CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ ENZIM

CHƯƠNG 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH
CHẾ ENZIM
•
Giai đoạn 1: dựa trên các tính chất lý – hoá học tác động lên các
chất phân tử lượng lớn.
•
Giai đoạn 2:

Khai thác các tính chất đặc trưng khác nhau của protein cầu.

Phân tách dựa trên các thông số riêng như trọng lượng phân tử,
điện tích của protein.
•
Giai đoạn 3: dựa trên những tương tác đặc hiệu và có tính rhuận
nghịch giữa enzim và:

Cơ chất.

Coenzim.

Chất gắn.

Chất hoạt hoá.

ξ1. LỊCH SỬ PHAT TRIỂN CỦA TINH CHẾ
ENZIM

•

ξ2. NGUYÊN TẮC CHỌN PHƯƠNG PHÁP TINH

CHẾ ENZIM

Xác định enzim mong muốn là gì và chọn nguyên liệu giàu enzim.

Xác định các đặc trưng của nguyên liệu:

Bản chất của NL: lỏng, rắn

Dạng chung của NL: động vật, thực vật, VSV.

Cấu trúc sinh học của NL: tế bào VSV, tế bào thực vật.

Xác định vùng chứa enzim: ty thể, tế bào chất, màng tế bào.

Xác định các tính chất cấu trúc và lý hoá của enzim: trọng lượng PT,
cấu trúc PT, hằng số động học, tính ổn định PT, pH tối ưu, điểm đẳng
điện, chất hoạt hoá, chất kìm hãm…

Phải có phương pháp giải phóng protein dưới dạng hoà tan mà không
làm mất hoạt tính của nó.

Xử lý phải thực hiện ở T thấp (+4
O
C); môi trường có chất đệm; tác
nhân bảo về (nếu cần như EDTA, 2-mecaptoetanol…); thời gian xử lý
ngắn.

ξ3. CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA ĐỂ PHÂN
ĐOẠN ENZIM
1. Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính

•
Nguyên tắc:

Protein hoà tan trong các dung dịch muối có pH xa với điểm đẳng điện.

Độ hoà tan của P chỉ tăng cùng với lực ion MT trong một khoảng nhất định
của [muối], Nồng độ muối cao hơn protein enzim có thể kết tủa.

Mối enzim có một khoảng [muối] mà enzim kết tủa hoàn toàn, gọi là nồng
độ muối tích. Dựa vào tính tan khác nhau mà phân đoạn enzim.
•
Cách tiến hành

Bổ sung vào dịch chứa enzim một thể tích muối bão hoà hoặc một lượng
muối trung tính dạng rắn để đạt được độ phần trăm bão hoà nào đó của
muối này.

Nếu kết tủa là những phần tử không phải enzim mong muốn thì tách hai
pha lỏng rắn và loại bỏ kết tủa thu hồi dịch trong.

Nếu enzim cần tinh chế kết tủa thì sau khi phân tách hai pha lỏng - rắn hoà
tan kết tủa trong một lượng nhỏ dung dịch đệm.

•
Loại muối và cách tính lượng muối sử dụng

Muối sulfat amôn và muối sulfat natri: giá rẻ, khả năng kết tủa cao, độ hoà
tan lớn, protein ít bị biến tính, thao tác đơn giản.

Các công thức tính lượng muối cần thiết đưa vào dung dịch như sau:

2
12
1
).(100
S
SS
Y
−
−
=
( )






−
−
=
1000
1
..1,0
2
12
g
V
S
GSS
A

Trong đó:G số gam (NH
4
)
2
SO
4
trong 1000ml dung dịch bão hoà
(G = 515g ở 0
o
C; 530,7g ở 15
o
C; 536g ở 20
o
C.
V
g
thể tích riêng biểu kiến của dung dịch (NH
4
)
2
SO
4
bão hoà
(V
g
/1000 = 0,271 ở 0
o
C; V
g
/1000 = 0,288 ở 15

o
C; V
g
/1000 = 0,29 ở 20
o
C.
Y: dung dịch muối bão hoà (ml) bổ sung vào 100ml dịch enzim
A: trọng lượng muối tinh thể (g) bổ sung vào 100ml dịch enzim
S
1
: độ bão hoà ban đầu của dung dịch
S
2
: độ bão hoà của dung dịch cuối nhận được

•
Kết tinh enzim

Kết tủa enzim thu hồi được phân tách nhờ dung dịch muối sulfat amôn có
nồng độ giảm dần ở 0
o
C. Các protein nhiễm tạp hoà tan ở nồng độ muối
cao hơn enzim sẽ được loại ra.
Ví dụ: một enzim kết tủa trong khoảng độ bão hoà 45 – 60% sẽ được tách
chiết với các dung dịch muối bão hoà 65; 58; 52%.

Nâng nhiệt độ của các phần phân đoạn nhận được tới nhiệt độ môi trường
và protein enzim kết tinh. Qúa trình kết tinh có thể thực hiện chỉ trong một
vài phút hoặc vài giờ.


Các đoạn protein enzim thu được sau đó phải được loại bỏ muối bằng
phương pháp thẩm tích hoặc phương pháp lọc gel.
•
Ưu nhược điểm của phương pháp

Kỹ thuật này cho phép nhận được một phần phân đoạn được làm giàu enzim
từ thể tích lớn: loại bỏ các protein, enzim liên kết hạy các tạp chất khác
không hoà tan trước và sau phần phân đoạn có chứa enzim cần tách chiết.

Thao tác đơn giản, dễ áp dụng nên được dùng phổ biến, nhưng khi làm việc
với thể tích lớn có nhiều khó khăn do đòi hỏi thiết bị phải chịu độ ăn mòn của
muối cao (inox).

Khoảng nồng độ muối tích của các protein thường hay trùng nhau nên không
bao giờ có thể thu được các phần phân đoạn enzim tinh khiết hoàn toàn.

Thường sử dụng phương pháp này vào giai đoạn đầu của quá trình tinh chế
enzim.

2. Kết tủa đẳngđiện
•
Nguyên tắc:
–
Enzim có độ hoà tan tối thiểu xung quanh điểm đẳng điện (pI),
vì phân tử protein enzim có tổng điện tích bằng không.
–
Không có lực đẩy tĩnh điện nên các phân tử protein enzim sẽ
kết hợp với nhau tạo nên kết tủa.
–
Mỗi protein có một pI khác nhau phụ thuộc thành phần axit amin

trong chuỗi mạch bên ion hoá, do đó kết tủa được enzim mong
muốn hoặc các protein tạp khác.
•
Cách tiến hành
–
Điều chỉnh pH của dịch hỗn hợp chứa enzim tới điểm đẳng điện
của enzim cần phân tách hoặc của các protein tạp.
–
Lọc hay ly tâm để thu hoặc loại bỏ các kết tủa.
•
Ưu nhược điểm của phương pháp
–
Kỹ thuật đơn giản, dễ áp dụng.
–
Quá trình điều chỉnh pH môi trường có thể dẫn tới biến tính
protein enzim ở một vài pH.

3. Tác dụng của nhiệt độ
•
Nguyên tắc:
–
Enzim có độ hoà tan tăng cùng với nhiệt độ
trong giới hạn dưới 40 – 50
o
C.
–
Vượt qua ngưỡng giới hạn này protein enzim
trở nên không ổn định và biến tính.
–
Dựa vào sự khác nhau về độ ổn định của

protein enzim ở nhiệt độ cao để phân huỷ một
cách chọn lọc một số enzim nhiễm tạp.
•
Ưu nhược điểm của phương pháp
–
Kỹ thuật đòi hỏi giá thành cao.
–
Cần phải kiểm soát chặt chẽ để tránh tổn thất
enzim mong muốn.

4. Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
•
Nguyên tắc:
–
Dung môi hữu cơ trung tính hoà tan trong nước sẽ làm thay đổi hằng số
điện môi của dung dịch, làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein.
–
Khi bổ sung lượng dung môi tăng dần thì phức hợp giữa các phân tử protein
enzim tích điện trái dấu lớn dần cho tới khi kết tủa.
–
Tuỳ tính chất từng loại protein enzim, dung môi hữu cơ và điều kiện kết tủa
mà mỗi enzim được kết tủa được kết tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác
nhau.
Protease kết tủa với etanol 76 – 78% (v/v)
α-amylase kết tủa với etanol 70%; hoặc izopropanol 55%; hoặc axeton 60%.
Glucoamylase kết tủa với etanol 45%.
•
Ưu nhược điểm của phương pháp
–
Một số dung môi sau khi sử dụng có thể chưng cất và thu hồi lại được.

–
Xử lý phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (trên điểm lạnh đông) vì dung môi
là các chất dễ cháy (-5
o
C).
–
Phương pháp chr sử dụng đối với enzim ít bị biến tính bởi dung môi hữu cơ.
–
Dùng với qui mô nhỏ do chi phí cao.

5. Kết tủa bằng các polyme có khối lượng phân tử lớn
–
Các polyme như dextran, polyetylen glycol thường rất háo nước sẽ làm
mất lớp vỏ solvat hoá của các phân tử protein enzim, kéo theo sự thay đổi
hằng số điện môi của môi trường xung quanh, thay đổi các tương tác
không gian của các nhóm háo nước trong các phân tử protein enzim.
–
Polyetylen glycol ở nồng độ 5% (theo trọng lượng) trong nước có thể làm
kết tủa phần lớn các protein nồng độ 6 – 20%.
–
Hiệu suất kết tủa phụ thuộc vào nhiệt độ, lực ion, pH, nồng độ protein và
khối lượng phân tử của các enzim.
6. Kết tủa bằng ion kim loại và các tác nhân đặc hiệu
–
Liên kết ion kim loại – protein làm giảm độ hoà tan của protein.
–
Kỹ thuật này không áp dụng để tạo kết tủa enzim mong muốn vì phức tạo
nên thường không phải là thuận nghịch (dẫn suất sulhydryl) và biến tính
protein enzim.
–

Kỹ thuật này được áp dụng để tách axit nucleic ra khỏi hỗn hợp sau khi
phá vỡ tế bào VSV. Ion kim loại (Mn
+2
) tạo muối kết tủa với axit nucleic và
được loại ra ngoài. Axit nucleic chiếm khoảng 7% ở E. coli, có độ nhớt cao
ảnh hưởng lớn tới quá trình tinh chế enzim.
–
Axit nucliec có nhóm axit mạnh liên kết với nhóm amin cuỉa protein enzim
trong môi trường axit làm kết tủa chúng. Bổ sung protein kiềm tính như
protamin sẽ thay thế được vị trí của protein trong phức hợp và enzim sẽ
tồn tại trong dung dịch. Ly tâm để laọi bỏ phức này.
–
Các chất phản ứng thường sử dụng là muối mangan, sulfat streptomycin,
sulfat protamin, bromcetytrimetylamôn, polyetylenimin (polyme cationic).
Kinh tế nhất là sử dụng chế phẩm enzim nuclease (ribo và desoxyribo
nuclease).