Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử KỶ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ
KHOA SINH HỌC

BÀI TIỂU LUẬN
BỘ MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ
Đề tài:
KỶ THUẬT PCR
(Polymerase Chain Reaction)

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc
Học viên thực hiện : Nguyễn Thị Duyên
Chuyên ngành: Thực vật học
Khóa học : XXII (2013 - 2015)


Phần một: ĐẶT VẤN ĐỀ
Huế, 01/2014
Trong khoảng 3 thập kỷ qua nhân loại đã trải qua cuộc cách về mạng sinh học, những vấn đề
sinh học phân tử (các quá trình lưu trữ, truyền đạt và biểu hiện thông tin di truyền ở mức độ
phân tử) là một bộ phận trong cuộc cách mạng đó. Các kiến thức của sinh học phân tử cho
phép chúng ta giải thích được mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các đại phân tử sinh
học cũng như sự vận hành và kiểm soát các quá trình sinh hóa trong tế bào. Trọng tâm của
sinh học phân tử là việc nghiên cứu các đại phân tử như ADN, ARN và Protein cùng các quá
trình tái bản, phiên mã và dịch mã Trong số các tiến bộ kỹ thuật góp phần tạo ra các cuộc bùng
nổ về lĩnh vực sinh học phân tử chúng ta phải kể tới kỹ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction). Kỹ thuật PCR do Kary Mullis đề suất ra vào năm 1985, đây là phương pháp invitro
để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó, có độ nhạy rất cao chỉ cần một khối lượng ban đầu
rất hạn chế. Bản thân kỹ thuật này chỉ là sự mở rộng trực tiếp các tính chất của quá trình tái
bản ADN. Nhưng nó đã được sử dụng theo nhiều cách khác nhau để làm cho việc tách dòng
và thao tác với ADN dễ dàng và hiệu quả hơn. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh
học phân tử nhằm nhân bản (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ống

nghiệm mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống. Kỹ thuật này
được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều
mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA,
chuẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.
Các áp dụng của nó hiện nay trong nhiều lãnh vực đã và đang làm được những
kết quả thật sự kỳ diệu, đã làm cho các công trình nghiên cứu sinh học phân tử
trở nên nhẹ nhàng và dễ dàng hơn gấp nhiều lần so với trước kia. Nếu trước đây
một thử nghiệm sinh học phân tử phải kéo dài hàng tuần, thậm chí hàng tháng,
thì nay cũng thí nghiệm có cùng mục đích như vậy, với PCR chỉ thực hiện trong
vài ngày. Nếu trước đây có những mục đích thí nghiệm không thể thực hiện
được, thì ngày nay với PCR mục đích này lại có thể thực hiện được một các dễ
dàng. Chính nhờ PCR mà ngày nay, sinh học phân tử đã làm được những bước
tiến nhảy vọt trong mọi lãnh vực. Vậy có thể nói là PCR đã thực sự làm một
cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử.
Với mục đích tìm hiểu để có cái nhìn tổng quan nhất về kỷ thuật này, em chọn
đề tài nghiên cứu là: " Kỷ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)".
Phần hai: NỘI DUNG
A. Phương pháp PCR
I. Lịch sử nghiên cứu
Phương pháp PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về
Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra
ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà ADN có thể nhân lên
nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme ADN
polymerase.
ADN polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức
năng nhân ADN khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi ADN và
tạo sợi bổ sung. Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản
ADN được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi ADN đôi bị tách thành 2
sợi đơn khi đun nóng ở 96°C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này ADN polymerase bị phá
hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ.

Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian,
cần một lượng lớn ADN polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình
PCR.
Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng ADN-
polymerase lấy từ vi khuẩn Thermus aquaticus (ưa nhiệt) sống trong mạch nước
phun ở nhiệt độ trên 110°C. ADN polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn
định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp
được nung nóng để tách sợi ADN. Từ đó, không cần phải thêm ADN-polymerase
vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép ADN có thể đơn giản và tự động hơn.
Một trong những ADN-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập
được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng
rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó
nhầm lẫn trong quá trình sao chép ADN, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi
ADN, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay
Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có
thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi ADN được sao
chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn
sự nhân bản chính xác của ADN.
II. Định nghĩa
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại
nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp PCR
được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể
thu nhận rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác
định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định
hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,….
III. Các điều kiện của phản ứng PCR
Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có các thành phần sau:
- ADN khuôn.
- Mồi.

- ADN polymerase.
- Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP).
- Dung dịch đệm (buffer).
1. ADN khuôn (template)
Gần như bất kỳ loại ADN, dù là mạch thẳng, mạch vòng, ADN plasmit, ADN
hệ gen, cADN, hoặc ARN…đều có thể làm khuôn cho phản ứng PCR. ADN lấy
từ nguồn nào không quan trọng yêu cầu duy nhất là vị trí gắn các mồi và trình tự
giữa chúng còn nguyên vẹn đã có những mẫu ADN mà tuổi đến hơn 7 nghìn
năm vẫn được sử dụng rất thành công trong các phản ứng PCR.
Chúng ta hãy xem xét việc nhân bội một phân tử ADN đích. Khi lượng phân
tử ADN ban đầu nhỏ, sự nhiễm (có mặt ADN mà chúng ta không quan tâm) trở
thành vấn đề chính. Đặc tính nhân bội của kỹ thuật PCR có nghĩa là, thậm chí
chỉ nhiễm rất ít ADN cũng có thể phá hỏng thí nghiệm. Nhiễm có thể từ nhiều
nguồn khác nhau, kể cả từ nhà nghiên cứu thực hiện thí nghiệm, từ ống nghiệm,
từ đầu tip, thậm chí từ enzym và dung môi dùng cho thí nghiệm. Trong một thí
nghiệm PCR điển hình, khoảng 0,1 - 1g hệ gen được thêm vào phản ứng để có
thể thực hiện PCR với số chu kỳ ít mà vẫn có đủ vật liệu cho các thí nghiệm tiếp
theo. Điều đó cũng giúp giảm thiểu khả năng nguồn nhiễm đươc nhân bội.
Lượng ADN này tương ứng với bao nhiêu bản sao trình tự đích? Nếu bạn thêm
1g ADN hệ gen người thì nó tương ứng với 1 x 10
-6
/(6,4 x 10
9
x 650) = 2,4.10
-19
mol. Vì ADN người chứa khoảng 6,4 x 10
9
bp và khối lượng phân tử trung bình
của một cặp bazơ là 650 Da nên 1g ADN người tương với 2,4 x 10
-19

mol x 6 x
10
23
(số Avogadro) = khoảng 144.000 phân tử. Một đoạn ADN hệ gen dài
1000bp nhân bội 8 triệu lần (sau 25 chu kỳ PCR) sẽ sinh ra khoảng 10 g đoạn
ADN đó. Lượng nhỏ đó đủ để nhận biết bằng cách nhuộm ethidium bromide sau
khi điện di.
2. Mồi (primer)
Thành công của phản ứng PCR có hiệu quả cao hay không cơ bản phụ thuộc
vào mồi.
Mồi gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer).
Các cặp mồi cần được thiết kế để mồi này nhận biết được sợi có nghĩa của ADN
mà ta cần tái bản, còn mồi kia nhận biết được sợi đối nghĩa. Các mồi có những
đặc điểm sau:
- Dài khoảng 17 – 30 nucleotit.
- Có hàm lượng GC khoảng 50%.
- Nhiệt độ ở giai đoạn gắn mồi của từng cặp mồi (được tính từ phương trình
2(AT) + 4(GC)) trong mỗi thí nghiệm phải như nhau.
- Trình tự nucleotit phải đảm bảo mồi không gắn vào trình tự lặp lại trên
ADN đích.
µµµµ
- Từng mồi không được chứa các đoạn trình tự bổ trợ. Ví dụ, mồi có trình tự
5
’
– GAGATCGATGCATCGATCTC – 3
’
có thể là mồi PCR tốt (vì dài 20
nucleotit, GC chiếm 50% và không chứa trình tự lặp lại) nhưng nó lại mang trình
tự bổ trợ ở hai đầu và sẽ tạo cấu trúc cặp tóc nếu đầu 5
’

gắn kết với đầu 3
’
. Khi
đó phản ứng PCR sẽ không diễn ra.
- Hai mồi của cặp không được bổ trợ nhau hoặc đầu 3
’
của hai mồi không
được bổ trợ nhau. Ví dụ, hai mồi
5
’
– GATCGATCGATACGTGATCC – 3
’
và
5
’
– CGTAGCTAGCTAGGATCACG – 3
’
dường như là cặp mồi tốt. Tuy
nhiên, các đầu 3
’
của hai mồi lại bổ trợ nhau và có thể tạo primer dime rồi được
tái bản trong chu kỳ 1 của phản ưng PCR:
5
’
– GATCGATCGATACGTGATCC – 3
’
3
’
– GCACTAGGATCGATCGATGC – 5
’

PCR

5
’
– GATCGATCGATACGTGATCCTAGCTAGCTACG – 3
’
3
’
– CTAGCTAGCTATGCACTAGGATCGATCGATGC – 5
’

* Ghép đôi sai của mồi
Các mồi oligonucleotit dùng cho kỹ thuật PCR phải ghép đôi chính xác với
trình tự đích. Điều đó đặc biệt có ý nghĩa khi chúng ta cố tạo đột biến hoặc
những biến đổi có chủ ý ở đoạn trình tự ADN nhân bội, hoặc khi chúng ta muốn
tìm trình tự gen tương đồng với trình tự đã biết. Vị trí trong mồi phải ghép đôi
thật chính xác với trình tự đích chính là đầu 3
’
. Nếu đầu 3
’
không ghép đôi chính
xác thì polymerase không tiếp tục tổng hợp hiệu quả được và thí nghiệm hỏng
hoàn toàn.
Để hiểu bằng cách nào có thể sử dụng PCR để gây tạo đột biến ở sản phẩm,
chung ta cần tìm hiểu kỹ hơn về mồi. Mồi không chỉ khởi đầu quá trình tái bản
ADN mà chính chúng được tổng hợp lồng ghép vào các sản phẩm cuối cùng.
Như vậy, bất kỳ sự thay đổi bazơ nào giưã mồi và ADN khuôn cũng được đưa
vào sản phẩm. Vì chúng ta không thể gây tạo đột biến ở đầu 3
’

nên vị trí thích
hợp để biến đổi là đầu 5
’
của mồi.

Mồi 1
5
’ –
GAATTCATGAAGCTACTGTCTTCT – 3
’
5
’
TGAAAGATGAAGCTACTGTCTTCT
ACTTTCTACTTCGATGACAGAAGA
GGATTATTTGTACAAGATAATGTG 3
’
CCTAATAAACATGTTCTATTACAC 5
’
3’–CCTAATAAACATGTTCTACCTAGG –5
’
Gen
GAL4

PCR Mồi 2


BamHI
EcoRI 5
’-
GAATTCATGAAGCTACTGTCTTCT

GGATTATTTGTACAAGATAATGTG 3
’

3
’-
CTTAAGTACTTCGATGACAGAAGA CCTAATAAACATGTTCTATTACAC 5
’

Các mồi dùng để nhân một phần gen GAL4 từ hệ gen Saccharomyces
cerevisiae và có gắn thêm vị trí nhận biết của enzym giới hạn.
Các sản phẩm PCR đều chứa trình tự này.
Trong trường hợp trên, chúng ta sử dung các mồi có chứa trình tự bổ sung ở
các đầu 5
’
. Ở mồi 1, đó là trình tự nhận biết cho enzym giới hạn EcoRI ở đầu 5
’
của đoạn trình tự dùng để nhận biết gen GAL4. Trình tự nhận biết của EcoRI
không kết đôi chính xác với trình tự đích nhưng cũng không đủ để ngăn cản sự
kết hợp đặc hiệu của mồi và trình tự đó có mặt ở tất cả các sản phẩm PCR. Mồi
chứa trình tự nhận biết cho enzym giới hạn BamHI. Việc tách dòng sản phẩm
cuối cùng trở nên dễ dàng sau khi cắt bằng 2 enzym giới hạn. Thường thì các
enzym giới hạn cần đoạn trình tự dài hơn trình tự nhận biết của chúng để cắt thật
hiệu quả. Vì vậy, người ta thường bổ sung thêm 3 đến 6 nucleotit vào trước trình
tự nhận biết của enzym giới hạn. Các nucleotit đó thường là G hoặc C (được gọi
là kẹp GC) để tăng khả nắng gắn mồi của hai mạch và tăng hiệu quả cắt của
enzym giới hạn.
Bất kỳ đôi bazơ ghép sai nào giữa mồi và ADN khuôn cũng được đưa vào
sản phẩm PCR cuối cùng. Vì vậy, có thể tạo ra những đột biến mong muốn ở sản
phẩm PCR bằng cách thay đổi trình tự mồi. Điều đó đặc biệt quan trọng nếu ta
muốn thay đổi trình tự mã hóa của gen để thay đổi trình tự axit amin, hoặc, ví

dụ, nếu ta muốn thay đổi codon cua gen để tạo ra vị trí nhận biết của enzym giới
hạn mà không làm thay đổi trình tự axit amin của protein.
Lợi ích thứ hai của primer ghép đôi sai là để tìm gen mã hóa một protein cụ
thể và tìm các gen tương đồng. Việc tách và đặc trưng hóa protein là việc phổ
biến trong hóa sinh học. Ví dụ, ta có thể tách protein mà ở đầu amin có trình tự
các axit amin: Met – Ile – Trp – Pro – Phe. Tính thoái hóa của mã cho biết trình
tự axit amin đó có thể được mã hóa bằng các trình tự ADN sau:
Met – Ile – Trp – Pro – Phe
5
’
– ATG – ATA – TGG – CCA – TTC – 3
’
C C T
Gen
GAL4
T T
G
Chúng ta không thể biết những codon nào được dùng để mã hóa các axit
amin trên. Vì vậy, để nhân đoạn trình tự mã hóa các protein đó, chúng ta phải
thiết kế mồi thoái hóa, nghĩa là phải gắn được với các tổ hợp có thể có mã hóa
được cho các axit amin. Mồi dưới đây có thể thực hiện được chức năng đó:
5
’
– ATG – ATA – TGG – CCA – TTC – 3
’
C T
T
3. Các ADN polymerase
Là các enzym xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotit A, T, G, C vào mạch
ADN mới đang tổng hợp. Ngày nay người ta dùng nhiều loại ADN polymerase:

Taq ADN polymerase, Pfu

ADN polymerase, T
4
ADN polymerase, T
th
ADN
polymerase nhưng phổ biến là Taq ADN polymerase.
Taq ADN polymerase được tách chiết từ chủng vi khuẩn suối nước nóng
Thermus aquaticus. Vi khuẩn này chịu được nhiệt độ từ 50
o
C – 80
o
C và sinh
trưởng tối ưu ở nhiệt độ 70
o
C.
Taq ADN polymerase là enzym đơn phân, có khối lượng phân tử 90kDa.
Bản thân enzym chịu được nhiệt, xúc tác tái bản ADN ở 74
o
C và thậm chí vẫn
duy trì khả năng hoạt động chức năng sau khi ủ ở 95
o
C.
Enzym này có hoạt tính polymerase 5
’
– 3
’
và hoạt tính exonuclease 5
’

–
3
’
nhưng không có hoạt tính exonuclease 3
’
– 5
’
(đọc sửa). Không có hoạt tính
đọc sửa nghĩa là, nếu bazơ sai xen vào chuỗi polynucleotit đang tổng hợp thì
cũng không bị loại bỏ và như vậy Taq ADN polymerase có xu hướng tổng hợp
có sai sót và sẽ sinh đột biến ở các sản phẩm PCR. Trong các thí nghiệm đánh
giá in vitro. Taq ADN polymerase ghép sai bazơ với tần số 1/10
4
- 1/10
5
. Tỷ lệ sai
sót xấu nhất là 1/10
4
, nghĩa là trong 1kb trình tự được nhân sau 25 vòng tái bản
thì khoảng 10% sản phẩm có chứa đột biến. Tuy nhiên, vì đột biến xảy ra ở chu
kỳ này sẽ chỉ được nhân lên ở các chu kỳ sau nên tần số đột biến thực sự sẽ khác
nhau ở các thí nghiệm khác nhau. Mặc dù vậy, mức độ sai sót đó có ảnh hưởng
khác nhau đến đầu ra của các sản phẩm PCR. Nếu thí nghiệm PCR được thiết kế
chỉ để xác định có hay không có một gen cụ thể trong đoạn ADN đích thì những
sai sót trong quá trình nhân bội không ảnh hưởng. Tuy nhiên, nếu để nghiên cứu
chức năng của gen thì những sai sót đó có thể tác động nghiêm trọng đến thí
nghiệm.
Một khía cạnh khác về hoạt động chức năng của Taq ADN polymerase là nó
có xu hướng gắn deoxynucleotit (thường là adenosine) vào đầu 3
’

của mạch mới
tổng hợp, không phụ thuộc vào mạch khuôn. Kết quả là, các sản phẩm PCR do
Taq ADN polymerase tạo ra không có đầu bằng mà có một nucleotit A nhô ra ở
đầu 3
’
. Đặc điểm này đã được khai thác để tách dòng các sản phẩm PCR.
Sau Taq ADN polymerase, nhiều ADN polymerase khác cũng được phát hiện
và sử dụng. Những ADN polymerase đó có những đặc điểm khác biệt.
Pfu ADN polymerase được tách chiết từ Pyrococcus furiosis có hoạt tính đọc
sửa exonuclease 3
’
– 5
’
nên làm giảm được tần số đột biến. Cũng với tần số đột
biến như trên (1/10
4
), thì với Pfu ADN polymerase, chỉ có 0,1% sản phẩm PCR
chứa đột biến. Một số ADN polymerase khác sinh các sản phẩm PCR đầu bằng.
Hoạt tính exonulease 5
’
– 3
’
của Taq ADN polymerase có nghĩa là enzym này
có khả năng phân hủy các mồi oligonucleotit dùng trong phản ứng. Điều đó đặc
biệt có ý nghĩa ở bước gây biến tính của chu kỳ 1, khi mà các oligonucleotit
không gắn vào khuôn ADN và polymerase còn đang tự do trong dung dịch. Vào
chu ky gia nhiệt đầu tiên, nhiệt độ của hỗn hợp PCR tăng từ nhiệt độ phòng
(hoặc từ 4
o
C nếu phản ứng được thiết kế trên đá) đến 94

o
C. Điều đó có nghĩa là,
ở một thời điểm nào đó, nhiệt độ bên trong ông nghiệm sẽ là 72
o
C – nhiệt độ tối
ưu cho polymerase – nhưng enzym lại không có khả năng tái bản ADN vì không
có oligonucleotit nào gắn vào khuôn. Việc đi qua nhiệt độ đó mà không tái bản
có xu thế dẫn đến phân hủy mồi và làm cho thí nghiệm không hiệu quả. Để giải
quyết khó khăn này, và để ngăn ngừa các sản phẩm PCR không đặc hiệu, có thể
bổ sung Taq ADN polymerase vào hỗn hợp ngay tại 94
o
C. Như vậy vừa giúp làm
tăng sản phẩm vừa tăng tính đặc hiệu của phản ứng. Cách khác là, Taq ADN
polymerase có thể được trộn với kháng thể đặc hiệu gắn kết với enzym để ức chế
hoạt tính của nó. Phức hệ kháng thể - enzym ức chế tái bản ADN ở nhiệt độ thấp,
rồi lại tách ra ở nhiệt độ cao nên enzym vẫn hoạt động chức năng được.
Có thể sử dụng hỗn hợp các ADN polymerase với các đặc tính khác nhau
trong các phản ứng đặc biệt. Ví dụ, Taq ADN polymerase sinh ra nhiều sản phẩm
PCR với kích thước tối đa là 5 – 7kbp nhưng sản phẩm lại có nhiều sai sót; Pfu
ADN polymerase sinh ra sản phẩm ít sai sót hơn nhưng không tạo được sản
phẩm tới 7kbp. Hỗn hợp 2 ADN polymerase đó (15 phần Taq: 1 phần Pfu) khá
hiệu quả để nhân chính xác đoạn ADN có kích thước đến 35kbp.
4. Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP)
Các dNTP gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tham
gia tạo nên mạch ADN mới. Nồng độ tối ưu của dNTP thường dùng là 100 –
200M. Tuy nhiên, ở nồng độ dNTP thấp (10 – 100M) thì Taq ADN polymerase
hoạt động chính xác hơn.
5. Dung dịch đệm (buffer)
Thành phần dung dịch của phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại
enzym ADN polymerase sử dụng trong PCR, quan trọng nhất là ion Mg

2+
.
Ví dụ, thành phần dung dịch đệm 10X cho phản ứng PCR khi sử dụng Taq ADN
polymerase bao gồm;
Tris-HCl 100M với pH = 8 ở 25
o
C.
KCl 500M.
µµ
µ
µ
Gelatin 0,01%.
MgCl
2
2mM.
Nồng độ ion magie có vai trò quan trọng đối với sự thành công của phản ứng
PCR. Magie cần cho ADN polymerase hoạt động chức năng nhưng mỗi phản
ứng PCR cụ thể cần nồng độ ion magie khác nhau. Nếu nồng độ magie thấp,
phản ứng không thành công vì polymerase không được hoạt hóa thích hợp. Nếu
nồng độ magie cao, phản ứng mất tính đặc hiệu và quá nhiều sản phẩm được tạo
ra. Nồng độ magie tối ưu được xác định dựa vào kinh nghiệm với từng bộ mồi
nhưng thường trong khoảng 0,5 – 5mM. Đệm và muối của phản ứng (Tris và
KCl) thường được giữ ổn định mặc dù một số protocol giảm bớt mức độ KCl để
kích thích polymerase bám trên mạch khuôn lâu hơn và tăng số lượng sản phẩm.
IV. Thiết bị và dụng cụ cho PCR
Phản ứng PCR được thực hiện trong máy chu trình nhiệt. Đây là máy đun
nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng.
Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR
cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho
một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng.

§

Máy
nhân
gen
PCR
Cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa
sự bốc hơi nước. Có thể tiến hành PCR ngay trên mô và tế bào.
Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuyếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một
nghiên cứu cần tiến hành trên cùng một loại.
Ống nghiệm dùng của một nghiên cứu phải cùng một kiểu vì đặc tính truyền
nhiệt của các ống cũng như nhiệt độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tỏa nhiệt của
thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuyếch đại.
V. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA
dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số
lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của
enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của
đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được
kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc
tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch
đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng
ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau
bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định,
cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự
base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
như sau :
Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân
tử (94 – 95 0C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép
tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho
sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bước 2: (bắt cặp, annealing)
Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các
primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt
độ này dao động trong khoảng 55 – 65 0C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà
thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)
Nhiệt độ được tăng lên 72
0
C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất.
Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo
nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào
độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2
n
m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa.
n: Là số chu kỳ.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản
sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA
đích đã nhân bản được thành 2
30
đến 2
40
bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.
Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần. Ba giai đoạn xãy ra trong điều kiện nhiệt độ
khác nhau nên người ta sữ dụng máy điều nhiệt tự động một cách chính xác với

sự trợ giúp của Taq. Sự lặp lại theo chu kỳ thường xãy ra khoảng 30 lần để tạo ra
10
6
bản sao.

Các bước thực hiện trong 1 chu kỳ PCR
* Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR điển hình thường là:
- 90
o
C, 30 giây – gây biến tính ADN.
- 60
o
C, 30 giây – gắn mồi.
- 72
o
C, 1 phút – tổng hợp.
Giai đoạn biến tính và gắn mồi thường ngắn nhưng phù hợp để phá hủy
và tái tạo các liên kết hydro giữa hai mạch ADN. Các protocol trước đây thường
có giai đoạn biến tính 94
o
C, 2 phút để đảm bảo ADN khuôn hoàn toàn tách ra.
Hiện nay thường không như vậy vì việc xử lí nhiệt độ cao, lâu thường gây các
vết đứt trên ADN khuôn. Chiều dài của sản phẩm PCR xác định thời gian giai
đoạn tổng hợp của phản ứng. Hầu hết các polymerase được sử dụng trong các
phản ứng PCR tái bản in vitro với tốc độ khoảng 500 – 1000 bp/ phút. Thời gian
của giai đoạn tổng hợp thay đổi phụ thuộc vào độ dài của sản phẩm PCR.
Sau khi hoàn thành, một số protocol còn thêm giai đoạn cuối (72
o
C, 5
phút) để đảm bảo tất cả các phân tử ADN trong phản ứng được tái bản thành

dạng mạch kép. Giai đoạn này cũng làm tăng hiệu quả tách dòng của các sản
phẩm PCR.
* Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
Số chu kỳ phản ứng của từng thí nghiệm PCR phụ thuộc vào lượng ADN
khuôn ban đầu và lượng ADN cần thu được sau phản ứng. Nói chung, thí
nghiêm PCR thường được thiết kế gồm từ 17 – 25 chu kỳ.
Nếu kéo dài quá 30 chu kỳ thì khả năng sai sót sẽ tăng theo vì phản ứng PCR diễn ra qua
hai giai đoạn:
- Giai đoạn đầu: Số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu.
- Sau đó, hiệu quả khuyếch đại giảm dần do:
+ Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
+ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
+ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với nhau
VI. Thu nhận kết quả
Thông thường sau khi thực hiện phản ứng PCR, cần tiến hành điện di trên gel agarose để
xác định chất lượng các đoạn ADN. Các bước tiến hành như sau:
- Chuẩn bị gel để điện di: Lấy 0,8 gam bột agarose hòa tan trong 100ml đệm TAE 1 lần
(Tris – bazơ 48,8g/l; axit axetic 10,2ml/l; EDTA 0,5M 20ml/l có pH = 8,0). Đun nóng đến
50oC thì đổ dung dịch vào khuôn gel đã cài răng lược để tạo thành giếng nhỏ. Độ dày của bản
gel tùy thuộc vào mục đích sử dụng. Để gel đông và ổn định trong 30 – 40 phút ở nhiệt độ
phòng. Rút lược ra khỏi khuôn. Đặt khay gel vào bể điện di sau đó đổ TAE 1 lần tới khi ngập
mặt gel khoảng 2mm.
- Tra mẫu: Mẫu được trộn theo tỷ lệ 2§l ADN + 1§l đệm tra mẫu 10X + 7§l nước cất
để được tổng thể tích 10§l. Thêm vài giọt Bromophenol Blue làm chỉ thị màu để quan sát sự
chuyển động của mẫu trong quá trình điện di.
- Chạy điện di: Đặt khay gel vào máy điện di. Chạy điện di với điện thế 60 – 80V
(10V/cm). Quan sát vạch màu đến cuối bản gel thì dừng lại.
- Nhuộm gel: Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng Ethidium Bromid (5§g/ml)
trong 15 phút. Lắc nhẹ. Rửa gel bằng nước cất, sau đó soi gel để xem băng ADN dưới ánh
sáng đèn tử ngoại. Nếu băng gọn rõ thì sản phẩm PCR tốt.

VII. Ưu điểm và hạn chế của kỷ thuật PCR
1. Ưu điểm:
- Thời gian thực hiện cực nhanh : Chỉ cần mất 3 giờ để khuếch đại một trình
tự ADN được quan tâm, so với phương pháp tạo dòng của kỷ thuật ADN tái tổ
hợp phải mất cả tuần hoặc lâu hơn.
- Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ
µµµµ
µ
gồm các thành phần tối thiểu được sữ dụng đồng thời. Trong khi đó phương
pháp tạo dòng điển hình cần các vật liệu đắt tiền như màng, nucleotid
triphosphat mang dấu phóng xạ và việc thực hiện cần các thao tác khéo léo đặc
biệt.
- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu
nuclotid thô. Điều này ngược với kỷ thuật ADN tái tổ hợp ADN, đoạn gen hoặc
vector cần tương đối tinh khiết.
- PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn hay
đột biến điểm.
- Dùng để định lượng so sánh bằng cách cho tiến hành khuếch đại đồng thời
trình tự đích và một trình tự chứng có nồng độ đã biết,
Nhờ các ưu thế trên PCR đã hấp dẫn các nhà nghiên cứu ngay từ lúc ra đời
trong việc khuếch đại các trình tự nucleic acid đặc hiệu và chẩn đoán phân tử.
Giới hạn duy nhất đối với phương pháp này là phải biết trình tự nucleotid của
đoạn cần khuếch đại. Nó không thay thế kỷ thuật tái tổ hợp ADN mà góp phần
đáng kể bổ sung cho kỷ thuật này.
2. Hạn chế:
Do độ nhạy cảm rất cao nên PCR vừa rất đơn giản, có khuynh hướng sữ
dụng rộng rãi nhưng gặp không ít khó khăn.
- Trong thực nghiệm kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu
tiên
Trừ một vài trường hợp PCR không hoạt động được với những phân tử ADN

có kích thước lớn hơn 3 kp. PCR cho kết quả tốt nhất ở độ dài ADN dưới 1,5 kp.
- Sự ngoại nhiêm là vấn đề ớn đặt ra đối với PCR gắn liền với khả năng
khuếch đại bản sao của phương pháp này
Vấn đề cấp thiết trong ứng dụng chẩn đoán, dự phòng vì hậu quả có thể rất
nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất là các các sản phẩm khuếch đại của
những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các
ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng
thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra ngoài bay lơ
lững trong không khí và bám vào tường ,cửa, các dụng cụ, thiết bị thí
nghiệm rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó.
- Các sai sót gây ra do Taq polymerase
Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (10-4 nghĩa là cứ 10.000 nucleotit
thì enzyme gắn sai 1 nucleotit). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích
thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuyếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định
chính xác trình tự nucleotit của ADN. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có
thể giảm bớt; Ví dụ như sự cân bằng nồng độ nucleotit trong phản ứng, xác định trình tự của
nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đến trình tự chính
thức và nhất là sử dụng các ADN polymera chịu nhiệt có tính trung thực cao như: VentTM,
Pfu, Ultma ADN polymerase
VIII. Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với
nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật
gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát hiện pháp y
1. Sản xuất mẩu dò
Phương pháp PCR có thể sản xuất nhanh một lượng lớn mẫu dò đánh dấu khi
thực hiện phản ứng với cặp mẫu chuyên biệt và các nucleotid đánh dấu.
2. Khuếch đại số lượng ADN, ARN
Bằng phương pháp PCR người ta khuếch đại số lượng ADN lên hàng triệu lần
làm vật liệu đề tiến hành các quá trình nghiên cứu hay trong sản xuất vật liệu di
truyền.

Đặc biệt phương pháp PCR còn có thể khuếch đại ARN. Do Taq polymerase
không hoạt động trên ARN cho nên người ta sữ dụng kỷ thuật phối hợp Rt-PCR (
Riverse Transeriptase - PCR). Trước hết ARN được chuyển thành cADN nhờ
enzym phiên mã ngược. Mồi sữ dụng trong giai đoạn này có thể là mồi ngược
của PCR ở giai đoạn sau, có thể là oligo T hay hexanucleotiex bắt cặp ngẫu
nhiên với ARN. Sau đó cADN được khuếch đại nhờ PCR khi sữ dụng Taq
polymerase.
3. Định lượng bằng phương pháp PCR
PCR được sữ dụng nghiên cứu các ADN, ARN có số lượng bản sao thấp không
thể định lượng bằng phương pháp cổ điển. Về nguyên tắc người ta xác định số
lượng bản mẫu ban đầu qua tính toán dựa vào sản phẩm cuối cùng số chu kỳ đã
tiến hành.
Trong thực nghiệm người ta khuếch đại đồng thời trình tự đích là một trình tự
chứng có nồng độ đã biết. Trình tự đích và nồng độ đã biết của trình tự chứng
được khuếch đại trong cùng một ống nghiệm, một cặp mồi. Sau phản ứng người
ta có thể phân biệt hai trình tự này dựa vào kích thước của chunga bằng phương
pháp điện di. Qua kết quả người ta có thể so sánh hàm lượng sản phẩm của trình
tự đích, từ đó so sánh được số lượng bản mẫu ban đầu.
Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với
nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật
gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát hiện pháp y
4. Tách dòng các sản phẩm PCR
Chúng ta đã thấy, có thể tách dòng các sản phẩm PCR bằng cách xen
thêm các trình tự cho enzym giới hạn nhận biết vào đầu 5
’
của mồi. Cũng có
thể tách dòng trực tiếp các sản phẩm PCR bằng cách lợi dụng ưu thế hoạt
tính tranferase kết thúc chuỗi của Taq ADN polymerase để bổ sung a vào
đầu 3
’

của sản phẩm PCR. Kết quả là, hầu hết các phân tử ADN được nhân
bội nhờ Taq ADN polymerase đều có đầu 3
’
– A so le. Trong quá trình được
gọi là tách dòng TA, các đầu so le đó được gắn với vectơ mạch thẳng T
mang đầu sole 3
’
– T ở cả hai đầu nhằm tách dòng trực tiếp với hiệu quả
cao các sản phẩm PCR. Điều này không xảy ra với các phân tử ADN đầu tù.

Sơ đồ tách dòng TA các sản phẩm PCR
Vectơ plasmit được cắt bằng enzym giới hạn tạo đầu bằng (ví dụ cắt
bằng EcoRV). Sau đó vectơ được xử lý bằng Taq polymerase với sự có mặt
của các dTTP. Hoạt tính tranferase kết thúc chuỗi của polymerase xúc tác bổ
sung dT vào đầu 3
’
– hydroxyl của ADN. Trộn vectơ T được tạo ra với sản
phẩm PCR do Taq polymerase xúc tác tổng hợp, chúng sẽ kết hợp lại nhờ
enzym ADN ligase. Như vậy sản phẩm PCR đã được tách dòng vào vectơ T.
PCR được hoàn thiện nhanh, nhiều biến dạng PCR mới được ra đời
như :
- RT – PCR (reverse transcriptase PCR) còn gọi là RNA – PCR hay RT –
PCR. RT – PCR nhạy hơn các phương pháp khác được dùng cho sự phân
tích ARN.
- RT – PCR cạnh tranh (Competitive RT – PCR) là kỹ thuật thường được
dùng trong định lượng các loại mARN chuyên biệt.
- Real – Time PCR có thể đánh giá sự tích lũy sản phẩm và định lượng
qPCR (quantitative PCR – là PCR định lượng).
Ngoài ra còn một số kỹ thuật PCR khác nữa…
B. RT – PCR

Như chúng ta đã biết, PCR là kỹ thuật nhân bội ADN mạch kép. Tuy nhiên,
vật liệu khởi đầu cho PCR không nhất thiết phải là ADN. Phản ứng chuỗi trùng
hợp – phiên mã ngược hay gọi tắt là RT – PCR đã được phát minh và được sử
dụng như một phương pháp nhân ARN và phân tích sau khi chuyển nó thành
ADN nhờ phiên mã ngược. RT – PCR có thể dùng để tách dòng, xây dựng thư
4
Polylinker
Plasmid
R
1
Cắt bằng R
1
(ví dụ: EcoRV)
1
2
Taq ADN polymerase
+ dNTP
3’ - T
Vectơ T
T- 3’
3
Sản phẩm PCR
–A–3
’

+
3
’
–A–
ADN ligaseSản

phẩm
viện cADN và tổng hợp mẫu đó. Kỹ thuật đó gồm hai phần : Tổng hợp ADN từ
ARN nhờ phiên mã ngược (RT) và nhân bội phân tử ADN đặc hiệu bằng phản
ứng PCR.
Sơ đồ phản ứng RT – PCR
1. Phương pháp
Phản ứng RT sử dụng khuôn ARN (ARN tổng số hoặc poly – A
+
ARN), mồi
(ngẫu nhiên hoặc oligo dT), các dNTP, dung môi và enzym tái bản ngược để
tổng hợp phân tử ADN mạch đơn bổ trợ với ARN (cADN). Sau đó cADN làm
khuôn cho phản ưng PCR. Ở chu kỳ đầu, ADN mạch kép được tạo ra từ ADN
mạch đơn thông qua sự gắn kết của mồi bổ trợ khác và Taq ADN polymerase.
Giống như các phương pháp phân tích mARN khác, RT – PCR cũng có thể
được dùng để định lượng mARN ở mẫu ban đầu. Kiểu phân tích này đặc biệt
quan trọng để kiểm tra những biến đổi trong sự biểu hiện của gen. Tuy nhiên, vì
sản phẩm PCR tăng theo cấp số nhân nên những sai khác rất nhỏ ở tỷ lệ mẫu
cũng được nhân lên như vậy.Vì vậy, RT – PCR cần được tối ưu hóa cẩn thận khi
sử dụng để phân tích định lượng mARN. Sự định lượng thường ở hai dạng:
tương đối và tuyệt đối.
RT
3
’
5
’
Mồi 1
RT
5
’
AAA-3'

3’

mARN
3
’
5
’
PCR: Chu kỳ 1
ADN
Mồi 2
5
’
3
’

3
’
5
’
Taq
Mồi
3
’
5
’

Sản phẩm nhân bội
3
’

3
’
5
’
5
’
5
’
3
’
Mồi 2

PCR: Chu kỳ 2
5
’
AAA -3'

3
’
5
’
5
’
3
’
RT- PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) là một phương pháp
dùng để khuyếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã
ngược. RT- PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA (complementary
DNA) lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA, sử dụng trong việc nhận biết các đột
biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc

định lượng mức độ phân tử của gene. Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng
quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus
RNA.
2. Nguyên tắc
Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme tổng hợp chuỗi
oligonucleotide: enzyme phiên mã ngược ( reverse transcriptase) và DNA
polymerase. Enzyme reverse transcriptase cần cho quá trình tổng hợp sợi cDNA
từ RNA và enzyme cần cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA. Do enzyme reverse
transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã ngược để tạo ra cDNA phải
được thực hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-450C). Điều này gây ra
những trở ngại:
- Sự tạo thành các sản phẩm khuếch không mong muốn do sự bắt cặp không
đặc hiệu của các primers.
- Giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gen do sự hình thành RNA cấu trúc bậc hai. Tuy
nhiên những trở ngại này có thể được giải quyết nhờ vào việc sử dụng enzyme
DNA polymerase chịu nhiệt được chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus.
Enzyme này trong những điều kiện nhất định, có đặc tính sinh học đặc biệt là có
thể thực hiện cùng lúc 2 chức năng: chức năng của reverse transcriptase và chức
năng của DNA polymerase.
C. REAL – TIME PCR
1. Định nghĩa
Trong sinh học phân tử, real – time PCR (PCRđúng thời điểm) là kỹ thuật phòng
thí nghiệm dựa trên phản ứng PCR dùng để nhân bội và định lượng đồng thời
phân tử ADN đích. Nó có khả năng vừa phát hiện vừa định lượng trình tự đặc
hiệu trong mẫu ADN.
2. Nguyên tắc
Quy trình này cũng giống như nguyên tắc chung của kỹ thuật PCR; đặc điểm
cơ bản của real – time PCR là ADN nhân bội được định lượng phổ biến là dùng
thuốc nhuộm phát huỳnh quang xen vào ADN mạch kép và dùng mẫu dò ADN
oligonucleotit được biến đổi để phát huỳnh quang khi lai với ADN bổ trợ. Thông

thường, phản ứng PCR đúng thời điểm được kết hợp với RT – PCR để định
lượng mARN có hàm lượng nhỏ, giúp nhà nghiên cứu định lượng mức độ biểu
hiện gen một cách tương đối tại một thời điểm cụ thể hoặc ở những tế bào hoặc
mô cụ thể.
ADN có thể được định lượng bằng thuốc nhuộm ADN mạch kép. Thuốc
nhuộm ADN mạch kép gắn vào tất cả các phân tử ADN mạch kép được tạo ra
trong phản ứng PCR và phát huỳnh quang hàm lượng ADN tăng lên trong phản
ứng dẫn đến sự tăng cường độ phát huỳnh quang đo được sau mỗi chu kỳ phản
ứng, nhờ đó có thể định lượng nồng độ ADN. Tuy nhiên, một số loại thuốc
nhuộm ADN mạch kép, như SYRB Green gắn vào tất cả các phân tử ADN mạch
kép, kể cả mồi và các sản phẩm PCR không đặc hiệu, làm cho việc định lượng
kém chính xác. Để định lượng phản ứng PCR được chuẩn bị theo cách thông
thường và bổ sung thêm thuốc nhuộm. Đo mức độ phát huỳnh quang sau mỗi
chu kỳ phản ứng rồi so sánh với thang nồng độ ADN pha loãng chuẩn để định
lượng.
Ngoài ra, người ta cũng có thể sử dụng mẫu dò phát huỳnh quang để định
lương ADN chính xác hơn, nhưng giá thành lại cao hơn. Mẫu dò thường được sử
dụng là TaqMan, loại mẫu dò dựa trên sự truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh
quang khi lai. Mẫu dò TaqMan là oligonucleotit có chứa thuốc nhuộm phát
huỳnh quang, thường gắn vào bazơ đầu 5
’
và thuốc nhuộm dập tắt, thường gắn
vào đầu 3
’
. Mẫu dò được thiết kế để lai với vùng giữa của sản phẩm PCR. Khi
phát xạ, thuốc nhuộm phát quang bị kích thích truyền năng lượng cho phân tử
thuốc nhuộm dập tắt bên cạnh chứ không phát sáng, tạo nên cơ chất không phát
huỳnh quang. Trong quá trình PCR khi enzym polymerase tái bản khuôn có mẫu
dò gắn vào, hoạt tính 5
’

-

3
’
của enzym cắt bỏ mẫu dò. Động thái đó tách thuốc
nhuộm phát huỳnh quang khỏi thuốc nhuộm dập tắt và sự truyền năng lượng
cộng hưởng huỳnh quang không xảy ra nữa. Sự phát huỳnh quang tăng lên trong
mỗi chu kỳ PCR, tỷ lệ với tốc độ mẫu dò bị cắt bỏ và có thể đo lường được.



Kỷ thuật Real - time PCR
D. Multiplex PCR
I. Định nghĩa
Phản ứng multiplex PCR là một dạng thay đổi của phản ứng PCR thông
thường, ở đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một
phản ứng.
II. Ứng dụng
1. Multiplex-PCR phát hiện và định type HSV
Herpes sinh dục là một bệnh do virus Herpes Simplex HSV1 và HSV2 gây
nên nhưng chủ yếu là HSV2. Là bệnh cấp tính lây truyền qua đường tình duc.
Bệnh tái phát dai dẳng, người lành mang mầm bệnh và người bệnh kín đáo
truyền bệnh cho người khác.Bệnh có triệu chứng hoặc không có triệu chứng. Khi
có triệu chứng: đối với Herpes sinh dục nguyên phát. Mụn nước thành chàm ở vị
trí tiếp xúc kết hợp đau và viêm hạch bạch huyết. Tuổi mắc bệnh: ở người trẻ
đang ở độ tuổi hoạt động tình dục.
- Các xét nghiệm như Tzanck smear có thể thấy Tế bào đa nhân khổng lồ.
- HSV-Multiplex-PCR: Sử dụng hỗn hợp 3 primers, cho kết quả dương tính và
có thể phân biệt được type1 hay type 2 qua độ dài sản phẩm PCR: HSV-1 có độ
dài 503bp và HSV-2 có độ dài 435bp.

- Hoặc HSV - PCR riêng biệt cho mỗi type HSV-1 cho sản phẩm 395bp và
HSV-2 cho sản phẩm 302bp.
2. Chẩn đoán bệnh rối loạn tiêu hóa ở dê
Sự phát hiện bằng kháng thể kết hợp kháng nguyên bệnh rối loạn tiêu hóa.
HLA typing sử dụng multiplex PCR và phát hiện với biosensors.
E. Nested PCR
I. Định nghĩa:
Nested PCR là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đó hai cặp mồi PCR
được dùng để khuếch đại đoạn DNA. Phản ứng nested PCR phải được thực hiện
hai lần. Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kỳ, với cặp
mồi thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định nằm
trong đoạn gen được khuếch đại lần 1. Sản phẩm PCR lần 1 sau đó sẽ là mẫu cho
PCR lần 2, cặp mồi thứ 2 sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần 1 và
khuếch đại đoạn gen cần xác định.
II. Nguyên tắc
III. Ưu điểm và hạn chế của nPCR
1. Ưu điểm
- Tăng tính đặc hiệu là do sự bắt cặp của primer thứ hai chỉ xảy ra chủ
yếu với đoạn gen được nhân lên bởi phản ứng PCR thứ nhất. Nếu ban đầu
khuôn DNA bị khuếch đại sai thì khả năng khuếch đại ở lần thứ hai sẽ rất
thấp
- Tăng độ nhạy nhờ tổng số chu kỳ được thực hiện nhiều hơn Nested
PCR áp dụng trong trường hợp có rất ít mẫu gốc
2. Hạn chế
Hạn chế lớn nhất của nPCR là gia tăng mức độ tạp nhiễm trong quá trình
chuyển mẫu giữa hai lần chạy PCR. Tuy nhiên có thể khắc phục bằng cách
cải tiến chạy nPCR trong một ống.
Phần 3: KẾT LUẬN
Việc đề suất ra phương pháp PCR đã tạo ra một bước tiến mang tính cách
mạng trong sinh học phân tử nói riêng và sinh học nói chung vì nhờ việc cho

phép phân lập, xác định các gen, đi sâu nghiên cứu chức năng cũng như biểu
hiện của gen trong quá trình phát triển hoặc phản ứng của gen đối với các điều
kiện môi trường, nó cho phép chúng ta tiến hành các nghiên cứu mà trước đây
không thể thực hiện được. Kỹ thuật này đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực của sinh học phân tử như chuẩn đoán các bệnh di truyền ở người, di
truyền quần thể, phân tích pháp y trong an ninh hình sự,…cho kết quả cao.
Do các ứng dụng cực kỳ to lớn và kỳ diệu trong mọi lĩnh vực, PCR đã thật sự
làm được một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử trong thời điểm hiện
nay. Với kỹ thuật và công nghệ ngày càng tiến bộ, các thuốc thử ngày càng rẻ
hơn và tốt hơn, giá máy chu kỳ nhiệt ngày càng hạ và đặc biệt là việc sử dụng hệ
thống nội tại chống ngoại nhiễm, thử nghiệm PCR không còn là một thử nghiệm
quá cao cấp chỉ thực hiện được tại các phòng thí nghiệm hiện đại. Có thể nói
PCR hiện nay hoàn toàn có thể triển khai tại các nước đang phát triển như nước
ta.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Thành Hổ. 2005. Nhập môn Công nghệ sinh học. NXB Giáo Dục.
2. PGS.TS Nguyễn Bá Lộc. 2002. Bài giảng Sinh học phân tử.
3. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ. 2010. Giáo trình Công
nghệ chuyển gen ở động - thực vật. NXB Đại học Huế.