Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh giai đoạn nảy mầm ở hạt đậu tương(Glycine max

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ LAN PHƯỢNG

ẢNH HƯỞNG CỦA ÁP SUẤT THẨM THẤU
ĐẾN MỘT SỐ CHÌ TIÊU SINH LÝ, HỐ SINH
GIAI ĐOẠN NẢY MẦM Ở HẠT ĐẬU TƯƠNG • • •
(Gỉycine mahx)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS NGUYỄN VĂN MÃ Học viên thực hiện:
NGUYỄN THỊ LAN PHƯỢNG

HÀ NỘI, 2010
MỞ ĐÀU

1. Lý do chon đề tài
Cây Đậu tương (Glycỉne max (L) Merrill) hay còn gọi là đậu nành, là cây cơng nghiệp ngắn
ngày có giá trị về mặt kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao. Trong hạt đậu chứa: 40% protein, 1225% lipid, 10-15% glucid, các chất khoáng Ca, Fe, Mg, p, K, Na, s, các vitamin A, Bl, B2, D, E, F
và các enzym, sáp, nhựa, cellulose [1], [4].


Trong cây đậu tương có nhiều loại axit amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, metionin,
phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn
chỉnh vì chứa một lượng đáng kế các amino axit khơng thay thế cần thiết cho cơ thể người và động
vật. Một đặc tính khác nữa ở cây đậu tương là có vi khuấn nốt sần ở rễ, tạo khả năng cố định nitơ
khơng khí, vì vậy trồng đậu tương có tác dụng cải tạo đất và bảo vệ môi trường [4].
Ở Việt Nam, đậu tương là cây trồng quan trọng và có mặt tương đối sớm, sản phẩm từ đậu
tương được sử dụng phổ biến trong các bữa ăn hàng ngày như: đậu phụ, sữa đậu nành, dầu ăn, nước

tương, bột đậu. Ngoài ra đậu tương được dùng như một số bài thuốc cố truyền ngừa ung thư, giảm
sỏi thận... [8]. Không những đậu tương được sử dụng cho người mà còn được sử dụng làm thức ăn
cung cấp protein thực vật cho động vật như: khô dầu đậu tương, bột đậu tương...
Đậu tương là loại cây trồng quan trọng ở một số nước trên thế giới như Mỹ, Braxin,
Achentina, Trung Quốc, Ân Độ, Paragoay, Canađa, Inđônêsia và các nước khác. Sản lượng đậu
tương cũng tăng theo từng năm. Theo dự báo của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng xuất khẩu đậu tương
trên thế giới năm 2010 dự báo đạt 88,24 triệu tấn, tăng so với 86,35 triệu tấn của năm 2009. Vì vậy
tổng sản lượng dầu đậu tương thế giới dự báo đạt 39,97 triệu tấn trong năm 2010, tăng so với 37,98
triệu tấn của năm 2009. Tổng xuất khẩu dầu đậu tương thế giới dự báo đạt 9,06 triệu tấn so với 9,01
triệu tấn của năm 2009.


3
Việc nâng cao năng suất cây đậu tương mang lại nhiều lợi ích. Tuy nhiên vấn
đề cơ bản hạn chế năng suất đậu tương ở Việt Nam là điều kiện khí hậu, đặc biệt là
hạn hán. Nước ta có địa hình đa dạng, diễn biến khí hậu phức tạp, lượng mưa phân bố
không đều giữa các vùng và các thời kỳ trong năm nên hạn hán có thể xảy ra ở bất kỳ
vùng nào, mùa nào, khi gặp điều kiện thiếu nước năng suất sẽ giảm đáng kể [6], [ 10],
[ 14].
Các nghiên cứu tìm hiểu bản chất khả năng chịu hạn của cây trồng nói chung
và đậu tương nói riêng ngày càng được mở rộng. Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật
hiện đại, các nhà khoa học có điều kiện đi sâu tìm hiểu cơ chế sinh lý liên quan đến
tính chịu hạn của thực vật như: ảnh hưởng của thiếu nước đến sự phát triển của hạt
[44], [50], đến q trình hơ hấp [45] và quang hợp [46], [48]. Một số cơ chế hóa sinh
và sinh học phân tử cũng đã được nghiên cứu nhằm: xác định vị trí của gen liên quan
đến điều chỉnh áp suất thấm thấu [17], gen tống họp một số chất hình thành và tích lũy
nhiều khi hạn hán: prolin [3], [12], nhóm amin bậc 4, một số đường [27], [33], [37],
[51]... Trên thế giới đã có một số nhà khoa học nghiên cứu như: James A.Bunce [42],
Miquel Ribas - Carbo [46], Sheỉla A.Blackman [52], tìm hiếu ảnh hưởng của sự thiếu
nước đến quang họp, hô hấp, sinh trưởng đã đạt được kết quả nhất định.

Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn khi xử lý
phân vi lượng, khả năng quang hợp, chất lượng hạt khi gây hạn, nâng cao khả năng
chịu hạn của đậu tương: Ngô Đức Dương [6], Điêu Thị Mai Hoa [11], Nguyễn Huy
Hoàng [13], [16], Trần Thị Phương Liên [17], Nguyễn Văn Mã [19], [20], [22], [23].
Đối với thực vật, để có thế tồn tại được với điều kiện bất lợi của mơi trường
phải có những cơ chế thích nghi. Một trong những phản ứng thích nghi đó là việc tăng
hàm lượng một số chất điều hoà áp suất thẩm thấu. Vì vậy việc nghiên cứu về áp suất
thẩm thấu và ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên thực vật nói chung, đậu tương nói
riêng là một việc quan trọng, xuất phát từ vấn đề này chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài “Anh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh giai
đoạn nảy mầm ở hạt đậu tương (Glỵcine max)’\


4

2. Mục đích nghiên cửu
Xác định một số chỉ tiêu trong điều kiện áp suất thẩm thấu (ASTT) khác nhau:
khả năng nảy mầm, sinh trưởng thân mầm, rễ mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô,
hàm lượng prolin, hoạt độ một số enzym trong mầm đậu tương.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu

-

Xác định một số chỉ tiêu sinh lý như: tỷ lệ nảy mầm, sinh trưởng thân mầm, rễ mầm,
khối lượng tươi, khối lượng khô của mầm đậu tương trong các điều kiện ASTT khác
nhau.

-

Xác định hàm lượng prolin của mầm đậu tương trong các điều kiện ASTT khác nhau.

-

Xác định hoạt độ các enzym proteaza, lipaza và ot-amylaza của mầm đậu tương ở các

điều kiện ASTT khác nhau.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cún
Đối tượng: Giống đậu tương DT96, AK02.
Phạm vi nghiên cứu: một số chỉ tiêu sinh lý (tỉ lệ nảy mầm, chiều dài thân
mầm, rễ mầm, khối lượng tươi, khối lượng khô của mầm), hàm lượng prolin, hoạt độ
các enzym proteaza, lipaza và a-amylaza của mầm đậu tương.
5. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
Bổ sung nguồn tài liệu cho việc nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh
của mầm đậu tương trong điều kiện ASTT khác nhau và mối quan hệ của chúng vói
khả năng chịu hạn của cây.
Xác định được giống chịu được điều kiện ASTT cao phục vụ cho việc gieo
trồng ở vùng ngập mặn hoặc vùng hạn.
CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.
1.1.1.

Giói thiệu chung về cây đậu tương
Nguồn gốc cây đậu tương
Cây đậu tương thuộc họ Đậu (Fabaceae), bộ Fabales là một trong nhũng cây

trồng cổ nhất của nhân loại. Năm 1948, Ricker và Morse đã khẳng định tên thực vật
đúng của đậu tương là Glycine max (L.) Merrill. Chi phụ Soja có hai lồi Glycine max
(L.) Merrill và Glycine soja Sieb et Zucc. Glycine max (L.) Merrill là cây trồng hàng
năm, khơng phát hiện thấy lồi hoang dại. Nó có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung

5
Quốc). Xuất phát từ một loài đậu nành dại thân mảnh, dạng dây leo, ít phân nhánh,
dạng bụi, xẻ lá chét lơng chim, phiến lá hình ơ van, chùm hoa có cuống ngắn, hoa tím
hoặc trắng, quả thắng hoặc cong, thường có nhiều lơng. Mỗi quả thường có ba hạt
hình trịn hoặc cầu. vỏ hạt có màu sắc biến đổi từ vàng sáng đến nâu, đen, xanh. Khối
lượng của hạt dao động từ 10g đến 20g [1], [4], [10].
Từ Trung Quốc, cây đậu nành đã được nhân rộng ra khắp thế giới. Theo các
nhà nghiên cứu Nhật Bản vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu nành được
đưa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật. Giữa thế kỷ 17, đậu nành mói được
nhà thực vật học người Đức Engelbert Caempfer đưa về Châu Âu và đến năm 1954,
đậu nành được du nhập vào Hoa Kỳ [28]. Những nghiên cứu về nguồn gốc cây đậu
tương chứng tỏ nó bắt nguồn tù' Trung Quốc, các kết quả nghiên cứu về tế bào học,
hình thái học, protein trong hạt và ADN của ty thể đã chứng tỏ rằng G. soj2a là tố tiên
hoang dại của cây đậu tương trồng [4].

1.1.2.

Tình hình gieo trồng cây đậu tương
Cây đậu tương là cây có ý nghĩa về mặt kinh tế và mơi trường. Nó có tác dụng

cải tạo đất. Trên thế giới, diện tích đậu tương ngày càng được mở rộng, năng suất
ngày càng tăng. Đậu tương có mặt ở khắp các châu lục, tập trung nhiều nhất ở châu
Mỹ, tiếp đến là châu Á và một số nơi khác trên thế giới.
Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng tương đối sớm nhưng do tập quán canh
tác nên đậu tương chưa phát triển về diện tích và năng suất. So với bình quân chung
của thế giới, năng suất đậu tương của Việt Nam chỉ đạt 57%. Cả nước hình thành 6
vùng sản xuất đậu tương: vùng Đơng Nam Bộ có diện tích lớn nhất chiếm 26,2% diện
tích đậu tương cả nước, miền núi Bắc Bộ 24,7%; Đồng bằng sông Hồng 17,5%; Đồng

bằng sơng Cửu Long 12,4%; cịn lại là vùng đồng bằng ven biển miền Trung và Tây
Nguyên chiếm 33,4%. về sản lượng: 3 vùng Đồng bằng sông Hồng, Đông Nam Bộ,
Đồng bằng sông Cửu Long chiếm 63% sản lượng đậu tương cả nước. Đặc biệt vùng
Đồng bằng sông Cửu Long với 12,4% diện tích nhưng lại chiếm 20,9% sản lượng đậu
tương cả nước, năng suất bình quân đạt 16 tạ/ha [4].


1.2.

Các giai đoạn sinh trưỏng phát triển của đậu tương

6

7.2.7. Giai đoạn nảy mầm
Sau khi trồng, hạt đậu tương ngấm nước rất nhanh, trù’ 1 vài giống đặc biệt là
loại hoang dại, khả năng ngấm nước chậm hơn. Trong điều kiện thuận lợi rễ xuất hiện
sau khi trồng tò 1 đến 2 ngày. Rễ này gọi là rễ chính nó phát triển nhanh xuống phía
dưới đến ngày thứ 4, ngày thứ 5 rễ phụ
hiện. Sau 3-4 ngày lá mầm xuất hiện và đẩy lên khỏi mặt đất

bắt đầu
do

xuất
sự sinh

trưởng mạnh của phần trên trụ mầm dưới. Lúc đầu lá mầm có màu vàng nhạt, sau có
màu xanh, sau cùng chuyến sang vàng và rụng xuống [1], [4], [15].
Thực chất quá trình nảy mầm là một chuỗi biến đổi sinh lý, sinh hoá mạnh mẽ
diễn ra trong hạt, chuẩn bị cho sự hình thành cây non. Đậu tương thuộc cây hai lá

mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các pha như sự nảy mầm của cây hai lá mầm, đó là:
+ Pha trương hạt: Tính tù' khi bắt đầu nảy mầm, hạt hút nước rất mạnh làm
trương hạt.
+ Pha hình thành và hoạt hố enzym: Hạt có một lượng enzym nhất định nhưng
chủ yếu ở dạng liên kết, khi hạt hút nước thì enzym mới được giải phóng ở dạng tự do
và bắt đầu hoạt động mạnh.
+ Pha tích luỹ chất dinh dưỡng: Ngay trong nhũng phút đầu tiên ngâm trong
nước, độ hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt chu trình hexozomonophotphat tăng lên
nhiều lần, do vậy lượng ATP tích luỹ nhiều.
+ Pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc trưng cho cơ
thể trong giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dưỡng trong hạt chủ yếu thuộc 3 nhóm
chất hữu cơ là: gluxit, protein, lipit. Trong quá trình nảy mầm enzym oc-amilaza tác
động vào liên kết 1,4- glucozit phân giải tinh bột thành các đextrin tham gia vào q
trình hơ hấp ở các dạng saccarơzơ tích luỹ ở các tế bào trụ phôi. Protein được phân
giải bởi enzym proteaza thành các axit amin và các amít. Phần lớn các axit amin tạo
thành được vận chuyến vào trụ phôi đế tổng họp các phân tử protein đặc trưng cho cơ
thể. Enzym lipaza phân giải lipit thành axit béo và glixerol. Ngoài ra lipit cịn được tái
chun hố thành gluxit cung cấp năng lượng cho hạt nảy mầm.


7
Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự hấp thụ nước, nhờ cơ chế hút trương của hạt làm
hạt trương lên. Sau khi kết thúc sự ngủ nghỉ, trong hạt bắt đầu tăng tính thuỷ hố của
keo ngun sinh chất, giảm tính ưa mỡ và độ nhớt của keo, dẫn đến những biến đối
sâu sắc và đột ngột trong quá trình trao đối chất trong hạt liên quan đến sự nảy mầm.
Đặc trưng nhất là tăng mạnh mẽ hoạt tính enzym thuỷ phân, polisaccarit, protein và
các chất phức tạp khác thành các chất đơn giản dẫn đến thay đổi hoạt động thấm thấu.
Các sản phẩm thuỷ phân này dùng làm nguyên liệu cho q trình hơ hấp tăng lên
mạnh mẽ của phôi hạt, vừa làm tăng ASTT trong hạt, giúp cho q trình hút nước vào
hạt nhanh chóng.

1.2.2.
Giai đoạn cây con
Sau khi gieo 5-7 ngày, thân rễ vươn dài và đưa hai lá mầm lên khỏi mặt đất, hai
lá mầm mở ra, thân mầm phát triển thành thân chính. Lúc này, cây con sống chủ yếu
nhờ vào thức ăn dự trữ trong lá mầm. Khi bộ rễ phát triển hút chất dinh dưỡng từ đất
nuôi cây là lúc lá mầm chuyển thành màu vàng, rụng xuống đất (sau khi gieo 15-20
ngày) [15].
Nhu cầu về nước của giai đoạn này khá lớn. Đe đảm bảo hạt nảy mầm, hàm
lượng nước trong hạt phải đạt 50% so với khối lượng hạt [4], [15]. Thiếu nước ở thời
kỳ cây con sẽ làm giảm quá trình tăng trưởng, nhưng ít ảnh hưởng nghiêm trọng đến
năng suất nếu hạn khơng cản trở sự khép tán hồn toàn [10].
1.2.3.
Giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng
Thân lá phát triển nhanh từ khi mọc đến khi ra hoa. Có hai loại đặc tính chính ở
cây đậu tương là sinh trưởng của thân và ra hoa chính. Đối với đặc tính sinh trưởng vô
hạn, cây tiếp tục sinh trưởng sinh dưỡng hầu như trong suốt vụ trồng. Đặc tính sinh
trưởng hữu hạn, cây ngừng sinh trưởng khi ra hoa. Ở giai đoạn này, bộ rễ phát triển
nhanh cả về chiều rộng và chiều sâu. Nốt sần hình thành nhiều và bắt đầu hoạt động
cố định đạm, cung cấp dinh dưỡng cho cây [4], [28].
Sự sinh trưởng, phát triển của cây là kết quả của các quá trình trao đối chất như
quang họp, hơ hấp, vận chuyến các chất đồng hố... Tất cả các quá trình này đều bị
kìm hãm bởi sự thiếu nước. Vì vậy, ở giai đoạn này nhu cầu về nước cho cây sinh


8
trưởng, phát triến tăng hơn so với giai đoạn cây con.
1.2.4.
Giai đoạn sinh trưởng sinh thực

* Giai đoạn ra hoa

Thòi gian ra hoa đầu tiên đến ra hoa cuối cùng kéo dài từ 3 đến 4 tuần, tùy
thuộc vào giống chín sớm hay chín muộn. Ớ những giống sinh trưởng hữu hạn, có
chùm hoa ở cả ngọn và nách lá, quả hình thành phân bố đều dọc theo thân, phía ngọn
có phần nhiều hơn. Cây đậu tương ra nhiều hoa nhưng tỷ lệ hoa không đậu quả chiếm
khoảng 20 - 80% [6], [10], [15]. Hoa rụng do nhiều nguyên nhân nhưng chủ yếu là sự
ảnh hưởng bất lợi từ môi trường, đặc biệt là hạn hán. Các nghiên cứu về nhu cầu nước
của cây đậu tương cho thấy cây cần rất nhiều nước ở giai đoạn này. Thiếu nước dẫn
đến giảm số chùm hoa, rụng hoa và giảm số quả [37].

* Giai đoạn hình thành quả và hạt
Quả đầu tiên hình thành trong phạm vi 7 - 8 ngày sau khi hoa đầu tiên nở.
Trong điều kiện bình thường, quả sẽ phát triến đầy đủ sau khoảng 20 ngày, các chất
dinh dưỡng trong cây được vận chuyển vào hạt, quả mẩy dần [15]. Nhu cầu về nước ở
giai đoạn này của cây tăng cao, thiếu nước làm rụng quả, giảm kích thước hạt, ảnh
hưởng nghiêm trọng đến năng suất và phấm chất của hạt [37].

* Giai đoạn quả chín
Hạt phình to, kín khoang hạt, quả mẩy đều, cây ngừng sinh trưởng, độ ẩm
trong hạt giảm dần cho đến khi chỉ còn 13 - 15%. Lá đậu chuyển sang mầu vàng và
rụng xuống đất [13]. Nhu cầu về nước của cây đậu tương ở giai đoạn này giảm hơn so
với các giai đoạn trước. Khi quả chín, để duy trì chất dinh dưỡng, tránh bị nhiễm bệnh
và nẩy mầm sớm cần phải điều chỉnh độ ấm của đất giảm dần.
Tính mẫn cảm của cây đậu tương đối với sự thiếu hụt nước ở các giai đoạn
sinh trưởng là khác nhau. Giá trị của tính mẫn cảm ở mỗi giai đoạn được cho là phần
năng suất bị giảm do thiếu nước nghiêm trọng ở giai đoạn đó. Ket quả cho thấy giá trị
mẫn cảm của đậu tương ở giai đoạn sinh dưỡng là 0,12; ở thời kì ra hoa là 0,24; cuối
ra hoa hình thành quả là 0,35 và giai đoạn quả chín là 0,13 [4]. Sử dụng giá trị này để
có kế hoạch tưới tiêu hợp lý cho từng giai đoạn sinh trưởng của cây đậu tương. Theo

9
đó cần tưới nước khi sự suy kiệt nước trong đất đạt tới 80% ở giai đoạn sinh trưởng
sinh dưỡng, 45% ở giai đoạn ra hoa, 30% ở giai đoạn cuối ra hoa, làm quả và 80% ở
giai đoạn quả chín. Như vậy, khơng nên để cây thiếu nước ở giai đoạn cây ra hoa, tạo
quả mà tưới nước là rất cần thiết ở giai đoạn này.

1.3.

Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến khả năng náy mầm của hạt
ASTT là lực gây ra sự chuyển dịch của dung môi vào tế bào qua màng sinh chất.

Nó khơng phụ thuộc vào bản chất của chất tan, mà phụ thuộc vào nồng độ phân tử
chất tan, nhiệt độ, sự phân li của dung dịch. ASTT bao gồm ASTT bên trong (ASTT
thấu nội bào) và bên ngồi (ASTT mơi trường).
ASTT bên trong: Dịch tế bào có chứa hàm lượng lớn các chất hữu cơ là sản
phẩm của quá trình trao đổi chất. Các chất này trong dịch tế bào đã tạo nên ASTT cao,
giúp cho quá trình xâm nhập của nước vào trong tế bào bằng con đường thẩm thấu.
ASTT bên ngoài chủ yếu do tính mặn của mơi trường gây nên. Đất bị nhiễm
mặn chứa hàm lượng muối cao, đặc biệt là NaCl. Điều đó đã hạn chế khả năng hút
nước, dẫn đến khó khăn trong việc hút chất dinh dưỡng [11]. Neu cây sinh trưởng
trong mơi trường khơng có muối, thì nước sẽ dễ dàng thấm qua màng bán thấm để đi
vào tế bào chất nhờ hiện tượng thẩm thấu. Đất bị nhiễm mặn sẽ gây nên 2 tác hại đối
với thực vật:
Tác hại thứ nhất, gây ra hiện tượng hạn sinh lí. Hàm lượng muối cao trong đất
làm cho ASTT môi trường lớn. Neu ASTT nội bào không thắng nối áp suất của môi
trường, cây sẽ bị khô héo do nước từ trong tế bào đi ra ngoài. Thiếu nước nhẹ thì làm
giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ dẫn đến biến đối hệ keo nguyên
sinh chất làm tăng q trình già hố tế bào. Khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị
đút vỡ cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tốn thương và chết.
Tác hại thứ hai, liên quan đến tính gây độc của các ion đối với thực vật. Đất bị

nhiễm mặn chứa hàm lượng cao các ion, đặc biệt Na+ và cr, ngồi ra cịn có các ion
khác: S042\ HCO3, Hàm lượng cao các ion này đều gây hại cho sự sinh trưởng và
phát triển của thực vật.


1
Nước là điều kiện quan trọng cho sự nảy mầm. Nước tham gia vào quá trình
trao đổi chất, các phản ứng sinh hoá trong tế bào, là nguồn nguyên liệu của nhiều phản
ứng. Nước đảm bảo cho cây tồn tại và phát triển.
Hạt khơ có hàm lượng nước từ 10 - 14% thì khơng nảy mầm. Nhờ lực hút
trương nước của keo nguyên sinh mà hạt hút được nước và khi hàm lượng nước bằng
50 - 70% khối lượng hạt thì các hoạt động sống tăng lên mạnh mẽ và phôi phát động
sinh trưởng hay nảy mầm.
Sự thiếu nước ở thực vật chủ yếu do hạn hán và ASTT môi trường gây nên. Khi
thiếu nước thường làm cho tế bào mất sức căng, đỉnh sinh trưởng bị héo và các q
trình sinh lý diễn ra khơng bình thường. Hoạt động của enzym thuỷ phân thường diễn
ra nhanh hơn là enzym tổng hợp dẫn đến tế bào mất chất dinh dưỡng. Đồng thời cũng
gây ảnh hưởng trầm trọng đến quá trình hô hấp. Khi thiếu nước cường độ hô hấp tăng
nhưng hiệu quả năng lượng bị giảm sút. Thiếu nước gây ảnh hưởng xấu đến sinh
trưởng và phát triển của cây, cuối cùng ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất của
chúng.
Thực vật nói chung và đậu tương nói riêng sống trong điều kiện thiếu nước có
khả năng chống lại hoặc hạn chế sự mất nước bằng những biến đổi hình thái hoặc
những phản ứng hố sinh phù hợp.
Biến đối hình thái được chú ý nhiều là ở bộ rễ. Bên cạnh đó là sự giảm diện tích
lá của đậu tương khi gặp hạn, nhằm giảm sự thoát hơi nước của lá.
Các thay đổi hoá sinh thường liên quan đến cơ chế chống mất nước do sinh tổng
hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước. Điều chỉnh ASTT nội
bào thơng qua tích luỹ các chất tan, các protein và axit amin nhờ enzym thuỷ phân là
cơ chế giúp tế bào duy trì lượng nước tối thiếu. Trong điều kiện thiếu nước, các phản

ứng hoá sinh diễn ra nhằm khử độc các sản phẩm được tạo nên trong quá trình phân
giải các hợp chất cao phân tử hoặc xúc tiến phục hồi các cấu trúc bị tổn thương.
về khả năng chịu mặn của thực vật, trước hết phải nói đến cơ chế tích luỹ và duy
trì nồng độ cao các chất hoà tan trong tế bào nhằm đảm bảo cạnh tranh nước với môi


1
trường nhiễm muối và chống lại hiện tượng hạn sinh lí. Hàm lượng NaCl cao trong
đất nhiễm mặn làm các loài thực vật sống thường xuyên trên đất này phải có khả năng
thu nhận và tích trữ Na+, cr cao hơn nhiều thực vật vốn có khả năng chịu mặn.
Ngồi ra cịn có những thay đối về các phản úng sinh lí như: hơ hấp, quang hợp,
thốt hơi nước của lá cho phù họp với điều kiện thiếu nước của cây.
Đã có một số cơng trình nghiên cứu sự ảnh hưởng của ASTT trên các đối tượng
động vật (lưỡng cư, bò sát... ). Trên thực vật, các nhà khoa học cũng đã đánh giá được
ảnh hưởng của ASTT đối với khả năng hút nước, sinh trưởng của rễ, thân và lá.
Trong ni cấy mơ, ảnh hưởng của manitol đến tích lũy prolin và glucose liên
quan đến khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy callus cà chua [7]. Đã có một
số cơng trình nghiên cứu ảnh hưởng của ASTT trên đối tượng đậu tương, nhưng
nghiên cứu mới chỉ dừng lại việc đánh giá sự ảnh hưởng của một ASTT nhất định (7
hoặc 9 atm). Hiện nay vẫn chưa có một cơng trình nghiên cún nào được cơng bố việc
đánh giá tổng thể ảnh hưởng của các mức ASTT khác nhau từ thấp đến cao.


1.4.
1.4.1.

1
Prolin và vai trị của prolin đối VĨI khả năng chịu hạn của cây
Cấu tạo prolin

COOH - C -  H H2C CH2 \ /
CH2

Công thức cấu tạo
Prolin hay cc - pừolidin cacboxylic là một cc - iminoaxit ưa nước có cơng thức
phân tử C5H9NO2, có mạch bên là hidrocacbua khác với các axit amin khác ở chỗ,
nhóm amin bậc 1 ở Ca liên kết với cacbon của mạch bên tạo thành vòng pirolidin.
1.4.2.
Vai trò của prolin
Prolin được tổng hợp từ L-glutamat bởi enzym chìa khố s -pyrrolincacboxilat-synthetaza (P5CS), enzym này được điều hồ bởi prolin thông qua cơ chế
ức chế ngược. Ở thực vật chịu stress nước, sự điều hoà ngược này đã biến mất và đây
có thể là nguyên nhân làm tăng sự tích luỹ prolin dưới các điều kiện stress.


1
Prolin thuộc nhóm các chất điều hịa thẩm thấu. Chúng có khối lượng phân tử
nhỏ, các họp chất này có chung tính chất khơng tích điện ở pH trung tính (như các ion
vơ cơ) và có khả năng hịa tan tốt trong nước, không độc khi tập trung với nồng độ cao
và làm on định cấu trúc của các phân tử protein, giúp thành tế bào chống lại ảnh
hưởng làm biến tính của sự tập trung muối cao và các chất tan khác có hại cho tế bào
[49]. Prolin tự do trong khi stress có hiệu ứng sinh học đa năng, khơng chỉ trong chức
năng điều chỉnh ASTT mà cịn có tác động bảo vệ hàng loạt enzym trong điều kiện
biến tính (nhiệtđộ cao, nồng độ muối cao...) [3]. Bên cạnh đó prolin cịn thể hiện khả
năng bảo vệ gián tiếp protein và màng khỏi tốn thương. Prolin còn được xem như một
dạng dự trữ nitơ. Khi gặp stress, nó dễ được sử dụng ở giai đoạn khử như thành phần
của hệ thống giữ gìn pH của tế bào và điều chỉnh thế khử của tế bào. Prolin còn là
nguồn cung cấp năng lượng và đương lượng khử [30].
Phân tử prolin có cấu trúc vịng (pirolidin). cấu trúc này tạo cho prolin một
hình dáng vững chắc hon so với các axit amin khác. Như vậy, vai trò của prolin trong
chống chịu stress nước ở thực vật thế hiện: prolin tham gia điều chỉnh ASTT của nội

bào, tham gia vào cấu trúc bảo vệ màng và protein, dự trữ nitơ và năng lượng.
Sự tích lũy prolin là một phản úng chuyển hóa thơng thường ở thực vật trong
điều kiện thiếu hụt nước và stress muối. Đây là chủ đề được các nhà khoa học nghiên
cứu hơn 20 năm qua (Stewart and Larher, Thompson, Stewart, Hanson and Hizt,
Rhodes, Delauney and Verma, Samaras, Taylor, Rhodes) T501.


1
Đã có nhiều cơng trình trên thế giới nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực vật
và cây trồng khác nhau, nhằm tìm hiếu về cơ chế tống họp, chuyến hố prolin,... liên
quan đến vai trị của prolin đối với tính chịu hạn của thực vật. Trong dòng tế bào
thuốc lá được ni cấy thích nghi với nồng độ 428 mM NaCl, prolin chiếm trên 80%
axit amin tự do (Rhodes and Handa, 1989) [50]. Người ta thừa nhận rằng, có sự phân
bố đồng đều prolin trong tồn bộ thể tích nước của nội bào, kết quả xác định axit amin
tại thời điểm này vượt quá 129 mM. Tuy nhiên, nếu chỉ hạn chế trong nội bào thì sự
tích lũy prolin có thể vượt quá nồng độ 200 mM trong các tế bào này vì thế nó góp
phần căn bản vào việc điều chỉnh thẩm thấu nội bào (Binzel et al, 1987) [33]. Tương
tự như vậy, sự tích lũy prolin nội bào ở các tế bào Distichlỉs spicata trong điều kiện
stress muối (xử lí ở nồng độ 200 mM NaCl) ước tính trên 230 mM (Ketchum et al,
1991) [43]. Kishor P.B.K và cộng sự (1995) [44] nghiên cứucây thuốc lá được chuyển
gen (gen liên quan đến sinh tổng hợp prolin - P5CS) trong điều kiện hạn nước, hạn
muối. Ket quả cho thấy hàm lượng prolin tăng khoảng từ 10 - 18 lần so với đối chứng.
Thực vật được chuyển gen (gen P5CS) cũng được nghiên cún trên đối tượng là cây
đậu tương (J.A.de Ronde; R.N. Laurie; T.Caetano; M.M. Greyling; I.Kerepesi 2004)
[41]. Kết quả so sánh tính chịu hạn giữa dịng đậu tương chuyến gen P5CS và dịng
đối chứng (khơng chuyển gen) cho thấy dịng chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt
hơn. Ngồi ra, cịn có nghiên cún trên nhiều đối tượng: dưa hấu, cà chua, lúa mỳ, củ
cải đường, khoai tây,... [34], [36], [38], [39], [40], ... cũng cho kết quả tương tự.
Theo Delauney AJ, Verma DPS (1993) [35] con đường tổng hợp prolin trong
thực vật như sau:

NADPH -t-H+

NADP* 4- Pi

ATP

LH_2
•4------------------L- Prolin

L-GI u t amat-5 - Semi aid eliit
coo


NADP* P5CR NADÍH+H* PyrroLiii-5-cacboxilat

1

P5CS: ổ -pyrrolin-5-cacboxilat synthetaza
P5CR: Ổ -pyrrolin-5-cacboxilat reductaza
Ở Việt Nam, một số tác giả đã nghiên cứu vai trò của prolin đối với khả năng
chịu hạn của nhiều loại cây trồng. Theo Nguyễn Hữu Cường (2003) [3]: bằng việc xử
lí lạnh, mặn, hạn trên các giống lúa đã cho thấy có mối tương quan thuận giữa tính
chống chịu của cây với hàm lượng


prolin gia tăng của các giống lúa nghiên cứu. Tác giả Đinh Thị Phịng (2001) [27] cho biết:
khi xử lí hạn, hàm lượng prolin đều tăng lên, mức độ tăng lên khác nhau ở mỗi giống.
Những giống chịu hạn tốt hàm lượng prolin tăng 9 lần sau khi xử lí hạn 8 ngày.
Như vậy, prolin có ảnh hưởng lớn tới tính chịu hạn ở thực vật và cây trồng nói riêng.
Sự tổng hợp axit amin prolin ở thực vật hay cây trồng diễn ra khi chúng sống trong điều

kiện thiếu nước, stress muối. Những nghiên cứu về prolin trên đối tượng lúa, đậu xanh, cà
chua, cây thuốc lá... cho thấy sự tương quan thuận giữa gia tăng hàm lượng prolin với tính
chống chịu sự thiếu nước, stress muối của chúng [3], [11], [34], [39]... Do đó, có thể xem
axit amin này như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật hay sự tích lũy prolin
là biếu hiện của phản ứng thích nghi của thực vật với điều kiện cung cấp nước khó khăn.
1.5. Một số enzym trong hạt nảy mầm
Trong hạt nảy mầm xuất hiện một so enzym để thuỷ phân các chất có trong hạt, xúc
tác cho sự nảy mầm của hạt. Một số enzym có vai trị quan trọng đối với sự nảy mầm của
hạt đậu tương là enzym proteaza, lipaza, a-amylaza...
Enzym có bản chất là protein. Đen nay đã biết và phân loại được hơn 3500 enzym.
Nhiều enzym được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau như: nghiên cứu cấu trúc
phân tủ', định lượng các chất trong công nghiệp, nông nghiệp, y học...
Ờ đậu tương đang nảy mầm, diễn ra quá trình phân giải các chất hữu cơ cung cấp
năng lượng cho cây sinh trưởng và phát triển.
yếu trong giai đoạn này là enzym thuỷ phân

Enzym hoạt động chủ
thuộcnhóm hidrolaza

(các

enzym xúc tác cho phản úng thuỷ phân) như: proteaza, lipaza, a-amilaza,...
Proteaza: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptit, tạo thành peptit phân tử thấp và
các axit amin. Proteaza đóng vai trị quan trọng trong cơ thể sống, nhất là thời kỳ nảy mầm
của hạt. Thời kỳ này protein bắt đầu được phân giải thành axit amin dưới tác dụng của
enzym proteaza. Proteaza không chỉ tham gia vào phân giải protein dự trữ trong hạt mà
chúng còn tham gia vào quá trình vi xử lý phân tử protein, phân giải các protein lạ hoặc bị
biến tính khi gặp điều kiện cực đoan (lạnh, mặn, hạn, tác động cơ học...) [17]. Trần Thị
Phương Liên (1999) khi nghiên cứu so sánh phổ điện di hoạt tính proteaza của các giống

đậu tương chịu nóng, chịu hạn khác nhau đã nhận xét rằng: proteaza trong quá trình nảy
mầm của hạt ở tất cả các giống đậu tương nghiên cứu rất đa dạng, có hoạt tính cao, có khả
năng phân giải hồn toàn chất dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp protein cho cơ thể mới
[17]. Có nhiều loại proteaza trong hạt đậu tương, chúng có kích thước phân tị, nhiệt độ tối
ưu và pH tối ưu là 5 (gần với pH của tế bào). Các axit amin là nguồn nguyên liệu cho quá
trình tổng hợp mới các chất đồng thời góp phần tăng ASTT của tế bào thực vật. Proteaza
cịn tham gia trong nhiều lĩnh vực quan trọng của đời sống như cơng nghiệp chất tẩy rửa,
cơng nghiệp hố chất, y học và nhiều ngành công nghiệp khác.
Lipaza: xúc tác phản úng thuỷ phân triaxilglixerol tạo thành các axit béo tự do và
glixerol. Lipaza xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt từng este trong phân tử chứ không cắt
đứt cả 3 liên kết este cùng lúc. Axit béo và glixerol là ngun liệu cho hơ hấp giải phóng
năng lượng và kiến tạo các thành phần của tế bào. Chuẩn độ lượng axit béo sinh ra bằng
kiềm từ đó xác định hoạt độ lipaza.
a-amilaza: phân giải liên kết l,4-glucozit ở giữa chuỗi mạch polisacarit tạo các đextrin
phân tủ’ thấp. Dưới tác dụng của enzym này dung dịch tinh bột nhanh chóng mất khả năng
tạo màu với dung dịch iot và bị giảm nhanh độ nhót. Do đó, để xác định hoạt độ của enzym
a-amilaza người ta thường dựa vào sự biến đổi màu của iot khi cho tác dụng với enzym này.
CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1.

Đối tượng nghiên cửu
Nghiên cứu được tiến hành trên 2 giống đậu tương AK02 và giống DT96.

-

AK02: giống được tạo ra bằng phương pháp chọn lọc cá thể từ giống đậu tương vàng
Mường Khương và được cơng nhận giống chính thức năm 1987 [9]. Giống được trồng 3 vụ
trong năm. Vùng đất gieo trồng thích hợp: đồng bằng, trung du và miền núi phía Bắc. Một

số đặc tính chủ yếu như chiều cao cây từ 30-40 cm, ít phân cành, thuộc nhóm ngắn ngày.
Thời gian sinh trưởng (TGST) từ 75-85 ngày. Hạt có dạng bầu dục hơi trịn, màu hạt vàng
nhạt. Khối lượng 1000 hạt đạt khoảng 100-120g. Năng suất trung bình đạt khoảng 10-12
tạ/ha. Khả năng chống chịu sâu bệnh và rét trung bình [9].

-

DT96 do Viện Di truyền nơng nghiệp (DTNN) cung cấp. Sau 7 năm khảo nghiệm liên tục


(1998-2004) tại nhiều vùng sinh thái khác nhau, Viện DTNN đã sản xuất thành công giống
đậu tương chịu hạn DT96. Giống mới được Bộ NN&PTNT cơng nhận chính thức là giống
Quốc gia vào tháng 7- 2004. Giống được tạo bằng phương pháp lai hữu tính giữa 2 giống
phổ biến trong sản xuất là DT90 và DT84. DT96 kết hợp được nhiều đặc tính tốt của 2
giống, chịu nóng tốt như DT84 và chịu lạnh như DT90. Ngồi ra cịn một số đặc điểm ưu
việt hơn DT84 và DT90 như chất lượng hạt thương phẩm, tính kháng sâu bệnh [29]. DT96
có TGST ngắn (90 - 98 ngày), phù hợp trồng thuần. Cây cao 45 - 58cm, thân có 12 - 15
đốt, sinh trưởng hữu hạn, phân cành vừa phải, lá hình tim nhọn, màu xanh sáng, lông nâu.
Hạt màu vàng sáng, rốn hạt màu trắng, hạt to, khối lượng 1000 hạt đạt 190 - 220g, tỉ lệ
protein 42,86%, lypit 18,34% [5].
2.2. Phương pháp nghiên cún
2.2.7. Phương pháp xác đinh áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu (P) được xác định theo phương pháp của Schardakov &
Grodzinsk (1981), tính giá trị bằng phương trình Van- Hoff:
p = ixCxRxT Trong
đó:

P: Áp suất thẩm thấu (atm)
C: Nồng độ mo 1/1 của dung dịch (M)
R: Hằng số khí (R=0,0821)

T: Nhiệt độ tuyệt đối (K) i: Hệ số điều chỉnh
sự phân ly (Đối với dung dịch saccarôzơ i= 1)

2.2.2.

Lập đường chuẩn prolin

* Xây dựng đường chuấn proỉin
Cân 10 mg prolin tinh khiết hoà tan trong 100ml nước, ta được dung dịch gốc (gọi là
dung dịch B) nồng độ 0,1 mg/ml (hoặc 100ng/ml). Lấy 5 ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1
đến 5, chõ các chất tham gia phản ứng như sau. Pha 10ml dung dịch A có nồng độ lần lượt
là 20, 40, 60, 80, 100 (ịag/ml) như sau:


STT

V
nước
8
(ml)

VB
(mĩ)

OD

2

0,45

1

10 ml dung dịch
A (ị-ig/ml)
20

2

40

6

4

0,81

3

60

4

6

1,17

4

80

2

8

1,52

5

100

0

10

1,88

Sau đó đo OD các dãy dung dịch prolin chuẩn ở bước sóng 520nm trên máy UVVisible Spectrophotometer, UV- 2450 do hãng SHIMADZU- Mỹ sản xuất. Thí nghiệm lặp
lại 3 lần, kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê, sau đó lập đường chuẩn bằng phần
mềm Excel, thu được đường chuẩn sau:
Mật độ OD52Ỏ

, *
.. Nồng đôprolin(ug/ml)
Đường chuân prolin
Sau khi xây dựng đường chuẩn để tính prolin là:
Y= 0,0179X + 0,095

(R2=0,99)

Trong đó: Y: Hàm lượng prolin (ỊJ.g/ml)

X: Giá trị mật độ quang học đo được ở bước sóng 520nm R2: Hệ số
tương quan

2.2.3.

Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển

giao công nghệ - Trường ĐHSP Hà Nội 2.


Đe xác định các chỉ tiêu nghiên cứu, hạt được gieo trong dung dịch đường theo
phương pháp xác định khả năng chịu hạn của Volcova:
Chọn hạt giống đều, khoẻ, có phơi sáng, khơng nấm mốc. Khử trùng khay, bình,
tay,... bằng cồn 96°. Giấy lọc được sấy 130°c trong vòng 1 giờ, hạt được khử trùng bằng
dung dịch KMnơ4 1 % trong 5 phút.
Gieo trên khay có giấy thấm, bổ sung kháng sinh nistatin 1/2 viên trong 1/2 lít thành
2 phần vào các mẫu thí nghiệm:
+ Phần 1: lơ đối chứng (ĐC) cho hạt nảy mầm trong nước cất.
+ Phần 2: lơ thí nghiệm (TN), cho hạt nảy mầm trong dung dịch đường saccarôzơ
với ASTT từ 1 atm đến 12 atm tương ứng từ M1 đến M12)
Hạt nảy mầm trong dung dịch đường. Hàng ngày bổ sung lượng nước hoặc dung
dịch đường ở các lơ như nhau.

2.2.4.

Phương pháp phân tích các chỉ tiêu
Các chỉ tiêu sinh lý: được xác định theo phương pháp của Volcova (1984) [31]

2.2.4.1.

Xác định tỉ lệ nảy mầm
Đem số hạt nảy mầm trong các mẫu từ khi hạt đầu tiên nảy mầm cho đến khi khơng

cịn có thêm hạt nảy mầm mới. Hạt được coi là đã nảy mầm khi có chiều dài rễ mầm đạt từ
3 mm trở lên. TLNM được tính theo cơng thức:
„
Trong đó:

a

T= 7- xioo b

T: tỉ lệ nảy mầm
a: số hạt nảy mầm b: tổng số hạt
đem gieo

2.2.4.2.
-

Xác định các chỉ tiêu sình trưởng của mầm

Chiều dài thân, rễ mầm (mm): sử dụng thước chia đơn vị đến mm để đo chiều dài của thân
mầm, rễ mầm vào các ngày 3,5,7 sau khi hạt nảy mầm.

-

Khối lượng tươi của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, sau đó cân khối
lượng của mầm vào ngày thứ 3 và ngày thứ 7 sau khi hạt nảy mầm.

-

Khối lượng khô của mầm (g/mầm): mầm được rửa sạch bằng nước cất, đem sấy khô ở


105°c đến khi khối lượng không đổi (3h). Cân khối lượng khô, thời gian cân vào ngày thứ
3 và ngày thứ 7 sau khi gieo hạt.
2.2.4.3.
Phân tích hàm lượng prolìn
Hàm lượng prolin của mầm được xác định theo phương pháp của Bates và cộng sự
(1973) [31], đã được Đinh Thị Phòng cải tiến (2001) [27]
Cân 0,5 g mầm/1 mẫu, nghiền kĩ, thêm 10 ml dung dịch axit sulfosalicylic 3%, li tâm 4000
vòng trong 30 phút, lọc lấy dịch trong. Lấy 2 ml dịch chiết cho vào bình (hoặc ống nghiệm)
thêm 2 ml axit axetic và 2 ml dung dịch ninhydrin (dung dịch này gồm 30 ml dung dịch
axit axetic + 1,25 g ninhydrin), đậy kín. ủ nước nóng 100°c trong lh. Sau đó ủ đá 5 phút.
Tiếp theo, bổ sung vào bình phản ứng 4 ml toluen, lắc đều. Lấy phần dịch mầu hồng ở bên
trên, đo mật độ quang học ở bước sóng 520 nm trên máy quang phố UV- Visible
Spectrophotometer, ƯV- 2450 do hãng SHIMADZU- Mỹ sản xuất.
Tất cả các a - axit amin của protein đều phản ứng màu với ninhydrin tạo hợp chất
màu xanh tím. Riêng imino axit như prolin tạo thành màu vàng với cơ chế phản ứng phức
tạp. Tính chất này có cực đại hấp thụ ở bước sóng x= 520 nm.
Hàm lượng axit amin prolin được tính theo cơng thức sau: (cơng thức suy ra từ việc
lập đường chuẩn prolin)
Y= 0,0179X + 0,095

(R2= 0,99)

Trong đó: Y: hàm lượng prolin (|u,g/ml)
X: giá trị mật độ quang học đo được ở bước sóng 520nm R2: hệ số
tương quan

Sau đó hàm lượng prolin được đổi ra đơn vị ịig/g theo cơng thức:
, YxV
A=
p
Trong đó:

A: hàm lượng prolin (l-ig/g)
P: khối lượng mẫu (g)
V: thể tích dịch prolin chiết được.

2.2.4.4. Xác định các chỉ tiêu hoả sinh của hạt nảy mẩm


* Hoạt độ của enzym proteaza
-

Xác định hoạt độ enzym proteaza theo Phạm Thị Trân Châu [2].
Cách tiến hành: Lấy hai bình nón (V= lOOml), cho vào mỗi bình 2g cơ chất đã
nghiền nát và lOml KH2PO4 0,1N, lắc nhẹ để tạo mơi trường pH thích hợp với hoạt
động của proteinaz có trong cơ. Thêm vào bình 1 (đối chúng) lOml axit tricloaxetic 10% để
kìm hãm hoạt động của enzym. Cho vào mỗi bình 2ml dung dịch protein 5%. Đặt 2 bình
trong tủ ấm 37°c, thời gian 1 giờ. Sau đó thêm vào bình 2: lOml axit tricloaxetic 10% đế
kìm hãm hoạt động của enzym kết thúc quá trình thủy phân protein . Dùng ống đong đo
dung dịch mẫu (V). Lọc dung dịch trong từng bình, đo lại dung tích dịch lọc, chuyển sang
bình tương ứng với bình thí nghiệm (2) và bình kiếm tra (1). Thêm vào mỗi bình chứa dịch
lọc lOml íbocmaldehit và 5 giọt timolphtalein đế làm chất chỉ thị màu. Chuẩn độ dung dịch
bằng NaOH 0,2N đến khi xuất hiện màu xanh mực cửu long
Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu được tính theo cơng thức:
(V -V )X2,82XVX/
x= VT—

2

Trong đó:

1

X: hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu
V: số ml dung dịch mẫu
Vi: số ml dung dịch NaOH 0,2N chuẩn độ bình đối chứng v2: số ml
dung dịch NaOH 0,2N chuẩn độ bình thí nghiệm
v3: số ml dịch lọc đem chuẩn độ g: số
gam mẫu phân tích
f: hệ số điều chỉnh NaOH 0,2N

* Hoạt độ của enzym lipaza
Xác định hoạt độ của enzym lipaza theo Nguyễn Văn Mùi [25]

-

Cách tiến hành
+ Cân 5 ghạt nghiền nhỏ thành dạng đồng thể, chuyển vào bình nón 1 OOml,
cho thêm 1 Oml nước cất, lắc đều.
+ Cho thêm 10ml dầu lạc làm cơ chất và 5 ml dung dịch đệm axetat pH= 4,7


với vài giọt toluen. Trộn đều hỗn hợp cho vào tủ ấm 30°c trong 20 đến 24 giờ
+ Bình kiểm tra phải đun sôi dịch enzym 3 đến 5 phút để làm mất hoạt động
của enzym trước khi cho tiếp xúc với cơ chất
+ Sau khi ngừng phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96% và 15 đến 25ml
ete. Lắc đều, để lắng

+ Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N với 0,5ml chỉ thị màu
phenolphtalein

-

Tỉnh kết quả: Hoạt độ của lipaza được biểu thị bằng số mililit (ml) NaOH 0,1N dùng
để chuẩn độ axit béo từ sự phân hủy dầu thực vật trong 10g hạt theo công thức:
(a-b)x/x 10 с0
Trong đó: X: là hoạt độ enzym lipaza
a: số ml NaOH 0,IN dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm b: số ml
NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình đối chứng f: hệ số chỉnh lí

NaOH 0,1N w: khối lượng hạt
* Hoạt độ của enzym a- aniilaza
Xác định hoạt độ enzym a-amilaza theo Nguyễn Văn Mùi [25],

-

Cách tiên hành
+ Cho vào 2 bình nón 50ml, mỗi bình lOml dung dịch tinh bột 1% và đặt vào máy ủ
nhiệt ở 30°c, giữ 10 phút.
+ Thêm vào bình 2 (bình thí nghiệm) 5ml dịch chiết enzym. Khuấy đều và giữ trong
10 phút.
+ Lấy tù’ mỗi bình 0,5ml hỗn họp cho vào 2 bình khác có chứa 50ml dung dịch iot.
Lắc đều. Bình đối chúng có màu xanh, bình thí nghiệm có màu tím.
+ Đo độ hấp thụ ở bước sóng 656nm. Mật độ quang của bình đối chứng (ODỊ) là
lượng tinh bột ban đầu. Mật độ quang của bình thí nghiệm (OD2) là lượng tinh bột còn lại
khi a-amilaza thủy phân. Sự khác nhau giữa mật độ quang của bình đối chứng và bình thí

-

nghiệm là lượng tinh bột bị enzym thủy phân.
Tỉnh kết quả
Lượng tinh bột bị thuỷ phân tính theo cơng thức:


«m -OD2)
c = ------——--------x(),l
ỠD|
Trong đó:

c: lượng tinh bột bị thuỷ phân
ỠD,: mật độ quang ở dung dịch đối chứng OD2: mật độ
quang ở dung dịch thí nghiệm Hoạt độ của enzym a-

amilaza tính theo cơng thức: x= (6,889x e-0,Q29388)x 100
Cú
Trong đó:

X: là hoạt độ a-amilaza
c: lượng tinh bột bị thuỷ phân (g) w: lượng chế
phẩm enzym phân tích (mg)


1000: là hệ số chuyển mg thành gam
6,889; 0,029388: là các hệ số phương trình tính hoạt độ thu được bằng
phương pháp xử lí số liệu thực nghiệm.

2.2.5.

Phương pháp xử lý số liệu
Ket quả nghiên cứu được tổng họp và xử lý theo phương pháp thống kê toán học qua

các thơng số: trung bình số học (X ), độ lệch chuấn (£), sai số trung bình (ra), hệ số biến
động (CV), độ chính xác của thí nghiệm (ra%), tiêu chuấn độ tin của hiệu (td). Tiêu chuẩn
độ tin của hiệu (td) được so trong bảng phân phối Student với số bậc tự do: (n!+ n 2 - 2) với
mức ý nghĩa a = 0,05.
N
z
x , -&- = X 100 ó'
=
-------------- = c V- -, s—=—, m = —ị=
n -1
X
4n
m% = í , mJ = Jm* + mỊ ,d = XDL.-XTN , td= —
X
mể
Các tính tốn được thực hiện trên cơ sở sử dụng phần mềm Microsoft
Excel. Trong mỗi bảng, số liệu so sánh giữa ĐC và các mẫu thí nghiệm kèm
theo chữ (a) thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy a = 0,05.
giữa các mẫu TN liền kề, dấu (*) thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê
với độ tin cậy a = 0,05 giữa các ngày TN liền kề.