Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus. Có khả năng xử lý nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn Quế Cường - Quế Sơn - Quảng Nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG




LÊ THỊ DŨNG






NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI
KHUẨN BACILLUS SP. CÓ KHẢ NĂNG XỬ LÝ
NƯỚC THẢI NHÀ MÁY CHẾ BIẾN TINH BỘT
SẮN QUẾ CƯỜNG – QUẾ SƠN – QUẢNG NAM







KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng - Năm 2015






ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƯỜNG





LÊ THỊ DŨNG




NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI

KHUẨN BACILLUS SP. CÓ KHẢ NĂNG XỬ LÝ
NƯỚC THẢI NHÀ MÁY CHẾ BIẾN TINH BỘT
SẮN QUẾ CƯỜNG – QUẾ SƠN – QUẢNG NAM





Chuyên ngành: Quản lý tài nguyên và môi trường



Người hướng dẫn khoa học: ThS. Nguyễn Thị Lan Phương









Đà Nẵng - Năm 2015


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn
Bacillus sp. có khả năng xử lý nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn
Quế Cường - Quế Sơn - Quảng Nam” là kết quả nghiên cứu của tác giả.

Các số liệu nghiên cứu, kết quả điều tra, kết quả phân tích trung thực,
chưa từng được công bố. Các số liệu liên quan được trích dẫn có ghi chú
nguồn gốc.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nếu kết quả là sản phẩm kế thừa
hoặc đã công bố của người khác.
Đà Nẵng, tháng 5 năm 2015
Tác giả


Lê Thị Dũng















LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này em bày tỏ lòng cảm ơn chân thành
đến cô Nguyễn Thị Lan Phương người đã trực tiếp hướng dẫn chỉ bảo tận tình em
suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa

Sinh – Môi trường, các thầy cô giáo và giám đốc công ty Cổ phần FOCOCEV
Quảng Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện khóa luận của mình.
Cuối cùng xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã động viên và giúp đỡ kịp thời.


Đà Nẵng, ngày 06 tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực hiện


Lê Thị Dũng
















MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu của đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3
4.1. Ý nghĩa khoa học 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Tổng quan về vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme amylase 4
1.1.1. Tổng quan về enzyme amylase và các ứng dụng của enzyme amylase 4
1.1.2. Tổng quan về vi sinh vật sinh tổng hợp amylase 5
1.2. Một số nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus phân giải tinh bột 6
1.2.1. Một số nghiên cứu trong nước 7
1.2.2. Một số nghiên cứu ngoài nước 8
1.3. Tổng quan về các phương pháp xử lý nước thải. 8
1.3.1. Phương pháp xử lý cơ học 9
1.3.2. Phương pháp xử lý hóa học và hóa lý 10
1.3.3. Phương pháp xử lý sinh học 10
1.4. Thực trạng xử lý nước thải tinh bột sắn ở Việt Nam và trên địa bàn tỉnh
Quảng Nam 11
1.4.1. Thực trạng xử lý nước thải tinh bột sắn ở Việt Nam 11
1.4.2. Thực trạng xử lý nước thải tinh bột sắn Quảng Nam. 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu 14
2.2. Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu 14
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 14


2.2.2. Phạm vi nghiên cứu 14

2.2.3. Thời gian nghiên cứu 15
2.3. Vật liệu và phương pháp 15
2.3.1. Vật liệu 15
2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 24
3.1. Kết quả phân lập và xác định VK từ nước thải chế biến tinh bột sắn 24
3.2. Test nhanh với KOH 25
3.3. Kết quả nhuộm Gram 26
3.4. Kết quả nhuộm bào tử 26
3.5. Kết quả xác định chủng VK có hoạt tính amylase 27
3.6. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
30
3.6.1. Ảnh hưởng của pH 30
3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 31
3.6.3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh hoạt tính enzyme của VK
32
3.7. Kết quả xác định mật độ vi khuẩn cho vào bể xử lý sinh học hiếu khí 34
3.8. Kết quả xử lý nước thải tinh bột sắn bằng bể xử lý sinh học hiếu khí 35
3.8.1. pH 36
3.8.2. COD 37
3.8.3. BOD
5
38
3.8.4. Chất rắn lơ lửng (SS) 40
3.8.5. Nitơ tổng 41
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
4.1. Kết luận 44
4.2. Kiến nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
TIẾNG VIỆT 45

TIẾNG ANH 46
PHỤ LỤC HÌNH ẢNH



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


VK Vi khuẩn
ĐHQGHN Đại học quốc gia Hà Nội
BOD (Biochemical Oxygen Demand)

Nhu cầu oxy sinh hóa
COD (Chemical Oxygen Demand) Nhu cầu oxy hóa học
XLNT Xử lý nước thải
SS Chất rắn lơ lửng
QCVN Quy chuẩn Việt Nam
TNHH Trách nhiệm hữu hạn
TBS Tinh bột sắn
VSV Vi sinh vât
BTNMT Bộ tài nguyên môi trường

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Số hiệu
bảng
Tên bảng Trang

Bảng 1.1
Phương pháp xử lý theo tinh chất của nước thải 9
Bảng 3.1
Hình thái khuẩn lạc các chủng VK phân lập được 25
Bảng 3.2
Vòng phân giải của các chủng VK Bacillus có hoạt tính
amylase
28
Bảng 3.3
Đường kính vòng phân giải enzyme của chủng VK D2, D5
và D15
33
Bảng 3.4
Giá trị pH của nước thải qua 7 ngày xử lý 36
Bảng 3.5
Giá trị COD của nước thải qua 7 ngày xử lý 38
Bảng 3.6
Giá trị BOD

5
của nước thải qua 7 ngày xử lý 39
Bảng 3.7
Giá trị SS của nước thải qua 7 ngày xử lý 41
Bảng 3.8
Giá trị N
tổng
của nước thải qua 7 ngày xử lý 42
Bảng 3.9
Giá trị các chỉ tiêu của nước thải sau 7 ngày xử lý 43













DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Số hiệu Danh mục hình ảnh, đồ thị Trang
Hình 1.1
Một số loại enzyme amylase 5
Hình 3.1
Hình ảnh ống giống 16 chủng VK phân lập được từ nước

thải chế biến tinh bột sắn.
24
Hình 3.2
Hình thái và khả năng bắt màu thuốc nhuộm Gram của
chủng VK phân lập
26
Hình 3.3
Bào tử của các chủng VK bắt màu đỏ với thuốc nhuộm
Ogietska
27
Hình 3.4
Vòng phân giải amylase của 16 chủng VK Bacillus có hoạt
tính
29
Hình 3.5
Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng VK D2,
D5, D15
31
Hình 3.6
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng chủng VK D2,
D5, D15
32
Hình 3.7
Đường kính vòng phân giải tinh bột của chủng VK D2, D5
và D15 tương ứng với thời gian nuôi cấy
34
Hình 3.8
Kết quả đếm khuẩn lạc xác định mật độ VK 35
Hình 3.9
Sự thay đổi pH trong nước thải qua 7 ngày xử lý 36

Hình 3.10
Sự thay đổi của COD trong nước thải qua 7 ngày xử lý 37
Hình 3.11

Sự thay đổi của BOD
5
trong nước thải qua 7 ngày xử lý 38
Hình 3.12
Sự thay đổi của SS trong nước thải qua 7 ngày xử lý 39
Hình 3.13
Sự thay đổi của N
tổng
trong nước thải qua 7 ngày xử lý 40


1


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong bối cảnh quốc tế hiện nay, công nghiệp hóa - hiện đại hóa được xem là
xu hướng chung của các nước đang phát triển. Cùng với mục tiêu phát triển nền
công nghiệp và dịch vụ để hiện đại hóa đất nước, chúng ta không thể quên tầm quan
trọng của nền nông nghiệp là chìa khóa để phát triển kinh tế, nâng cao đời sống
nhân dân và ổn đinh xã hội [20]. Mặt khác, nhiều sản phẩm nông nghiệp cũng đồng
thời trở thành nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp, đặc biệt là công
nghiệp chế biến. Sắn là loại cây nông nghiệp dễ trồng, có khả năng chống chịu tốt,
năng suất sinh học cao và phù hợp với những vùng có khí hậu nhiệt đới như các
nước Đông Nam Á. Ở miền Trung Việt Nam, cây sắn là một trong những loại cây
lương thực chủ lực của bà con nông dân theo xu thế tái cấu trúc cơ cấu kinh tế đồng

thời, nó cũng trở thành nguồn nguyên liệu chính của nhà máy chế biến tinh bột sắn.
Hiện nay, nhiều cơ sở, nhà máy chế biến hoạt động với sản lượng khoảng 800.000
– 1.200.000 tấn tinh bột sắn mỗi năm, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu
thụ trong nước. Theo thống kê năm 2009 xuất khẩu tinh bột sắn được Bộ công
thương xếp vào một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực, đem lại công ăn việc
làm và thu nhập cao cho người dân [23].
Tuy vậy, song song với sự phát triển mang lại lợi ích kinh tế xã hội cao thì
ngành công nghiệp chế biến mặt hàng này cũng gây áp lực lớn đến môi trường, mà
một trong những vấn đề nổi cộm nhất là xử lý nước thải (XLNT) sau sản xuất.
Nước thải từ nhà máy chế biến tinh bột sắn được đánh giá là tác nhân gây ô nhiễm
lớn đến nguồn nước tự nhiên với nhiều thành phần hữu cơ như tinh bột, xenlulo,
pectin, đường, protein có trong nguyên liệu củ sắn tươi giàu nitơ, photpho,…[29].
Bên cạnh đó, sự phân giải các thành phần này trong điều kiện tự nhiên gây ra mùi
hôi rất khó chịu, ảnh hưởng đến chất lượng môi trường không khí xung quanh.
Nước thải xử lý chưa đạt tiêu chuẩn xả thải nếu được đưa vào môi trường sẽ là
nguồn tác động xấu đến sức khỏe con người và hệ sinh thái. Với tính chất và thành
phần như thế, trong việc lựa chọn các biện pháp xử lý chất thải, các nhà quản lý
2


luôn cân nhắc giữa việc sử dụng các biện pháp hóa lý với các biện pháp sinh học.
Xử lý chất thải bằng các tác nhân sinh học đã được nghiên cứu và chứng minh là
đem lại hiệu quả cao, giảm chi phí và ưu điểm nhất là thân thiện với môi trường.
Vi khuẩn (VK) Bacillus thuộc nhóm VK Gram dương, hình que, sinh trưởng
trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc và có khả năng sinh bào tử, do
đó chúng có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau. VK
Bacillus rất phổ biến trong tự nhiên và đồng thời tham gia vào nhiều quá trình
chuyển hóa vật chất, phân giải các hợp chất hữu cơ cao phân tử gây ô nhiễm nhờ
khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme ngoại bào [16]. Đây cũng là cơ sở khoa
học cho các nghiên cứu sản xuất và chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ nông

nghiệp và xử lý môi trường. Trên cơ sở lý thuyết này, nhằm tuyển chọn được các
chủng VK có tiềm năng ứng dụng vào trong quy trình xử lý nước thải tinh bột,
chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus
sp. có khả năng xử lý nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn Quế Cường - Quế
Sơn - Quảng Nam”.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chính của đề tài là xác định được các chủng VK Bacillus sp. có khả
năng sinh tổng hợp ezyme amylase và nghiên cứu ứng dụng các chủng có hoạt tính
tốt vào quy trình xử lý nước thải nhà máy tinh bột sắn bằng bể aerotank.
3. Nội dung nghiên cứu
Đề tài tập trung nghiên cứu các nội dung sau:
- Nghiên cứu tổng quan tài liệu về vi sinh vật (VSV) sinh tổng hợp enzyme
amylase, thực trạng và phương pháp xử lý nước thải tinh bột sắn.
- Phân lập, xác định các chủng VK Bacillus sp. có khả năng phân giải tinh bột
cao từ nước thải của nhà máy FOCOCEV ở Quế Cường - Quế Sơn – Quảng Nam.
- Tuyển chọn chủng VK sinh tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất để nghiên
cứu các đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh hoạt
tính của chúng.
- Nghiên cứu thử nghiệm xử lý nước thải chế biến tinh bột sắn bằng các chủng
VK Bacillus sp. đã tuyển chọn được ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Xử lý số liệu thực nghiệm.
3


4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
4.1.
Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài sẽ là nguồn dẫn liệu bổ sung cho các nghiên cứu trước về
các chủng VK Bacillus có hoạt tính sinh học mạnh phân bố ở địa điểm nghiên cứu.

Đồng thời tạo tiền đề cho việc nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học từ các
chủng VK này.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các chủng VK có khả năng phân giải tinh bột mạnh được tuyển chọn có thể
được sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học xử lý chất thải rắn, làm phân vi
sinh, phân hữu cơ vi sinh và XLNT giàu chất hữu cơ tinh bột như nước thải nhà
máy chế biến tinh bột sắn.
















4


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về VSV sinh tổng hợp enzyme amylase
1.1.1. Tổng quan về enzyme amylase và các ứng dụng của enzyme

amylase
Enzyme là chất xúc tác sinh học đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng sinh
hóa diễn ra trong tế bào. Enzyme có bản chất là protein nên chúng cũng mang
những tính chất của protein như:
- Hòa tan trong nước, tạo dung dịch keo với những tính chất đặc trưng như
khuếch tán kém, áp suất thẩm thấu thấp, độ nhớt cao,…
- Có tính lưỡng cực.
- Mỗi enzyme có một điểm đẳng điện nên tại điểm đó có độ hòa tan thấp nhất.
- Dễ bị phá hủy bởi các tác nhân khác như enzyme tiêu hóa (pepsin,
tripsin,…).
- Enzyme không chịu đươc nhiệt độ cao, dễ mất hoạt tính xúc tác và dễ bị biến
tính.
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme
này thuộc nhóm enzyme thủy phân, trong điều kiện có nước, chúng xúc tác cho sự
phân giải các liên kết nội phân tử nhóm polysaccharide
R.R’ + H-OH  RH + R’OH
Amylase có trọng lượng phân tử rất lớn từ 20.000 – 1.000.000 Dalton [8],
được cấu tạo từ 200 – 1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-
glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh.
Vì có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống và sản xuất nên enzyme
amylase đã được nghiên cứu và khảo sát một cách có hệ thống về các đặc điểm
cũng như phương pháp phân lập, tách chết từ nhiều nguồn khác nhau từ VSV (VK
Bacillus subtilis, nấm Aspegillus oryzae…), từ thực vật (mầm mạch, mầm đậu
tương…).
5


Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và
exoamylase (enzyme ngoại bào) [27].
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme

khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6
– glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và
maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi
polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân
tinh bột của chuỗi polysaccharide.


α – amylase β-amylase
Hình 1.1. Một số loại enzyme amylase
(Nguồn: />)

1.1.2. Tổng quan về VSV sinh tổng hợp amylase
Hiện nay người ta đã phát hiện được trên 2000 enzyme khác nhau, nhưng chỉ
có khoảng 140 enzyme có thể được sử dụng cho mục đích thương mại. Trong đó,
enzyme amylase được sử dụng nhiều trong công nghiệp và sản xuất với số lượng
lớn. Ngoài việc sử dụng các enzyme có nguồn gốc từ thực vật thì nhiều nhóm VSV
6


cũng được biết đến như các “nhà máy” sản xuất amylase, ví dụ như các VK, nấm
mốc và nấm men [8].
1.1.2.1. Nấm mốc
Các nấm mốc sinh enzyme amylase mạnh có thể được kể đến như là các mốc
thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Mucorsnr, Neurospora, Rhizopus sp, Rhizopus
japanicus. Trong đó, chế phẩm enzyme amylse được thu từ hai loài nấm
mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh
mì .
1.1.2.2. Nấm men
Đã từ lâu một số chi nấm men đã được nghiên cứu có khả năng sinh enzyme

amylase như: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Gratrova,
1975; Conovalov, 1972; Fukumoto, 1962; Hattori, 1961). Theo đó, người ta ứng
dụng các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae

trong ngành sản xuất rượu để
lên men rượu nhờ khả năng sinh enzyme amylase của chúng [12].
1.1.2.3. Vi khuẩn
Nhiều nhóm vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất enzyme
do năng suất cao, ổn định hóa học và chi phí sản xuất thấp. Sản lượng enzyme
amylase từ VK được sản xuất trên thế giới là 50 tấn/năm. Nhiều loài Bacillus như
Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis được sử dụng
để sản xuất một loạt các enzyme trong nhiều thập kỷ qua. Các chi Bacillus đã sản
sinh ra một lượng lớn các enzyme ngoại bào mà trong đó enzyme amylase có tầm
quan trọng đặc biệt trong công nghiệp [28]. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản
xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase từ VK bacillus sp [11]. Bên cạnh đó
có một số loài VK khác như Lactobacillus, Micrococus, Pseuclomonas,
Arthrobacter, Proteus, Seratia cũng có khả năng sinh enzyme amylase.
1.2. Một số nghiên cứu về VK Bacillus phân giải tinh bột
Bacillus là VK Gram dương, chúng có khả năng sinh enzyme ngoại bào:
amylase, protease kiềm, cellulose,… và các enzyme này được ứng dụng rất nhiều
trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp,…[4]. Đến nay, đã có nhiều
7


công trình nghiên cứu về đối tượng VK Bacillus sp. ở trong nước cũng như nước
ngoài.

1.2.1. Một số nghiên cứu trong nước
Trên Tạp chí Khoa học ĐHQGHN năm 2009, Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt
Hà*, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn đã tiến hành nghiên cứu phân lập được 236

chủng Bacillus từ các mẫu đất và nước thải khác nhau. Theo đó, khi khảo sát hoạt
tính enzyme ngoại bào như amylase, protease và CMC – aza của 236 chủng trên thì
có 3 chủng có khả năng sinh enzyme mạnh và XLNT hiêu quả.
Một nghiên cứu khác của Phạm Trần Thùy Hương và Đỗ Thị Bích Thủy
(2012) tập trung vào khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình thu nhận
chế phẩm amylase ngoại bào trên đối tượng Bacillus subtilis DC5. Trong nghiên
cứu này, cùng với việc đã xác định được thành phần môi trường thích hợp để nuôi
cấy chủng Bacillus subtilis DC5 là pepton 1%; cao thịt 0,3%; NaCl 0,5%; lactose
0,25%, nhiệt độ 35
o
C và pH 5, tác giả cũng xác định được sau 24 giờ nuôi cấy cũng
là thời điểm tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào.
Cũng với VK lactic, VK Bacillus cũng được xác định là những VK có đặc tính
probiotic được áp dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học. Để tăng khả năng đề
kháng của tôm, tác giả Khuất Hữu Thanh; Nguyễn Đăng Phúc Hải; Bùi Văn Đạt;
Võ Văn Nha (2009) đã phân lập được 12 chủng VK Bacillus và 18 chủng VK lactic
có hoạt tính đối kháng VK Vibrio và VK kiểm. Kết quả nghiên cứu trên cho thấy
chế phẩm probitic tạo được có hiệu quả tăng sức kháng bệnh của tôm sú ở điều kiện
phòng thí nghiệm.
Phạm Thị Xòe (2012), tiến hành phân lập được 35 chủng VK có hoạt tính
kitinaza và một số đặc tính của enzyme từ mẫu đất làm giàu. Theo đó, chọn lọc
được 2 chủng VK sinh kitinaza cao nhất xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho sự
phát triển là chủng HD1 ở 40
o
C, pH 7 và chủng HD5 ở 35
o
C, pH 7,5. Đồng thời,
khẳng định 2 chủng VK trên là Bacillus.
Một nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý (2012), từ nước
thải làng nghề sản suất bột gạo đã tiến hành phân lập được 13 dòng VK thuộc gram

8


âm và 10 dòng VK thuộc gram dương và các VK này đều có hoạt tính enzyme
amylase từ 72,44 U/ml đến 910,89 U/ml sau thời gian là 72 giờ nuôi cấy và xác
định đó là Bacillus.
1.2.2. Một số nghiên cứu ngoài nước
Kết quả nghiên cứu cho biết khả năng sinh enzyme phân giải tối ưu ở pH 8,5
và 45°C. Ổn định nhiệt của nó giữa 20-50°C là khoảng 89,5% trong 30 phút. Sự ổn
định độ pH đã được quan sát giữa pH 7 và 10 với mức trung bình 84,9% của duy trì
hoạt động trong 15 phút [24].
Để khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tối ưu về khả năng sinh hoạt tính
amylase của VK thì P. Ruban, T. Sangeetha and S. Indira (2013) đã tiến hành phân
lập VK Bacillus subtilis và Aspergillus niger từ hai loại chất thải tinh bột khác nhau
(chất thải cao lương và lúa mì cám), đồng thời đã xác định với pH 7, nhiệt độ ổn
định 37
o
C và pH 5 nhiệt độ ổn định 20
o
C là thích hợp cho khả năng sinh hoạt tính
mạnh nhất [29].
Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm kumura
từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc
Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus [11].
Các công trình nghiên cứu nói chung đã góp phần vào việc xác định môi
trường phân lập và điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng
VK Bacillus. Theo đó cũng đã khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và
xác định được điều kiện môi trường tối ưu cho hoạt động sinh hoạt tính enzyme
phân giải của VSV nhằm góp phần tạo ra các chế phẩm sinh học ứng dụng trong
lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, sản xuất probiotic phòng bệnh,… Trong khi đó,

những nghiên cứu về ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của VSV
vào quá trình XLNT, đặc biệt là nước thải giàu tinh bột còn tương đối hạn chế. Như
vậy, trên nền tảng của những nghiên cứu trước, chúng tôi tiến hành đề tài này với
mong muốn phát triển hơn nữa những ứng dụng của VSV vào thực tiễn cuộc sống.
1.3. Tổng quan về các phương pháp XLNT.
Đối với các hoạt động công nghiệp, nước thải được thải ra môi trường nếu bị
lưu đọng hoặc xử lý chưa đạt yêu cầu sẽ gây ô nhiễm môi trường, đặc biệt đối với
9


nguồn nước tiếp nhận, hậu quả kéo theo gây tác động xấu đến vệ sinh môi trường
và sức khoẻ con người. Do đó, quy trình XLNT được áp dụng rất nhiều phương
pháp nhằm đạt hiệu quả xử lý cao. Thông thường, hệ thống xử lý nước thải bao gồm
tổng hợp các phương pháp lý học (cơ học), hoá học và sinh học [15].
Việc áp dụng các phương pháp trên ngoài sự phụ thuộc vào tính chất nước thải
(bảng 1.1), lưu lượng nước thải còn phụ thuộc vào hàng loạt các yếu tố khác như:
kinh phí, diện tích dành cho hệ thống xử lý, đặc điểm địa hình, hệ thống thoát nước,
mục đích sử dụng của nguồn nước tiếp nhận v.v
Bảng 1.1. Phương pháp xử lý theo tinh chất của nước thải
Chất bẩn Các phương pháp xử lý
Chất hữu cơ dễ phân hủy sinh hóa
(BOD)




Chất lơ lửng
Chất hữu cơ bền vững
Vết nhơ
Photpho

Kim loại nặng
Chất hữu cơ tan
- Phương pháp sinh học hiếu khí (bùn hoạt
tính, hồ làm thoáng, lọc sinh học, hồ ổn
định)
- Phương pháp sinh học trong điều kiệm yếm
khí (hồ yếm khí, bể metan) bơm xuống
lòng đất UASB.
- Lắng, tuyển nổi và lưới lọc, song chắn.

- Hấp phụ bằng than, bơm xuống lòng đất.
- Hồ, sục khí, nitrat hóa, khử nitrat, trao đổi
ion.
- Kết tủa bằng vôi, bằng muối sắt, nhôm.
- Kết tủa kết hợp sinh học, trao đổi ion.
- Trao đổi ion, kết tủa hóa học.
- Trao đổi ion, bám thấm.

Một số phương pháp áp dụng XLNT như sau:
1.3.1. Phương pháp xử lý cơ học
Áp dụng phương pháp xử lý cơ học nhằm loại bỏ tất cả các tạp chất có thể gây
sự cố trong quá trình vận hành hệ thống XLNT như tắc ống bơm, đường ống hoặc
10


ống dẫn. Xử lý cơ học là khâu sơ bộ chuẩn bị cho quá trình xử lý sinh học tiếp theo.
Một số công trình và thiết bị được áp dụng trong XLNT bằng phương pháp cơ học
như lưới chắn rác, bể điều hòa, bể lắng cát, lọc, …
1.3.2. Phương pháp xử lý hóa học và hóa lý
Bản chất của quá trình XLNT bằng phương pháp hóa học và hóa lý là áp dụng

các phản ứng hóa học và vật lý khi bổ sung các hợp chất khác nhau vào để loại bỏ
bớt các chất ô nhiễm, các quá trình thường được áp dụng trong phương pháp xử lý
hóa học và hóa lý bao gồm [6]:
- Phương pháp đông tụ: để tăng nhanh quá trình lắng các chất lơ lửng phân tán
nhỏ, keo,…
- Phương pháp trung hòa: Nước thải sản xuất trong nhiều lĩnh vực có chứa
nhiều axit hoặc kiềm. Ðể ngăn ngừa hiện tượng xâm thực ở các công trình thoát
nuớc và tránh cho các quá trình sinh hóa ở các công trình làm sạch và trong hồ,
sông không bị phá hoại, nguời ta phải trung hòa các loại nước thải đó. Trung hòa
còn với mục đích làm cho một số muối kim loại nặng lắng xuống và tách ra khỏi
nước.
- Phương pháp oxy hóa – khử.
- Phương pháp hấp phụ.
1.3.3. Phương pháp xử lý sinh học
Phương pháp dựa trên cơ sở: Hoạt động của VSV để phân hủy các chất hữu cơ
gây nhiễm bẩn trong nước thải. Các VSV sử dụng các chất hữu cơ và một số chất
khoáng làm chất dinh dưỡng và tạo năng lượng. Chúng nhận các chất dinh duỡng để
xây dựng tế bào, sinh truởng, sinh sản nên sinh khối của chúng tăng lên. Quá trình
phân hủy các chất hữu cơ nhờ VSV gọi là quá trình oxy hóa sinh hóa. Nước thải
đuợc xử lý bằng phương pháp sinh học sẽ được đặc trưng bằng chỉ tiêu COD và
BOD
5
. Đặc biệt quá trình tự làm sạch do trong môi trường có các VK giúp cho quá
trình chuyển hóa, phân hủy chất hữu cơ nên khi XLNT cần xem xét nước có các
VSV hay không để lợi dụng sự có mặt của nó và nếu có thì tạo diều kiện tốt nhất
cho các VSV phát triển. Do đó, đối với dòng nước thải chứa nhiều hợp chất hữu cơ
thì phương pháp xử lý sinh học là tối ưu nhất [15], [6].
11

Hiện nay, người ta xử lý các nước thải hữu cơ bằng hai nhóm phương pháp:
Thứ nhất: Xử lý nước thải hữu cơ bằng phương pháp sinh học hiếu khí được
dựa trên sự oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước thải nhờ oxy tự do hòa tan. Nếu
oxy được cung cấp bằng thiết bị hoặc nhờ cấu tạo công trình, thì đó là quá trình sinh
học hiếu khí trong điều kiện nhân tạo. Ngược lại, nếu oxy vận chuyển và hòa tan
nhờ các yếu tố tự nhiên thì đó là quá trình xử lý sinh học hiếu khí trong điều kiện tự
nhiên. Các công trình xử lý sinh học hiếu khí nhân tạo như bể lọc sinh học nhỏ giọt,
bể lọc sinh học cao tải, đĩa lọc sinh học, bể lọc sinh học có vật liệu lọc ngập trong
nước (bể bioten), kênh oxy hóa tuần hoàn, bể Aerotank hoạt động gián đoạn theo
mẻ (Sequencing Batch Reactor – SBR). Bênh cạnh đó còn có một số công trình xử
lý sinh học hiếu khí trong điều kiện tự nhiên như: cánh đồng ngập nước tự nhiên,
cánh đồng ngập nước nhân tạo (gồm cánh đồng ngập nước bề mặt và cánh đồng
ngập nước phía dưới), hồ sinh học. Theo đó, có một số công trình xử lý sinh học
hiếu khí được áp dụng cho xử lý nước thải tinh bột như: bể Aerotank, lọc sinh học
hiếu khí, lọc sinh học nhỏ giọt, đĩa quay sinh học,… cũng góp phần làm giảm đáng
kể lượng hợp chất hữu cơ [5].
Thứ hai: XLNT hữu cơ bằng phương pháp sinh học kỵ khí là quá trình xử lý
dựa trên cơ sở phân hủy các chất hữu cơ nhờ quá trình lên men kỵ khí. Một số hệ
thống XLNT tinh bột vừa và nhỏ người ta thường áp dụng phương pháp sinh học kỵ
khí này và đồng thời tiến hành thu khí Biogas [29].
1.4. Thực trạng XLNT tinh bột sắn ở Việt Nam và trên địa bàn tỉnh
Quảng Nam
1.4.1. Thực trạng XLNT tinh bột sắn ở Việt Nam
Ngành chế biến tinh bột sắn là ngành phát sinh một lượng lớn nước thải, trung
bình lượng nước thải ra trong quá trình chế biến là 10 – 30m
3
/tấn sản phẩm. Đặc
trưng của dòng nước thải này là hàm lượng chất hữu cơ cao thể hiện qua hàm lượng
chất rắn lơ lửng (SS), các chất dinh dưỡng N, P, K và nhu cầu oxy sinh hóa học
(BOD), nhu cầu oxy hóa học (COD) có nồng độ cao, đặc biệt là hàm lượng tinh bột

trong củ cao (62 – 65% lượng chất khô) sẽ là nguyên nhân chủ yếu làm cho dòng
nước thêm ô nhiễm [9], [1]. Vì vậy, phương pháp sinh học là lựu chọn tối ưu nhất
12


cho quá trình xử lý, nhưng do tính đặc thù của quy trình chế biến là phải loại bỏ các
phần vỏ và đất của sắn nên tách riêng dòng nước thải ra là không thể thiếu nhằm
nâng cao hiệu quả xử lý.
Hiện nay, tại Việt Nam công nghệ phổ biến được áp dụng trong xử lý là công
nghệ hồ sinh học kỵ khí dạng hở (open anaerotic lagoons). Một số nhà máy tinh bột
sắn áp dụng bể CIGAR (bể được tạo thành bằng cách phủ bạt toàn bộ mặt hồ kỵ
khí) và công nghệ UASB (kỵ khí kiểu chạy ngược qua lớp bùn yếm khí) kết hợp thu
khí metan (CH
4
). Đối với phương pháp kỵ khí kết hợp thu khí CH
4
tại 13 nhà máy ở
nước ta được công nhận là dự án CDM (CDM – clean Development Mechansm).
Quá trình xử lý nước thải tinh bột sắn của một số nhà máy được áp dụng như sau:
- Nước thải từ quy trình công nghệ dẫn qua song chắn rác để loại bỏ tạp chất
thô rồi được dẫn qua bể gạn bột để thu hồi tinh bột, từ đó được dẫn qua bể lắng cát
và qua bể axit hóa để khử CN
-
nhằm tạo môi trường thuận lợi cho quá trình xử lý
sinh học phía sau. Nước thải sẽ được dẫn vào hai mương với hai dòng nước thải
khác nhau.
- Quy trình xử lý sinh học ở các bể hiếu khí và kỵ khí là giai đoạn mà nước
thải tiếp tục đưa qua bể UASB (kỵ khí) sau đó dẫn qua bể Aeroten (hiếu khí), ở đây
sục khí liên tục và các vi sinh vật dạng hiếu khí sẽ phân hủy các chất hữu cơ còn lại
trong nước thải thành các chất vô cơ đạng đơn giản hơn nhằm nâng cao hiệu quả xử

lý.
- Bùn dư được bơm vào bể nén bùn trọng lực để giảm thể tích sau đó bơm đến
ngăn khuấy trộn của máy lọc ép băng, đóng thành bánh đem đi chôn lấp hoặc sử
dụng làm phân bón. Các quá trình xử lý nước thải đầu ra sẽ đạt QCVN: 2008 loại B.
1.4.2. Thực trạng xử lý nước thải tinh bột sắn Quảng Nam.
Hiện nay, trên địa bàn tỉnh Quảng Nam có 1 cơ sở sản xuất tinh bột sắn nhỏ lẻ
(Công ty TNHH sản xuất tinh bột sắn Cẩn Tuyết thuộc huyện Quế Sơn) và 1 công
ty cổ phần FOCOCEV Quảng Nam đóng trên địa bàn xã Quế Cường, huyện Quế
Sơn (Quảng Nam) có công suất 150 tấn sắn tươi/ngày đêm, bình quân sử dụng và
thải ra ngoài môi trường khoảng 150 nghìn m
3
nước thải/ngày đêm. Năm 2008, chủ
tịch UBND xã Quế Cường cho biết, tình trạng ô nhiễm môi trường do Nhà máy sản
13


xuất tinh bột sắn gây ra làm ảnh hưởng đến gần 200 hộ dân trong xã. Vừa qua,
khoảng 3 ha lúa đông xuân 2008 bị hư hại (rụi rục). Bên cạnh đó, mùi hôi từ nước
thải xả ra môi trường được người dân phản ánh rất gây gắt.
Hệ thống XLNT tinh bột sắn trên địa bàn tỉnh Quảng Nam được xử lý như
sau:
- Hồ tùy tiện: Là công trình xử lý nước thải TBS trong điều kiện tự nhiên,
trong hồ xẩy ra các quá trình phân hủy hiếu khí, kỵ khí và tùy tiện.
- Bể biogas (CIGAR): Đây là công trình kiểm soát, để khắc phục một số nhược
điểm của hồ kỵ khí, người ta tiến hành phủ cho hồ kỵ khí lớp lót đáy hồ và bề mặt
nhằm tạo ra hệ kỵ khí tuyệt đối và ngăn không cho nước thấm vào đất gây ô nhiễm
nước ngầm.
Đối với tỉnh Quảng Nam có ít cơ sở chế biến tinh bột sắn và quá trình xử lý
nước thải ở đây chủ yếu là xử lý kỵ khí bằng phương pháp phủ bạc HPDE, trước
khi nước thải vào hồ kỵ khí thì được lưu lại tại bể tùy nghi để thực hiện quá trình

lắng và phân hủy hiếu khí. Tuy nhiên, quá trình xử lý của các nhà máy, cơ sở sản
xuất chưa thực sự hiệu quả.












14


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng Bacillus sp. sinh enzyme amylase có trong nước thải chế biến
tinh bột sắn
- Nước thải chế biến tinh bột sắn.
- Mô hình thử nghiệm XLNT.
2.2. Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
* Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa
Quá trình thu mẫu nước để phân lập và xác định các chủng vi khuẩn Bacillus
sp. được thực hiện tại Công ty cổ phần FOCOCEV thuộc xã Quế Cường – Quế Sơn

– Quảng Nam.
* Địa điểm tiến hành thí nghiệm
Quá trình phân lập, xác định hoạt tính, nghiên cứu đặc điểm sinh học, sử dụng
vi khuẩn Bacillus sp. để nghiên cứu thử nghiệm xử lý nước tinh bột sắn và phân tích
các chỉ số được tiến hành ở các phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường, trường
Đại học Sư Phạm Đà Nẵng:
- Phòng thí nghiệm Sinh lý – Hóa sinh – Vi sinh
- Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học
- Phòng thí nghiệm Phân tích môi trường
2.2.2. Phạm vi nghiên cứu
Trong giới hạn nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tập trung vào đối tượng các
VK Bacillus sp. là loại VSV hiếu khí được tuyển chọn từ nước thải của các nhà máy
chế biến tinh bột sắn ở khu vực huyện Quế Sơn - Quảng Nam, đồng thời chú trọng
nghiên cứu đến khả năng sinh hoạt tính phân giải tinh bột là thành phần hữu cơ chủ
yếu trong nước thải chế biến tinh bột sắn và thử nghiệm XLNT bằng biện pháp sinh
học hiếu khí.
15


2.2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 8/2014 – 4/2015
2.3. Vật liệu và phương pháp
2.3.1. Vật liệu
2.3.1.1. Thiết bị
Tủ cấy vô trùng
Cân phân tích
Máy ly tâm
Kính hiển vi quang học
Tủ ấm
Tủ sấy

Máy đo pH
Máy lắc
Nồi hấp vô trùng ở áp suất
cao
Kính hiển vi
Bếp điện nấu môi trường
Máy đo so màu
Ống nghiệm
Đĩa petri
2.3.1.2. Hóa chất
Cao nấm men
NaCl
Peptone
NaNO
3
KH
2
PO
4

KCl
MgSO
4
. 7H
2
O
FeSO
4

Tinh bột tan

Ethanol 96
0

NaOH
Thạch
Thuốc nhuộm fucsin
Thuốc nhuộm tím Gentian
Thuốc nhuộm Lugol
HCl
đặc
H
2
SO
4 đặc
Thuốc nhuộm xanh metylen
Leoeffler

2.3.1.3. Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy
Chúng tôi tiến hành thực hiện trên môi trường LB Broth (Luria-Bertani broth)
[2].
Cao nấm men 5g
NaCl 10g
16


Peptone 10g
Thạch 20g
Nước cất 1000ml
Khử trùng ở 121
o

C và trong thời gian 20 phút
2.3.1.4. Môi trường định tính sinh tổng hợp enzyme amylase
NaNO
3
1,6g
KH
2
PO
4
0,8g
KCl 0,4g
MgSO
4
. 7H
2
O 0,4g
FeSO
4
0,008g
Tinh bột tan 4g
Thạch 16g
Nước cất 800ml
pH 7 ÷ 7,5
2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu nước phân lập
Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho mẫu thu được có tính đại diện cho khối
lượng nước cần phân tích. Quá trình lấy mẫu chúng tôi sử dụng bình thu mẫu loại
dùng một lần hoặc có thể dùng nhiều lần. Trường hợp dùng bình chứa sử dụng
nhiều lần, chất liệu bình phải cho phép khử trùng lặp lại nhiều lần mà không tạo ra
các tạp chất ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật. Tránh gây tạp nhiễm mẫu

trong lúc thu, bảo quản và vận chuyển mẫu. Mẫu nước được thu vào bình đã khử
trùng, cần chừa môt khoảng không khí đủ lớn giữa mặt nước và nắp bình. Chọn ở
độ sâu 20 – 30cm để thu mẫu. Trên mỗi bình chứa mẫu cần ghi chú rõ ràng, đầy đủ
các thông tin cần thiết (địa điểm, thời gian, mục đích,…). Mẫu bảo quản lạnh ở
nhiệt độ 4
o
C trong thùng xốp vận chuyển về phòng thí nghiệm phân tích liền hoặc
trường hợp chưa thể phân tích được chúng ta bảo quản mẫu trong tủ lạnh ở 4
o
C
[19].