Xác định hóa chất bảo vệ thực vật carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LCMS)

Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
MỤC LỤC
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 3
Chương 1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
NHÓM CARBAMATE 4
1.1 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật 4
1.1.1 Định nghĩa 4
1.1.2 Phân loại 4
1.1.3 Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật 5
1.2 Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamate 6
1.3 Một số thuốc bảo vệ thực vật nhóm carbamate 7
1.3.1. Carbofuran 7
1.3.2. Carbaryl 7
1.3.3. Fenobucarb 8
1.3.4. Propoxur 8
1.3.5Giới hạn cho phép 9
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ
LC/MS 11
2.1.Phương pháp xác định 11
2.1.1. Phương pháp cực phổ 11
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 11
2.1.3. Phương pháp phân tích dòng chảy 11
2.1.4. Phương pháo điện di mao dẫn 12
2.1.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 12
2.1.6. Phương pháp sắc ký khí 13
2.1.7. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 13
2.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 14
2.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng 15
2.2.1.1. Pha động trong HPLC 15
2.2.1.2. Pha tĩnh trong HPLC 16

2.2.2. Phương pháp khối phổ 17
2.2.2.1. Cấu tạo 17
a. Nguồn ion 17
b. Bộ phận phân tích khối lượng 19
Nhóm 09 Trang 1
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
c. Bộ phận phát hiện 21
Chương 3.QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CARBAMATE 22
3.1. Phương tiện nghiên cứu 22
3.1.1. Thiết bị 22
3.1.2. Dụng cụ 22
3.1.3. Dung môi hóa chất 23
3.2. Cách tiến hành 24
3.2.1. Yêu cầu chung 24
3.2.2. Chuẩn bị mẫu 24
3.2.3. Chuẩn bị phần mẫu thử 25
3.2.3.1. Chiết xuất mẫu thu mẫu 25
3.2.3.2. Làm sạch mẫu thử 25
3.2.4. Chuẩn bị phần mẫu trắng 25
3.2.5. Chuẩn bị phần mẫu kiểm tra hiệu suất thu hồi 25
3.2.6. Điều kiện phân tích 26
3.2.7. Dựng đường chuẩn 26
3.2.8. Xác định 27
3.3. Tính toán kết quả 27
3.3.1. Công thức tính kết quả 27
Chương 4. KẾT LUẬN 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO 29
MỞ ĐẦU
Thời gian gần đây tình trạng thực phẩm nhiễm dư lượng thuốc bảo vệ thực vật quá
mức cho phép vẫn đang diễn ra hết sức nghiêm trọng. Nhiều vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra

hàng loạt, được xác định có liên quan đến dư lượng thuốc bảo vệ thực vật có trong rau, củ,
Nhóm 09 Trang 2
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
quả. Không chỉ dừng lại ở mức độ gây ngộ độc, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật còn lại
trong rau quả còn được nghi ngờ là những mối nguy lớn có khả năng gây ung thư hay đột
biến gen. Do đó, việc xác định dư lượng thuốc trừ sâu còn lại trong rau quả là việc làm hết
sức cần thiết để xác định mức độ an toàn của rau và để ngăn chặn ảnh hưởng trên người,
động vật và môi trường sống. Một trong những nhóm thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng
rất phổ biến hiện nay là thuốc trừ sâu họ Carbamate(CBM).
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là một kĩ thuật mới được phát triển trong những
năm gần đây. Về cơ bản, nó là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là
detector khối phổ. Phương pháp này tuy mới ra đời nhưng nó được ứng dụng rộng rãi để
phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu đặc biệt là nhóm carbamate. Phương pháp có thể
phân tích đồng thời từ hàng chục đến hàng trăm các loại thuốc trừ sâu khác nhau. Phương
pháp có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích
nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp
sắc kí lỏng thường không làm được.
Với những ưu điểm trên, chúng em đã chọn đề tài: “Xác định hóa chất bảo vệ thực
vật carbamat trong một số loại rau quả bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
(LC/MS)”.
Chương 1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Nhóm 09 Trang 3
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT NHÓM CARBAMATE
I.1. Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật
1.1.1 Định nghĩa
Hóa chất bảo vệ thực vật là những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa
học được dùng để phòng và trừ sinh vật gây hại cây trồng và nông sản. Hóa chất bảo vệ
thực vật gồm nhiều nhóm khác nhau, gọi theo tên nhóm sinh vật gây hại, như thuốc trừ sâu
dùng để trừ sâu hại, thuốc trừ bệnh dùng để trừ bệnh cây…

1.1.2 Phân loại
Các loại hóa chất bảo vệ thực vật gồm nhiều loại, chủ yếu gồm 4 nhóm chính:
- Nhóm Clo hữu cơ (organnochlorine) là các dẫn xuất clo của một số hợp chất hữu cơ
như diphenyletan, cyclodien, benzen, hexan. Nhóm này bao gồm những hợp chất hữu
cơ rất bền vững trong môi trường tự nhiên và thời gian bán phân huỷ dài (ví dụ như
DDT có thời gian bán phân huỷ là 20 năm, chúng ít bị đào thải và tích luỹ vào cơ thể
sinh vật qua chuỗi thức ăn). Đại diện của nhóm này là Aldrin, Dieldrin, DDT,
Heptachlo, Lindan, Methoxychlor
- Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus) đều là các este, là các dẫn xuất hữu cơ của
acid photphoric. Nhóm này có thời gian bán phân huỷ ngắn hơn so với nhóm Clo hữu
cơ và được sử dụng rộng rãi hơn. Nhóm này tác động vào thần kinh của côn trùng bằng
cách ngăn cản sự tạo thành men Cholinestaza làm cho thần kinh hoạt động kém, làm
yếu cơ, gây choáng váng và chết. Nhóm này bao gồm một số hợp chất như parathion,
malathion, diclovos, clopyrifos…
- Nhóm Carbamat là các dẫn xuất hữu cơ của acid cacbamic, gồm những hoá chất ít
bền vững hơn trong môi trường tự nhiên, song cũng có độc tính cao đối với người và
động vật. Khi sử dụng, chúng tác động trực tiếp vào men Cholinestraza của hệ thần
kinh và có cơ chế gây độc giống như nhóm lân hữu cơ. Đại diện cho nhóm này như:
carbofuran, carbaryl, carbosulfan, isoprocarb, methomyl…
Nhóm 09 Trang 4
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
- Nhóm Pyrethroid là những thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên, là hỗn hợp của các
este khác nhau với cấu trúc phức tạp được tách ra từ hoa của những giống cúc nào đó.
Đại diện của nhóm này gồm cypermethrin, permethrin, fenvalarate, deltamethrin,…
Ngoài ra, còn có một số nhóm khác như: các chất trừ sâu vô cơ (nhóm asen), nhóm
thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm, virus (thuốc trừ nấm, trừ vi
khuẩn…), nhóm các hợp chất vô cơ (hợp chất của đồng, thủy ngân, …).
1.1.3 Tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật
Hầu hết hóa chất bảo vệ thực vật đều độc với con người và động vật máu nóng ở các
mức độ khác nhau. Theo đặc tính hóa chất bảo vệ thực vật được chia làm hai loại: chất

độc cấp tính và chất độc mãn tính.
Hóa chất bảo vệ thực vật có thể thâm nhập vào cơ thể con người và động vật qua
nhiều con đường khác nhau; thông thường qua 03 đường chính: hô hấp, tiêu hoá và
tiếp xúc trực tiếp. Khi tiếp xúc với hóa chất bảo vệ thực vật, con người có thể bị nhiễm
độc cấp tính hoặc mãn tính, tùy thuộc vào phạm vi ảnh hưởng của thuốc.
• Nhiễm độc cấp tính: Là nhiễm độc tức thời khi một lượng đủ lớn hoá chất bảo
vệ thực vật thâm nhập vào cơ thể. Những triệu chứng nhiễm độc tăng tỉ lệ với việc
tiếp xúc và trong một số trường hợp nặng có thể dẫn tới tử vong. Biểu hiện bệnh lý
của nhiễm độc cấp tính: mệt mỏi, ngứa da, đau đầu, lợm giọng, buồn nôn, hoa mắt
chóng mặt, khô họng, mất ngủ, tăng tiết nước bọt, yếu cơ, chảy nước mắt, sảy thai,
nếu nặng có thể gây tử vong.
• Nhiễm độc mãn tính: Là nhiễm độc gây ra do tích luỹ dần dần trong cơ thể.
Thông thường, không có triệu chứng nào xuất hiện ngay trong mỗi lần nhiễm. Sau
một thời gian dài, một lượng chất độc lớn tích tụ trong cơ thể sẽ gây ra các triệu
chứng lâm sàng. Biểu hiện bệnh lý của nhiễm độc mãn tính: kích thích các tế bào
ung thư phát triển, gây đẻ quái thai, dị dạng, suy giảm trí nhớ và khả năng tập trung,
suy nhược nghiêm trọng, ảnh hưởng đến hệ thần kinh, gây tổn hại cho gan, thận và
não.
Nhóm 09 Trang 5
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
I.2. Giới thiệu về hóa chất bảo vệ thực vật nhóm carbamate
Thuốc trừ sâu carbamat là các dẫn xuất của acid cacbamic có tính độc trừ sâu. Nhiều
hợp chất trong nhóm tuy có hiệu lực cao với sâu hại nhưng không có tác dụng trừ nhện
hoặc chỉ có tác dụng trừ một số thuộc nhóm này mà không trừ được nhóm sâu khác.
Là nhóm thuốc bảo vệ thực vật rất phổ biến có công thức chung.
Được dùng nhiều trong nông nghiệp: thuốc trừ sâu, diệt cỏ, trừ
nấm…Có hơn 50 loại carbamate được biết đến phần lớn là do tổng
hợp. Carbamate không bền, dễ bị phân hủy dưới tác động của môi
trường. Carbamate là những chất độc và cực độc theo tiêu chuẩn
Việt Nam được xếp vào nhóm độc I hoặc II

 Cơ chế tác động:
- Các thuốc carbamate kìm hãm men cholinesteraza bằng cách cacbaryl hóa các vị trí
hoạt động của toàn men. Nhưng sự liên kết giữa các thuốc carbamate với
cholinesteraza thường không bền, nên có trường hợp sâu hại phục hồi được.
- Các thuốc carbamate chỉ ức chế được men cholinesteraza khi toàn bộ phân tử của
chúng gắn được lên bề mặt của men. Các chất carbamate càng bền, càng ức chế
men cholinesteraza mạnh.
- Carbamate kìm hãm vị trí men tác động, dẫn đến hệ thần kinh không kiểm soát
được, làm mất khả năng phối hợp giữa các cơ quan, giải phóng quá mức hormon,
sinh vật mất nước và chết.
Các thuốc carbamate an toàn với cây, ít độc đối với cá hơn các thuốc lân hữu cơ;
không tồn lưu quá lâu trên nông sản và môi trường sống. Độ độc của thuốc đối với động
vật máu nóng rất khác nhau, tùy thuộc vào loại thuốc.
Các chất chủ yếu thuộc nhóm bao gồm: carbaryl, methiocarb, pirimicarb, oxamyl,
carbendazim, propoxur, aminocarb, aldicarb…
I.3. Một số thuốc bảo vệ thực vật nhóm carbamate
I.3.1. Carbofuran
Nhóm 09 Trang 6
Trong đó: R1 là ankyl
R2 là aryl
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
Carbofuran là một trong những thuốc trừ sâu nhóm carbamat độc nhất, có tên là 2,3-
dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranyl methylcarbamate, tên thương mại là Furadan,
Curater.
Carbofuran là một trong những thuốc trừ sâu có độc tính cao đối với con người. Nó có
thể xâm nhập vào cơ thể qua hô hấp, qua miệng và qua da. Triệu chứng khi bị ngộ độc
carbofuran: buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy, giảm tầm nhìn… Ở liều cao có thể gây tử vong.
Chỉ cần uống 1ml carbofuran cũng có thể dẫn tới tử vong.
Theo WHO, mức hấp thụ hàng ngày cho phép (ADI) của carbofuran là 0,01mg/kg
trọng lượng cơ thể. Liều gây chết trung bình đối với chuột qua miệng là LD

50
= 5mg/kg.
I.3.2. Carbaryl
Carbaryl có tên là 1-naphthyl methylcarbamate, tên thương mại là Sevin, là một loại
thuốc trừ sâu nhóm carbamat. Carbayl là tinh thể màu trắng, tan kém trong nước nhưng tan
nhiều trong dung môi phân cực như đimethyl sulfoxide và đimethyl formaldehyde.
Công thức phân tử C
12
H
11
NO
2
.
M = 201,2g/mol.
t
s
= 145°C.
d = 1,232g/cm
3
.
Carbaryl là một chất ức chế men cholinesteraza và có độc với con người. Nó được xếp
vào loại chất gây ung thư đối với con người.
Nhóm 09 Trang 7
Công thức phân tử: C
12
H
15
NO
3
.

M = 221,25g/mol.
t
nc
= 151°C.
d = 1,18g/cm
3
.
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
Carbaryl là một thuốc trừ sâu có độc tính trung bình. Khi tiếp xúc với carbaryl có thể
gây ra ngộ độc cấp và mãn tính với các triệu chứng như: buồn nôn, chuột rút dạ dày, tiêu
chảy. Các triệu chứng khác ở liều lượng cao bao gồm đổ mồ hôi, làm mờ của tầm nhìn, và
co giật, ảnh hưởng đến phổi, thận và gan.
Mức hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của carbaryl là 0,1mg/kg trọng lượng cơ
thể. Đối với chuột, liều gây chết trung bình qua miệng LD
50
= 250 – 850mg/kg, liều gây
chết trung bình qua hô hấp LC
50
= 0,005 – 0,023mg/kg.
I.3.3. Fenobucarb
Fenobucarb có tên là 2-(1-Methylpropyl) phenol methylcarbamate, là một loại thuốc
trừ sâu nhóm carbamat
Công thức phân tử: C
12
H
17
NO
2
M = 207,3g/mol
t

s
= 32°C
d = 1,035g/cm
3
Fenobucarb tan kém trong nước, tan tốt trong các dung môi Acetone, Benzene,
Toluene, xylene. Fenobucarb được sử dụng làm thuốc trừ sâu trên lúa và bông, rất độc hại
đối với con người, nó ảnh hưởng đến hệ thần kinh, bộ phận sinh sản, gây ung thư và ngộ
độc cấp tính. Liều gây chết trung bình qua miệng đối với chuột là 410mg/kg.
I.3.4. Propoxur
Propoxur có tên theo IUPAC là 2-isopropoxyphenyl methylcarbamate, là một dẫn xuất
của carbamat và được sử dụng làm thuốc trừ sâu.
Nhóm 09 Trang 8
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
• Công thức phân tử: C
11
H
15
NO
3
• M = 209,2g/mol
• t
s
= 91°C
Propoxur có độc tính cao đối với ruồi, muỗi, gián và bọ chét. Nó là chất có độc tính
cao với con người, nó có thể xâm nhập vào cơ thể qua hô hấp, qua đường miệng và qua da.
Triệu chứng ngộ độc propoxur: buồn nôn, đau bụng, ra mồ hôi, tăng huyết áp, mắt mờ, mệt
mỏi, khó thở. Propoxur nhiễm độc mãn tính đối với con người gây ung thư, ảnh hưởng đến
cơ quan sinh sản và hệ thần kinh trung ương.
Đối với chuột, liều gây chết trung bình qua miệng là 90 – 128mg/kg, qua da là 800
– 1000mg/kg. Theo WHO, mức hấp thụ hàng ngày tối đa cho phép ADI của propoxur là

0,02mg/kg trọng lượng cơ thể.
Liều gây chết trung bình qua miệng đối với chuột là 410mg/kg.
I.3.5. Giới hạn cho phép
Dư lượng là phần còn lại của hoạt chất, các sản phẩm chuyển hóa và các thành phần
khác có trong thuốc, tồn tại trên cây trồng, nông sản, đất, nước sau một thời gian dưới tác
động của hệ sống và điều kiện ngoại cảnh. Dư lượng của thuốc được tính bằng mg thuốc
có trong 1kg nông sản, đất hay nước.
Mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) là giới hạn dư lượng của một loại thuốc,
được phép tồn tại về mặt pháp lí hoặc xem như có thể chấp nhận được ở trong hay trên
nông sản, thức ăn gia súc mà không gây hại cho người sử dụng và vật nuôi khi ăn các nông
sản đó.
Nhóm 09 Trang 9
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
Bảng 1. Mức dư lượng tối đa cho phép sử dụng thuốc bảo vệ thực vật carbamat ở một số
quốc gia.
Quốc gia Đối tượng
Carbofuran
(mg/kg)
Carbayl
(mg/kg)
Propoxur
(mg/kg)
Fenobucarb
(mg/kg)
Nhật Bản Xoài 0,3 3,0 1,0 0,3
Việt Nam
(Quyết định
46/2007/QĐ
-BYT)
Táo, nho, lê 5,0 3,0

Cà chua, cà
rôt
0,1 0,05
EU Trái cây 0,1 1 0,05
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nhóm 09 Trang 10
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS
2.1. Các phương pháp xác định
2.1.1. Phương pháp cực phổ
Trong phương pháp này, người ta phân cực điện cực giọt thủy ngân bằng một điện áp
một chiều biến thiên tuyến tính với thời gian để nghiên cứu các quá trình khử cực của
chất phân tích trên điện cực đó. Vì vậy, thiết bị cực phổ gồm hai phần chính là máy cực
phổ và hệ điện cực bao gồm điện cực giọt thuỷ ngân và điện cực so sánh. Đường cực phổ
biểu diễn sự phụ thuộc của chiều cao cường độ dòng với nồng độ chất phân tích. Để xác
định các lượng nhỏ chất thường dùng cực phổ cổ điển (10
-3
– n.10
-5
). Để xác định các
lượng chất cực nhỏ thường dùng các phương pháp cực phổ hiện đại như cực phổ sóng
vuông, cực phổ xung vi phân.
Một số nhà phân tích đã xác định carbaryl và carbofuran bằng phương pháp cực phổ
xung vi phân.
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Phương pháp này đã xác định đồng thời 3 loại thuốc trừ sâu nhóm carbamat bằng
phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp dựa trên sự tạo mầu của carbamat
với thuốc thử p-aminoacetanlide. Khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert - Beer của
carbaryl, propoxur và carbosulfan. Phương pháp đã được áp dụng để phân tích thuốc trừ
sâu nhóm carbamat trên các mẫu rau, đất, thức ăn, nước … với hiệu suất thu hồi khoảng

95%.
Các phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử chỉ phân tích được một loại carbamat
nào đó hoặc phân tích đồng thời một số carbamat. Hơn nữa, phương pháp có độ nhạy
kém. Do đó, hiện nay phương pháp này rất ít được ứng dụng để phân tích carbamat.
2.1.3. Phương pháp phân tích dòng chảy (flow injection analysis – FIA)
Phân tích dòng chảy là một kĩ thuật phân tích động, trong đó mẫu phân tích ở dạng
lỏng được bơm vào dòng chất mang chuyển động liên tục. Sau đó trong vòng phản ứng
chất phân tích sẽ phản ứng với thuốc thử có trong dòng chất mang, hay được bơm trực
tiếp vào đầu vòng phản ứng, để tạo ra một sản phẩm có thể phát hiện được theo một tính
chất hóa lí nào đó nhờ một loại detector phù hợp. Các tính chất hóa lí đó thường là: sự
hấp thụ quang phân tử UV-VIS và nguyên tử, tính chất phát xạ của nguyên tử, tính chất
huỳnh quang, sự thay đổi chiết suất, tính chất điện hóa. Ứng với mỗi tính chất người ta có
Nhóm 09 Trang 11
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
một loại detector. Đây là một phương pháp đơn giản, nhanh và dễ dàng kết hợp với
phương pháp sắc ký lỏng để xác định đồng thời một số carbamat.
Một phương pháp phân tích dòng chảy sử dụng detector huỳnh quang để xác định
carbofuran đã được đề cập. Phương pháp dựa trên phản ứng của carbofuran với KMnO
4
và luminol trong môi trường kiềm nhẹ sẽ tạo thành hợp chất màu. Phương pháp đã ứng
dụng thành công xác định dư lượng carbofuran trong mẫu rau diếp.
Phương pháp phân tích dòng chảy có ưu điểm là nhanh, thiết bị phân tích dễ kiếm và
rẻ tiền. Tuy nhiên, phương pháp không thể xác định đồng thời các chất carbamat. Do vậy,
phương pháp cũng ít được ứng dụng để phân tích carbamat.
2.1.4. Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp sắc ký mao quản điện động học mixen đã xác định đồng thời aldicarb,
carbofuran và một số dạng chuyển hóa của nó trong nước bề mặt.
Kĩ thuật điện di mao quản là một kĩ thuật mới được phát triển khoảng hơn 10 năm trở
lại đây. Đây là một kĩ thuật có thời gian phân tích nhanh, tốn ít dung môi và hóa chất.
Việc xác định các hóa chất bảo vệ thực vật bằng thiết bị này vẫn đang được nghiên cứu

và chưa có nhiều loại thuốc trừ sâu được xác định bằng phương pháp này.
2.1.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detetor huỳnh quang xác định đồng
thời các chất carbamat như aldicarb, propoxur, carbofuran, carbaryl và methiocarb trong
mật.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp thông dụng để xác định
các hợp chất hữu cơ. Phương pháp này đã được ứng dụng để xác định đồng thời các chất
carbamat. Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy kém khi sử dụng detector UV, còn khi sử
dụng detector huỳnh quang, phương pháp có độ nhạy tốt hơn nhưng chỉ có thể nhận biết
chất phân tích thông qua thời gian lưu. Đối với những nền mẫu phức tạp, các chất phân
tích rất dễ bị ảnh hưởng bởi nền mẫu, nếu chỉ dựa vào thời gian lưu sẽ rất khó để có thể
khẳng định chất cần phân tích.
2.1.6. Phương pháp sắc ký khí
Xác định thuốc trừ sâu carbamat và nhóm nito hữu cơ trong thực phẩm bằng phương
pháp sắc ký khí khối phổ. Phương pháp đã xác định đồng thời 29 loại thuốc trừ sâu trong
một số thực phẩm như táo, khoai tây, gạo, chuối… Mẫu được chiết bằng aceton và được
làm sạch bằng 3 loại cột chiết pha rắn khác nhau: cột diatomaceous, cột diatomit kết hợp
Nhóm 09 Trang 12
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
với cột C18, cột florisil. Hiệu suất chiết các mẫu thực phẩm bằng 3 loại cột đều trên 80%.
Sau đó, mẫu được xác định bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ.
Phương pháp sắc ký khí đã được ứng dụng rộng rãi để xác định các hóa chất bảo vệ
thực vật như các chất clo hữu cơ, lân hữu cơ, pyrethroid và carbamat. Tuy nhiên phương
pháp chỉ phân tích được những chất dễ bay hơi, còn các chất khó bay hơi thì phải tạo dẫn
xuất nên tốn thời gian và hóa chất. Hơn nữa, để phân tích được đồng thời các chất thì cần
thời gian phân tích dài. Do vậy, phương pháp ít được ứng dụng để phân tích carbamat.
2.1.7. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ là một kĩ thuật mới được phát triển trong những
năm gần đây. Về cơ bản, nó là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là
detector khối phổ. Phương pháp này tuy mới ra đời nhưng nó được ứng dụng rộng rãi

để phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu đặc biệt là nhóm carbamat. Phương pháp có thể
phân tích đồng thời từ hàng chục đến hàng trăm các loại thuốc trừ sâu khác nhau.
 Phương pháp có nhiều ưu điểm như:
- Độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định
lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí lỏng
thường không làm được.
- Tự động hóa, đa năng; hiệu quả tách tốt nên có thể phân tích nhiều hỗn hợp phức
tạp; độ chọn lọc cao; giới hạn phát hiện thấp; thời gian phân tích nhanh; có thể
định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí
lỏng thường không làm được.
- Phương pháp này đã được nghiên cứu để khắc phục được một số nhược điểm của
các phương pháp sắc kí lỏng thông thường như: mất thời gian, tốn kém hóa chất
(mẫu, pha tĩnh, dung môi), tách hỗn hợp phức tạp và kém hiệu quả. Từ đó có nó
được ứng dụng rộng rãi trong phân tích hóa học, sinh hóa, thực phẩm, dược phẩm,
môi trường,…
Với những ưu điểm trên, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc kí lỏng khối phổ để
nghiên cứu xác định đồng thời các chất carbamat.
2.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ
Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ: là phương pháp được hiểu là mẫu được phân
tách và tinh sạch qua sắc ký,sau đó mẫu được đưa qua máy khối phổ để tiếp tục xác định
Nhóm 09 Trang 13
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
khối lượng nguyên tử đó. Kết thúc quá trình ta thu được lượng mẫu nhất định và cấu trúc
phân tử đó.
Sơ đồ chung:
Nguyên tắc hoạt động: Nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp các chất phân tích
A, B, C … Vào cột phân tích, kết quả các chất A,B,C…. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi
đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký là tổng hợp các tương tác. Đối với mỗi
chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết
định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là

lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột, F3 là lực tương tác giữa pha động và
pha tĩnh. Như vậy với các chất thì F1 và F2 là khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di
chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột
Mẫu cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo khối
phổ. Để đo đặc tính của các phân tử cụ thể,máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các ion,
chuyển động kiểm soát chuyển động của chúng bởi điện từ trường bên ngoài. Quá trình thực
hiện trong môi trường chân không. Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách
gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường
ngoài. Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân
tích và lưu trữ trong một máy vi tính.
Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối
mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ
Nhóm 09 Trang 14
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dò
MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí,
vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng
dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng.

Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện.
Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB), bắn phá nguyên
tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB),… đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến
cuối thập nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển
(Atmospheric Pressure Ionization – API).
Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong
buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như
bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-
FAB) hay như tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của
API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích
nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều

khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân
tích.
2.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng (HPLC)
Sắc ký lỏng là phương pháp hóa lý dùng để tách và phân tích các cấu tử của một hỗn hợp
cấu tử dựa vào tính chất hóa học,vật lý, hóa lý của chất cần phân tích(cần tách) với pha
động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn.
2.2.1.1. Pha động trong HPLC
Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất
phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng
cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được các điều kiện
sau:
Nhóm 09 Trang 15
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
• Pha động phải trơ với pha tĩnh.
• Pha động phải hòa tan tốt mẫu phân tích, phải bền vững và không bị phân hủy
trong quá trình chạy sắc ký.
• Pha động phải có độ tinh khiết cao.
• Pha động phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân bằng
hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tuỳ theo bản chất của từng loại sắc ký.
• Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích.
• Pha động phải không quá đắt.
Có thể chia pha động làm hai loại:
 Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên
để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ
phân cực như MeOH, ACN. Pha động loại này được dùng trong sắc ký
pha liên kết ngược.
 Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như
xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan,
cacbondisulfua (CS
2

), chlorobutan, CCl
4
, toluene Tuy nhiên pha động
một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta
thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực
từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha
động theo thời gian gọi là rửa giải gradient
2.2.1.2. Pha tĩnh trong HPLC
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích.
Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7mm. Tuỳ theo bản chất của
pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha
thường (NP-HPLC) và sắc ký pha ngược (RP-HPLC)
• Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần
hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân
cực: -NH
2
, -CN ), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-
hexan, toluene Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân
cực.
Nhóm 09 Trang 16
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
• Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân
cực, loại thông dụng nhất là –C
18
H
37
, còn pha động phân cực: nước, methanol,
axetonitril Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là
nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa
dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực

2.2.2. Phương pháp khối phổ
Khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối
lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện hay ion trong
một điện trường hoặc từ trường nhất định
2.2.2.1. Cấu tạo
Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và
detector. Trước hết, các mẫu
được ion
hóa trong nguồn
ion,
sau
đó đưa
vào
bộ phận phân tích khối để
tách các ion theo tỉ số m/z.
Các tín hiệu thu được sẽ chuyển
vào máy tính để xử lí và lưu trữ.
a.Nguồn ion
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành
dạng hơi và được ion hóa nguyên tử. Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký
lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở
áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hóa bắn phá
nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment – FAB). Dưới đây là hai phương pháp ion hóa
được sử dụng trên thiết bị Finnigan LCQ
DUO
:
Nhóm 09 Trang 17
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
a.1) Ion hóa phun điện tử – ESI
Kĩ thuật này chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí. Dung

dịch mẫu được dẫn vào vùng có trường điện từ mạnh được duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV.
Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và được hút tĩnh điện tới lối
vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trước khi vào thiết bị phân tích khối phổ
sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi. Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá
với chế độ ion dương và ion âm.
Hình 2.2. Kĩ thuật ESI bắn phá với chế độ ion dương
Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao. Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất
không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol, và các
chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ.
a.2) Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển – APCI
Đây cũng là một kĩ thuật ion hóa mềm. APCI được sử dụng để phân tích các chất có
khối lượng phân tử trung bình. Kĩ thuật này có thể bắn phá ở 2 chế độ: ion âm và ion
dương.
Nhóm 09 Trang 18
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
Hình 2.3. Kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương
Chất phân tích và dung môi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa hơi ở
nhiệt độ cao khoảng 500°C. Một điện thế cao từ 3 – 5kV tạo ra các electrron và ion hóa
chất phân tích. Đối với kĩ thuật APCI bắn phá với chế độ ion dương, sự ion hóa mẫu được
thực hiện qua 3 giai đoạn:
 Giai đoạn thứ nhất:
−+−
+→+ eNNe 2
.
22
 Giai đoạn thứ hai:
.
222
.
2

++
+→+ OHNOHN
.
32
.
2
HOOHOHOH +→+
++
 Giai đoạn thứ ba:
OHHMMOH
23
)( ++→+
++
APCI là một kĩ thuật ion hóa mạnh, nó không bị ảnh hưởng khi thay đổi đệm chạy và
nồng độ đệm. Nó được sử dụng để ion hóa các chất có khối lượng phân tử nhỏ (có khối
lượng phân tử < 2000u).
b. Bộ phận phân tích khối lượng
Nhóm 09 Trang 19
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
b.1) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để
các ion bay qua. Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều
(DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối. Khi
một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào
tỉ số giữa m/z và trường RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ
lọc này.
b.2) Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)
Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện cực
bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dưới. Trái với lại thiết bị
tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đường cong ổn định được bẫy lại cho

đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cực vòng. Các ion khác nhau m/z sau đó trở nên
không ổn định và sẽ có hướng đi về phía detector. Do điện áp RF khác nhau trong hệ thống
này mà thu được một phổ khối lượng đầy đủ.
Các ion tồn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về
m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu được các mảnh ion
con, từ đó thực hiện phân tích theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần). Về nguyên tắc các
ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong
thực tế thường chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần.
b.3) Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)
Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector với cùng một năng
lượng. Do các ion có cùng năng lượng nhưng lại khác nhau về khối lượng nên thời gian đi
tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có vận tốc lớn
hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này được gọi là thiết bị phân tích
thời gian bay do tỉ số m/z được xác định bởi thời gian bay của các ion. Thời gian bay của
một ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động học của các
ion. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhưng nó có ưu điểm là khối lượng
ion có thể phân tích không bị hạn chế.
Nhóm 09 Trang 20
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam

c.Bộ phận phát hiện
Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị
khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu
của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do
điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân
electron và bộ phận phát hiện nhân quang.
Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy
cao. Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó
được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành
dòng các electron.

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập
vào một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau
đó sẽ va đập vào một màn chắn phôtpho và giải phóng ra các photon. Các photon này được
phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của
phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các
khả năng nhiễm bẩn
Chương 3. QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
CARBAMATE
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thiết bị
Nhóm 09 Trang 21
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
 Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC/MS bao gồm: bộ phận bơm dung môi, bộ
loại khí, bộ phận điều nhiệt, máy vi tính và detector MS.
 Cột sắc ký C
18
của Water (150mm × 4,6mm × 5μm).
 Máy lắc vortex.
 Máy đồng nhất mẫu.
 Hệ thống cô quay chân không
 Máy li tâm MIKRO 22R.
 Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg).
 Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).
 Máy cất quay chân không Eyela.
 Máy nghiền mẫu
 Máy sinh khí nitơ, có thể tạo ra nitơ có độ tinh khiết 99%;
3.1.2. Dụng cụ
• Pipet: dung tích 1, 2, 5, 10ml, chia vạch đến 0.1ml
• Bình định mức: dung tích 5ml, 10ml, 20ml và 50ml.
• Micropipet: dung tích từ 20 µl đến 100 µl, từ 50 µl đến 200 µl và từ 200

µl đến 1000 µl
• Ống đong: dung tích 25ml và 100ml.
• Bình tam giác: dung tích 250ml
• Bình cầu: dung tích 50ml
• Xyranh: dung tích 5ml
• Màng lọc 0.45µm
• Phễu, giấy lọc, ống nhỏ giọt.
3.1.3. Dung môi, hóa chất
Nhóm 09 Trang 22
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích.
o Chuẩn carbamat gồm: carbofuran, propoxur, carbaryl, fenobucarb.
o Methanol.
o Aceton
o Diclometan
o Ete dầu hỏa, nhiệt độ sôi 35-60
0
C
o Toluen
o Acetonitril
o Hỗn hợp dung môi 1: aceton, diclometan, ete dầu hỏa với tỷ lệ thể tích 4:3:3
o Hỗn hợp dung môi 2: metanol và nước với tỷ lệ thể tích bằng 2:1
o Hỗn hợp dung môi 3: acetonitril và toluen với tỉ lệ thể tích bằng 3:1.
o Dung môi pha động 1: axit axetic 0,1%(v/v) trong nước.
o Dung môi pha động 2: axit axetic 0,1%(v/v) trong metanol
o Acid acetic
o Diclometan
o Nước cất.
o Natri sulfat khan hoạt hóa 130
0

C trong 8h, để nguội trong bình hút ẩm, đậy kín.
o SPE Carbo 500mg/8ml.
o SPE NH
2
500mg/6ml.
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc 1000µg/ml: Cân chính xác 0,01g chất chuẩn lần lượt của từng
carbamat, chính xác đến 0.01mg, hoà tan cho vào từng bình định mức 10ml và định mức
đến vạch bằng methanol.
- Dung dịch chuẩn trung gian 10µg/ml: Dùng micropipet lấy 200 µl từng dung dịch
chuẩn gốc cho vào bình định mức dung tích 20 ml, hoà tan và định mức đến vạch bằng
hỗn hợp dung môi 2
Nhóm 09 Trang 23
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
- Dung dịch chuẩn làm việc:
o Dung dịch chuẩn làm việc 1: nồng độ 0.01 µg/ml. Dùng micropipet lấy 20 µl
dung dịch chuẩn trung gian cho vào bình định mức dung tích 20 ml, hoà tan và
định mức đến vạch bằng hỗn hợp dung môi 2.
o Dung dịch chuẩn làm việc 2: nồng độ 0.03 µg/ml. Dùng micropipet lấy 30 µl
dung dịch chuẩn trung gian cho vào bình định mức dung tích 10 ml, hoà tan và
định mức đến vạch bằng hỗn hợp dung môi 2.
o Dung dịch chuẩn làm việc 3: nồng độ 0.3 µg/ml Dùng micropipet lấy 300 µl
dung dịch chuẩn trung gian cho vào bình định mức dung tích 10 ml, hoà tan và
định mức đến vạch bằng hỗn hợp dung môi 2.
o Dung dịch chuẩn làm việc 4: nồng độ 1.0 µg/ml. Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch
chuẩn trung gian cho vào bình định mức dung tích 10 ml, hoà tan và định mức đến
vạch bằng hỗn hợp dung môi 2.
o Dung dịch chuẩn làm việc 5: nồng độ 1.5 µg/ml. Dùng pipet lấy 1.5 ml dung dịch
chuẩn trung gian cho vào bình định mức dung tích 10 ml, hoà tan và định mức đến
vạch bằng hỗn hợp dung môi 2.

3.2. Cách tiến hành
3.2.1 Yêu cầu chung
Toàn bộ qui trình phân tích cần được thực hiện trong ngày. Nếu không phân tích được
trong ngày thì phải lưu dịch mẫu trong tủ mát ở 4
0
C.
3.2.2 Chuẩn bị mẫu
Mẫu thử được nghiền trong máy nghiền mẫu đến khi đồng nhất.
3.2.3 Chuẩn bị phần mẫu thử
3.2.3.1 Chiết xuất mẫu thử
Cân khoảng 20 g mẫu thử đã được đồng nhất ở bước chuẩn bị mẫu, chính xác tới 0.01 g
vào bình tam giác dung tích 250 ml.
Thêm vào bình 100 ml hỗn hợp dung môi 1 gồm axeton, diclomethan, ete dầu hỏa với tỉ lệ
thể tích bằng 4: 3: 3 (V
1
), đậy nắp kín, lắc đều 30 phút, đưa về nhiệt độ phòng.
Thêm 10g Na
2
SO
4
khan, để yên 30 phút.
Nhóm 09 Trang 24
Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM GVHD: Nguyễn Thanh Nam
Dùng pipet dung tích 10 ml lấy chính xác 10 ml (V
2
) dịch lỏng thu được cho vào bình cầu
50 ml và cô cạn ở 40
O
C bằng hệ thống cô quay chân không.
Dùng pipet thêm 2 ml hỗn hợp dung môi Axetonitril và toluen với tỉ lệ thể tích bằng 3:1,

lắc đều được dung dịch A.
3.2.3.2 Làm sạch mẫu thử
Nối hai cột SPE Carbo và NH
2
lại với nhau, dùng ống đong lấy 10 ml hỗn hợp dung môi 3
hoạt hóa cột.
Chuyển toàn bộ dung dịch A vào cột. Rửa giải bằng 15 ml hỗn hợp dung môi 3.
Cô cạn dung dịch thu được ở 40
O
C bằng hệ thống cô quay chân không.
Dùng pipet thêm 2 ml (V
E
) hỗn hợp dung môi 2 vào để thu được phần mẫu thử.
3.2.4 Chuẩn bị phần mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu không chứa dư lượng benfuracarb, carbaryl, carbosulfan, fenobucarb,
isoprocarb và methomyl, được chuẩn bị như phần mẫu thử.
3.2.5 Chuẩn bị phần mẫu kiểm tra hiệu suất thu hồi
Cân khoảng 20 g mẫu trắng đã được đồng nhất, chính xác tới 0.01 g vào bình
tam giác dung tích 250 ml. Dùng micropipet thêm 40 µl dung dịch chuẩn trung
gian để yên trong nhiệt độ phòng tối thiểu 15 phút. Tiếp tục thực hiện chuần bị
như phần (3).
3.2.6 Điều kiện phân tích
Tốc độ dòng pha động: 0,2 ml/phút
Nhiệt độ buồng cột: 40
O
C
Thể tích bơm mẫu: 5 µl.
Chương trình dung môi:
Thời gian(phút) % dung môi pha động 1 % dung môi pha động 2
0 50 50

Nhóm 09 Trang 25