Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phản nitrat cao phân lập từ các đầm nuôi tôm ven biển đồ sơn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HẢI PHÒNG
VIỆN SINH - NÔNG
*****
HỌ VÀ TÊN : VŨ THỊ VÂN ANH
LỚP: KSNTTS K12. KHÓA : 2011 - 2015

TÊN ĐỀ TÀI: Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phản
nitrat cao phân lập từ các đầm nuôi tôm ven biển Đồ Sơn.
Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản
BÁO CÁO ĐỀ CƯƠNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Giáo viên hướng dẫn: 1.Ts. Đỗ Mạnh Hào
2. Ths. Mai Thị Yến
Học viên thực hiện: Vũ Thị Vân Anh
MỞ ĐẦU
Nước ta có bờ biển dài với hệ thống kênh rạch chằng chịt rất thuận lợi cho
nghề phát triển nuôi trồng thủy sản, trong đó nghề nuôi tôm đóng góp một phần
không nhỏ vào sự phát triển của ngành. Sản lượng tôm không chỉ đáp ứng nhu cầu
trong nước mà còn xuất khẩu ra nước ngoài và góp phần quan trọng vào tăng
trưởng kinh tế cho đất nước (7.662 triệu USD/8 tháng 2004).
Trong nuôi trồng thủy sản, các điều kiện vật lý, hóa học và sinh học của môi
trường ao nuôi có ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe và khả năng sản xuất của tôm.
Sự tiếp xúc của tôm với các độc tố như H
2
S, NH
3
, CO
2
dễ làm tôm bị stress và từ
đó mang bệnh. Các chất thải trong ao nuôi tôm bao gồm: (1) thức ăn dư thừa và
phân; (2) các sản phẩm phụ trong quá trình trao đổi chất; (3) tồn dư các chất diệt
khuẩn như kháng sinh; (4) các chất thải có nguồn gốc từ phân bón; (5) các chất thải

trong quá trình lột vỏ tôm; (6) tảo bị chết.
Các hướng nghiên cứu hiện tại hướng đến việc nâng cao chất lượng nước ao
nuôi bằng cách sử dụng các enzyme hoặc chế phẩm sinh học chứa các nhóm vi
sinh vật có lợi vào trong ao nuôi, gọi là “xử lý sinh học”. Khi các vi sinh vật và các
sản phẩm của chúng được sử dụng để cải thiện chất lượng nước, chúng được gọi là
tác nhân xử lý sinh học. Kết quả là làm giảm sự tích tụ của các chất cặn bã và bùn
đáy, làm tăng lượng oxy hòa tan trong nước ao nuôi. Do đó, việc sử dụng các
chủng vi sinh có khả năng oxy hóa mạnh các nguồn sulfide nhằm làm giảm hàm
lượng H
2
S; tối ưu hóa việc khoáng hóa nguồn carbon thành CO
2
nhằm làm giảm
lượng bùn đáy; tối ưu hóa để kích thích sản xuất tôm ở từng mùa vụ nuôi; duy trì
cộng đồng vi sinh ổn định và đa dạng nhằm hạn chế sự phát triển ưu thế của các vi
sinh vật không mong muốn.
Quá trình khử đạm là một trong những quá trình rất quan trọng trong xử lý
nước, được xem là một cách loại thải ammonia và nitrate thừa trong môi trường và
kích thích sự loại trừ cacbon khi sự sục khí gặp khó khăn. Trong xử lý nước thải,
sự loại thải hợp chất đạm có thể được thực hiện bởi sự kết hợp của quá trình nitrate
hóa (oxi hóa ammonia thành nitrate) và quá trình khử nitrate (khử nitrate thành
N
2
O hoặc N
2
). Điều này đòi hỏi hoạt động phối hợp hoặc nối tiếp của các nhóm vi
sinh vật khác nhau, đặc biệt là vi khuẩn nitrate hóa và vi khuẩn khử nitrate (Lee và
các cộng sự (2002)).
Một số dòng vi khuẩn tham gia trong chu trình nitơ có khả năng khử đạm
(denitrifying bacteria) dưới dạng thức ăn thừa hoặc phân cá, tôm giúp giảm lượng

nitrate, ammonium gây ô nhiễm nguồn nước, cải thiện chất lượng nước ao nuôi,
góp phần thực hiện nuôi thủy sản bền vững. Ngoài ra, việc ứng dụng các kỹ thuật
sinh học phân tử sẽ giúp nhận diện vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính
xác.Do vậy, thực hiện đề tài “Tổng hợp một số loài vi sinh vật có khả năng phản
nitrat cao phân lập từ các đầm nuôi tôm ven biển Đồ Sơn” là hết sức cần thiết.
1.2. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG
1.2.1. Mục tiêu của đề tài
- Mục tiêu chung: Phân lập được một số chủng vi sinh vật phản nitrate từ ao
nuôi tôm vùng ven biển. Kết quả của việc nghiên cứu sẽ góp phần vào việc giải
quyết vấn đề ô nhiễm đạm trong nước ở ao nuôi tôm.
- Mục tiêu cụ thể:
+ Học tập được các phương pháp cơ bản trong nghiên cứu vi sinh vật.
+ Có được một số chủng vi sinh vật phản nitrate phân lập từ các ao nuôi tôm
ven biển Đồ Sơn.
Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Kết quả của đề tài là tài liệu tham khảo tốt cho các công trình nghiên cứu
tiếp theo về lựa chọn, phân lập các chủng vi sinh vật phản nitrate trong nước.
- Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng quy trình lựa chọn các một số
chủng vi sinh vật.
1.2.2. Nội dung
- Phân lập một số chủng vi khuẩn phản nitrate trong trầm tích thu từ các ao
nuôi tôm ven biển.
- Thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn phản nitrate từ các mẫu thu được.
- Bước đầu đánh giá tiềm năng khử nitrate của khu hệ vi sinh vật bản địa
trong khu vực nuôi trồng thuỷ sản nước lợ khu vực cửa sông Lạch Tray, Hải
Phòng.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. HIỆN TRẠNG NUÔI TÔM HIỆN NAY VÀ CÁC CHẤT Ô NHIỄM
NITƠ TRONG ĐẦM NUÔI THỦY SẢN NƯỚC LỢ
Trong khoảng 2 thập niên gần đây, chúng ta đang chứng kiến ngành nuôi trồng

thuỷ sản đặc biệt là ngành nuôi trồng thuỷ sản nước lợ đang phát triển với tốc độ
rất nhanh xét cả về quy mô và phương thức nuôi trồng. Giai đoạn từ 1990 đến
2000, nhà nước mở rộng diện tích nuôi được tiến hành chủ yếu trên các vùng ngập
nước ven biển, trong các thủy vực nước mặn ven biển, trên các vùng cát trũng ven
biển miền Trung và một phần diện tích từ canh tác nông nghiệp kém hiệu quả. Giai
đoạn sau là giai đoạn chuyển dịch từ hình thức nuôi quảng canh là chủ yếu sang
hình thức nuôi thâm canh và công nghiệp.
Tuy nhiên, việc phát triển nuôi trồng thuỷ sản nước lợ đặc biệt là nuôi tôm
công nghiệp với tốc độ quá nóng trong thời gian qua đã và đang gây ra những hệ
quả tiêu cực cho sự phát triển bền vững của ngành và những tác động tiêu cực đến
môi trường sinh thái xung quanh. Nước và trầm tích từ ao nuôi thường có hàm
lượng các chất ô nhiễm, dư lượng chất kháng sinh và các vi sinh vật gây bệnh tiềm
tàng rất cao đã tạo điều kiện môi thuận lợi cho các nhân tố gây bệnh bùng phát làm
tôm chết hàng loạt. Theo ước tính của Colt (1986) thì cứ 1kg thức ăn có thể sinh ra
0,28 kg CO
2
, 0,03 kg N-NH
4
, 0,3 kg TSS và tiêu tốn 0,2 kg ôxy. Theo ước tính của
Dierberg & Kattisimkul (1996), tổng lượng chất thải sinh ra trong mỗi hecta sau
một vụ nuôi được ước tính có thể đạt 321 kg phốt pho tổng, 668 kg nitơ tổng và
215.000 kg tổng chất rắn lơ lửng. Hầu hết các khu vực nuôi tôm công nghiệp đều
không có hệ thống xử lý chất các chất ô nhiễm, nguồn chất thải từ đầm nuôi
thường bị thải trực tiếp ra môi trường xung quanh dẫn đến nhiều hệ sinh thái ven
biển bị suy thoái nghiêm trọng,
Trong quá trình nuôi tôm, các chất ô nhiễm nitơ vô cơ (TAN, N-NO
2
và N-
NO
3

) được tích luỹ dần do sự bài tiết trực tiếp từ đối tượng nuôi, phân huỷ thức ăn
dư thừa hay sẵn có từ nguồn nước cấp vào đã nhiễm các hợp chất nitơ. TAN và
nitrite là độc tố đối với các đối tượng nuôi, bởi nó có thể gây ra hiệu ứng cấp tính
và kinh niên dẫn đến giảm khả năng đề kháng bệnh và sinh trưởng của vật nuôi.
Theo Chin & Chen (1987), nồng độ NH
3
là 0,09 mg/L có thể làm giảm sinh
trưởng, tại nồng độ 0,1 mg/L có thể gây chết tôm (Chin & Chen, 1987; Boyd,
2000). N-NO
2
có thể ảnh hưởng đển sức khỏe của tôm trong dài hạn tại nồng độ
thấp đến 0,45 mg/L (Gross & cs., 2004). Nitrate không gây độc trực tiếp đối với
vật nuôi nhưng sự có mặt của nitrate với nồng độ cao sẽ kích thích sự nở hoa của
tảo, có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vật nuôi như cá chình (Kamstra &
van der Heul, 1998), mực (Hyrayama, 1996), cá hồi (Berka & cs., 1981) và tôm
(Muir & cs., 1991).
Hình 1. Chu trình nitơ trong đầm nuôi tôm ven biển
2.2. KHÁI QUÁT VỀ CHU TRÌNH NITƠ VÀ VI KHUẨN PHẢN NITRATE
2.2.1. Chu trình chuyển hoá nitơ sinh học trong đầm nuôi thuỷ sản nước lợ
Chu trình nitơ là một trong những chu trình quan trọng nhất của hệ sinh thái
bởi nitơ là nguyên tố chính cấu thành các hợp chất hữu cơ quan trọng của sự sống
như protein và axit nucleic. Trong nhiều hệ sinh thái tự nhiên, nitơ thường là
nguyên tố cần thiết cho sự sống của sinh vật do nguồn cung cấp nitơ giới hạn có
thể làm giảm năng suất sơ cấp của hệ sinh thái. Trong một số hệ sinh thái khác như
hệ sinh thái đồng ruộng canh tác nông nghiệp, sông ngòi và ven biển, do chịu ảnh
hưởng mạnh mẽ bởi các hoạt động của con người mà nguồn nitơ trong các hệ sinh
thái này thường dư thừa (eutrophication) và có ảnh hưởng tiêu cực đến sự cân bằng
của hệ sinh thái.
Hình 2. Chu trình nitơ vi sinh vật trong hệ sinh thái tự nhiên
Các nhóm vi khuẩn mới được phát hiện bao gồm nhóm vi khuẩn lam đơn bào

cố định khí nitơ (unicellular N
2
fixing cyanobacteria), nhóm vi khuẩn ôxy hoá
nitrite quang tự dưỡng (phototrophic nitrite oxidation), nhóm vi khuẩn phản nitrate
hoá phụ thuộc CH
4
(CH
4
-dependent denitrification), nhóm vi khuẩn khử N
2
O (N
2
O
reduction), nhóm vi khuẩn cổ ôxy hoá ammonia hiếu khí (archaeal NH
3
oxidation),
nhóm vi khuẩn ôxy hoá ammonia kị khí (anammox).
Trong tự nhiên có hai loại khử nitrate:
- Quá trình đồng hoá (ammonia hoá nitrate) tức là quá trình khử nitrate thành
ammonia, quá trình này xảy ra ở một số vi khuẩn như Bacillus , E. coli,
Aerobacter.
- Quá trình dị hoá (phản nitrate hoá) là quá trình khử nitrate hoặc nitrite thành nitơ
phân tử.
Hai quá trình khử nitrate này có chung giai đoạn đầu.
Quá trình khử nitrate thành khí nitơ là quá trình phản nitrate hoàn toàn. Mức độ
ôxy hoá của các hợp chất trung gian trong quá trình phản nitrate hoá như sau:
NO
3
-
→ NO

2
-
→ NO → N
2
O → N
2

Quá trình phản nitrate xảy ra chủ yếu do nhóm vi sinh vật dị dưỡng trong điều
kiện kị khí hoặc hiếu khí tuỳ tiện và có chuỗi hô hấp hoàn chính, chúng phân bố
rộng rãi trong tự nhiên. Chúng gồm một số đại diện như Pseudomonas,
Alcaligenes, Azospirillum, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Propionibacterium,
Achromobacter, Micrococcus, Paracoccus, Bacillus v.v. Ngoài ra còn một số vi
khuẩn lưu huỳnh cũng có khả năng này như Thiobacillus denitrificans, Sulfomonas
denitrificans. Bên cạnh các vi khuẩn dị dưỡng còn có các vi khuẩn tự dưỡng như
Thiobacillus denitrificans hoặc tự dưỡng không bắt buộc khác. Các vi khuẩn này là
các vi khuẩn kị khí tuỳ tiện trong môi trường đủ ôxy các vi khuẩn phản nitrate hoá
ôxy hoá các hợp chất hữu cơ giống như vi khuẩn hiếu khí bình thường, khi môi
trường thiếu ôxy chúng mới tiến hành khử nitrate.
Quá trình phản nitrate hoá có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí tùy tiện,
nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện thiếu ôxy. Các vi khuẩn phản nitrate hoá là
các tác nhân có hại cho sản xuất nông nghiệp vì làm mất một lượng lớn chất đạm
vô cơ ở dạng NO
3
-
dành cho thực vật. Tuy nhiên, chúng lại là tác nhân quan trọng
trong xử lý nước thải và nước sinh hoạt vì chúng loại bỏ nguồn nitơ liên kết đối với
môi trường sinh thái.
Cần chú ý một tới một số loài vi khuẩn như Alcaligens, Escherichia,
Aeromonas, Enterobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia, Spirillum,
Staphylococcus và Vibrio, chúng chỉ chuyển hoá NO

3
-
thành NO
2
-
và do đó gây độc
cho nguồn sử dụng.
Ngoài ra nitrate và nitrite thường tồn dưới dạng muối của các kim loại kiềm và
kiềm thổ. Trong quá trình phân giải các muối kali, natri, canxi v.v. Các muối
cacbonat và kiềm được tạo thành. Vì thế, quá trình phản nitrate hoá thường kèm
theo sự kiềm hoá môi trường.
Độ pH tối ưu cho quá trình phản nitrate xảy ra là từ 6,0 – 8,0.
2.2.2.Sơ lược về một số vi khuẩn khử đạm:
- Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí gram âm, tồn tại ở dạng đơn,
bắt cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn cực. Là vi
khuẩn hiếu khí bắt buộc, nhưng P. aeruginosa có thể phát triển trong môi trường
kỵ khí nếu có NO3-làm chất nhận điện tử, nhiệt độ phát triển tối ưu ở 37
o
C. Loài
này tăng trưởngđược trên môi trường nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và một
nguồn carbon thích hợp duy nhất như acetate, pyruvate, succinate, glucose,… P.
aeruginosa có khả năng thủy giải gelatin, tinh bột, khử nitrate, oxidase…Khuẩn lạc
của P. aeruginosa có ba dạng: (1) khuẩn lạc nhỏ, thô ở những chủng hoang dại
phân lập từ đất, nước; (2) khuẩn lạc to, trơn, rìa phẳng, nhô cao và (3) khuẩn lạc có
dạng nhầy (được phân lập từ bệnh phẩm) (Trần Linh Thước, 2003). Nhóm vi
khuẩn này phân bố rộng rãi và được tìm thấy chủ yếu trong đất, nước.
- Pseudomonas stutzeri là vi khuẩn khử đạm không có sắc tố huỳnh quang của
giống Pseudomonas. Tế bào vi khuẩn hình que, gam âm, di chuyển bằng
chiênmao đỉnh, có khả năng khử nitrate thành nitơ phân tử, có thể tăng trưởng
trong maltosevà tinh bột (Bennasar và các cộng sự, 1998; Sikorski và các cộng sự,

1999). Cho phản ứng dương tính với kiểm tra catalase và oxidase. Nó được phân
lập lần đầu tiên bởi Burri và Stutzer (Burri và Stutzer, 1895), có tên gọi là Bacillus
denitrificans II, sau đó được đổi tên thành Pseudomonas stutzeri bởi Niel và Allen
(Van Niel và Allen, 1952). Khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri có dạng không
bình thường và độ sệt thay đổi theo thời gian, có khuẩn lạc thì khô cứng và gắn kết
chặt, có nếp gấp, có khuẩn lạc có màu trắng đục hay màu vàng nhạt (Van Neil và
Allen, 1952; Lalucat và các cộng sự, 2006).
2.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC
Năm 1983, Curtis đã tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng khử nitrate của
ba loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
paracoccus, mặc dù 3 loài vi khuẩn này đều làm giảm nitrate tạo ra nitơ, nhưng tốc
độ tích lũy số lượng các chất trung gian của chúng khác nhau. Sản phẩm sinh ra
của quá trình khử nitrate của 3 loài vi khuẩn có sự khác biệt rõ ràng: Vi khuẩn P.
stutzeri khử nitrate sản phẩm khí sinh ra duy nhất là N
2
, P. aeruginosa và P.
paracoccus khử nitrate sản phẩm sinh ra là khí NO
2
. Vi khuẩn P.stutzeri và P.
Paracoccus khử nitrate làm giảm nhanh nồng độ NO
3
-, NO
2
-, NO
2
và vi khuẩn này
có thể tăng trưởng trong môi trường kỵ khí khi có sự hiện diện của NO
2
trong môi
trường.

Những nghiên cứu tiếp theo của Holmes (1986) và Rosello và các cộng sự
(1991) đã phân lập được tổng cộng 49 dòng P. stutzeri. Chúng được phân lập từ
các mẫu bệnh lý, bùn biển và trong hệ thống nước thải.
Những nghiên cứu đầu tiên về cơ sở phân tử và sinh học tế bào của sự khử
đạm được biết đến là mô tả kích thước gen và bản đồ gen của vi khuẩn khử đạm;
những đặc tính và cấu trúc enzyme khử nitrite, nitric oxide, nitrous oxide; các dòng
Pseudomonas khử đạm; độ đa dạng của vi khuẩn khử đạm. Nghiên cứu này do
Zumft thực hiện năm 1997.
Sự xuất hiện của kỹ thuật PCR (Kary Mulis, 1985) đã hỗ trợ rất nhiều trong
việc nhận diện các dòng vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác. Vì thế
những nghiên cứu sau này tập trung vào các đoạn gen mã hóa cho tính khử đạm.
Điển hình có Braker cùng đồng nghiệp (1998) đã nghiên cứu phát triển hệ thống
các cặp mồi chạy PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa quá trình khử nitrite (nirK và
nirS) để phát hiện vi khuẩn khử đạm trong mẫu môi trường thu được (bùn hoạt
động của hệ thống xử lý nước thải ở Đức). Gen nirK đã được khuếch đại từ
Blastobacter denitrificans, Alcaligenes xylosoxidans và Alcaligenes sp.
(DM 30128); gen nirS được khuếch đại từ Alcaligenes eutrophus DSM 530 và từ
chủng khử đạm IFAM 3698. Với mỗi gen, ít nhất một mồi phối hợp đã khuếch đại
thành công đối với tất cả các chủng trong thí nghiệm. Cặp mồi nirK1F-nirK5R và
nirS1F-nirS6R được dùng trong PCR cho kết quả như mong đợi với các chủng vi
khuẩn khử đạm có mang gen tương ứng nirK và nirS. Sản phẩm khuếch đại không
chuyên biệt đã không thu được ở những vi khuẩn không khử đạm hoặc với các
chủng có kiểu gen nir khác.
Năm 1999, Hallin và Lindgren đã tìm ra gen mã hóa cho quá trình khử nitrite
(2 dạngcủa gen nir: nirK và nirS) trong vi khuẩn khử đạm (P. stutzeri ATCC
14405, P. fluorescens ATCC 33512, P. putida CCUG 2479, P. aureofaciens
ATCC 13985, P. denitrificans ATCC 13867, Paracoccus denitrificans ATCC
19367, Alcaligenes eutrophus ATCC 17699,…) bằng kỹ thuật PCR. Bước chính
của con đường khử đạm là sự khử nitrite bằng enzyme nitrite reductase (nir). Được
biết có 2 loại enzyme nir đó là: một enzyme với heme c và heme d1 (cd1-nir) và

một có chứa đồng (Cu-nir). Cả hai loại enzyme này đều tương tự nhau về chức
năng và đặc điểm sinh lý học.
Chèneby cùng cộng sự (2000) tiến hành phân tích 16S rDNA về đặc tính của
vi khuẩn khử đạm phân lập từ 3 vị trí đất nông nghiệp ở Đông bắc nước Pháp, đất
được lấy từ tầng mặt (0-20 cm). Tổng cộng đã phân lập được 138 chủng từ tổng số
1445 chủng vi khuẩn kỵ khí là có khả năng khử đạm. Phân tích hệ thống phát sinh
loài của 16S rDNA của những dòng khử đạm đã phân lập được từ 3 loại đất trên đã
phát hiện sự đa dạng ở một mức độ cao.
Su và đồng nghiệp (2001) tiến hành so sánh sự khử nitrite ở điều kiện hiếu
khí, dưới bầu khí quyển có mức oxy cao của Thiosphaera pantotropha ATCC
35512 và P. stutzeri SU2. Chúng đã được phân lập từ bùn hoạt tính trong hệ thống
xử lý nước thải từ trại chăn nuôi heo theo quy trình của Thái Lan.
Năm 2002, Sikorski cùng cộng sự sử dụng môi trường SW-LB để phân lập P.
stutzeri từ mẫu môi trường (đất). SW-LB gồm có 10 g/l Bacto Trypton; 5 g/l yeast
extract và 15 g/l agar cùng với nước biển nhân tạo (SW) chứa 24 g/l NaCl; 10,5 g/l
MgSO4.7H2O và 0,11 g/l NaHCO3, có bổ sung 50mg cycloheximide để ngăn
chặn sự phát triển của nấm. Cặp mồi đặc hiệu và rất nhạy dựa trên vùng gen 16S
rDNA được sử dụng trong bài là fps158 và rps743 đã được mô tả bởi Bennasar et
al. (1998) để phân tích sự diện của P. stutzeri trong mẫu môi trường. Phương pháp
này đã cải tiến một chuyên biệt những qui trình phân lập, nhận diện P. stutzeri
được Baggi và cộng sự mô tả năm 1987 bằng đoạn mồi thích hợp và đặc biệt hơn
nữa là có độ nhạy tối đa để khuếch đại mẫu DNA vi khuẩn đã phân lập từ môi
trường. Gia tăng tính chuyên biệt của qui trình phân lập, nhận diện đối với P.
stutzeri có quan hệ với những vi khuẩn khác bằng việc rút ngắn 4 nucleotide ở đầu
5’của mồi ngược rps743, đổi tên thành rps743minus4; mà các nucleotide đó được
cho là đã làm tăng hiệu quả mất ổn định của những lỗi sao chép ở đầu 3’ trong lúc
mồi gắn với các gen của vùng 16S rDNA của vi khuẩn khác hơn là của P. stutzeri.
Cùng lúc đó Lee và đồng nghiệp (2002) nghiên cứu về đặc điểm phân tử của
quần xã vi khuẩn trong mẫu bùn hoạt tính loại thải nitrate với việc sử dụng phương
pháp dựa trên 16S rDNA. Bài báo cáo cũng đã mô tả một vài đặc tính của một số

chủng từ CR-I (high-nitrate-removing activated sludge) và CR-II (low-nitrate-
removing activated sludge). Đa số thuộc lớp Gammaproteobacteria và là vi khuẩn
gram (-), có hình que như P. putida, P. stutzeri, P. azotoformans.
Nghiên cứu về định lượng gen khử đạm của Henry và đồng nghiệp (2006) đã
ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện, định lượng gen nosZ (mã hóa cho enzyme
nitrous oxide reductase khử nitrous oxide [N
2
O] thành nitơ phân tử [N
2
]) trong vi
khuẩn Pseudomona fluorescens từ mẫu môi trường đất và đối chiếu với sự phong
phú của các gen 16S rRNA, narG (mã hóa cho enzyme khử nitrate ở màng), và
nirK (mã hóa cho enzyme khử nitrite với nhân đồng). Hiện nay, nồng độ nitrous
oxide (N
2
O) (một khí nhà kính quan trọng) trong khí quyển đang gia tăng với một
tỉ lệ khoảng 0,3 % mỗi năm. N
2
O là một sản phẩm trung gian của con đường khử
đạm, bao gồm sự khử nối tiếp NO
3
-thành N
2
với sự tham gia của các
metalloenzyme như nitrate reductase, nitrite reductase, nitric oxide reductase và
nitrous oxide reductase.
Một nghiên cứu khác nhằm tối ưu hóa điều kiện phân lập và nuôi cấy vi
khuẩn khử đạm cũng đã được tiến hành bởi Heylen (2006). Theo đó, môi trường
sinh trưởng tối ưu với giá trị pH= 7; hàm lượng đạm là 3 mM; có bổ sung 1ml
dung dịch vitamin; nguồn carbon từ ethanol hoặc succinate và tỉ lệ phân tử gam

C/N là 2,5 : 20 hoặc 25 là những điều kiện nuôi cấy thành công nhất. Nghiên cứu
cũng đồng thời quan sát sự đa dạng của vi khuẩn khử đạm từ bùn hoạt động của hệ
thống xử lý nước thải đô thị. Có 199 vi khuẩn khử đạm đã được phân lập, trong đó,
đa số thuộc về lớp Betaproteobacteria (50,4 %) và Alphaproteobacteria (36,8 %),
còn tìm thấy một số lớp khác như Gammaproteobacteria (5,6 %),
Epsilonproteobacteria (2 %), Firmicutes (4 %) và Bacteroidetes.
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC
Hiện nay ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn khử đạm P.
stutzeri: Phan Trường Khanh (2007), thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý
ammonia trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm”. Tác giả đã phân lập được 20
dòng vi khuẩn Pseudomonas từ các mẫu đất phù sa, phèn, mặn ở ĐBSCL và nhận
diện được một dòng P. stutzeri bằng cặp mồi đặc trưng 16S rDNA. Bước đầu khảo
sát khả năng khử đạm trong nước ao nuôi tôm bị nhiễm ammonia.
Nguyễn Trần Hải Bằng (2008), dùng cặp mồi đặc hiệu nosZ2F-nosZ2R và
cd1-nirF-cd1-nirR đã nhận diện được 6 dòng Pseudomonas stutzeri có chứa gen
nosZ, và 8 dòng có chứa gen cd1-nir.
Tô Thị Lài (2008), ở qui mô phòng thí nghiệm cho thấy các dòng vi khuẩn
P. stutzeri phân lập từ môi trường nuôi cá tra đều có khả năng xử lý
ammonia hiệu quả.
Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học- Trường Đại Học Cần Thơ
(2006) đã thực hiện: phân lập và nhận diện vi khuẩn khử đạm Pseudomonas
stutzeri từ đất và trong các ao nuôi thủy sản.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU:
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
- Nhóm vi sinh vật có khả năng khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử trong
hợp phần trầm tích ao nuôi thuỷ sản:
+ Hoạt lực khử nitrate của vi khuẩn phản nitrate.
+ Đặc điểm sinh học của vi khuẩn phản nitrate.

- Các đặc điểm lý hoá trong hợp phần nước ao nuôi thuỷ sản: nhiệt độ, pH, độ
muối, DO, COD, BOD
5
, TAN, NO3-, NO2- và PO43
3.1.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu:
- Thời gian nghiên cứu: 1/1/2015 đến 1/5/2015.
- Địa điểm:
+ Thu mẫu từ các ao nuôi tôm ven biển Đồ Sơn và cửa sông Lạch Tray.
+ Tiến hành thí nghiệm tại phòng thí nghiệm vi sinh vật tại Trạm biển Đồ Sơn
thuộc Viện Tài nguyên và môi trường biển.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Dụng cụ nghiên cứu:
- Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, lam kính, lamen,
ống eppendorf, bọc nylon và chai đựng mẫu bùn và mẫu nước,
- Kính hiển vi Olympus (Nhật Bản)
- Cân điện tử Precisa (Ý)
- Máy đo pH (Metrohm, Đức), khúc xạ kế đo độ mặn (Atago, Nhật Bản), máy đo
oxy hòa tan (YSI, Mỹ)
- Tủ cấy vi sinh vật
- Tủ ổn nhiệt nuôi vi sinh vật
- Tủ lạnh giữ mẫu
- Máy lắc mẫu GFL 3005
- Máy li tâm Eppendorf
- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000
- Bộ điện di một chiều BioRad
- Nồi hấp tiệt trùng STURDY SA-300VL
- Lò vi sóng
- Đèn UV- Máy đọc và chụp gel
- Máy PCR Perkin Elmer 9700- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu
3.2.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy:

 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường phản nitrat hóa (nitrat-glucoza): Pepton: 5g/ L, Cao thịt: 3g/ L, KNO
3
:
1g/ L, NH
4
NO
3
: 1g/L, Agar (5g/ L cho môi trường dịch thể và 16g/ L cho môi
trường thạch), NaCl (10-20g/ L)
 Dùng để tách triết DNA vi khuẩn khử đạm
- TE (10mM Tris-HCl [pH 7,6], 1mM EDTA, pH 8,0) hòa tan DNA
- Sodium dodecyl sulfate (SDS)10% hòa tan DNA và giúp proteinase K hoạt động
tách protein khỏi DNA hiệu quả hơn.
- Isopropanol nhằm tủa DNA
- Ethanol 70% dùng rửa DNA
- Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% NaCl 0,75 M
- Proteinase K (20 mg/ml) để loại bỏ protein hoặc polysaccharid khỏi DNA
- Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) nhằm tủa protein và tạo màng ngăn giữa
DNA và protein.
- Lysozyme
- RNase A
- Nước cất hai lần vô trùng
 Dùng để chạy điện di sản phẩm PCR
- Agarose 1,5% - 2%
- TAE buffer, loading buffer
- Ethidium bromide (EtBr)
- Thang chuẩn 1kb để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel
agarose
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1. Sơ đồ khối thí nghiệm:
Thu mẫu nước, bùn từ các đầm nuôi
tôm
Phân lập vi sinh vật khử đạm trên môi trường chọn lọc
(môi trường dịch thể nitrate-glucoza)
Làm thuần vi sinh vật khử đạm
(môi trường thạch nitrate-glucoza)
Nuôi sinh khối và thử hoạt tính khử nitrate của
một số chủng vi sinh vật xác định
Nhận diện vi khuẩn
Tổng hợp một số vi sinh vật phân lập
được
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu, thu mẫu ngoài hiện trường :
- Mẫu bùn đáy và mẫu nước từ các cống cấp thoát nước từ các ao nuôi tôm
ven biển Đồ Sơn và vùng cửa sông Lạch Tray.
- Quá trình thu mẫu sẽ được thực hiện vào thời điểm trước khi người nuôi tôm
xử lý ao bằng các hóa chất, chế phẩm sinh học và vét bùn đáy ao khoảng 2- 10
ngày.
- Phương pháp đo nhanh các thông số môi trường nền:
+ Nhiệt độ nước và pH được đo bằng máy đo pH.
+ Độ mặn (S‰) được đo bằng máy khúc xạ kế cầm tay (Atago, Nhật Bản)
+ DO được đo bằng máy đo ôxy (YSI-58, Mỹ)
- Mẫu nước được thu cách mặt nước 20-30cm bằng bathometer, sau đó
chuyển vào lọ thủy tinh 250 ml đã khử trùng có dán nhãn và bảo quản lạnh trong
hộp xốp ở 4
o
C trước khi mang về phòng thí nghiệm phân tích các thông số môi
trường như COD, BOD
5
, NH

4
+
, NO
2
-
, NO
3
-
và PO
4
3-
).
- Mẫu bùn được lấy bằng thiết bị lấy bùn chuyên dụng hoặc bằng thìa inox đã
khử trùng, một lượng bùn nhất định được cho vào túi nylon (đã được chiếu đèn cực
tím và dán nhãn). Mẫu được bảo quản lạnh trong hộp xốp ở 4
o
C trước khi mang về
phòng thí nghiệm phân tích.
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.3.3.1. Phương pháp phân tích các thông số môi trường
- Xác định NH
4
+
bằng phương pháp Indophenol, so màu trên máy quang phổ
kế ở bước sóng 630 nm.
- Xác định NO
2
-
bằng cách sử dụng thuốc thử diazotizing và so màu trên máy
quang phổ kế ở bước sóng 543nm.

- Xác định NO
3
-
bằng phương pháp khử Cadmium và so màu trên máy quang
phổ kế ở bước sóng 543nm.
- Xác định PO
4
3-
bằng phương pháp axit ascorbic.
- Xác định COD bằng cách sử dụng KMnO
4
trong môi trường kiềm.
- Xác định BOD
5
bằng cách chuẩn độ trực tiếp theo phương pháp Winkler:
sục bão hoà oxi mẫu nước và cho vào 2 lọ thuỷ tinh nút mài. Một lọ đem phân tích
ngay hàm lượng oxi hoà tan, lọ còn lại để trong phòng mát bảo quản ở nhiệt độ ổn
định 20
o
C, sau 5 ngày xác định lượng oxi còn lại trong lọ bằng phương pháp
Winkler.
BOD
5
(mg/l) = DO
đầu
- DO
cuối

3.3.3.2. Phương pháp nuôi cấy và nhận diện vi sinh vật
a. Phân lập vi khuẩn khử đạm

Nhóm vi sinh vật phản nitrat hoá được phân tích bằng phương pháp pha loãng
tới hạn và nuôi cấy trên môi trường phản nitrat lỏng (nitrat-glucoza). Sau 5- 7 ngày
nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả. Những chủng dương tính (có khả năng khử hết
nitrat) với thuốc thử difenylamin hay sinh khí nitơ sẽ được làm thuần trên môi
trường thạch. Định loài bằng phương pháp PCR và đọc trình tự gen 16S rRNA kết
hợp với đặc điểm sinh lý, sinh hoá theo khoá phân loại của Bergey (1989).
b. Nuôi sinh khối vi khuẩn
Cấy chuyển khuẩn lạc đã kiểm tra độ thuần vào ống nghiệm có chứa môi
trường dịch thể phản nitrate và đặt trên máy lắc 5-7 ngày.Các chủng vi khuẩn đã
phân lập, nuôi cấy được cất trữ trong glycerol 15 % (Hallin và Lindgren, 1999)
hoặc glycerol 10% (Sikorski và cộng sự, 2002) cho đến khi lấy ra sử dụng cho các
bước tiếp theo.
3.3.3.3 Phương pháp thử hoạt tính của các chủng vi khuẩn khử nitrate
Tốc độ phản nitrate được xác định bằng phương pháp ức chế acetylene như mô
tả của Sirensen (1978). Khí N
2
O được phân tích bằng máy sắc ký khí. Tốc độ phản
nitrate được tính toán dựa trên sự chênh lệch nồng độ nitrate trước và sau thời gian
nuôi ủ 4h, tại nhiệt độ 20
o
C dưới điều kiện kị khí.
3.4. TỔNG HỢP, XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
- Các số liệu, kết quả nghiên cứu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học.
-Số liệu được nhập, tổng hợp và xử lí bằng phần mềm excel 2010.
DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
4.1. KẾT QUẢ CHÍNH DỰ KIẾN SẼ ĐẠT ĐƯỢC
- Nắm vững được các phương pháp cơ bản trong nghiên cứu vi sinh vật
- Phân lập được một số chủng vi khuẩn phản nitrate có trong các đầm nuôi tôm.
- Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn phản nitrate có hoạt tính cao, từ đó đưa ra
hướng ứng dụng của chúng vào xử lý môi trường ao nuôi thuỷ sản ven biển.

- Luận văn tốt nghiệp
TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN
Tháng
Nội dung
12 1 2 3 4 5
Ngày nhận đề tài tốt
nghiệp
x
Viết đề cương nghiên cứu x x
Đọc tài liệu tham khảo x x x x x x
Chuẩn bị thí nghiệm x x x x
Làm thí nghiệm x x
Thu hoạch thí nghiệm x x x
Phân tích, xử lý số liệu x x x
Viết báo cáo x x x x x x
Nộp báo cáo x
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Lee…. (2002)
Somerville CC, Knight IT, Straube WL, Colwell RR (1989) Simple, rapid method
for direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl Environ
Microbiol 55:548–554
Sirensen J., 1978. Denitrification rates in a marine sediment as measured by the
acetylene inhibition technique. Appl. Environ. Microbiol. 36:139-143
PHỤ LỤC