Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESA T6CFP10 phục vụ việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao

ii
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN 3
1.1. KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO 3
1.4. VI KHUẨN LAO 6
1.4.1. Đặc điểm phân loại 6
1.4.2. Đặc điểm hình thái 7
1.4.3. Cấu trúc thành tế bào 8
1.4.4. Đặc điểm nuôi cấy 10
1.4.4.1. Môi trường và dạng khuẩn lạc 10
1.4.4.2. Chu kì tế bào 11
1.4.5. Khả năng gây bệnh 11
1.4.6. Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao 12
1.4.6.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis 12
1.4.6.2. Đặc điểm di truyền của vùng gene biệt hóa RD1. 12
1.5. PROTEIN ESAT6/CFP10 14
1.5.1. Cấu trúc phân tử của phức hệ protein ESAT6/CFP10. 14
1.5.2. Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 và tiềm năng ứng dụng. 15
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17
2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 21
2.4. PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU 22
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu 22
2.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử 22
2.4.2.1. Tách chiết ADN 22
2.4.2.2. PCR khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 22

iii

2.4.2.3. Tách dòng gen mã hóa protein ESAT6-CFP10. 23
2.4.2.4. Giải trình tự ADN 24
2.4.2.5. Thiết kế vector tách dòng pGEMT chứa đoạn gen mã hóa protein
CFP10/ESAT6 27
2.4.2.6. Thiết kế vector biểu hiện pET21a chứa đoạn gen mã hóa protein
CFP10/ESAT6 28
2.4.2.7. Biểu hiện protein ESAT6-CFP10 trong tế bào vi khuẩn Escherichia
coli chủng BL21(DE3) 30
2.4.2.8. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10 32
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33
3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO KHÁNG
NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 33
3.1.1. Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 33
3.1.1.1. Kết quả khuếch đại trình tự gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 của
M.tuberculosis 33
3.1.1.2. Xác định tính ổn định của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 33
3.1.2. Kết quả tách dòng 35
3.1.2.1. Kết quả khuếch đại, nối 2 gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 của
M.tuberculosis 35
3.1.2.2. Kết quả tách dòng 35
3.1.2.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen ESAT6-CFP10
37
3.1.2.3.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen pET21a+ 37
3.1.2.3.2. Gắn đoạn gen đích vào vector biểu hiện pET21a+ 40
3.1.2.3.3. Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR-
colonies 40
3.2. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN ESAT6/CFP10 41

iv
3.2.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/ESAT6-CFP10 vào E.coli chủng

BL21(DE3) 41
3.2.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen CFP10/ESAT6 43
3.2.3. Tối ưu điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp CFP10-ESAT6 44
3.2.3.1. Kết quả tối ưu nhiệt độ cảm ứng 44
3.2.3.2. Kết quả tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng trên
gen CFP10/ESAT6 46
3.2.4. Tinh sạch protein ESAT6/CFP10 47
3.2.5. Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm 48
3.2.6. Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp bằng kháng thể đặc hiệu 49
3.2.7. Xác định hoạt tính kháng nguyên 49
KẾT LUẬN 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52


v
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính 18
Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính 19
Bảng 2.3. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu 20
Bảng 3.1. Mức độ tương đồng của gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 từ các
chủng vi khuẩn lao Việt Nam so sánh với chủng chuẩn H37Rv 34
Bảng 3.2. Mức độ biểu hiện CFP10/ESAT6 tại các điều kiện khác nhau. 47
Bảng 3.3. Nồng độ độc tố trong sản phẩm. 48
Bảng 3.4. Đáp ứng với các nồng độ kháng nguyên khác nhau 50


vi
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Vi khuẩn lao M. tuberculosis trên kính hiển vi điện tử [57]. 7

Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [57]. 8

Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao [72]. 8

Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trường Lowenstein - Jensen 10

Hình 1.5. Vùng gen RD [31]. 13

Hình 1.6 . Mô phỏng cấu trúc của phức hệ protein ESAT6/CFP10 [49]. 14

Hình 3.1. Kết quả khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 33

Hình 3.2. Kết quả khuếch đại gene mã hóa protein CFP10 và ESAT6 35

Hình 3.3. Khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid. 36

Hình 3.4. Sản phẩm PCR được khuếch đại trên các plasmid tái tổ hợp, sử
dụng cặp mồi P1, P4. 37

Hình 3.5. Kết quả mở vòng pET21a+ và pGEMT/ESAT6/CFP10. 39

Hình 3.6. Trình tự khung đọc mở mã hóa protein CFP10/ESAT6. 41

Hình 3.7. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc chứa pET21a+/CFP10-ESAT6. 42

Hình 3.8. Kết quả kiểm tra protein đích trên gel SDS. 44

Hình 3.9. Kết quả cảm ứng ở điều kiện nhiệt độ khác nhau. 45

Hình 3.10. Kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp. 48

Hình 3.11: Westerm blot trên 49

Hình 3.12: Westerm blot 49




vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BCG Bacillus Calmette-Guérin
Bp ` Base pair
(Cặp bazo)
CFP10 Culture Filtetrate Protein 10
CTCLQG Chương trình chống lao Quốc gia
DNA Deoxyribonucleotide acid
ESAT6 Early Secretory Antigenic Target 6
INF γ Interferon gamma
IS Insert sequence
(Trình tự chèn)
MDR Multi drug resistant
(Chủng lao đa kháng thuốc)
ORF Open reading frame
(Khung đọc mở)
PCR Polymerase chain reaction
(Phản ứng chuỗi polymerase)
RD1 Region deletion 1

RFLP Restriction fragment length polymorphisms
(Đa hình độ dài đoạn cắt bởi enzym giới hạn)
RNA Ribonucleotide acid
TST Tuberculin Skin Test
(Phản ứng quá mẫn muộn với tuberculin)
WHO World Health Organization
(Tổ chức Y tế Thế Giới)
XDR Extensively drug resistant
(Chủng lao kháng thuốc tuyệt đối)


1
MỞ ĐẦU

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao hiện nay
chiếm 1/3 dân số thế giới. Hàng năm có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và
có khoảng 3 triệu người chết vì lao [6]. Tuy nhiên, theo ước tính tỷ lệ phát hiện
bệnh chỉ đạt 37%. Như vậy số bệnh nhân mắc lao nhưng không được phát hiện và
chữa trị kịp thời chiếm đến 63%, đây sẽ là nguồn lây nhiễm rất khó kiểm soát.
Việt Nam là 1 trong 22 nước có tỉ lệ nhiễm lao cao trên thế giới. Tính riêng khu
vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3, chỉ sau Trung Quốc và Philipine
[6, 70 ]. Điều này đồng nghĩa với việc Việt Nam đang phải đối mặt với nguy cơ lây
nhiễm lao trong cộng đồng mà một trong những nguyên nhân chính là do lây nhiễm
lao trước chẩn đoán. Số người mắc mới bệnh lao ngày càng tăng, số người không
được phát hiện, điều trị càng nhiều sẽ là nguồn lây nhiễm đến cộng đồng. Mặt khác,
trong số những người mắc được phát hiện, điều trị thì có đến 20% bệnh nhân không
khỏi do kháng thuốc làm tăng nguy cơ lây lan nhanh bệnh lao [6].
Trước diễn biến nghiêm trọng đó, WHO đã kêu gọi các quốc gia trên thế giới
quan tâm đặc biệt đến phòng chống và kiểm soát bệnh lao. Bệnh lao ngày càng trở
nên nguy hiểm hơn, đặc biệt là lao kháng đa thuốc gây tử vong rất lớn, vì vậy việc

phát hiện và điều trị sớm càng trở nên cần thiết. Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc
vào việc chẩn đoán nhanh và chính xác. Tuy nhiên việc chẩn đoán còn gặp rất nhiều
khó khăn.
Trong nhiều thập kỉ nay, phản ứng tuberculin skin test (TST) vẫn được sử
dụng để chẩn đoán nhiễm lao. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra TST
có độ đặc hiệu thấp đặc biệt trên các đối tượng có chủng ngừa BCG. Một phương
pháp mới dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua việc xác định interferon
gamma được tiết ra bởi tế bào T khi được kích thích bằng kháng nguyên đặc hiệu
của vi khuẩn lao đã được chứng minh có độ đặc hiệu cao hơn TST. Hai kháng
nguyên 10 Kdal Culture Filtetrate Proteinn (CFP10) và 6 Kdal Early Secretory
Antigenic Target (ESAT6) được mã hóa bởi gen Ihp nằm trên vùng đặc hiệu RD1
của vi khuẩn lao. Vùng RD1 có chiều dài 9,5 kb và có chứa 9 khung đọc mở

2
(ORFs) [36, 55]. Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng
minh RD1 chỉ quan sát được trên các chủng Mycobacterium tuberculosis, không có
mặt trên các chủng BCG và các chủng Mycobacteria trong môi trường [42,49]. Do
vậy việc nghiên cứu, ứng dụng gen mã hóa protein ESAT6 và CFP10 trong chẩn
đoán lao và có thể phát triển 1 vacxin có hiệu quả bảo vệ cao được coi là một hướng
đi mới và đã được nghiên cứu ở nhiều nơi trên thế giới [29, 59, 65].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu quy trình
biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 phục vụ cho việc
chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao”. Đề tài này thuộc một phần nghiên
cứu của nhiệm vụ Nghị định thư Hoa Kỳ:״ Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình
chế tạo bộ sinh phẩm ELISPOT chẩn đoán nhiễm lao ở quy mô phòng thí
nghiệm״.
Mục tiêu đề tài:
1. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp
ESAT6/CFP10.
2. Biểu hiện và tinh sạch protein ESAT6/CFP10 trong tế bào vi khuẩn E. coli tạo

nguyên liệu chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao.













3
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO
Bệnh lao là căn bệnh truyền nhiễm xuất hiện lâu đời, đã được hiện diện trong
con người từ thời cổ đại. Các nghiên cứu dấu tích hoá thạch đã cho thấy bệnh lao
xuất hiện trên quần thể người khoảng 400- 230 năm trước Công nguyên. Các dấu
hiệu của bệnh cũng đã được tìm thấy trong xác ướp Ai Cập giữa năm 3000 và 2400
trước Công Nguyên.
Bệnh ho lao (còn được gọi là consumption) là một thuật ngữ tiếng Hy Lạp.
Khoảng 400 năm trước Công nguyên, Hippocrate đã xác định bệnh ho lao là căn
nguyên phổ biến nhất liên quan đến ho ra máu và sốt, hầu như luôn gây tử vong.
Đại dịch lao bùng phát ở châu Âu (mà sau này được gọi là “Great White Plague”)
bắt đầu vào thế kỷ XVII lan sang châu Mỹ và kéo dài cho đến tận thế kỷ XIX.
Tác nhân gây bệnh lao, Mycobacterium tuberculosis, chính thức được xác
định và mô tả vào năm 1882. Đây là công trình nghiên cứu của Robert Koch (1843-

1910) [3, 72]. Để ghi nhận công lao của ông, ngày nay người ta còn gọi trực khuẩn
lao gây bệnh trên người là trực khuẩn Koch (Bacille de Koch) [57].
Việc áp dụng các thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh đã cứu chữa cho hàng triệu
bệnh nhân lao khỏi căn bệnh nguy hiểm này. Tuy nhiên điều đó cũng đã tạo ra một
áp lực chọn lọc cho sự hình thành và phát triển các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc.
Hy vọng rằng bệnh này có thể được loại bỏ đã hoàn toàn bị dập tắt kể từ khi xuất
hiện các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc vào những năm 1980 [69].
Bên cạnh đó, cùng với sự phát triển của đại dịch HIV/AIDS, dịch tễ lao toàn cầu đã
bước sang một hướng phát triển mới gây ra những thách thức vô cùng to lớn cho
cuộc chiến chống lao của loài người, đó là sự tương tác giữa lao và đại dịch
HIV/AIDS và sự phát triển của các chủng lao kháng thuốc [57, 61].
1.2. TÌNH HÌNH BỆNH LAO TRÊN THẾ GIỚI
Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay.
Trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia, một khu vực, một dân tộc nào

4
không có người mắc bệnh lao và chết do lao. Năm 1993, WHO đã tuyên bố tình
trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là
bệnh lao kháng thuốc [6].
Các kết quả thống kê lặp lại nhiều lần đã ước tính có khoảng 1/3 dânk.bb. số
thế giới (khoảng 2,2 tỷ người) bị lây nhiễm tiên phát với M.tuberculosis và 10%
trong số đó sẽ ph át triển thành bệnh tại một thời điểm nào đó trong đời. Khoảng
95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao thuộc về các nước có thu nhập
vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động, do đó bệnh lao
là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển
kinh tế xã hội [70].
Năm 2007, WHO ước tính rằng khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao
chiếm tới 34% trên toàn thế giới. Số lượng các ca mới nhiễm trên toàn cầu vẫn tăng
lên và tập trung ở châu Phi, Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á. Trong năm 2010,
có khoảng 10 triệu trẻ em mồ côi do cha mẹ tử vong vì lao, có khoảng 80% số bệnh

nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao [70]. Hiện nay, tỷ lệ điều trị
thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân
ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục
lây bệnh cho cộng đồng, và theo ước tính của WHO mỗi năm có thêm khoảng 1%
dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người). Ngày nay bệnh lao càng trở nên
nghiêm trọng hơn do xuất hiện các chủng lao đa kháng thuốc (MDR), lao kháng
thuốc tuyệt đối (XDR) và lao đồng nhiễm HIV/AIDS [61, 69].
Đến cuối thế kỷ 20, con người vẫn lạc quan về khả năng có thể kiểm soát được
đại dịch này. Thực tế, cuối thập niên 70 đầu thập niên 80 ở một số nước phát triển
người ta đã tưởng như chế ngự được hoàn toàn bệnh lao, do đó bệnh lao đã đi vào
quá khứ bởi sự lãng quên của các nhà y học và khoa học. Tuy nhiên, thực tế lại
không như vậy bởi sự xuất hiện cơ chế kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn lao,
khiến cho việc phát hiện và điều trị ngày càng trở nên khó khăn và tốn kém [61].
Theo số liệu công bố của WHO [70], ước tính trong năm 2010 có thêm khoảng
8,8 triệu người mắc lao mới (trung bình 128 trường hợp trên 100 000 dân) và 1,4

5
triệu người chết do lao (trong đó 1,1 triệu người HIV (-) và 0,35 triệu người tử vong
do lao/HIV (+)). Sau HIV/AIDS, vi khuẩn lao là căn nguyên thường gặp nhất gây tử
vong do các bệnh truyền nhiễm; và khuynh hướng hiện tại cho thấy, vi khuẩn lao
vẫn là một trong 10 nguyên nhân gây gánh nặng bệnh tật toàn cầu đến năm 2020
[70].
Tổ chức Y tế thế giới WHO đang phấn đấu đến năm 2015 sẽ giảm 1 nửa số
người nhiễm và tử vong do lao [67,68]. Ngày Thế giới phòng chống lao (24/3) được
tổ chức hàng năm nhằm nâng cao nhận thức về dịch bệnh lao toàn cầu và nỗ lực loại
trừ bệnh lao.
Bệnh lao vẫn tiếp tục là một trong ba căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất
trên thế giới cùng với hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) và sốt rét [6,
52]. Điều này đã một lần nữa khơi dậy các nghiên cứu sâu hơn trong phương pháp
phát hiện (chẩn đoán) và điều trị bệnh lao.

1.3. TÌNH HÌNH BỆNH LAO TẠI VIỆT NAM
Việt Nam hiện vẫn là nước có gánh nặng bệnh lao cao, đứng thứ 12 trong 22
nước có tình hình dịch tễ lao cao nhất trên toàn cầu, đồng thời đứng thứ 14 trong số
27 nước có gánh nặng bệnh lao kháng đa thuốc cao nhất thế giới [68].
Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu,
công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh
lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa
Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình Y tế Quốc gia trọng
điểm [6].
Năm 1996, Việt Nam đã đạt mục tiêu toàn cầu về tìm và điều trị bệnh lao,
nhưng số ca bệnh báo cáo không thuyên giảm.
Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân
lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của
TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ
lệ khỏi là 92% [6, 15].

6
Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao
các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân do
CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân
lao phổi AFB(+) mới [6].
Năm 2010, Việt Nam có 88.000 ca mắc lao mới được phát hiện, trên 8.000
bệnh nhân lao cũ cần tái điều trị và gần 30.000 người chết vì bệnh lao. Tổng số
bệnh nhân lao hiện mắc là 300.000 người [5]. Năm 2012, tổng số người mắc lao là
161.000, trong đó số người mắc lao mới khoảng 149.000, số người mắc lao thứ phát
là 12.000 người. Mỗi năm, Chương trình chống lao quốc gia phát hiện 100.000
bệnh nhân lao và chữa khỏi cho 92% [4].
Bên cạnh sự gia tăng đáng lo ngại thì tình trạng lao kháng thuốc là một vấn đề
cấp bách. Theo nghiên cứu của CTCLQG có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới có
mang vi trùng lao kháng thuốc, trong đó có kháng SM 25,1%, tiếp theo là INH

20.0%, đây là hai loại thuốc phổ biến trong điều trị bệnh lao [73].
Vấn đề đồng nhiễm HIV và lao không chỉ làm tăng số bệnh nhân lao mà còn
làm giảm hiệu quả điều trị bệnh, tăng tỷ lệ tử vong.
Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% nhưng trên
thực tế có thể còn cao hơn, như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn [6]. Việc
chẩn đoán nhiễm lao, phát triển một vacxin có hiệu quả bảo vệ cao từ gen mã hóa
protein ESAT6/CFP10 được coi là một hướng đi mới ở nước ta.
1.4. VI KHUẨN LAO
1.4.1. Đặc điểm phân loại
Tên khoa học: Mycobacterium tuberculosis [3, 7]
Chi(genus): Mycobacterium
Họ(familia): Mycobacteriaceae
Phân bộ(subordo): Corynebacterineae
Bộ(ordo): Actinomycetales
Ngành(philum): Actinobacteria
Giới(regnum): Bacteria

7
Các chủng vi khuẩn thuộc chi Mycobacterium được chia làm 2 nhóm
 Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) gồm:
M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti. Trong đó M. tuberculosis và
M. bovis gây bệnh lao điển hình.
 Mycobacterium other than tuberculosis (MOTT) gồm:
M. avium, M. ortuitum, M. govdovac, M. kansasii Nhóm này không gây bệnh lao
[57, 60].
1.4.2. Đặc điểm hình thái
Trực khuẩn lao có hình que, kích thước 2-3 µm, dầy 0,3 µm, đứng riêng lẻ
hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây (hình
1.1). Tuy nhiên tùy thuộc vào điều kiện và thời gian nuôi cấy mà có sự thay đổi về
hình dạng, kích thước, từ cầu- trực khuẩn đến trực khuẩn dài [7, 20, 57]. Vi khuẩn

không di động, không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường do
có lớp sáp ở thành tế bào. Mycobacterium tuberculosis được xếp vào nhóm vi
khuẩn Gram dương, tuy nhiên khi nhuộm Gram vi khuẩn bắt màu rất yếu hoặc
không giữ được màu thuốc nhuộm [3, 7, 8]. Nhuộm theo phương pháp Ziehl-
Neelsen, trực khuẩn lao không bị cồn và axit làm mất màu của cacbonfuchsin, bắt
màu đỏ [8, 20], (hình 1.2).

Hình 1.1. Vi khuẩn lao M. tuberculosis trên kính hiển vi điện tử [57].

8


Hình 1.2. Trực khuẩn M. tuberculosis sau khi nhuộm Ziehl – Nielsen [57].
1.4.3. Cấu trúc thành tế bào
Lớp vách của trực khuẩn có vai trò rất quan trọng. Cấu trúc của lớp này ngoài
đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững đối với hiện
tượng thực bào, khi xâm nhập vào cơ thể trực khuẩn lao khó bị tiêu diệt, ảnh hưởng
rất lớn đến khả năng gây bệnh của trực khuẩn [8].
Mycobacterium tuberculosis có cấu trúc vách tế bào phức tạp, được chia thành 4 lớp
(hình 1.3).


Hình 1.3. Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn lao [72].
1- Lipid ngoài
2- Axit mycolic
3- Polysaccharides
(arabinogalactan)
4- Peptidoglycan
5- Màng sinh chất
6- Lipoarabinomannan (LAM)

7- Phosphatidylinositol
mannoside
8- Khung thành tế bào


9
Lớp ngoài cùng có cấu trúc peptidoglycolipid, đây là lớp chỉ thấy ở vi khuẩn
lao, phát triển trong tế bào có tác dụng tăng cường như một lớp áo giáp cho các vi
khuẩn nằm trong tế bào chống chịu các enzyme phân giải từ các lyzozyme của tế
bào. Khi phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc trong đại thực bào, M.
tuberculosis tích lũy một capsule giả không bám. Thành phần của capsule này có
protein, polysaccharide và lượng nhỏ lipid. Cấu trúc của capsule có thể bung ra bên
trong các đại thực bào. Màng tế bào của vi khuẩn lao gây bệnh hầu như giống với
màng của các Mycobacteria trong cùng một giống, bao gồm cả các Mycobacteria
không gây bệnh [7, 20].
Lớp tiếp theo được tạo nên bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và các lipit
phức tạp. Đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao, làm tăng khả năng chống
thấm nước của thành vi khuẩn, chống lại sự hủy diệt của đại thực bào và các tế bào
miễn dịch [7]. Gắn với peptidoglican là một poysaccharide phân nhánh và
arabinogalactan, đầu ngoài của các phân tử này được este hóa với axit béo có khối
lượng phân tử cao là axit mycolic. Các axit mycolic đặc hiệu của M. tuberculosis là
alpha - keto và mythoxymycolate chứa 76 đến 82, 84 đến 89 và 83 đến 90 carbon.
Lớp ngoài của thành tế bào có các phân tử lipid tự do như phthiocerol dilycoserosates
(PDIM), phenolic glycolipids (PGL), trehalose-containing glycolipids và sulfolipids
(SL). Xuyên qua toàn bộ lớp màng là những glycolipid như phosphatidyl- myoinositol
mannosides, lipomannan (LM) và lipoarabinomannan (LAM) được đính vào màng sinh
chất và mở rộng ra bên ngoài thành tế bào, trong đó LAM có tính đặc hiệu loài. Thành tế
bào Mycobacteria chứa các protein nằm rải rác, một vài protein này tham gia vào cấu
trúc thành tế bào, các protein porin hình thành các kênh ưa nước cho phép vận chuyển
tích cực các chất tan trong nước thông qua lớp axit mycolic [57].

Lớp thứ ba gồm các peptidoglican liên kết với đường arabinose và các phân tử
axit mycolic tạo nên bộ khung định hình cho vi khuẩn, đảm bảo cho vi khuẩn có độ
cứng nhất định. Thành tế bào của Mycobacteria có cấu trúc phức tạp với các thành
phần hóa học và nhiều liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglycan
ở thành tế bào của M. tuberculosis là 70 đến 80% trong khi ở E. coli là 20-30% [57].
Lớp trong cùng là màng sinh chất có thành phần chủ yếu là các photpholipit.
Các photpholipit gồm 2 nhóm, nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kị nước

10
hướng ra phía ngoài vỏ [7, 20, 57]. Màng sinh chất giữ vai trò điều hòa áp suất thẩm
thấu giữa tế bào chất và môi trường. Ngoài ra các protein của màng giữ các chức
năng khác nhau như protein nhạy với nồng độ của các phân tử trong môi trường ,
protein truyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và bộ máy di truyền trong nguyên
sinh chất, các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng. Các
enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo vách ngăn trong quá trình phân chia tế
bào [20].
1.4.4. Đặc điểm nuôi cấy
1.4.4.1. Môi trường và dạng khuẩn lạc
Trực khuẩn lao là vi khuẩn ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí.
Nhiệt độ thích hợp để mọc là 37
o
C , ở nhiệt độ dưới 37
o
C và trên 42
o
C vi khuẩn lao
hầu như không mọc [20, 57]. Trực khuẩn lao sinh trưởng tốt nhất khi pO
2
là 100
mmHg và pCO

2
là 40 mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn hay mắc lao
nhất (pO
2
là 120-130 mmHg khi đứng), rồi đến thân xương và đầu xương (pO
2
là
100 mmHg). Gan lách, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì pO
2
thấp.
Vi khuẩn lao không sinh trưởng trong môi trường thông thường mà phải được
nuôi trong môi trường đặc biệt giàu chất dinh dưỡng gồm trứng, khoai tây, citrat,
glixerol, asparagin, xanh malachite.
Môi trường thường dùng là môi trường Loewenstein đặc đã được cải tiến bởi Jensen
hoặc môi trường lỏng Sauton. Trong môi trường đặc, trực khuẩn lao mọc rất chậm,
phải mất 4 đến 6 tuần mới mọc khuẩn lạc điển hình dạng R ( hình 1.4).




Hình 1.4. Khuẩn lạc M. tuberculosis trên môi trường Lowenstein - Jensen

11
Sau một thời gian nuôi cấy trực khuẩn M. tuberculosis gây bệnh sẽ tạo thành
các khuẩn lạc có bề mặt dính và xù xì. Các Mycobacteria không gây bệnh và các
trực khuẩn lao bị làm yếu đi trong nuôi cấy kéo dài thường mọc khuẩn lạc nhẵn,
tạo thành đám [3, 8, 57].
1.4.4.2. Chu kì tế bào
Trong điều kiện phòng thí nghiệm cứ 18 đến 24 giờ M. tuberculosis phân chia một
lần. Chu kì tế bào của M. tuberculosis khá dài, điều này có thể do tính thẩm thấu

của thành tế bào gây hạn chế trong việc hấp thụ các chất dinh dưỡng và liên quan
đến tốc độ tổng hợp ribosome [57].
1.4.5. Khả năng gây bệnh
Độc lực của trực khuẩn lao có liên quan trực tiếp đến yếu tố “Cord” (trehalose-
6,6’-dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu, gây nên những u
hạt mãn tính. M. tuberculosis sinh ra ngoại độc tố nhưng không có ý nghĩa gây
bệnh.
Vi khuẩn lao có thể vào cơ thể qua nhiều đường. Thường là qua đường hô hấp,
gây lao phổi (90% các bệnh lao). Khi đó các mô của phế nang bị vi khuẩn xâm nhập
tạo ra các ổ chứa vi khuẩn, sau đó đến hạch lympho trong vùng rồi đến các mô
khác. Trực khuẩn lao cũng có thể xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa ( thường
qua sữa bò tươi) gây lao dạ dày, ruột. Ngoài ra, trực khuẩn lao còn có thể vào cơ thể
qua da, giác mạc, đường sinh dục, nhưng rất hiếm.
Sau khi gây tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết
hoặc đường máu tới cơ quan khác gây tổn thương thứ phát [19]. Miễn dịch trong lao
là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Đáp ứng miễn dịch làm chậm sự nhân
lên của trực khuẩn lao, gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn và cuối cùng làm phá
hủy trực khuẩn. Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao phát sinh một phản ứng quá mẫn
muộn. Một số trường hợp vi khuẩn lao có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt trở lại
bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ ở trong các u hạt nên cơ thể không thanh
toán được. Đặc biệt là trong các trường hợp lao kháng thuốc cơ thể không thanh

12
toán được vi khuẩn và các thuốc cũng không tác động được, đây là một vấn đề nan
giải trong điều trị lao [19].
1.4.6. Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao
1.4.6.1. Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosis
Hệ gen của chủng H37Rv được công bố năm 1998 có chiều dài 4.411.529
cặp base. Trong đó có 3.918 gen và các gen này đều được dự đoán là có mã hóa cho
protein, tỷ lệ G+C chiếm 65,61% không thay đổi ở các vị trí khác nhau trong toàn

bộ genome. Genome của Mycobacteria tuberculosis có tới 90,8% trình tự mã hóa
protein và chỉ có 8 gen giả [ 26, 50, 57].
Trong hệ gen của phần lớn các vi khuẩn thường có nhiều operon rRNA
(operon rrn) nằm gần vị trí khởi đầu tái bản. Tuy nhiên hệ gen của vi khuẩn lao chỉ
có duy nhất 1 operon rrn cách vị trí khởi đầu tái bản 1,5Mb. Điều này góp phần lý
giải về tốc độ sinh trưởng rất chậm của vi khuẩn đặc biệt này [26].
Một trong những đặc tính được quan tâm nhiều nhất của Mycobacterium
tuberculosis là nghiên cứu sự có mặt và phân bố của các trình tự chèn (IS), trong đó
đặc biệt là đoạn IS6110. Hệ gen của M. tuberculosis H37Rv có 16 bản sao IS6110 và
6 bản sao IS1081; tuy nhiên chỉ có 95% số chủng vi khuẩn lao có chứa 4-20 bản sao
IS6110. Bộ gen của Mycobacterium tuberculosis thiếu hệ thống MutS có tác dụng
sửa chữa các lỗi trong bắt cặp nucleotide. Tuy nhiên sự tái bản ở vi khuẩn lao lại rất
chính xác do sự có mặt của gần 45 gen liên quan đến cơ chế sửa chữa DNA bao gồm
cả 3 bản sao của gen mutT mã hóa cho loại enzyme chịu trách nhiệm cho việc loại bỏ
các Guanin bị oxy hóa trong quá trình tái bản- nguyên nhân gây ra sự bắt cặp sai [62].
1.4.6.2. Đặc điểm di truyền của vùng gene biệt hóa RD1.
Các nghiên cứu so sánh hệ gen của chủng vắc xin BCG và các chủng
M.tuberculosis gây bệnh đã chỉ ra một số vùng gen quyết định độc tố của vi khuẩn
nhưng bị thiếu ở chủng vắc xin BCG và đa số các chủng mycobacterium trong môi
trường [49]. Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh những gen này đóng vai trò
quan trọng trong quyết định độc tố của vi khuẩn, cũng như khởi động quá trình đáp

13
ứng miễn dịch bảo vệ của cơ thể vật chủ [55].
Theo báo cáo dựa trên việc so sánh hệ gen giữa chủng chuẩn H37Rv và chủng
vắc xin BCG, có tới 129 khung đọc mở có mặt ở chủng gây bệnh nhưng không phát
hiện ở chủng BCG. Vùng gen khuyết thiếu trên chủng vắc xin BCG được biết đến là
vùng gen biệt hóa RD [32]. Nằm trên vùng RD, vùng gen biệt hóa RD1 bao gồm 9
khung đọc mở (Rv3871-Rv3879), có chiều dài 9454 bp (hình 1.5) là một trong
những gen khuyết thiếu của chủng BCG được nghiên cứu nhiều nhất. Những

protein quan trọng được mã hóa bởi vùng gen này bao gồm ESAT6 (Early
Secretory Antigenic Target 6); CFP10 ( Culture Filtetrate Protein 10) và CFP21 (
Culture Filtetrate protein 21) là những kháng nguyên được nhận biết bởi tế bào T
[31]. Sự vắng mặt của chúng trên chủng vắc xin BCG có thể là nguyên nhân ảnh
hưởng đến hiệu quả bảo vệ của BCG. Xóa vùng gen biệt hóa RD1 trên các chủng vi
khuẩn lao gây bệnh làm giảm khả năng sinh trưởng của vi khuẩn cũng như làm
giảm độc lực của vi khuẩn. Hệ thống tiết RD1 đóng vai trò quan trọng trong cơ chế
sinh bệnh của vi khuẩn lao liên quan đến độc lực của vi khuẩn và cơ chế miễn dịch
bảo vệ của vật chủ [38, 42, 55] bao gồm sự hình thành các u hạt (granulomas); giảm
chức năng của các tế bào gai, đại thực bào, tế bào T bằng cách ức chế quá trình tiết
các cytokine kích hoạt hệ thống miễn dịch của vật chủ [56].

Hình 1.5. Vùng gen RD [31].
Trong khi các kháng nguyên được mã hóa bởi vùng RD1 được biết đến như là
một trong những yếu tố quyết định độc tố vi khuẩn lao thì bức tranh toàn cảnh về
mối quan hệ giữa các kháng nguyên này và cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn lao vẫn
chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Vai trò của kháng nguyên ESAT6 liên quan

14
đến quá trình xâm nhập của vi khuẩn lao vào hệ thống miễn dịch của vật chủ vẫn
chưa rõ ràng. Tuy nhiên nhiều nghiên cứu hiện tại đã chứng minh vai trò của vùng
gen biệt hóa RD1 trong quá trình sản xuất kháng nguyên ESAT6 và CFP10 của vi
khuẩn lao.
1.5. PROTEIN ESAT6/CFP10
1.5.1. Cấu trúc phân tử của phức hệ protein ESAT6/CFP10.
ESAT6 có trọng lượng phân tử 6kDa, được tinh sạch lần đầu tiên bởi
L.Sorensen và cộng sự vào năm 1995 bao gồm 95 amino axit. ESAT6 được tiết
ngay trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm, liên quan đến cơ chế xâm nhập của vi
khuẩn vào tế bào vật chủ. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các vùng nhận biết trên
protein ESAT6 có vai trò kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên [46].

CFP10 có trọng lượng phân tử 10kD bao gồm 100 amino axit. Gen mã hóa
protein CFP10 và ESAT6 là 2 gen Rv 3874 và Rv 3875 nằm trên vùng gen biệt hóa
RD1. Hai gen này được phiên mã và biểu hiện thành một phức hệ protein
CFP10/ESAT6 với tỷ lệ 1:1 [31, 36, 58]. Đoạn gen mã hóa protein CFP10 và
ESAT6 phân lập từ các chủng M.tuberculosis trên bệnh nhân lao phổi dương tính
tại nhiều vùng địa lý khác nhau đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi
tiết và đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI). Cấu trúc của phức hệ
protein CFP10/ESAT6 được mô tả trong hình 1.6.



Hình 1.6 . Mô phỏng cấu trúc của phức hệ protein ESAT6/CFP10 [49].

15
1.5.2. Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 và tiềm năng ứng dụng.
Công nghệ sinh học hiện đại có khả năng tạo ra các protein tái tổ hợp ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có y sinh học. Biểu hiện gene thành protein tái
tổ hợp không độc phục vụ nghiên cứu tạo vacxin cũng được quan tâm nghiên cứu.
Năm 2007 một nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Columbia, Hoa Kỳ đã
nghiên cứu tạo vacxin tái tổ hợp ESAT6/CFP10 thử nghiệm trên mô hình động vật.
Theo đó vacxin tái tổ hợp ESAT6/CFP10 gây đáp ứng miễn dịch tốt hơn BCG.
Hai kháng nguyên CFP10 và ESAT6 đã được chứng minh là các kháng
nguyên có tính sinh miễn dịch cao. Hiện nay, chức năng của protein CFP10 và
ESAT6 của vi khuẩn lao vẫn chưa rõ ràng, tuy nhiên một số nghiên cứu đã chỉ ra
mối tương quan giữa sự có mặt của hai kháng nguyên này và độc lực của vi khuẩn
lao [40].
Kết quả một nghiên cứu trên mô hình động vật đã chứng minh kháng nguyên
ESAT6 được nhận biết bởi tế bào T ở giai đoạn đầu của quá trình nhiễm lao, khởi
động quá trình tiết INF gamma [59], 64]. Nghiên cứu trên mô hình chuột gây nhiễm
M. tuberculosis của Brandt và cs cho thấy ESAT6 có khả năng bảo vệ chống lại vi

khuẩn lao sống [46]. Một nghiên cứu khác cũng chứng minh CFP10/ESAT6 có khả
năng kích thích tế bào T của bò đã bị nhiễm M.bovis sản sinh INF-γ ở nồng độ cao
[66]. Những phát hiện này đã khiến nhiều nhà khoa học nghĩ đến khả năng ứng
dụng hai kháng nguyên CFP10 và ESAT6 trong việc phát triển vacxin thay thế
vacxin BCG [48].
Kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng tuberculin skin test có phản ứng
chéo với non-tuberculosis mycobacteria, nên TST không phân biệt được giữa
nhiễm Mycobacterium tuberculosis và nhiễm non-tuberculosis mycobacteria.
Cho đến nay, chủng M. bovis BCG vẫn được coi là ứng cử viên duy nhất cho
việc phát triển vacxin chống vi khuẩn lao. Tuy nhiên, hiệu quả bảo vệ của BCG đã
được chứng minh chỉ đạt từ 0-80%.
Do vậy, phát triển một vacxin mới, có hiệu quả bảo vệ cao, thay thế BCG là
rất cần thiết, góp phần khống chế được sự lây lan của bệnh lao trên toàn cầu.

16
CFP10 và ESAT6 đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu nhằm phát triển
phương pháp chẩn đoán nhiễm lao thay thế phản ứng mantoux. Một phương pháp
mới dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào của hai kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao
ESAT6/CFP10 là Quantiferon TB gold test (Celletist Limitted, Carnegie Victoria
Australia) và T SPOT-TB assay (Oxford Immunotec, Oxford UK) đã được đánh giá
là có độ đặc hiệu cao hơn TST trong chẩn đoán nhiễm lao. Cả hai bộ sinh phẩm
thương phẩm này đều được xây dựng dựa trên đáp ứng miễn dịch tế bào của vi
khuẩn lao thông qua việc xác định interferon gamma được tiết ra bởi T cells khi
được kích thích với kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao ESAT6/CFP10. Độ nhạy
và độ đặc hiệu của hai bộ kít trên cao nhưng ESAT6/CFP10 được sử dụng trong hai
bộ KIT có mặt trên thị trường (Quantiferon TB gold test, T Spot TB) là các
overlapping peptides dẫn đến giá thành đắt, khó có thể đưa vào sử dụng đại trà đặc
biệt là ở những nước đang phát triển như Việt nam. Hill và các cộng sự [39] đã
chứng minh rằng protein tái tổ hợp ESAT6/CFP10 có tính đặc hiệu và đáp ứng
miễn dịch tương tự như overlapping peptides trong chẩn đoán nhiễm lao.

Nhiều nghiên cứu khác trên thế giới cũng đã chứng minh tính sinh miễn dịch
của kháng nguyên tái tổ hợp CFP10/ESAT6. Do vậy, tạo protein tái tổ hợp
ESAT6/CFP10 là mục tiêu của đề tài này.

17
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Chủng vi khuẩn và plasmid:
 54 chủng vi khuẩn lao được phân lập từ bệnh nhân lao phổi dương tính tại
Bệnh viện Lao Hà nội và bệnh viện Phạm Ngọc Thạch.
 Chủng vi khuẩn kiểm chứng H37Rv do Khoa vi sinh, Bệnh viện Phổi Trung
ương cung cấp
 Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng DH5α và BL21(DE3) được
sử dụng cho mục đích tách dòng và biểu hiện protein ESAT6/CFP10, vector
biểu hiện pET21a+ do Khoa sinh hóa tế bào, Trường Đại học Ohio, Hoa kỳ
cung cấp.
2.2. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

18
Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính
Tên hóa chất Hãng sản xuất
1. Hóa chất dùng trong tách chiết ADN
Tris – Base

Applied BioSiciences (Mỹ)
PBS Rectopur(CE- EMB)
Proteinase K Sigma
Ethanol Wako (Japan)
Natri acetate Wako (Japan)

Lysozyme QIAGEN
Các dung môi hữu cơ Gibco BRL Life technology
2. Hóa chất dùng trong PCR và PCR gắn BigDye
Mồi Promega
MgCl
2
Promega
Deoxyribonucleoside triphosphate mixture Promega

Tag polymerase Promega

Đệm BigDye QIAGEN
HiDi Formanid Invitrogen
3. Hóa chất trong điện di và soi gel
Thang ADN chuẩn Fermentas
Agarose Fermentas
Red safe Sigma (Mỹ)

Polyacrylamide Fermentas





19
Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính

QIAamp DNA QIAGEN
Eppendorf tubes Eppendorf
Máy ly tâm Eppendorf
Kit tách chiết plasmid QIAGEN
kit Pgemt QIAGEN
Quick Plasmid Miniprep Kit QIAGEN
ABI avant 3100 DNA analyzer Invitrogen
Gel Extraction kit (Cat. No 28704). QIAGEN)
Máy chụp ảnh Gel – Doc Dolphin
Lò vi sóng Sanyo
Cân điện tử Adam
Vortex Janke and Kunkel
Máy lắc Certomat
Bộ điện di DNA Labnet
Pippetman Gilson, Haminlton, Bio-Rad
Tủ lạnh 4
o
C, -20
o
C Nuaire
Tủ cấy an toàn sinh học Nuaire

Tủ ấm Shelab
Máy PCR Eppendorf