Nghiên cứu tuyển chọn chủng giống khởi động cho lên men pho mát

v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
LỜI CAM ĐOAN iv
MỤC LỤC v
DANH MỤC BẢNG BIỂU viii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ix
BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT x
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về pho mát 3
1.1.1. Pho mát 3
1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ pho mát trên thế giới và Việt Nam 4
1.1.3. Công nghệ sản xuất pho mát 6
1.1.4. Các quá trình chuyển hóa của vi khuẩn lactic trong sản xuất pho mát 8
1.1.4.1. Quá trình chuyển hóa lactose 9
1.1.4.2. Quá trình chuyển hóa axit lactic 10
1.1.4.3. Quá trình chuyển hóa citrate 11
1.1.4.4. Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo 14
1.1.4.5. Quá trình phân giải protein 16
1.2. Giống khởi động cho sản xuất pho mát 19
1.2.1. Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động trong công nghiệp sản xuất pho mát
19
1.2.1.1. Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm 20
1.2.1.2. Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt 21
1.2.1.3. Các chủng khởi động “thủ công” 22
1.2.2. Chức năng cần thiết của giống khởi động công nghiệp 23
1.2.2.1. Sản xuất axit 23
1.2.2.2. Tổng hợp enzym phân giải protein 23
1.2.2.3. Tổng hợp exopolysaccharide 24

vi

1.2.2.4. Khả năng tạo hương 25
1.2.3. Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động cho sản xuất pho mát ở Việt
Nam 26
Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27
2.1. Hóa chất và thiết bị 27
2.1.1. Hóa chất 27
2.1.2. Thiết bị 27
2.2. Nguồn sữa và chủng vi sinh vật 28
2.3. Môi trường 28
2.2.1. Môi trường MRS 28
2.2.2. Môi trường thử citrate 28
2.2.4. Môi trường thử khả năng đông tụ sữa 29
2.4. Phương pháp nghiên cứu 29
2.4.1. Phương pháp kiểm tra khả năng đông tụ sữa 29
2.4.2. Phương pháp xác định kiểu len men 30
2.4.3. Phương pháp kiểm tra phổ nhiệt độ sinh trưởng 30
2.4.4. Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng citrate 30
2.4.5. Phương pháp định lượng exopolysaccharide 30
2.4.6. Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số phenol - axit sunfuric 31
2.4.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym protease ngoại bào 32
2.4.8. Xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH 32
2.4.9. Phương pháp xác định hoạt tính X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase
33
2.4.10. Định lượng protein bằng phương pháp Lowry 35
2.4.11. Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng nguồn cacbon 36
2.4.12. Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzym 37
2.4.13. Phương pháp xác định tên loài bằng trình tự 16S rDNA 39
2.4.14. Phương pháp sản xuất pho mát tươi 40

2.4.15. Tách hợp chất dễ bay hơi bằng phương pháp chưng cất 41
vii

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 42
3.1. Nghiên cứu đặc điểm của giống khởi động cho sản xuất pho mát 42
3.1.1. Khả năng đông tụ sữa 43
3.1.2. Phổ nhiệt độ sinh trưởng 45
3.1.3. Kiểu lên men lactic 46
3.1.4. Khả năng chuyển hóa citrate 47
3.1.5. Khả năng tổng hợp exopolysaccharide 49
3.1.6. Hoạt tính protease ngoại bào 50
3.1.7. Khả năng tổng hợp enzym X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase 51
3.1.8. Khả năng tạo hương thơm của các chủng vi khuẩn lactic trên mẫu pho
mát tươi 52
3.1.9. Hoạt tính chống oxy hóa 52
3.2. Hồ sơ bộ chủng giống tuyển chọn 54
3.2.1. Định tên chủng 54
3.2.2. Khả năng sử dụng các nguồn đường 55
3.2.3. Phổ hoạt tính enzym 58
3.3. Phối trộn 2 chủng M11 và T21 60
3.3.1. Thời gian đông tụ và đặc tính của sữa lên men bởi hỗn hợp chủng M11
và T21 60
3.3.2. Khả năng tạo các hợp chất dễ bay hơi của hỗn hợp chủng M11 và T21
trong lên men sữa 62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65
PHỤ LỤC 73

viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Phân loại pho mát theo độ ẩm 3
Bảng 1.2: Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của pho mát
Cheddar (ủ chín 6 tháng) 16
Bảng 1.3: Các hợp chất hương hình thành từ quá trình chuyển hóa axit amin qua
axit α – keto theo con đường chuyển hóa transaminase 19
Bảng 1.4: Các giống khởi động của một số loại pho mát 19
Bảng 2.1: Các nguồn cacbon của bộ kit API 50 CHL 36
Bảng 2.2: Enzym và cơ chất của bộ kit API ZYM 37
Bảng 3.1. Thống kê các chủng vi khuẩn lactic được khảo sát 42
Bảng 3.2: Khả năng đông tụ sữa của vi khuẩn lactic 44
Bảng 3.3: Dải nhiệt độ sinh trưởng của các vi khuẩn lactic 46
Bảng 3.4: Kiểu lên men lactic của các vi khuẩn lactic 47
Bảng 3.5: Khả năng chuyển hóa citrate của các vi khuẩn lactic 48
Bảng 3.6: Hàm lượng exopolysaccharide được tổng hợp bởi các vi khuẩn lactic 49
Bảng 3.7: Hoạt tính protease ngoại bào của các vi khuẩn lactic 50
Bảng 3.8: Hoạt lực X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase của các vi khuẩn lactic
51
Bảng 3.9: Cảm quan hương thơm của mẫu pho mát 52
Bảng 3.10: Khả năng giảm gốc DPPH của sữa lên men bởi các vi khuẩn lactic 53
Bảng 3.11: Khả năng sử dụng đường 55
Bảng 3.12: Phổ hoạt tính enzym của chủng M11 và T21 58
Bảng 3.13: Thời gian đông tụ của sữa lên men bởi chủng M11, T21 61
Bảng 3.14: Đặc tính của sữa lên men bởi hỗn hợp chủng 61
Bảng 3.15: Các cấu tử trong thành phần các hợp chất dễ bay hơi của pho mát tươi
.62

ix

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Sản lượng pho mát trên thế giới giai đoạn 2000 – 2010 5
Hình 1.2: Tỉ trọng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa 6
của Việt Nam, năm 2009 6
Hình 1.3: Sơ đồ sản xuất pho mát Cheddar (a) và Emmental (b) 8
Hình 1.4: Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic 9
Hình 1.5: Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín pho mát 10
Hình 1.6: Các con đường chuyển hóa citrate của các chủng Cit
+
thuộc Lactococcus
và Leuconostoc sp. 12
Hình 1.7: Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus 13
Hình 1.8: Các con đường chuyển hóa axit béo tự do 15
Hình 1.9: Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm
sữa lên men 18
Hình 1.10: Vị trí của polysaccharide được tổng hợp bởi các vi khuẩn Gram (+) và
Gram (-) trên tế bào 25
Hình 3.1: Khả năng đông tụ sữa của VNC1 và T21 sau 24 giờ 45
Hình 3.2: Khả năng sử dụng citrate 48
Hình 3.3: Hoạt tính phân giải casein của các vi khuẩn lactic 51
Hình 3.4 : Hình thái tế bào hai chủng T21 và M11 54
Hình 3.5: Khả năng sử dụng các nguồn đường của chủng M11 và T21 sau 48h 57
Hình 3.6: Hoạt tính enzym dịch nội bào của chủng M11 và T21 60

x

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BSA Bovine serum albumin
CoA Coenzyme A
CO
2
Carbon dioxide
CPS Capsular polysaccharides
DNA Deoxyribonucleic Acid
DPPH 2,2 – diphenyl – 1 – picrylhydrazyl
EPS Exopolysaccharide
FAA Free amino acid
FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc
GC - MS Gas chromatography – Mass spectrometry
H
2
Hydrogenium
LAB Lactic acid bacteria
MRS de Man, Rogosa and Sharpe (Medium for LAB)
OD Optical Density
pNA p – nitroaniline
PCR Polymerase Chain Reaction
rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic acid

TCA cycle Tricarboxylic acid cycle
WHO Tổ chức Y tế Thế giới


1

LỜI MỞ ĐẦU

Pho mát là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao với đầy
đủ các axit amin không thay thế, chứa nhiều vitamin như: Vitamin A, riboflavin,
vitamin B, vitamin D và các chất khoáng: kẽm, photpho, canxi. Pho mát cũng mang
lại nhiều lợi ích về sức khỏe như: Bảo vệ răng, chống loãng xương, ngăn ngừa ung
thư.
Theo thống kê của FAO, sản lượng pho mát trên toàn thế giới liên tục tăng qua
các năm. Năm 2013, sản lượng pho mát đạt khoảng 20 triệu tấn/năm. Trong đó, sản
xuất và tiêu thụ sản phẩm này chỉ tập trung ở các nước phát triển. Ở Việt Nam, hầu
hết pho mát được nhập khẩu và mức tiêu thụ còn khiêm tốn: kim ngạch nhập khẩu
pho mát chỉ đạt 24,04 triệu USD (năm 2008), chiếm khoảng 7% tổng kim ngạch
nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa. Một trong những nguyên nhân là do sản
phẩm chưa hợp với thị hiếu của người Việt Nam và giá thành cao. Tuy nhiên, cùng
với đà tăng trưởng kinh tế thì nhu cầu về các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng, tốt
cho sức khỏe như pho mát sẽ tăng cao. Năm 2009, mức tiêu thụ sữa và các sản
phẩm từ sữa bình quân đầu người đang ở mức rất thấp 11,2 kg/người/năm so với
mức bình quân 62 kg/người/năm của Châu Á, 96 kg/người/năm của thế giới và 248
kg/người/năm ở các nước phát triển. Như vậy có thể thấy nhu cầu về sữa và các sản
phẩm từ sữa trong đó có pho mát ở Việt Nam còn rất lớn.
Vi khuẩn lactic được coi là vi sinh vật an toàn và đã được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực sản xuất và bảo quản thực phẩm. Trong ngành công nghiệp sản
xuất pho mát, các vi khuẩn lactic với vai trò là giống khởi động được sử dụng nhằm
tạo lập các đặc điểm đặc trưng về cảm quan, cấu trúc và dinh dưỡng cho sản phẩm.

Hơn nữa, hệ enzym của vi khuẩn lactic cũng góp phần tích cực chuyển hóa các sản
phẩm thủy phân protein từ sữa thành các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các giống
khởi động đã được thương mại hóa thường là sự kết hợp của một, hai hoặc một vài
chủng thuộc thuộc các chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc.
2

Hiện nay, ở Việt Nam đã có nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế phẩm
giống khởi động cho lên men thực phẩm như nem chua, tôm chua, sữa chua. Tuy
nhiên, nghiên cứu về giống khởi động ứng dụng cho sản xuất pho mát vẫn chưa
được tiến hành nhiều. Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu tuyển chọn chủng giống khởi động cho lên men pho mát”.
Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic làm giống khởi
động phục vụ cho sản xuất pho mát.
Nội dụng nghiên cứu
 Khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn lactic làm giống khởi động trong
sản xuất pho mát: khả năng đông tụ sữa, kiểu hình lên men lactic, sinh
tổng hợp exopolysaccharide, chuyển hóa citrate, hoạt tính X – prolyl –
dipeptidyl aminopeptidase, hoạt tính chống oxy hóa.
 Tuyển chọn chủng giống, định tên và lập hồ sơ bộ chủng giống.
 Kiểm tra đặc tính của sữa lên men và khả năng tạo hương của pho mát
tươi làm từ sữa lên men bởi hỗn hợp chủng giống.

3

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về pho mát
1.1.1. Pho mát
Pho mát (hay phô mai) là tên gọi chung của một nhóm các sản phẩm từ sữa,
được sản xuất trên toàn thế giới với đủ các hương vị, màu sắc, độ mềm cứng khác
nhau. Hiện nay, có hơn 1000 loại pho mát, được làm từ nhiều nguồn khác nhau như

sữa bò, cừu, dê , nhưng chủ yếu là từ sữa bò. Pho mát là một thực phẩm có nguồn
gốc lâu đời, được cho là bắt nguồn từ khu vực nằm giữa hai con sông Tigris và
Euphrates, nay là Iraq, cách đây khoảng 8000 năm [26, 59].
Pho mát là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein, chất béo
tương đối cao, ở dạng dễ hấp thu, có đầy đủ các axit amin không thay thế, các
vitamin và chất khoáng [9, 58].
Theo định nghĩa của FAO/WHO, pho mát là sản phẩm rắn hoặc bán rắn, ở
dạng tươi hoặc đã qua ủ chín, thu được bằng cách làm đông tụ sữa hoặc các nguyên
liệu từ sữa: sữa gầy, sữa tách béo, cream, whey cream, nhờ hoạt động của enzym
rennet hoặc các tác nhân đông tụ thích hợp khác và làm tách một phần nước khỏi
quện sữa đông [62].
Pho mát có thể được phân loại theo nhiều cách khác nhau: tác nhân đông tụ
casein, độ ẩm, loại vi sinh vật tham gia vào quá trình ủ chín hay dựa vào cấu trúc
của pho mát. Phân loại theo độ ẩm, pho mát được chia các loại như sau:
Bảng 1.1: Phân loại pho mát theo độ ẩm [66]
Loại pho mát

Độ ẩm, % Sản phẩm
Pho mát mềm 55- 80
Pho mát tươi, không ủ chín: Cottage, Ricotta,
Quarg, Mozzarella
Pho mát ủ chín bề mặt bằng nấm mốc: Brie,
Camembert
Pho mát bán
rắn
41 - 55
Pho mát có quá trình ủ chín: Limburger,
Gorgonzola, Roquefort
Pho mát rắn 20 - 40
Pho mát ủ chín có cấu trúc mắt: Emmental

Pho mát ủ chín không có cấu trúc mắt: Cheddar,
Cheshire
4

Phân loại pho mát dựa vào cấu trúc và công nghệ sản xuất:
- Pho mát tươi đông tụ bởi axit, không bổ sung enzym rennet hoặc nếu có thì
với tỷ lệ rất thấp. Axit được tạo ra thường bằng vi khuẩn lactic. Tuy nhiên có một
số loại pho mát tươi được axit hóa trực tiếp bởi gluconodelta – lactone. Sản phẩm
điển hình là Cottage, Quark, Cream và pho mát tươi Bắc Mỹ.
- Pho mát tươi đông tụ bởi rennet, không bổ sung vi khuẩn lactic hoặc nếu có
thì rất ít như: Quesco, Balnco, Quesco Fresco, Halloumi, pho mát tươi từ Ý.
- Pho mát đông tụ bởi axit ở nhiệt độ cao. Sản phẩm có độ ẩm cao nhưng chắc.
Sản phẩm điển hình như Ricotta (Ý), Channa và Paneer (Ấn Độ), pho mát trắng
Mỹ - Latin.
- Pho mát mềm ủ chín: vi khuẩn lactic được cấy vào để lên men lactic trước khâu
được đông tụ bởi enzym rennet. Một số pho mát điển hình như: Fetta, Camembert,
Brie, Blue.
- Pho mát bán cứng có qua giai đoạn rửa hạt pho mát sau đông tụ như: Gouda,
Edam, Colby.
- Pho mát cứng nhiệt độ thấp, không qua giai đoạn rửa hạt pho mát sau đông
tụ như: Cheddar, Pasta Filata.
- Pho mát cứng nhiệt độ cao, quá trình tách nước hỗ trợ bằng nhiệt độ cao như:
Romano, Swiss, Parmersan.
1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ pho mát trên thế giới và Việt Nam
Theo thống kê của FAO, sản lượng pho mát trên thế giới năm 2010 đạt khoảng
20,2 triệu tấn, trong đó tập trung chủ yếu ở khu vực châu Âu, bắc – trung Mỹ với
sản lượng tương ứng là 10,3 và 6,8 triệu tấn. Trong giai đoạn từ 2000 – 2010, sản
lượng pho mát trên toàn thế giới tăng 3,6 triệu tấn, trung bình mỗi năm sản lượng
pho mát tăng khoảng 2% [80]. Tình hình tiêu thụ pho mát cũng khác nhau rõ rệt
giữa các nước và theo khu vực. Pho mát chủ yếu được tiêu thụ ở các nước phát

triển, tập trung nhiều ở khu vực châu Âu và bắc Mỹ. Tuy nhiên, các số liệu thống kê
cũng cho thấy lượng pho mát tiêu thụ được cho đã tăng ở hầu hết các nước.

5


Hình 1.1: Sản lượng pho mát trên thế giới giai đoạn 2000 – 2010 [28]
Ở Việt Nam, tính đến năm 2009, mức tiêu thụ sữa và các sản phẩm từ sữa bình
quân đầu người là 11,2 kg/người/năm thấp hơn nhiều so với mức bình quân của
Châu Á (62 kg/người/năm) và của thế giới (96 kg/người/năm) [4]. Tuy nhiên, cùng
với việc thu nhập bình quân đầu người đang tăng lên hàng năm và thói quen tiêu thụ
sữa được hình thành thì thị trường sữa Việt Nam có tiềm năng tăng trưởng khá tốt
trong tương lai. Theo thống kê của Tổng cục hải quan, kim ngạch nhập khẩu sữa và
các sản phẩm từ sữa của 11 tháng đầu năm 2009 chỉ đạt 287,14 triệu USD, giảm
28,92% so với cùng kì năm 2007 nhưng tới năm 2013, con số này đã tăng lên 839,4
triệu USD, tăng 25% so với cùng kỳ năm 2012 (673,8 triệu USD) [78].
Hiện nay, các sản phẩm pho mát: Chedda, Gouda, Emmental, Pasmesan,
Mozzarella, Edam đã được nhập khẩu vào Việt Nam nhưng mức tiêu thụ chưa cao.
Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng các sản phẩm sạch và có giá trị dinh dưỡng cao ngày
Triệu tấn
6

càng tăng nên các sản phẩm như pho mát sẽ có nhiều triển vọng. Năm 2008, kim
ngạch nhập khẩu pho mát đạt 24,04 triệu USD, tăng 7,33 triệu USD so với năm
2007. Năm 2009, kim ngạch nhập khẩu pho mát 11 tháng đầu năm chiếm 7,23%
tổng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa [6]. Đến nay, pho mát đã trở
thành loại thực phẩm khá quen thuộc ở các thành phố lớn. Đánh giá được nhu cầu
về pho mát sẽ tăng trưởng ở Việt Nam, đặc biệt là loại pho mát chế biến hợp với
khẩu vị và sở thích của người Việt Nam, các công ty chế biến sữa quy mô vừa và
nhỏ như công ty Cổ phần Sữa Ba Vì đang chuẩn bị tham gia vào lĩnh vực sản xuất

này.

Hình 1.2: Tỉ trọng kim ngạch nhập khẩu sữa và các sản phẩm từ sữa
của Việt Nam, năm 2009 [6]
1.1.3. Công nghệ sản xuất pho mát
Sản xuất pho mát thực chất là quá trình loại nước khỏi sữa, trong đó casein và
chất béo của sữa được cô đặc từ 6 – 12 lần tùy từng loại pho mát, bắt đầu bằng một
hoặc kết hợp của hai quá trình: lên men nhờ vi sinh vật và đông tụ protein sữa nhờ
enzym rennet. Quy trình sản xuất pho mát gồm các khâu chính: đông tụ sữa, loại
nước khỏi quện sữa (cắt quện sữa, nấu, khuấy, ép), tạo hình (nghiền, đổ khuôn, ép)
và muối. Tuy nhiên, ở mỗi khâu cách thức thực hiện khác nhau đã tạo ra các sản
phẩm đặc trưng riêng. Quy trình sản xuất có thể tóm tắt như sau [9, 10, 59]:
7

- Tiêu chuẩn hóa: Pho mát có thể làm từ sữa, sữa đã tách béo hoặc tách một
phần chất béo. Trước khi đưa vào sản xuất sữa được tiêu chuẩn hóa nhằm đảm bảo
nguồn nguyên liệu ổn định để tạo ra sản phẩm pho mát có chất lượng đồng nhất.
- Thanh trùng: Thanh trùng nhằm tiêu diệt hệ vi sinh vật có mặt trong sữa. Tuy
nhiên, thanh trùng cũng làm giảm hàm lượng canxi trong sữa do đó làm giảm khả
năng đông tụ sữa bằng enzym. Để khắc phục nhược điểm này, nhà sản xuất thường
bổ sung thêm muối calcium chloride. Chế độ thanh trùng phổ biến 72 – 76
o
C, trong
15 – 20 giây. Một số loại pho mát như Parmigiano – Reggiano làm từ sữa tươi chưa
qua thanh trùng.
- Đông tụ sữa: Quá trình đông tụ casin có thể thực hiện bằng tác nhân đông tụ là
enzym hoặc giống khởi động. Một số loại pho mát, quá trình này diễn ra nhờ sự kết
hợp cả hai tác nhân trên. Giống khởi động cho mỗi loại pho mát thường khác nhau:
Giống khởi động trong sản xuất pho mát Cheddar là các vi khuẩn lactic ưa ấm, có thể
là một hoặc kết hợp cả hai loài Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp.

lactis; ở pho mát Emmental là các vi khuẩn ưa nhiệt và có thể có các vi khuẩn
propionic; các pho mát sử dụng sữa chưa thanh trùng thì hệ vi sinh vật sẵn có trong sữa
được xem như là giống khởi động.
- Tách nước khỏi quện sữa: Giai đoạn này gồm các bước cắt quện sữa, gia nhiệt
nhằm làm đẩy nhanh quá trình tách nước. Ở mỗi loại pho mát, thời gian và nhiệt độ gia
nhiệt quện sữa là khác nhau: Ở pho mát Cheddar quện sữa được gia nhiệt tới 37 –
39
o
C, pho mát Parmigiano – Reggiano, Emmental nhiệt độ gia nhiệt lên tới 53 – 55
o
C.
- Tạo hình và muối: Sau khi tách nước, quện sữa có thể được xay nhỏ, bổ sung
thêm muối và ép, tạo khuôn hoặc được ép thành khuôn trước, sau đó bổ sung muối
bằng cách ngâm trong bể muối từ 1 -2 ngày. Kết thúc quá trình này, thu được pho mát
tươi và sử dụng được.
- Ủ chín: Pho mát tươi có thời hạn sử dụng ngắn (1 – 2 tuần). Để kéo dài thời gian
sử dụng cũng như tạo cảm quan về hương vị, các loại pho mát thường được ủ chín. Nhiệt
độ ủ chín thường 4 – 12
o
C, tùy từng pho mát mà thời gian ủ chín có thể từ 1 – 2 tháng
(Emmental), 2 – 3 tháng (Gouda) hoặc tới 2 năm (Parmigiano – Reggiano).
8


Hình 1.3: Sơ đồ sản xuất pho mát Cheddar (a) và Emmental (b) [59]
1.1.4. Các quá trình chuyển hóa của vi khuẩn lactic trong sản xuất pho mát
Quá trình sản xuất pho mát đòi hỏi phải có vi khuẩn lactic (LAB). Chúng có
thể được chủ động bổ sung vào sữa hoặc sử dụng ngay những vi khuẩn có mặt trong
sữa tươi.
Vi khuẩn lactic đã được sử dụng trên toàn thế giới, đóng vai trò quan trọng

trong lên men thực phẩm ở quy mô công nghiệp. Thuật ngữ vi khuẩn lactic dùng để
chỉ đặc điểm của quá trình trao đổi chất cơ bản của nhóm vi khuẩn này: Chuyển hóa
đường hexose chủ yếu thành axit lactic. Do liên quan tới sản xuất axit lactic nên
9

định nghĩa mang tính chất hóa sinh nhiều hơn phân loại học. Trong sản xuất pho
mát, các vi khuẩn lactic tham gia vào nhiều quá trình sinh hóa:
1.1.4.1. Quá trình chuyển hóa lactose
Lên men lactose thành L – axit lactic là chức năng cơ bản của chủng giống
khởi động trong sản xuất pho mát. Sự axit hóa này không chỉ tới ảnh hưởng đến cấu
trúc ban đầu của quện sữa mà còn ảnh hưởng tới chất lượng pho mát do pH quyết
định khả năng hòa tan của casein [61]. Ngoài ra, pH còn gián tiếp tác động tới việc
tổng hợp chất thơm: tạo ra hệ đệm quy định sự sinh trưởng của vi sinh vật và khả
năng hoạt động của các enzym trong quá trình ủ chín.
Tùy theo giống khởi động mà lactose có thể được chuyển hóa theo con đường
Embden-Meyerhof (EM) hoặc con đường phosphoketolase (hình 1.4). Theo con đường
EM, từ một phân tử glucose tạo ra hai phân tử axit lactic. Theo con đường
phosphoketolase thì một phân tử glucose tạo ra một phân tử axit lactic, ethanol và CO
2
.

Hình 1.4: Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic [42]
Streptococcus thermophilus không sử dụng được galactose, khi lên men sữa sẽ
gây ra sự tích tụ galactose trong quện sữa. Do đó, loài này thường được kết hợp với
các loài có khả năng sử dụng galactose. Trong sản xuất pho mát, việc lên men triệt
để nguồn lactose là quan trọng để tránh sự phát triển quá mức của hệ vi sinh vật
không mong muốn khác [61].
10

1.1.4.2. Quá trình chuyển hóa axit lactic

Lactate cũng là một chất thơm của pho mát. Ở một số pho mát Thụy Sĩ,
lactate là nguồn cơ chất chính cho vi khuẩn propionic Propionibacterium sp. sinh
trưởng. Chúng chuyển hóa lactate thành axit propionic (cũng là hợp chất thơm) và
CO
2
– tạo ra cấu trúc mắt của pho mát [60]. Ngoài ra, lactate có thể bị oxy hóa theo
các con đường khác nhau, tổng hợp nên các hợp chất thơm khác như acetate,
ethanol, formate ở giai đoạn ủ chín. Tuy nhiên, mức độ oxy hóa này phụ thuộc vào
hệ vi sinh vật và sự sẵn có oxy trong pho mát. Một số chủng lactobacili và
pediococci phân lập từ pho mát Cheddar có khả năng oxy hóa lactate thành acetate
và CO
2
trong điều kiện hiếu khí ở phòng thí nghiệm và hệ thống oxy hóa này được
cho là cũng xảy ra dưới những điều kiện ủ chín của pho mát Cheddar. Khi có mặt
của oxy, một vài chủng pediococci có thể oxy hóa lactate thành formate và acetate.
Sự có sẵn oxy không chỉ phụ thuộc vào kích thước khối pho mát mà còn do tính
thấm oxy của vật liệu bao gói quy định. Ở các loại pho mát có màng bọc, quá trình
oxy hóa lactate xảy ra rất hạn chế do lượng oxy sẵn có thấp [61].

Hình 1.5: Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín pho mát [59,61]
1) Sự raxemic hóa; 2) Chuyển hóa bởi Propionibacterium freudenreichii ở pho mát Thụy
Sĩ; 3) Quá trình oxi hóa lactate; 4) Chuyển hóa thành formate, ethanol và acetate; 5)
Chuyển hóa kị khí lactate thành butyrate và H
2
.
11

Ở một số loại pho mát rắn, quá trình đường phân có thể tạo ra một số sản
phẩm không mong muốn trong giai đoạn ủ chín. Dưới điều kiện kị khí, Clostridium
tyrobutyricum chuyển hóa lactate thành butyrate và khí H

2
. Quá trình này không chỉ
tạo ra khí H
2
gây hiện tượng vỡ pho mát mà còn liên quan đến sự phát triển của các
hợp chất không có hương vị [61]. Để tránh hiện tượng này, một số kỹ thuật làm
giảm số lượng bào tử trong sữa được sử dụng như: vệ sinh sạch sẽ, ngăn cản sự nảy
mầm của bào tử bằng việc bổ sung lysozyme hay bổ sung thêm nitrate (NO
3
-
) hoặc
loại bỏ cơ học các bào từ bằng vi lọc [59].
1.1.4.3. Quá trình chuyển hóa citrate
Hàm lượng citrate trong sữa tươi khoảng 8 mmol/ lít sữa, nhưng 94% trong số
này bị mất trong quá trình sản xuất pho mát do hòa tan vào huyết tương sữa [60].
Tuy nhiên, một lượng ít citrate còn lại trong quện sữa (10mmol/kg quện sữa) lại
đóng vai trò quan trọng trong quá trình thành các hợp chất thơm bay hơi. Một số
loài có khả năng chuyển hóa citrate (Cit
+
) như Lactococcus lactis subsp. lactis
biovar diacetylactis (trước đây gọi là Streptococcus diacetylactis) và Leuconostoc
spp. (như Leuconostoc mesenteriodes subsp. cremoris và Ln. lactis) [42, 48, 60].
Các loài này có gen mã hóa cho protein vận chuyển citrate ngoại bào vào tế bào
chất nằm trên plasmid.
12


Hình 1.6: Các con đường chuyển hóa citrate của các chủng Cit
+
thuộc Lactococcus

và Leuconostoc sp. [59, 61]
Các chủng Cit
+
không sử dụng citrate như là nguồn năng lượng nhưng chúng
nhanh chóng chuyển hóa citrate khi có mặt của lactose và một số loại đường khác
theo các con đường như hình 1.6. Sản phẩm của quá trình chuyển hóa là CO
2
,
diacetyl, acetate, acetoin và có thể có 2,3 – butanediol. CO
2
đóng vai trò chính trong
việc tạo nên cấu trúc “mắt” của một số pho mát Hà Lan. Diacetyl là một hợp chất
thơm quan trọng của pho mát, nhưng các phản ứng dẫn đến sự tổng hợp diacetyl thì
chưa được nghiên cứu sâu. Diacetyl có thể được tổng hợp trực tiếp từ acetaldehyde
13

– thiamine pyrophosphate (Acetaldehyde TPP) và acetyl – CoA nhưng enzym
diacetyl synthase chưa được nhận dạng một cách rõ ràng ở LAB hoặc có thể được
tổng hợp từ quá trình oxy hóa α – acetolactate [56]. Diacetyl thường được tổng hợp
với một lượng rất nhỏ (<0,11 mmol) trong khi đó lượng acetoin sinh ra cao hơn 10
– 50 lần [59].
Một số loài Lactobacillus có khả năng sử dụng citrate để tổng hợp succinate
(hình 1.7). Succinate là một axit hữu cơ, có vị cay mặn, là một trong 15 hợp chất cần
thiết tạo nên hương vị của pho mát. Ở pho mát Emmental, hàm lượng succinate được
công bố là 0,8 – 1,4 g/kg [25]. Ở pho mát Cheddar, một số loài Lactobacillus tổng
hợp succinate thông qua chu trình tricacboxilic acid dạng rút gọn (chu trình TCA)
[42]. Ở pho mát Thụy Sĩ, succinate được các vi khuẩn propionic tổng hợp từ quá trình
dị hóa axit aspartic. Các chủng này không phải đóng vai trò là chủng khởi động.

Hình 1.7: Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus [25]

Các enzym tham gia: 1 – lactate dehydrogenase; 2 – pyruvate casrboxylase; 3 –
malate dehydrogenase; 4 – fumarase; 5 – fumarate reductase; 6 – citrate lyase; 7 –
aspartate aminotransferase; 8 – aspartase; 9 – aconitase; 10 – isocitrate lyase
14

1.1.4.4. Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo
Chất béo sữa có vai trò quan trọng để tạo nên những hợp chất hương thuần túy
của pho mát. Những nghiên cứu ở pho mát Cheddar cho thấy pho mát được sản xuất
từ sữa đã thay chất béo bằng nguồn lipit khác đã không tạo ra hương thơm chính
xác. Trên thực tế, việc phát triển hương vị hài hòa là khó khăn chính khi sản xuất
loại pho mát ít hoặc tách chất béo [29, 60].
Quá trình phân giải lipit diễn ra chủ yếu trong giai đoạn ủ chín pho mát.
Lipase tồn tại trong pho mát do nhiều nguồn khác nhau. Bản thân sữa tươi cũng
chứa enzym lipoprotein lipase, tuy nhiên hoạt tính của enzym bị mất ở sữa đã thanh
trùng. Một số pho mát Ý như Provolone, Pecorino trong quá trình sản xuất người ta
bổ sung hỗn hợp lipase, esterase cùng với enzym rennet. Hệ enzym lipase/esterase
của chủng khởi động ít được quan tâm hơn hệ enzym phân giải protein. Các loài
Lactococcus có hoạt tính phân giải lipit yếu nhưng có thể đã giải phóng một lượng
lớn axit béo tự do khi mật độ tế bào ở mức cao sau giai đoạn đông tụ sữa. Các
lipase/esterase của Lactococcus thường là enzym nội bào. Các loài Lactobacillus
lên men lactic đồng hình bắt buộc như: Lactobacillus helveticus, Lb. delbrueckii
subsp. bulgaricus và Lb. delbrueckii subsp. lactis cũng tổng hợp esterase [60]. Các
loài Lactobacillus lên men lactic dị hình tùy nghi như Lb. casei, Lb. paracasei và Lb.
plantarum chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật không đóng vai trò là chủng khởi động
(Nonstarter lactic acid bacteria – NSLAB) cũng có hoạt tính phân giải lipit yếu.
15


Hình 1.8: Các con đường chuyển hóa axit béo tự do [59]
Quá trình phân giải triglyceride tạo ra các axit béo, glycerol, mono – hoặc

diglyceride. Chất béo trong sữa của các động vật nhai lại chứa lượng lớn các chuỗi
axit béo ngắn và trung bình, khi bị thủy phân chúng đóng góp đáng kể vào việc tạo
hương của nhiều loại pho mát. Các axit béo tự do có thể phản ứng với ethanol hoặc
các nhóm chứa gốc lưu huỳnh tạo ra các ester hoặc thioester (hình 1.8). Có tới 14
loại ester khác nhau được tìm thấy trong pho mát Emmental, và ester cũng được cho
là góp phần vào hương thơm ở pho mát Parmigiano – Reggiano. Các ester phổ biến
nhất trong số 38 ester được tìm thấy trong pho mát Parmigiano – Reggiano bao
gồm: ethyl butanoate, ethyl hexanoate, ethyl acetate, ethyl octanoate, ethyl
decanoate và methyl hexanoate [42, 60].
16

1.1.4.5. Quá trình phân giải protein
Phân giải protein là quá trình phức tạp nhất và có thể là quan trọng nhất trong số
các sự kiện sinh hóa diễn ra ở giai đoạn ủ chín pho mát. Quá trình này ảnh hưởng đến
sự hình thành hương vị của pho mát theo nhiều hướng khác nhau. Một vài chuỗi
peptit ngắn, axit amin tạo hương vị và có thể là cả vị không mong muốn (như vị
đắng) cho pho mát (bảng 1.2). Sự phân giải casein làm thay đổi cấu trúc pho mát (làm
mềm) tạo điều kiện để giải phóng các hợp chất có vị trong khi nhai. Ngoài ra, quá
trình này còn là nguồn cung cấp cơ chất (axit amin) cho một loạt các quá trình dị hóa
diễn ra sau đó như: sự khử amin, khử cacboxyl, chuyển amin, khử lưu huỳnh [59].
Bảng 1.2: Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của pho mát
Cheddar (ủ chín 6 tháng) [60]
Axit
amin
Q
(cal/mol)

Ngưỡng vị
(mg/100mL)

Nồng độ trong
Cheddar
(µg/g)

Cảm nhận
Vị
Ngọt Mặn Chua Đắng Umami

Các enzym xúc tác cho quá trình phân giải có thể bắt nguồn từ nhiều nguồn
khác nhau: từ tác nhân đông tụ (chymosin, pepsin hay các proteinase có nguồn gốc
từ thực vật hoặc nấm); từ sữa (plasmin, cathepsin D); các chủng khởi động và các
chủng tự nhiên có trong sữa; các chủng khởi động thứ cấp gặp ở một số loại pho
mát rắn: Propionibacterium freudenreichii ở pho mát Thụy Sĩ, P. camemberti ở
pho mát Camembert và Brie, P. roqueforti ở pho mát Blue [61]. Ngoài ra, các
peptidase hoặc proteinase cũng có thể được bổ sung vào quện sữa để đẩy nhanh quá
trình chín [29].
17

Ở hầu hết các loại pho mát, quá trình thủy phân casein ban đầu diễn ra chủ yếu
nhờ hoạt động của enzym đông tụ và một mức độ ít hơn của các plasmin, tạo ra các
peptit chuỗi dài và trung bình. Các oligopeptit này được hấp thụ vào tế bào nhờ
kênh vận chuyển oligopeptit, di -/tri – peptit [41]. Trong tế bào chất, các peptit bị
phân giải nhờ một loạt các enzym nội bào. Các peptidase của LAB được chia thành
các endopeptidase, aminopeptidase, di -/tri – peptidase [16, 34]. Sản phẩm cuối
cùng của quá trình phân giải protein là các axit amin tự do (FAA). Nồng độ FAA
phụ thuộc vào từng loại pho mát và được dùng như là một chỉ số của sự chín [29].
Nồng độ của FAA trong pho mát ở bất kì giai đoạn của quá trình chín là kết quả của
sự giải phóng các axit amin từ casein và sự chuyển hóa các axit amin thành các sản
phẩm khác qua quá trình dị hóa. Các axit amin chính ở pho mát Cheddar là
glutamate, leucine, arginine, lysine, phenylalanine và serine [70]. Nồng độ của các

axit amin thường là tăng lên trong quá trình chín, ngoại trừ arginine [63].
Mặc dù một số peptit, axit amin có hương vị đặc trưng như vị đắng, ngọt, malt
nhưng nhìn chung chúng chỉ tạo nên hương vị cơ bản của pho mát. Việc tác động
nhằm làm tăng quá mức hoạt tính của một vài enzym phân giải protein, cũng như
việc thêm các axit amin vào pho mát hầu như không ảnh hưởng tích cực đến hương
vị của sản phẩm. Sự phân giải protein một cách không cân đối có thể dẫn tới sự dư
thừa các peptit có vị đắng và do đó, làm giảm hương vị vốn có của pho mát [74].
18


Hình 1.9: Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm
sữa lên men [70]
Trong tế bào, hầu hết axit amin bị chuyển hóa thành α – keto axit nhờ enzym
aminotransferase. Axit α – Keto là chất trung gian, có thể bị chuyển hóa thành axit
hydoroxy, aldehyde hay CoA – ester. Các phản ứng này hầu hết diễn ra nhờ enzym,
nhưng cũng có thể xảy ra sự chuyển đổi hóa học như sự hình thành benzaldehyde từ
axit phenypyruvic [65]. Các aldehyde có thể bị khử hydro hoặc hydro hóa để tạo
thành các chất tương ứng là alcohol và axit hữu cơ. Các hợp chất này là cơ chất cho
các enzym esterase và acyltransferase hoạt động, tạo ra các (thio) – ester. Một trong
những vai trò sinh học của sự phân giải axit amin là tổng hợp nên các tiền chất,
chẳng hạn như cần thiết cho sự tổng hợp sterol và các chuỗi axit béo có nhánh.
Con đường chuyển hóa axit amin quan trọng khác, được bắt đầu bởi enzym
lyase như: cystathionine β – lyase có khả năng xúc tác chuyển hóa methionine thành
Ngoại bào
Nội bào
Axit amin
Axit amin
19

methanethiol [23]; threonine aldolase, thuộc lớp enzym lyase khác, có thể chuyển

hóa trực tiếp threonine thành acetaldehyde [45].
Các hợp chất có hương tiềm năng nhất trong sơ đồ trên là các aldehyde,
alcohol, axit cacboxylic và ester. Trong đó, quan trọng hơn cả là các các aldehyde,
alcohol, axit cacboxylic và ester được chuyển hóa từ các axit amin: methionine,
phenylalanine, threonine [42].
Bảng 1.3: Các hợp chất hương hình thành từ quá trình chuyển hóa axit amin qua
axit α – keto theo con đường chuyển hóa transaminase [60]
Axit
amin
Axit keto Andehit Axit hữu cơ
Alcohol
(thiol)
Este

1.2. Giống khởi động cho sản xuất pho mát
1.2.1. Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động trong công nghiệp sản xuất pho mát
Giống khởi động cho sản xuất sản phẩm từ sữa là vi sinh vật được chủ động
bổ sung vào nguyên liệu để tạo ra sản phẩm cuối cùng với các đặc điểm mong
muốn, thông qua sự phát triển và quá trình lên men của chúng [64].
Bảng 1.4: Các giống khởi động của một số loại pho mát [17]
STT Loại pho mát Giống khởi động
1 Parmesan, Romano
Hỗn hợp Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus
thermophilus.
2 Cheddar
Lactococcus lactis ssp. lactis; Lc. lactis ssp. cremoris;
Lc. lactis ssp. lactis var. diacetylactis.
3 Swiss, Emmental
Hỗn hợp Lactobacillus bulgaricus (hoặc Lactobacillus
lactis hoặc Lactobacillus helveticus) và Streptococcus

thermophilus và Propiani bacterium shermanii.
4 Provolone
Hỗn hợp các chủng Lactobacillus chịu nhiệt và
Streptococcus thermophilus