Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa asparaginase của aspergillus oryzae trong nấm men pichia pastoris

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM 3
1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide 3
1.1.2. Cơ chế tạo acrylamide trong sản xuất bánh nƣớng 4
1.1.3. Hàm lƣợng acrylamide trong một số thực phẩm 5
1.2. ASPARAGINASE 5
1.2.1. Asparaginase 5
1.2.2. Ứng dụng asparaginase để làm giảm acrylamide trong thực phẩm 6
1.2.3. Công nghệ sản xuất asparaginase 8
1.2.3.1. Sản xuất asparaginase từ chủng E. coli tái tổ hợp 8
1.2.3.2. Sản xuất asparaginase từ các chủng đã đƣợc chứng nhận an toàn
(chủng GRAS) tái tổ hợp 10
1.3. HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS 12
1.3.1. Những đặc điểm chung của hệ biểu hiện trong nấm men 12
1.3.2. Những ƣu điểm của hệ biểu hiện nấm men 13
1.3.3. Hệ biểu hiện P. pastoris 14
1.3.3.1. Promoter AOX1 14
1.3.3.2. Chủng biểu hiện 15
1.3.3.3. Vector biểu hiện gen 17
1.3.3.4. Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris 18
1.3.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris 19
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. VẬT LIỆU 21
2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid 21
2.1.2. Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị 21
2.1.3. Dung dịch và môi trƣờng sử dụng 22
2.1.3.1. Môi trƣờng và dung dịch sử dụng để biến nạp DNA plasmid vào tế

bào E. coli DH10b 22
2.1.3.2. Dung dịch đƣợc sử dụng để tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli
22
2.1.3.3. Dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose 23
2.1.3.4. Môi trƣờng biến nạp và biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào nấm men
P. pastoris 23
2.1.3.5. Dung dịch sử dụng trong điện đi SDS-PAGE 23
2.1.3.6. Dung dịch sử dụng trong nhuộm bạc 24
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1. Nghiên cứu phân tích và cải biến trình tự gen bằng các công cụ tin sinh 24
2.2.2. Phƣơng pháp PCR 25
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 26
2.2.4. Quy trình biến nạp sốc nhiệt 27
2.2.5. Quy trình tách DNA plasmid 28
2.2.6. Kiểm tra DNA thu đƣợc bằng enzyme hạn chế 29
2.2.7. Tinh sạch DNA plasmid để gửi đi giải trình tự bằng cột Qiagen 29
2.2.8. Phản ứng nối ghép gen 30
2.2.9. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện 30
2.2.10. Lên men chủng P. Pastoris 31
2.2.11. Điện di SDS – PAGE 31
2.2.12. Thử hoạt tính asparaginase bằng phƣơng pháp điện di không biến tính
và thử hoạt tính bằng đặt gel trên đĩa thạch 32
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN ASPARAGINASE CỦA A. ORYZAE
3.1.1. Lựa chọn vùng gen thích hợp để biểu hiện asparaginase tái tổ hợp 36
3.1.2. Cải biến sơ bộ gen asparaginse 37
3.1.3. Đánh giá các chỉ số phù hợp mã bộ ba của gen asp1 đối với chủng biểu hiện . 41
3.1.4. Thiết kế vùng gen để biểu hiện asp1 trong P. pastoris 42
3.2. NHÂN DÒNG GEN ASP1 43
3.2.1. Kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp bằng các enzyme hạn chế 44

3.2.2 Giải trình tự gen asp1 45
3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN pPIC-ASP1 45
3.3.1 Ghép nối gen asp1 vào vector biểu hiện pPIC9 45
3.3.2. Kiểm tra gen asp1 trong plasmid tái tổ hợp pPIC-asp1 bằng PCR 47
3.3.3. Tách lƣợng lớn vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen asp1 48
3.4. TẠO CHỦNG NẤM MEN P. PASTORIS MANG ASP1 49
3.5. BIỂU HIỆN PROTEIN ASP1 TRONG NẤM MEN P. PASTORIS SMD1168
TRONG BÌNH TAM GIÁC 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ
Hình 1. Sơ đồ minh họa sự hình thành acrylamide trong chế biến thực phẩm 5
Hình 2. Sơ đồ minh họa cơ chế phản ứng của L-asparaginase 7
Hình 3. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 ngoại lai trong nấm men P. pastoris. 18
Hình 4. Sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris tại locus his4 19
Hình 5. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện để biểu hiện gen asp1
trong tế bào nấm men P. pastoris SMD1168 35
Hình 6. Đồ thị dự đoán sự có mặt, vị trí và điểm cắt tín hiệu tiết có trong
asparaginase của A. oryzae. 36
Hình 7. Trình tự đoạn gen asp đƣợc sử dụng để cải biến và biểu hiện trong nấm
men P. pastoris. 37
Hình 8. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp định
biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ mức độ phù hợp của các bộ mã trên asp so
với bộ mã trong chủng biểu hiện P. pastoris (B). 38
Hình 9. Đồ thị so sánh tần suất sử dụng của các codon trong hai chủng A. oryzae
(đỏ) và P. pastoris (đen) 39
Hình 10. So sánh trình tự protein đƣợc dịch mã từ gen asp và asp1 40
Hình 11. So sánh trình tự gen asp1 đã đƣợc cải biến và trình tự gen asp chƣa cải
biến 41
Hình 12. Biểu đồ phân bố tần số sử dụng codon dọc theo chiều dài gen asp1 định

biểu hiện trong P. pastoris (A). Biểu đồ phần trăm phù hợp của các bộ mã của gen
asp1 khi đƣợc biểu hiện trong chủng biểu hiện P. pastoris (B) 41
Hình 13. Trình tự gen asp1 cần đặt có chứa thêm trình tự mã hóa cho vị trí cắt của
tín hiệu tiết trong nấm men (trình tự đƣợc gạch chân), vị trí cắt của enzyme giới hạn
XhoI, NotI (đƣợc tô đậm). 42
Hình 14. Phân tích các dòng plasmid pUC-asp1 trên gel điện di agarose 1%. 44
Hình 15. Phân tích sản phẩm cắt plasmid pUC-asp1 bằng cặp enzyme XhoI và NotI
trên gel agarose 1%. 45
Hình 16. Sơ đồ vector pPIC9 (trái) và ảnh điện (phải) kết quả cắt pPIC9 bằng NotI
(đƣờng chạy 1) và XhoI ( đƣờng chạy 2) 46
Hinh 17. Phân tích gen asp1, pPIC9 sau khi đã đƣợc cắt bằng cặp enzyme
NcoI+XhoI và đƣợc tinh chế trên gel agarose 1%. 47
Hình 18. Ảnh điện di kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen asp1 trong vector
pPIC9 bằng cặp mồi AOX1 48
Hình 19. Phân tích plasmid pPIC-asp1 và sản phẩm cắt kiểm tra pPIC-asp1 bằng
NotI và XhoI trên gel điện di agarose 1%. 49
Hình 20. Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra pPUC-asp1 bằng StuI 50
Hình 21. Sản phẩm biến nạp pPIC-asp1 vào nấm men P. pastoris. 50
Hình 22. Phân tích sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc chủng tái tổ hợp P.
pastoris SMD1168 mang gen asp1 với cặp mồi AOX1. 51
Hình 23. Đƣờng cong sinh trƣởng của 4 chủng P. pastoris tái tổ hợp theo thời gian
53
Hình 24. Phân tích protein ngoại bào từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp ở
các thời điểm khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% 54
Hình 25. A: Gel không biến tính nhuộm Commassie; B: Xác định hoạt tính ASP
trên gel bằng thẩm thấu gel điện di không biến tính xuống đĩa thạch có 1%
asparagine. 55
Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ
hợp. 16
Bảng 2. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp đƣợc giám sát

thông qua OD
600
theo thời gian lên men 52






BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN
AOX
APS
ARN
ASP
Amp
BMGY
BMMY
bp
dNTP
EDTA
ETBr
E. coli
GRAS
kb
kDa
LB
MCS
MD

mARN
P. pastoris
PCR
SDS
TAE
TE

Axit deoxyribonucleic
Alcohol oxidase
Ammonium persulfate
Axit ribonucleic
Asparaginase
Ampicillin
Buffered Minimal Glycerol Yeast
Buffered Minimal Methanol Yeast
Base pair
2’- deoxyribonucleotide 5’ – triphosphate
Ethylene diamine tetra acetic acid
Ethidium bromide
Escherichia coli
Generally Recognized as Safe
Kilobase
Kilo Dalton
Luria-Bertani
Multiple cloning site ( vị trí đa nối)
Minimal Dextrose
Messenger RNA (ARN thông tin)
Pichia pastoris
Polymerase Chain Reaction ( phản ứng chuỗi trùng hợp)
Sodium dodecyl sunfat

Tris-acetate-EDTA
Tris-EDTA

1


MỞ ĐẦU
Hiện nay tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ ngày càng tăng. Một trong các yếu tố
dẫn đến bệnh ung thƣ là do chế độ ăn uống. Những thực phẩm chứa nhiều mỡ, ƣớp
muối, hun khói đƣợc coi là những thực phẩm có thể dẫn đến căn bệnh chết ngƣời
này. Tuy vậy, rất ít ngƣời dân nhận thức đƣợc rằng các thực phẩm tƣởng chừng vô
hại nhƣ các loại bánh nƣớng lại chứa acrylamide, một chất có khả năng gây ung thƣ.
Năm 2002 các nhà khoa học Thụy Điển đã tìm ra chất này trong các sản phẩm thực
phẩm nhƣ khoai tây chiên, bánh mỳ, bánh quy, ngũ cốc [10].
Acrylamide hình thành khi các thực phẩm giàu tinh bột đƣợc chiên rán ở
nhiệt độ trên 120
o
C. Nguyên nhân là do ở nhiệt độ cao, asparagine trong bột làm
bánh phản ứng với đƣờng khử tạo thành hợp chất có màu vàng nâu chứa acrylamide
[29]. Các nhà khoa học trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử dụng
asparaginase để làm giảm lƣợng acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột nhờ việc
loại bỏ asparagine. Enzyme asparaginase sẽ xúc tác thủy phân asparagine thành axit
aspartic và ammonia, không cho asparagine tham gia phản ứng Maillard để hình
thành acrylamide [8].
Trên thế giới hiện nay hãng Novozymes A/S Denmark đã sản xuất và thƣơng
mại hóa thành công asparaginase tái tổ hợp từ chủng nấm sợi A. oryzae ứng dụng
trong công nghiệp thực phẩm với tên thƣơng mại là Acrylaway®L (2007) [24].
Trong dƣợc phẩm asparaginase đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ máu với
tên thƣơng mại Elspar [11]. Hiện nay giá thành asparaginase trên thị trƣờng rất cao
nên việc ứng dụng enzyme để làm giảm acrylamide trong quá trình chế biến các

thực phẩm chiên nƣớng ở Việt Nam còn rất hạn chế. Với mong muốn tạo ra chủng
sản xuất asparaginase tái tổ hợp giống với asparaginase thƣơng mại để sử dụng ở
trong nƣớc, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gen mã
hóa asparaginase của Aspergillus oryzae trong nấm men Pichia pastoris”.
Nấm men P. pastoris là hệ thống biểu hiện protein ngoại lai đƣợc các nhà
khoa học sử dụng rộng rãi bởi những đặc tính ƣu việt đó là chủng an toàn sinh học,
2


là chủng eukaryote đơn giản, có thể thực hiện biến đổi sau dịch mã tốt, có khả năng
sinh trƣởng mạnh tạo lƣợng sinh khối lớn trong quá trình lên men, thao tác dễ dàng
[3,49]. Ngoài ra, hệ thống P. pastoris có thể sản xuất lƣợng lớn protein mục tiêu với
nguồn nguyên liệu methanol rẻ tiền và ít bị tạp nhiễm. Chính vì những ƣu điểm này
mà P. pastoris đƣợc xem là hệ biểu hiện thích hợp nhất đƣợc lựa chọn để biểu hiện
gen mã hóa asparaginase từ nấm sợi A. oryzae. Hiện nay, có rất nhiều công trình
trên thế giới biểu hiện asparaginase từ các nguồn khác nhau để phục vụ chủ yếu cho
mục đích chữa bệnh và làm chất phụ gia. Các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn thƣờng
đƣợc biểu hiện trong E. coli và Bacillus [27, 50, 51, 52] còn các gen có nguồn gốc
từ nấm thƣờng đƣợc biểu hiện ở các chủng nấm tƣơng ứng [36, 53, 54, 55]. Ngoài
ra có hai công trình nghiên cứu biểu hiện asparaginase I và III của nấm men
Saccharomyces cerevisiae trong nấm men P. pastoris [53]. Đây là nghiên cứu đầu
tiên sử dụng chủng nấm men P. pastoris để biểu hiện asparaginase của A. oryzae.
Toàn bộ công việc nghiên cứu đƣợc tiến hành tại phòng Kỹ thuật Di truyền,
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

3


Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM
1.1.1. Khả năng gây bệnh của acrylamide
Các nhà khoa học trên thế giới đã từng cảnh báo ngƣời tiêu dùng về nguy cơ
ung thƣ do ăn khoai tây chiên. Trên thực tế, nhiều loại thực phẩm tƣởng nhƣ vô hại
khác nhƣ cà phê, bánh mì, bánh quy cũng có thể dẫn đến ung thƣ. Nguyên nhân
chính là do các thực phẩm trên có acrylamide. Ngay sau khi ăn, acrylamide trong
thực phẩm sẽ nhanh chóng chuyển đi khắp cơ quan trong cơ thể thông qua hệ tuần
hoàn. Nó đƣợc phát hiện trên gan, tim, não, thận, tuyến ức và thậm chí là cả trong
sữa mẹ. Acrylamide chuyển hoá thành glycidamide ở trong gan thông qua
cytochrome P540. Khi nồng độ của acrylamide và glycidamide tăng cao, chúng có
thể tƣơng tác với các đại phân tử nhƣ DNA, hemoglobin và các enzyme gây đột
biến DNA hoặc làm ảnh hƣởng tới chức năng sinh học của hệ enzyme trong cơ thể
[16].
Những nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh acrylamide có ảnh hƣởng xấu đến
sức khoẻ con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và ảnh hƣởng đến hệ thần kinh [38]. Thông
thƣờng chỉ ở nồng độ cao nó mới ảnh hƣởng đến hệ thần kinh (liều không độc ≤ 0,5
mg/kg trọng lƣợng cơ thể/ngày), tuy nhiên nồng độ này thƣờng khó đạt đƣợc thông
qua ăn uống. Ngƣợc lại, khả năng gây ung thƣ và đột biến gen của acrylamide và
glycidamide đã đƣợc công bố ở nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng nhƣ trên
động vật. Nghiên cứu trong nuôi cấy tế bào cho thấy acrylamide và glycidamide có
thể làm gãy nhiễm sắc thể và gây đột biến điểm dẫn đến sự khác thƣờng trên nhiễm
sắc thể nên phá vỡ quá trình nguyên phân, tạo thể bội không chỉnh. Những nghiên
cứu trên tế bào chuột và ngƣời đƣợc xử lý bằng acrylamide cho thấy, acrylamide

làm tăng tỉ lệ đột biến, đặc biệt là đột biến thay thế các nucleobase nhƣ adenine
bằng guanine và guanine bằng cytosine. Đối với thí nghiệm trên chuột, acrylamide
thúc đẩy quá trình hình thành khối u trên não, phổi, tinh hoàn và tuyến vú. Khi
chuột đƣợc xử lý với liều 2 mg acrylamide trên 1 kg trọng lƣợng cơ thể sẽ làm tăng
4


đáng kể u não, tuyến ức, tử cung và những tế bào khác. Mặc dù vậy, acrylamide
đƣợc sử dụng với liều cao trong các nghiên cứu trên động vật có thể không phản
ánh trung thực những ảnh hƣởng, tác động của acrylamide hấp thu đƣợc trong thức
ăn. Do đó rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ học đã đƣợc thực hiện để đánh giá nguy
cơ gây ung thƣ của acrylamide cho con ngƣời. Mucci và cộng sự (2003) đã chứng
minh rằng acrylamide hầu nhƣ không liên quan tới ung thƣ bóng đái, ruột, thận,
thanh quản, thực quản, vú và buồng trứng [32]. Tuy nhiên, Tô
̉
chức Y tế thế giới
(WHO), Tô
̉
chức Nông lƣơng liên hiệp quốc (FAO), Tổ chức Hóa học Châu Âu và
Tổ chức Nghiên cứu ung thƣ thế giới (IARC) đều coi acrylamide là chất có khả
năng gây ung thƣ cho ngƣời, thuộc nhóm 2A [24]. Vì vậy, nồng độ của acrylamide
trong thực phẩm phải đƣợc kiểm soát ở mức độ cho phép. Vì lý do đó, con đƣờng
hình thành acrylamide cần phải đƣợc xác định để kiểm soát lƣợng acrylamide hấp
thu vào cơ thể. Tổ chức Bảo vệ môi trƣờng Mỹ (EPA) và WHO đã đƣa ra hàm
lƣợng acrylamide tối đa trong đồ uống là 0,5 ppb hoặc 0,05 µg/lít. Hiện nay, số liệu
về lƣợng acrylamide vào cơ thể từ thức ăn và liều gây chết còn hạn chế [9].
1.1.2. Cơ chế tạo acrylamide trong sản xuất bánh nƣớng
Bột mỳ là nguyên liệu chính giàu carbohydrate đƣợc sử dụng trong quá trình
sản xuất các loại bánh nƣớng nhƣ bánh mỳ, bánh bích quy Bột mỳ đƣợc trộn với
nguyên phụ liệu, nhào bột, ép nặn tạo hình, ủ, nƣớng, làm nguội, phân loại và bao

gói. Quá trình nƣớng trải qua ba giai đoạn với nhiệt độ nƣớng là 160
o
C, 190
o
C và
trên 225
o
C từ 10 đến 20 phút tùy theo yêu cầu về màu sắc và độ giòn [24].
Tuy nhiên, nghiên cứu của các nhà khoa học Na Uy , Thụy Sĩ, Anh và Mỹ đã
cho thấy các loại thực phâ
̉
m có nguồn gốc thực vâ
̣
t giàu carbohydrate khi đƣợc chế
biến bằng các phƣơng pháp đòi hỏi nhiê
̣
t đô
̣
cao (>120
o
C) đều sản sinh acrylamide
[16, 30, 41]. Nguyên nhân là trong sản xuất bánh nƣớng, sự tạo thành màu vàng sau
khi nƣớng là do các axit amin phản ứng với đƣờng glucose (phản ứng Maillard) tạo
thành hợp chất có màu vàng nâu. Tuy nhiên, chỉ có asparagine là tiền chất chủ yếu
tạo thành acrylamide. Những loại đƣờng khử tham gia tạo thành acrylamide mạnh
mẽ nhất là glucose, fructose [16, 30]. Hàm lƣợng asparagine tự do trong các loại bột
5


mỳ rất khác nhau, dao động từ 0,14-0,4 g/kg [28].

Hình 1. Sơ đồ minh họa sự hình thành acrylamide trong chế biến thực phẩm [30]
1.1.3. Hàm lƣợng acrylamide trong một số thực phẩm
Sự lo ngại về acrylamide trong thực phâ
̉
m đã thu hút sự quan tâm của các
nhà khoa học trên thế giới. Các nghiên cứu đã đƣa ra số liệu về hàm lƣợng
acrylamide trong một số loại thực phẩm nhƣ sau: khoai tây chiên 600-4300 µg/kg,
bánh bích quy 100-750 µg/kg, bánh mỳ 50-4000 µg/kg, ngũ cốc 50-1350 µg/kg
[30]. Mức độ nhiễm acrylamide trong một số sản phẩm thƣơng mại cũng đã đƣợc
Uỷ ban Châu Âu báo cáo: bánh mỳ gừng lên đến 7834 µg/kg, trung bình là 303
µg/kg, trong bánh bích quy 3324 µg/kg, trung bình là 145 µg/kg và ở bánh mỳ 2838
µg/kg, trung bình là 244 µg/kg [33]. Tuy nhiên, lƣợng acrylamide trong thực phẩm
giàu protein đƣợc chế biến ở nhiê
̣
t đô
̣
cao là thấp , từ 5-50 µg/kg, nhƣng phát hiện
với liều cao ở thực phẩm giàu carbohydrate, trung bình 150-4000 µg/kg và không
phát hiện thấy ở thực phẩm không nƣớng và thực phẩm luộc [16].
1.2. ASPARAGINASE
1.2.1. Asparaginase
Asparaginase (L-asparagine amidohydrolase) là enzym thủy phân L-
asparagine thành axit aspartic và ammonia. Asparaginase có mặt trong giới thực vật,
động vật và vi sinh vật. Ở thực vật, phần lớn các nghiên cứu về asparaginase từ cây
đậu. Ở động vật, enzyme này đƣợc tìm thấy trong gan gà. Việc sản xuất
asparaginase bằng vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu từ năm 1972 [18] . Asparaginase
đƣợc sinh ra từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau [33] nhƣ Escherichia coli,
Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Aerobacter aerogens, Aeromonas
6

hydrophila, Erwinia amylovora, Xanthomonas campestris, Bacillus subtilis,
Streptomyces griseus, Corynebacterium glutamicum [22, 33, 34]. Nấm mốc và nấm
men cũng có khả năng sinh asparaginase nhƣ Aspergillus niger, A. oryzae, A.
tamarri, A. terreus, Penicillium granulatum, P. digitatum, Fusarium solani, F.
oxysporum, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae [22, 33, 34] .
Asparaginase có thể đƣợc tổng hợp nội bào hoặc ngoại bào, hầu hết các chủng
sản sinh asparaginase ngoại bào thuộc nấm sợi. Asparaginase sinh ra từ vi sinh vật
khác nhau có khối lƣợng phân tử khác nhau: từ 40 đến gần 200 kDa. Tính chịu nhiệt
của các asparaginase khác nhau thƣờng khác nhau. Asparaginase của một số vi
khuẩn nhƣ là P. aeruginosa 50071, P. stutzeri MB-405, Erwinia carotovoca và
Staphylococcus hoạt động tối ƣu ở 37
o
C, trong khi asparaginase của
Chrombacteriaceae có nhiệt độ tối ƣu chỉ là 20
o
C [20] . Asparaginase từ A. oryzae
hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 đến 70
o
C, đạt cực đại ở 60
o
C. Tính bền
của asparaginase từ A. oryzae đạt đƣợc 2 giờ ở 37
o
C, pH 4-8, hầu nhƣ không bị bất
hoạt ở nồng độ muối cao [24]. Asparaginase từ A. niger có hoạt tính trong dải nhiệt
độ từ 20-65
o
C, nhiệt độ tối ƣu khoảng 50

o
C và bị bất hoạt rất nhanh khi nhiệt độ
trên 70
o
C [42].
1.2.2. Ứng dụng asparaginase để làm giảm acrylamide trong thực phẩm
Asparaginase thƣờng đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm hoặc dƣợc
phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm, asparaginase đƣợc sử dụng nhƣ là chất phụ
gia với tên thƣơng mại nhƣ Acrylaway®L và PreventASe. Trong dƣợc phẩm,
asparaginase đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ máu với tên thƣơng mại
Elspar, Oncaspar, Erwinase và Kidrolase [37].
Trong công nghiệp thực phẩm, để giảm lƣợng acrylamide trong sản xuất bánh
nƣớng, asparaginase đƣợc bổ sung trƣớc khi nƣớng để chuyển hóa asparagine thành
axit aspartic và ammonia (Hình 2), do vậy asparagine không tham gia vào phản ứng
Maillard nên sự hình thành acrylamide giảm đáng kể [24, 28].

7



Hình 2. Sơ đồ minh họa cơ chế phản ứng của L-asparaginase [28]
Đối với mỗi loại thực phẩm, lƣợng enzyme đƣợc bổ sung, thời gian ủ, pH,
nhiệt độ, độ ẩm đều ảnh hƣởng đến khả năng loại acrylamide trong thành phẩm
[24].
Công ty DSM đã khuyến cáo lƣợng enzym cần sử dụng phụ thuộc vào chất
lƣợng của từng loại nguyên liệu, hàm lƣợng asparagine, thời gian và nhiệt độ áp
dụng trong quá trình làm bánh. Đối với bánh làm từ bột mỳ thì cần sử dụng
asparaginase với liều 77-385 IU/kg, còn bánh làm từ các bột của hạt ngũ cốc nhƣ
bột ngô thì cần liều dùng 20-850 IU/kg và từ bột khoai tây thì liều dùng cần là 500-
1500 IU/kg. Khi bổ sung asparaginase vào bột mỳ ƣớt đã cho thấy hàm lƣợng

acrylamide trong vỏ bánh mỳ giảm từ 36% đến 75%. Ngoài ra sự hình thành
acrylamide từ các sản phẩm bánh quy, bánh nƣớng, bánh đậu phộng đã giảm tới
trên 80% sau khi bổ sung asparaginase vào bột nguyên liệu trƣớc khi nƣớng bánh.
Hơn thế nữa, các sản phẩm từ bột khoai tây đã đƣợc phát hiện có hàm lƣợng
acrylamide rất cao, lên tới 2500 ppb, nhƣng sau khi bổ sung asparaginase vào bột
khoai tây ƣớt đã làm giảm trên 80% lƣợng L-asparagine tự do. Sau quá trình nƣớng,
asparaginase bị mất hoàn toàn hoạt tính, dƣ lƣợng chất rắn hữu cơ trong sản phẩm
thực phẩm sau cùng là từ 2-13 mg/kg (0,0002-0,0013%) đối với bánh mỳ; 0,2-30
mg/kg (0,00002-0,0030%) đối với các sản phẩm bánh có nguồn gốc từ ngũ cốc; 4-
562 mg/kg (0,0004-0,0562%) đối với các sản phẩm từ khoai tây và 3-5 mg/kg
(0,0003-0,0005%) đối với các sản phẩm gia vị. Asparaginase có mặt trong thực
8


phẩm ở hàm lƣợng thấp đƣợc xem nhƣ là các protein không hoạt động và không
gây hại cho ngƣời sử dụng [42].
1.2.3. Công nghệ sản xuất asparaginase
Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp asparaginase kể trên thì E.
coli, Ewinia carotovora, Serratia marcescens, S. cerevisiae, A. oryzae và A. niger đã
đƣợc sử dụng để sản xuất asparaginase ở quy mô công nghiệp ứng dụng vào trong y
tế và thực phẩm [20, 33]. Rất nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hƣởng của thành phần
môi trƣờng, pH và nhiệt độ lên men nhằm thu đƣợc lƣợng asparaginase tối đa.
Baskar và Renganathan (2011) cho rằng ammonium chloride là nguồn nitơ tốt nhất
đối với Aspergillus terreus MTCC1782, trong khi đó Sarquis và cộng sự (2004) lại
cho rằng môi trƣờng bổ sung 2% proline phù hợp với A. terreus IOC 217 và A.
tamari IOC 186 [36]. Nhƣng đối với chủng E. coli thì nguồn cazein thủy phân 0,2%
hoặc cao men 0,1% hoặc tryptone 1% đƣợc sử dụng nhƣ là nguồn nitơ thích hợp
nhất cho sản lƣợng asparaginase cao.
Hầu hết các chủng tự nhiên này thƣờng chỉ sản xuất asparaginase ở một lƣợng
rất thấp nhƣ E. coli 0-225 U/g (đơn vị/g tế bào khô), E. carotovora 40-450 U/g, S.

marcescens 100-335 U/g [22, 33], S. cerevisiae 100-180 U/g, Aspergillus terreus 58
U/l (đơn vị/lít dịch lên men), A. tamari 38 U/l, A. oryzae 140 U/l, A. niger 70 U/l
[48]. Trƣờng hợp hiếm, Rani và cộng sự (2012) đã phân lập đƣợc chủng Aspergillus
sp KUFS20 có khả năng tổng hợp asparaginase lên đến 3800 U/l [37].
Việc sản xuất asparaginase bằng công nghệ DNA tái tổ hợp là con đƣờng có
triển vọng nhất để thu đƣợc chế phẩm enzyme đạt sản lƣợng cao, giá thành rẻ, có
khả năng ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và dƣợc phẩm.
1.2.3.1. Sản xuất asparaginase từ chủng E. coli tái tổ hợp
Vi khuẩn E. coli có khả năng sản xuất hai loại asparaginase khác nhau về tính
chất, nhất là khả năng ái lực của chúng với asparagine [12]. Asparaginase II, khác
với asparaginase I, có ái lực cao hơn với asparagine và có hoạt tính chống lại sự
hình thành khối u, đƣợc tìm thấy ở khoang chu chất. Do đó một loạt các nghiên cứu
9


về tính chất, biểu hiện và sản xuất asparaginase II từ E. coli đƣợc triển khai. L-
asparaginase II của E. coli đƣợc cấu tạo từ 4 tiểu đơn vị giống nhau và có khối
lƣợng phân tử là 141 kDa. Mỗi tiểu đơn vị gồm 326 gốc axit amin và cứ 2 tiểu đơn
vị hợp lại thành một dimer có chứa đầy đủ các đơn vị cấu trúc và các nhóm chức
năng cho một enzym hoạt động. Tuy nhiên, dạng hoạt động của enzyme này luôn
tồn tại ở dạng tetramer [39]. Enzyme đạt hoạt tính tối đa ở pH 6-7 tại 40
o
C. Vì
enzym từ E. coli có dải pH tối ƣu rộng và có ái lực lớn với cơ chất nên thuận tiện
hơn trong ứng dụng thực tiễn. Do đó, hiện nay ngƣời ta vẫn tập trung vào nghiên
cứu asparaginase II từ E. coli. Harms cùng cộng sự (1991) đã thiết kế thành công hệ
biểu hiện cho L-asparaginase II từ E. coli. Enzym đƣợc tiết vào khoang chu chất và
đƣợc thu nhận với hàm lƣợng là 10-15 mg/l [23]. Nhƣợc điểm của hệ biểu hiện này
là hiệu suất thu hồi enzyme không cao, hoạt tính enzyme thấp và quy trình tinh sạch
phức tạp (phá tế bào, loại bỏ endotoxin) [14]. Để khắc phục nhƣợc điểm này,

Khushoo và cộng sự (2005) đã tạo đƣợc chủng E. coli tái tổ hợp tiết E. coli L-
asparaginase II ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy nên enzyme ít bị protease phân hủy
hơn, thƣờng ở dạng hòa tan và hoạt động, nhờ thế mà hiệu suất thu hồi enzyme tăng
lên đáng kể, đạt 86% và sản lƣợng enzym thu đƣợc tăng gấp 8 lần, ứng với 95 mg/l,
hoạt tính enzyme đạt đƣợc 20950 IU/l. Tiếp đến, nhiều tổ hợp chủng vector biểu
hiện đƣợc thử nghiệm nhằm tìm ra chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện tốt nhất E. coli
Lasparaginase II ra ngoài môi trƣờng. E. coli asparaginase biểu hiện khi lên men ở
quy mô lớn hơn đạt đƣợc sản lƣợng rất cao, tới 5,24 g/l với hoạt tính enzyme là
870000 IU/l, ứng với 80% hoạt tính của asparaginase tự nhiên [27].
E. coli là cơ thể vật chủ đƣợc sử dụng thƣờng xuyên cho biểu hiện protein tái
tổ hợp do chúng dễ nuôi cấy, phân chia tế bào nhanh và chấp nhận nhiều loại
vector. Tuy nhiên asparaginase đƣợc sản xuất từ vi khuẩn thƣờng gây ra những tác
dụng phụ khi thử nghiệm ở ngƣời cũng nhƣ ứng dụng vào trong công nghệ thực
phẩm và dƣợc phẩm, nhƣ gây ra các phản ứng dị ứng và sốc phản vệ. Asparaginase
tổng hợp từ E. coli đã đƣợc thử trên một loạt các động vật thí nghiệm (thỏ, chuột,
chó) và gây ra những ảnh hƣởng bất lợi cho động vật nhƣ giảm cân nặng, giảm khả
10


năng tiêu thụ thức ăn, dị ứng [42]. Do đó, các nhà khoa học đã tiến hành tìm những
nguồn sản xuất asparaginase mới an toàn hơn.
1.2.3.2. Sản xuất asparaginase từ các chủng đã đƣợc chứng nhận an toàn
(chủng GRAS) tái tổ hợp
Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris và Aspergilus spp là những chủng
đã đƣợc chứng nhận là an toàn đƣợc dùng để sản xuất nhiều loại protein dùng trong
y tế. Cũng giống nhƣ E. coli, S. cerevisiae cũng tổng hợp hai loại asparaginase khác
nhau: asparaginase I đƣợc tổng hợp thƣờng xuyên trong tế bào và đƣợc mã hóa bởi
gen ASP I, còn asparaginase II thì đƣợc tổng hợp ở một lƣợng rất ít dƣới sự điều
hòa của nguồn nitơ và đƣợc tiết ra ngoài tế bào. Asparaginas II từ S. cerevisiae
đƣợc mã hóa bởi gen ASP3 và đạt hoạt tính cao nhất ở pH 6,8 và nhiệt độ 65

o
C [19,
26]. Do asparaginase II đƣợc tổng hợp trong S. cerevisiae rất ít, 100-180 U/g, ngay
cả khi đƣợc tổng hợp từ các chủng đột biến bị làm yếu đi nhu cầu nitơ, nên việc
biểu hiện gen asparaginase II tái tổ hợp của S. cerevisiae trong một hệ biểu hiện
sinh vật nhân chuẩn khác có thể coi là một giải pháp hứa hẹn nhằm làm tăng mức
độ biểu hiện của enzym.
P. pastoris là cơ thể chủ đƣợc sử dụng rất thành công để biểu hiện nhiều loại
protein tái tổ hợp với năng suất cao nhờ có promoter AOX1 rất mạnh đƣợc cảm ứng
bởi methanol. Ferrara cùng cộng sự lần đầu tiên đã thu đƣợc S. cerevisiae
asparaginase II tái tổ hợp đƣợc biểu hiện trong nấm men P. pastoris với hoạt tính là
800 U/g, cao gấp bảy lần so với chủng đột biến. Tuy nhiên asparaginase tái tổ hợp
không đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng dù trình tự tiết đã đƣợc gắn trong vectơ biểu
hiện. Có thể lý giải là do một tiểu phần nào đó của enzym này đã liên kết với thành
tế bào của cơ thể chủ, do đó đã ngăn cản sự tiết enzym này ra ngoại bào. Ngoài ra,
promoter AOX1 của P. pastoris đƣợc lấy từ gen mã hóa cho alcohol oxidase -
enzym xúc tác cho quá trình oxy hóa methanol để tạo thành formaldehyde. Do vậy,
trong quá trình tổng hợp protein tái tổ hợp, việc cảm ứng methanol sẽ dẫn tới hình
thành sản phẩm phụ là formaldehyde - một chất gây độc cho con ngƣời. Do đó, để
ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, formaldehyde cần phải đƣợc loại bỏ khỏi
11


asparaginase tái tổ hợp. Điều này sẽ khiến cho quy trình sản xuất công nghiệp của
asparaginase trong P. pastoris phức tạp hơn, đồng nghĩa với giá thành chế phẩm
enzym cũng nhƣ của sản phẩm cuối (thực phẩm chứa nhiều tinh bột) sẽ tăng cao
[31].
Ngoài hệ biểu hiện protein tái tổ hợp P. pastoris thì S. cerevisiae cũng đƣợc sử
dụng rất rộng rãi để biệu hiện nhiều loại chế phẩm sinh học trong các ngành công
nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm và y học. S. cerevisiae là an toàn sinh

học và có khả năng sinh tổng hợp hàm lƣợng protein, vitamin rất lớn, có giá trị dinh
dƣỡng cao nên thƣờng đƣợc bổ sung trực tiếp vào thức ăn cho ngƣời và động vật.
Tuy nhiên, protein ngoại lai đƣợc tiết từ S. cerevisiae thƣờng thấp, chỉ đạt 0,1- 5
mg/l. Có thể đây cũng là lý do cho tới thời điểm này vẫn chƣa có một công bố
nghiên cứu nào về việc biểu hiện asparaginase tái tổ hợp trong S. cerevisiae.
Hãng Novozymes A/S Denmark và DSM đã sản xuất và thƣơng mại hóa thành
công asparaginase tái tổ hợp từ các chủng nấm sợi biến đổi gen tƣơng ứng A. oryzae
và A. Niger để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhằm làm giảm sự hình
thành acrylamide trong thực phẩm. Tên thƣơng mại của sản phẩm asparaginase từ
A. oryzae là Acrylaway®L, còn asparaginase từ A. niger là PreventASe
TM
M,
PreventASe
TM
W (dạng bột) và PreventASe
TM
L (dạng lỏng). Asparaginase từ A.
oryzae có hoạt tính trong dải pH từ 2-11, đạt cực đại ở pH 6-7; bền ở pH 4-8; hoạt
động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 đến 70
o
C, đạt cực đại ở 60
o
C. Tính bền của A.
oryzae asparaginase đạt đƣợc 2 giờ ở 37
o
C, pH 4-8, không bị bất hoạt ở nồng độ
muối cao [24]. Novozymes A/S đã thiết kế thành công vector biểu hiện
asparaginase từ A. oryzae trong chủng biến đổi gen A. oryzae. Asparaginase tái tổ
hợp đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng ở quy mô nhỏ với hoạt tính enzym là 14280 IU/g,
còn ở quy mô công nghiệp là 3500 IU/g. Asparaginase từ A. niger có hoạt tính trong

dải pH từ 2-9, tối ƣu ở pH 4-5 và trong dải nhiệt độ từ 20-65
o
C với nhiệt độ tối ƣu
khoảng 50
0
C và bị bất hoạt rất nhanh khi nhiệt độ trên 70
o
C. Chế phẩm enzym dạng
lỏng có màu nâu, trong suốt, hoạt tính enzyme đạt từ 2375-2625 IU/ml, pH: 4,3-4,7.
Chế phẩm bột có dạng hạt nhỏ, màu trắng, hoạt tính enzyme đạt từ 9500-10500 đơn
12


vị/g, cỡ hạt là: 63<90%<224 µm. Chế phẩm enzyme này đạt các chỉ tiêu về kim loại
nặng và vi sinh vật theo quy định đối với chế phẩm enzyme sử dụng trong chế biến
thực phẩm của Hội đồng chuyên gia quốc tế về chất phụ gia thực phẩm (JECFA),
FAO/WHO năm 2006 [42].
1.3. HỆ BIỂU HIỆN TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS
1.3.1. Những đặc điểm chung của hệ biểu hiện trong nấm men
Nấm men là một cơ thể vi sinh vật nhân chuẩn đơn giản, nhƣng chúng mang
đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào.
Chính vì sự đơn giản trong cấu trúc mà nấm men đƣợc nghiên cứu rất kỹ về mặt di
truyền. Tế bào nấm men có dạng hình elip hoặc hình tròn, một số loài có dạng phân
nhánh. Nấm men có thể tồn tại ở trạng thái đơn bội hoặc lƣỡng bội. Tế bào đơn bội
có kích thƣớc khoảng 4µm, còn tế bào lƣỡng bội có kích thƣớc khoảng 6 µm. Nấm
men có hai giới tính là a và α. Các tế bào đơn bội sinh sản qua nguyên phân bằng
cách nảy chồi. Khi hai nòi đơn bội kết hợp với nhau tạo thành nòi lƣỡng bội mang
giới tính a/α trên môi trƣờng nghèo nitơ thì các tế bào bắt đầu giảm phân tạo thành
4 bào tử sinh dƣỡng, hai bào tử có giới tính a, hai bào tử có giới tính α [1].
Có 4 loại promoter mạnh đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi để tổng

hợp protein ngoại lai trong nấm men đó là [35]: Promoter hệ đƣờng phân, ví dụ nhƣ
promoter của gen mã hóa cho alcohol dehydrogenase I (ADHI); Promoter điều hòa
quá trình trao đổi chất galactose, đây là một promoter đƣợc điều khiển chặt chẽ có
liên quan đến chuyển hóa galactose; Promoter điều hòa quá trình hoạt động của nhóm
photphat nhƣ promoter POH5; Promoter bị ức chế bởi glucose, ví dụ nhƣ ADH2.
Vector biểu hiện trong nấm men gồm có hai nhóm: Nhóm không có khả
năng tự sao chép trong tế bào (YIp- Yeast integrating plasmid) là nhóm plasmid
tích hợp bằng cách trao đổi chéo vào gen của nấm men ở những vùng tƣơng đồng
và nhóm có khả năng tự sao chép trong tế bào. Nhóm có khả năng tự sao chép trong
tế bào đƣợc chia thành ba nhóm nhỏ: Nhóm plasmid episom YEp (YEp- Yeast
13


episomal plasmid), nhóm plasmid tái bản YRp (YRp- Yeast replicating plasmid) và
nhóm plasmid chứa tâm động YCp (YCp- Yeast centromere plasmid) [36].
Tất cả các plasmid này chỉ có khả năng mang các đoạn gen ngoại lai có kích
thƣớc tối đa là 20 kb. Hầu hết các plasmid tự sao chép đều là dạng plasmid con thoi,
chúng có trình tự mang các dấu chuẩn chọn lọc để phù hợp cho sinh trƣởng và chọn
lọc trong cả tế bào E. coli và nấm men. Thông thƣờng các vector nấm men đều chứa
tâm sao chép của E. coli là vùng Ori, vùng này có tác dụng làm tăng số bản sao
trong E. coli và đồng thời chứa các dấu chuẩn chọn lọc trong E. coli nhƣ chứa gen
kháng kháng sinh: Gen kháng Ampicillin kí hiệu là amp (Amp
R
), gen kháng
tetracycline kí hiệu tet (Tet
R
). Các vector nấm men thƣờng chứa các gen URA3, HIS
3, LEU 2, TRP 1, LYS 2. Đây chính là các dấu chuẩn chọn lọc trong các dòng nấm
men tái tổ hợp, chúng có khả năng bổ sung cho những đột biến khuyết dƣỡng tƣơng
ứng [35].

1.3.2. Những ƣu điểm của hệ biểu hiện nấm men
Nấm men có những thuận lợi trong biểu hiện các gen ngoại lai có nguồn gốc
từ sinh vật nhân chuẩn. Do có các đặc điểm sau đây:
- Nấm men là một sinh vật nhân thực, nên môi trƣờng bên trong tế bào thích
hợp cho việc hình thành các cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc tự nhiên của protein
ngoại lai. Đây là một vấn đề rất thuận lợi cho việc biểu hiện các gen có nguồn gốc
từ các tế bào nhân thực. Trong cấu trúc của DNA còn chứa những đoạn trình tự
không mã hóa cho axit amin. Những đoạn trình tự này phải đƣợc loại đi để tạo
thành phân tử mARN chính trƣớc khi chúng đƣợc dịch mã sang protein. Chính điều
này đảm bảo cho protein có đƣợc trình tự cũng nhƣ cấu trúc không gian tƣơng tự
nhƣ protein tự nhiên [1].
- Nấm men có khả năng glycosyl hóa, đảm bảo cho protein có khả năng tan
và đảm bảo cấu trúc toàn vẹn để thực hiện chức năng sinh học của chúng [45].
14


- Nấm men có khả năng tiết protein ngoại lai ra môi trƣờng rất hiệu quả. Một
mặt có thể sử dụng các trình tự tín hiệu tiết của bản thân gen đƣa vào trong cơ thể
vật chủ, hoặc cũng có thê sử dụng trình tự tín hiệu tiết của tế bào nấm men. Hệ
vector thiết kế dùng trong việc biểu hiện protein ngoại lai ở nấm men ngày càng
đƣợc cải biến theo hƣớng tăng cƣờng các trình tự tín hiệu tiết [46].
1.3.3. Hệ biểu hiện P. pastoris
P. pastoris là nấm men đƣợc Koichi Ogata phát hiện vào năm 1969, có khả
năng sử dụng methanol làm nguồn cacrbon và nguồn năng lƣợng. Trong những năm
1970, P. pastoris đƣợc ứng dụng để sản xuất protein đơn bào. Đến những năm
1980, cùng với sự phân lập thành công gen aox, P. pastoris trở thành vật chủ nhân
chuẩn để biểu hiện gen ngoại lai hiệu quả [13]. Ƣu điểm lớn nhất của việc biểu hiện
protein ngoại lai trong P. pastoris là vật chủ này có khả năng tiết protein ngoại lai
ra môi trƣờng và tiết chủ yếu protein đích, còn các protein của tế bào chỉ đƣợc tiết
ra ở mức độ rất thấp. Hơn nữa, khi nuôi Pichia trong môi trƣờng tối thiểu thì lƣợng

protein tiết ra rất thấp, có nghĩa là trong số protein đƣợc vật chủ tiết ra môi trƣờng
ngoại bào thì chủ yếu là protein ngoại lai [43]. Điều này rất thuận lợi cho quá trình
thu hồi sản phẩm mà không cần quá trình tách protein ngoại lai khỏi tế bào.
1.3.3.1. Promoter AOX1
Việc biểu hiện các gen ngoại lai trong P. pastoris đƣợc điều khiển hiệu quả
và chặt chẽ bởi promoter AOX1. Promoter này đƣợc kiểm soát ở mức độ cao trong
tế bào sinh trƣởng trên môi trƣờng glucose, glycerol và một số nguồn carbon khác,
nhƣng đƣợc cảm ứng mạnh mẽ bởi methanol [13]. Bƣớc đầu tiên trong quá trình
trao đổi methanol ở P. pastoris là sự oxy hóa methanol nhờ alcohol oxidase (AOX),
sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử và tạo thành hydrogenperoxid (H
2
O
2
) và
formaldehyde. Để tránh độc tố của H
2
O
2
, sự trao đổi methanol diễn ra bên trong
một bào quan chuyên biệt của tế bào là peroxisome, do đó peroxisome cô lập sản
phẩm độc khỏi phần khác của tế bào [44].
15


Hệ gen của P. pastoris chứa 2 gen alcohol oxidase là aox1 vào
aox2. Các vùng mã hóa protein của 2 gen này chiếm 92% gen và chúng tƣơng đồng
nhau đến 97% nucleotide. Tuy nhiên, gen aox1 chịu trách nhiệm chủ yếu về hoạt
tính AOX trong tế bào (gần 85%) [40]. Sự biểu hiện AOX1 đƣợc điều hòa chặt chẽ
ở mức độ dịch mã và đƣợc kiểm soát bởi cả cơ chế tiêu cực/tích cực và cảm ứng.
Enzyme AOX1 có ái lực thấp với oxy, nhƣng bù vào đó là promoter AOX1 vận

hành gen aox1 biểu hiện và tạo ra một lƣợng lớn enzyme AOX1 [23]. Thực tế,
enzyme AOX có thể chiếm đến 30% protein tổng số của tế bào khi sinh trƣởng trên
môi trƣờng có methanol [21]. Promoter AOX1 là promoter mạnh, vì vậy có thể đƣợc
sử dụng để kiểm soát sự biểu hiện của các protein tái tổ hợp ở mức độ cao [17] .
Hơn nữa, promoter này có thể tự ngừng hoạt động khi nguồn carbon không bị giới
hạn nhƣ glycerol và glucose ức chế promoter ở mức độ sau dịch mã và giảm đến
mức tối thiểu khả năng biểu hiện của các đột biến trong quá trình tạo sinh khối [13].
1.3.3.2. Chủng biểu hiện
Phần lớn các chủng P. pastoris đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp
đều bị gây đột biến gen his4 và đều có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430
(Northern Regional Research Laboratories, Peoria, IL). Những chủng này không có
khả năng tổng hợp histidinol dehydrogenase. Chúng sinh trƣởng đƣợc trên môi
trƣờng giàu chất dinh dƣỡng, nhƣng trong môi trƣờng cơ bản cần bổ sung thêm
histidine. Do vậy, gen his4 của P. pastoris đƣợc xem là một chỉ thị nhận biết chủng
chứa vector biểu hiện sau biến nạp do vector biểu hiện chứa gen his4 bình thƣờng.
Xét về khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng methanol thì các chủng P.
pastoris có 3 kiểu hình là Mut
+
, Mut
s
, Mut
-
[13]. Chủng có cả 2 gen aox1 và aox2 có
khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng methanol mạnh nhƣ chủng dại có kiểu hình
Mut
+
, ví dụ chủng GS115 (his4 – không có hoạt tính histidinol dehydrogenase).
Chủng bị loại bỏ phần lớn gen aox1 sinh trƣởng chậm trên môi trƣờng methanol có
kiểu hình Mut
s

(Methanol utilization slow), ví dụ chủng KM71 (his4 aox1
∆::ARG4). Chủng bị loại bỏ hoàn toàn cả 2 gen aox1 và aox2 không có khả năng
sinh trƣởng trên môi trƣờng methanol có kiểu hình là Mut
-
, ví dụ chủng MC 100-3
16


(his4 arg4 aox1 ∆::ARG4 aopx2∆::Phis4). Tất cả các chủng này vẫn có khả năng
biểu hiện protein tái tổ hợp tốt nhờ có promoter AOX1. Tuy nhiên, các chủng Mut
-

rất mẫn cảm với nồng độ methanol dƣ thừa cao. Do vậy, sự thay đổi đột ngột các
mức độ methanol dƣ thừa thƣờng dẫn đến mất hoạt tính AOX và thậm chí tế bào có
thể chết. Để khắc phục nhƣợc điểm này, các chủng Mut
-
có thể đƣợc nuôi cấy theo
mẻ (fed-batch), hoặc sử dụng chủng Mut
s
không mẫn cảm với nồng độ methanol dƣ
thừa cao bởi vì tốc độ tiêu thụ methanol của chúng thấp. Ngoài ra, nồng độ các chất
khác của tế bào nhƣ proteinase cũng sẽ tăng theo mật độ tế bào. Điều này đặc biệt
ảnh hƣởng đến các protein tiết trong nuôi cấy tế bào mật độ cao, bởi vì sự phân hủy
tế bào sẽ giải phóng proteinase vào môi trƣờng nuôi cấy dẫn đến các protein tiết sẽ
bị phân hủy nhanh chóng. Do vậy, sử dụng chủng biểu hiện bị loại bỏ bớt gen mã
hóa các proteinase sẽ giảm sự phân hủy protein tiết. Chủng SMD1163 (his4 pep4
prb4),SMD1165 (his4 prb1) và chủng SMD1168 (his4 pep4) là các chủng khuyết
proteinase có thể đƣợc sử dụng để biểu hiện một số loại protein tiết nhất định
(Bảng1) [14].
Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ

hợp.
Chủng
Kiểu gen
Y-11430
Dại
GS115
His4
GS190
Arg4
GS200
His4 arg4
SMD1168
∆pep4::URA his4 ura3
SMD1165
His4 prb1
SMD1163
Pep4 his4 prb1

Chú thích: Gen pep mã hóa proteinase A trong không bào. Protein này cần thiết cho
sự hoạt hóa các proteinase không bào khác nhƣ carboxypeptidase Y và proteinase
17


B. Đột biến gen pep4 sẽ làm giảm hoạt tính của proteinase A và carboxypeptidase Y
và giảm mạnh hoạt tính của proteinase B. Gen prb1 mã hóa proteinase B. Đột biến
gen prb1 thì chỉ hoạt tính proteinase B bị giảm. Ngƣợc lại, nếu đột biến 2 gen pep4
prb1 thì cả 3 protease sẽ giảm hoạt tính [25].
1.3.3.3. Vector biểu hiện gen
Nhiều vector biểu hiện dành cho P. pastoris đã đƣợc thiết kế và đều có 5 yếu
tố sau [25, 43]: (1) Promoter AOX1 (5’AOX1) là một đoạn trình tự có chiều dài gần

1 kb, cho phép protein đƣợc biểu hiện mạnh trong Pichia và định hƣớng plasmid
tích hợp với hệ gen nấm men tại locus AOX1. Ngoài ra còn có trình tự nằm sau trình
tự kết thúc phiên mã ở đầu 3’ của gen aox1 cũng có tác dụng định hƣớng plasmid
tích hợp với hệ gen nấm men tại vị trí locus aox1.
(2) Một hoặc nhiều vị trí đa nối (MCS) cho phép chèn gen mong muốn vào
vector biểu hiện.
(3) Trình tự kết thúc dịch mã có nguồn gốc từ gen aox1 của P. pastoris (TT)
là trình tự dài khoảng 260 bp, cho phép kết thúc quá trình dịch mã và sự thêm đuôi
poly A ở mARN hiệu quả.
(4) Gen chỉ thị chọn lọc (his4) là một gen nguyên vẹn của Pichia mã hóa cho
histidinol dehydrogenase, dài khoảng 2,4 kb và đƣợc sử dụng để bổ sung cho các
chủng Pichia bị đột biến gen HIS4.
(5) Một trình tự cần thiết cho sự sao chép và tồn tại của plasmid trong vi
khuẩn (Ampicillin và ColE1 origin). Amp là gen kháng ampicillin cho phép chọn
lọc tế bào mang vector tái tổ hợp. ColE1 cho phép plasmid tái tổ hợp sao chép và
tồn tại trong tế bào vi khuẩn.
Ngoài ra, vector biểu hiện còn có trình tự chuyên biệt kích thích tiết protein
tái tổ hợp ra môi trƣờng nuôi cấy nhƣ trình tự PHO1 của gen mã hóa cho
phosphatase trong P. pastoris hoặc trình tự của gen mã hóa cho nhân tố giới tính α
(α factor prepro peptide) của S. cerevisiae đã đƣợc sử dụng thành công [15].
Để sử dụng promoter P
AOX1
cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp, có 4 vector
biểu hiện phổ biến là pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-S1 và pPIC9. Vector pHIL-D2 và
18


pPIC3.5 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein nội bào, còn pHIL-S1 và pPIC9 đƣợc sử
dụng để biểu hiện protein tiết. Trong đó, vector pPIC9 đƣợc sử dụng rộng rãi để
biểu hiện các protein.

1.3.3.4. Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris
Cách đơn giản nhất để vector biểu hiện đƣợc tích hợp vào hệ gen P. pastoris
là mở vòng vector biểu hiện bằng enzyme hạn chế ở một vị trí đã đƣợc thiết kế sẵn
trên gen đánh dấu his4 hoặc trên đoạn promoter AOX1. Khi vector mở vòng sẽ tạo
thành các đầu DNA và chính các đầu tận cùng DNA này sẽ kích thích sự tái tổ hợp
tƣơng đồng dẫn đến sự trao đổi chéo đơn và tích hợp vector vào locus tƣơng đồng
[13].
Hình 4 cho thấy sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris. Việc
tích hợp đƣợc thực hiện bằng sự trao đổi chéo đơn giữa gen his4 trên vector và
locus HIS4 của hệ gen P. pastoris nhờ sự mở vòng vector biểu hiện bằng enzyme
hạn chế (SalI hoặc StuI) cắt trình tự tƣơng ứng đã đƣợc thiết kế nằm trên gen his4.
Kết quả là promoter P
AOX1
và gen mong muốn đƣợc tích hợp vào hệ gen của P.
pastoris tại locus HIS4. Lúc này thể biến nạp có hiểu hình His
+
. Vì locus aox1 hoặc

Đầu 5’ promoter AOX1: nucleotide base 1-948
Vị trí mồi 5’ AOX1: nucleotide 855-875
Tín hiệu tiết (nhân tố α) (S): nucleotide 949-1218
Vị trí mồi α: nucleotide 1152-1172
Vùng đa nối: nucleotide 1192-1241
Vị trí mồi đầu 3’ AOX1: nucleotide 1327-1347
Đoạn kết thúc dịch mã 3’AOX1 (TT): nucleotide
1253-1586
Khung đọc mở (ORF) HIS4: nucleotide
4514-1980
Đoạn 3’ AOX1: nucleotide 4870-5626
ColE1 origin: bases 6708-6034

Gen kháng Ampicillin: nucleotide 713-6853

Hình 3. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9
ngoại lai trong nấm men P. pastoris [43]

19


aox1:: ARG4 không liên quan đến sự tái tổ hợp này nên kiểu hình Mut
+
của chủng
sau khi tái tổ hợp xảy ra giống với kiểu hình trƣớc khi tái tổ hợp.












Hình 4. Sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gen P. pastoris tại locus his4 [43]
1.3.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris
Các protein sau khi đƣợc tổng hợp ra thƣờng trải qua quá trình biến đổi sau
dịch mã. Trong quá trình này, các protein đƣợc hoàn thiện về mặt cấu trúc, hình
thành các trung tâm hoạt động và tạo nên cấu trúc bền vững của protein. Các protein
tạo ra sau quá trình chế biến có thể đƣợc giữ lại trong tế bào chất hoặc đƣợc tiết ra

ngoài tế bào. Những protein đƣợc tiết ra ngoài tế bào gọi là protein ngoại bào. Quá
trình tiết của protein ngoại bào đòi hỏi phải có một trình tự tiết gồm các acid amin
đặc biệt hay còn gọi là tín hiệu dẫn ở đầu tận cùng N để giúp cho protein có thể đi
qua màng tế bào. Tùy thuộc vào tín hiệu dẫn khác nhau mà protein có thể đƣợc vận
chuyển đến các bào quan khác nhau hoặc đƣợc tiết khỏi tế bào. Ở P. pastoris, trình
tự tiết cho protein ngoại lai đã đƣợc sử dụng rất có hiệu quả trong một số vector
biểu hiện, nhờ đó mà một lƣợng lớn protein ngoại lai đã đƣợc tiết ra ở mức độ cao,
ví dụ nhƣ tín hiệu dẫn α-MF prepro gồm khoảng 89 acid amin có nguồn gốc từ S.
cerevisiae [48]. Tín hiệu này giúp protein đi qua màng của mạng lƣới nội chất dễ