7.
- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski
Lấy 553 ml H
2
SO
4
(98%) cho vào nước cất đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ

được dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc 10,8M.
Cân 4,5g FeCl
3
cho vào 1 lít H
2
SO
4
10,8M đã pha ở trên để được thuốc
thử Salkowski.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA
Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch đệm phosphat
được nồng độ là 160mg/l. Sau đó tiến hành pha loãng ra các nồng độ 0, 5, 10, 16,
20, 40, 80 mg/l.
Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau có
thể tích 2 ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần.
21
Để 10 phút trong tối ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau
đó tiến hành đo OD ở bước sóng 530 nm.
Từ kết quả trên, chúng tôi xác định được phương trình đường chuẩn của
dung dịch IAA thông qua chỉ số OD
530nm
. Dựa vào phương trình đường chuẩn để
xác định nồng độ IAA ( mg/l) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi
cấy.
Bảng nồng độ IAA thành lập đồ thị đường chuẩn
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6

Thể tích IAA 160 mg/l 0 1,0 0,50 0,25 0,20 0,125 0,0625
Dung dich đệm (ml) 2,0 1,0 1,50 1,75 1,80 1,875 1,9375
Tổng thể tích (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
Nồng độ IAA (mg/l ) 0 80 40 20 16 10 5
Thuốc thử Salkowski
(ml)
4 4 4 4 4 4 4
Thực hiện nuôi cấy các chủng Azospirillum phân lập được trên môi trường
chiết khoai tây (BMS). Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi
bình chứa 50ml dịch môi trường, hấp khử trùng, để nguội. Tiến hành cấy các
chủng Azospirillum vào các bình tam giác chứa môi trường đã khử trùng. Nuôi ở
nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút. Sau 72h thu dịch nuôi
cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 4 phút, lấy dịch trong để đo lượng IAA
được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu
Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.3.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố định
đạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô
Đánh giá hoạt tính cố định đạm của các chủng Azospirillum dựa trên N
tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô. N tổng số có trong lá
và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô của các lô thực nghiệm càng cao hơn so
với lô đối chứng, chứng tỏ hoạt tính cố định đạm của chủng vi khuẩn càng mạnh.
22
* Phương pháp thí nghiệm: Hạt ngô lai C919 được khử trùng bằng H
2
O
2
3% trong 3 phút, rửa lại 4 lần với nước cất. Sau đó, cho hạt vào đĩa petri có bông
đã được khử trùng, với một ít nước và ủ cho tới khi hạt nứt mộng chuẩn bị nảy
mầm. Rửa sạch hạt bằng nước cất. Vi khuẩn Azospirillum được nuôi trong ống
nghiệm sau 72

h lấy dịch sinh khối tế bào cho hạt ngô vào và ngâm 15 phút. Sau
đó đem gieo 1 hạt/bầu đất. Loại đất đóng bầu là đất đỏ Bazan chỉ lấy lớp đất
mặt, mỗi bầu đóng khoảng 5 kg đất. Mỗi chủng Azospirillum có 1 nghiệm thức,
mỗi nghiệm thức có 15 bầu đất, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Nghiệm thức 1: Đối chứng không bón phân, không nhiễm vi khuẩn
Azospirillum
Nghiệm thức 2: Không bón phân, nhiễm vi khuẩn Azospirillum.
Các chỉ tiêu theo dõi cây ngô sau khi gieo 45 ngày: Chiều cao cây, số lá
trên cây, chiều dài lá, đường kính gốc, chiều dài rễ, khối lượng tươi, khô.
Các chỉ tiêu phân tích: Hàm lượng đạm tổng số, hàm lượng diệp lục
trong lá.
* Phương pháp xác định hàm lượng đạm tổng số: Theo phương pháp
Kjeldanl [2],[14].
* Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục
(chlorophyll) và carotenoid được xác định bằng phương pháp so màu [36].
- Lấy 500mg lá, cắt nhỏ, ngâm trong 50ml aceton 80%, để trong tối.
- Sau 3 ngày lấy toàn bộ dịch chiết định mức đến 100ml. Sau đó lấy dịch
chiết đo ở các bước sóng 663nm, 645nm và 440,5nm.
Hàm lượng chlorophyll a (C
a
), chlorophyll b (C
b
) và carotenoid (C
car
)
được tính theo công thức:
C
a
= 0,0127 x OD

663
- 0,00269 x OD
645
C
b
(mg x g
-1
) = 0,0299 x OD
645
- 0,00468 x OD
663
C
car
(mg x g
-1
) = 0,004695 x OD
440,5
- 0,000268 x (C
a
+ C
b
)
2.3.6. Phương pháp định danh các chủng Azospirillum được tuyển chọn
bằng kỹ thuật PCR
23
Nuôi cấy vi khuẩn ở pha log (sau 36
h
), ly trích DNA vi khuẩn và tiến hành
nhân DNA bằng máy PCR rồi chạy điện di sản phẩm. So sánh độ lớn DNA vi
khuẩn với thang chuẩn và với mẫu đối chứng dương Azospirillum lipoferum

AL10. Nếu độ dài của DNA vi khuẩn cần nhận diện là 400bp, giống mẫu đối
chứng dương thì đó là vi khuẩn Azospirillum lipoferum. Phản ứng khuếch đại
DNA được thực hiện trong thể tích 25 µl.
Một phản ứng bao gồm: 1,0µL DNA vi khuẩn; 2,5µL 10X PCR buffer;
1,0µL mồi xuôi; 1,0µL mồi ngược; 1,0µL dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);
0,5µL Taq polymerase; 18µL nước cất vô trùng.
Chu kỳ phản ứng PCR gồm các bước thứ tự như sau:
Bước 1: Biến tính các mẫu ADN ở 95
0
C trong 5 phút
Bước 2: Thực hiện tiếp ở 95
0
C trong 1 phút
Bước 3: Hạ nhiệt độ đến 55
0
C trong 1 phút
Bước 4: Nâng nhiệt độ lên 72
0
C trong 1 phút
Bước 2 đến bước 4 lặp lại 30 chu kỳ.
Bước 5: Giữ ở 72
0
C trong 10 phút
Bảo quản sản phẩm PCR ở 4
0
C.
Điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR: Các sản phẩm sau khi được
khuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên gel agarose 1,2% có bổ
sung thêm ethidium bromide (EtBr).
2.3.7 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các

chủng Azospirillum được tuyển chọn
2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến
sinh khối của các chủng Azospirillum
24
Các chủng Azospirillum sẽ được nuôi trên 3 loại môi trường Nfb, Fallik,
môi trường nước chiết khoai tây ( BMS), ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc xoay
vòng 150 vòng/phút. Sau 72
h
tiến hành đo OD
660
để xác định sinh khối tế bào.
Mật độ tế bào được xác định tương quan OD
660
= 1,0 tương đương với mật độ
10
9
tế bào/ml [26]. Chọn môi trường thuận lợi nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn
Azospirillum để tiến hành những thí nghiệm tiếp theo.
* Môi trường Nfb [25], [34].
- Acid Malic: 5g
- K
2
HPO
4
: 0,5g
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,2g

- NaCl: 0,1g
- CaCl
2
: 0,02g
- KOH: 4g
- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập.
- Thêm nước cất cho đủ 1000ml
- Điều chỉnh pH: 6,8
* Môi trường của Fallik [26].
- KH
2
PO
4
: 4g
- K
2
HPO
4
: 6 g
- Na-Succinate: 5g
- NH
4
Cl: 1g
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,2g
- Cao nấm men: 0,2g
- NaOH: 3,5g

- Nước cất vừa đủ 1 lít
- Điều chỉnh pH: 6,8
* Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) [12], [34].
- Nước chiết khoai tây: 500ml ( 200g/l )
- Acid Malic: 2,5g
25