Khảo sát đột biến gen BCR/ABL gây kháng imatinib trên bệnh nhân bệnh bạch cầu mạn dòng tuỷ (CML) bằng phương pháp giải trình tự chuỗi DNA

ỦY BAN NHÂN DÂN TP. HCM SỞ Y TẾ TP. HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BV. TRUYỀN MÁU – HUYẾT HỌC









BÁO CÁO NGHIỆM THU





KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL GÂY
KHÁNG IMATINIB TRÊN BỆNH NHÂN BỆNH
BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY (CML) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA




CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: BSCKII. NGUYỄN THỊ HỒNG NGA

ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS.BS. PHAN THỊ XINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 01/2013


ỦY BAN NHÂN DÂN TP. HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ










BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN BCR/ABL GÂY
KHÁNG IMATINIB TRÊN BỆNH NHÂN BỆNH
BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY (CML) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA



CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên)







CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)








THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 01/2013

3


1

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Yếu tố dịch tễ học và nguyên nhân của bạch cầu mạn dòng tủy
Bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT) chiếm 3% trong tổng số ung thư trên thế
giới và chiếm 20% trong các bệnh bạch cầu ở người lớn. Tại các nước Châu Âu, tỷ lệ
mắc bệnh mới là khoảng 1/100.000 dân, nam mắc bệnh nhiều hơn nữ với tỷ lệ nam/nữ là
3/2 và thường gặp nhất ở lứa tuổi 40 đến 60. Đa số các trường hợp BCMDT thì không
tìm được nguyên nhân. Tuy nhiên, tiếp xúc với chất phóng xạ liều cao có thể làm tăng tỷ
lệ bệnh [4]. Trong một số nghiên cứu trên nhóm người Nhật tiếp xúc với phóng xạ từ vụ
nổ bom nguyên tử tại thành phố Hiroshima và Nagasaki, và những phụ nữ bị ung thư cổ
tử cung được điều trị với tia xạ, thì tần suất mắc bệnh BCMDT cao hơn có ý nghĩa so với
nhóm dân số không tiếp xúc với tia xạ.
2. Sinh bệnh học của BCMDT
2.1. Nhiễm sắc thể Philadelphia
Thay đổi quan trọng nhất và trở thành đặc hiệu cho BCMDT là nhiễm sắc thể (NST)
Philadelphia (NST Ph), là NST 22 có nhánh dài bị ngắn đi, được tạo ra do chuyển vị hỗ
tương của nhánh dài NST 9 và nhánh dài của NST 22, gọi là t(9;22)(q34;q11) (Hình 1.1).
NST Ph được tìm thấy trong tất cả các tế bào máu bao gồm cả tế bào B và tế bào T, và nó
hiện diện trong suốt quá trình bệnh cả trong giai đoạn cấp. NST Ph được tìm thấy trong
hơn 90% bệnh nhân BCMDT, ngoài ra còn gặp trong khoảng 30% bệnh nhân bạch cầu
cấp dòng lympho (BCCDL) ở người lớn [25] và 3% BCCDL ở trẻ em [29].
2.2. Các tổ hợp gen BCR/ABL và protein BCR/ABL
Chuyển vị giữa nhánh dài NST 9 băng q34 và nhánh dài NST 22 băng q11 tạo ra
tổ hợp gen BCR/ABL mà exon 1 của ABL trên 9q34 được thay thế bằng những exon ở đầu
5’ của BCR (Hình 1.2) [18]. Điểm gãy của gen BCR trên 22q11 gồm có 3 vùng là minor-

BCR (breakpoint cluster region), major-BCR và micro-BCR mà tùy vào vị trí điểm gãy
của BCR, những tổ hợp gen được tạo ra là e1a2, b2a2 hoặc b3a2, và e19a2 (Hình 1.2) mã
2

hóa ra các dạng tổ hợp protein p190
BCR/ABL
, p210
BCR/ABL
và p230
BCR/ABL
tyrosine kinase
tương ứng [35].
der(22)
Ph chromosome
ABL gene
BCR gene
9q34:
22q11:
8.5 kb BCR/ABL mRNA
BCR/ABL gene
P210
BCR/ABL
der(9)
ABL/BCR gene
ABL/BCR mRNA
No.9
ABL gene
6.0 kb
7.0 kb
Họat tính

tyrosine kinase (-)
P145
ABL
No.22
BCR gene
t(9;22)(q34;q11)
Họat tính
tyrosine kinase (+++)

Hình 1.1: Chuyển vị nhiễm sắc thể t(9;22)(q34;q11) và các gen liên quan.
Bệnh nhân BCMDT chủ yếu có điểm gãy ở vùng major-BCR, tuy nhiên, một số ít
trường hợp điểm gãy xảy ra ở vùng µ-bcr và bệnh cảnh của những bệnh nhân này thường
có tăng ưu thế neutrophil. Khoảng 2/3 trường hợp BCCDL, và rất hiếm trường hợp
BCMDT và bạch cầu cấp dòng tủy có điểm gãy trên BCR ở vùng minor-BCR. Khi đầu 5’
của ABL được thay thế bởi gen BCR trong tổ hợp p210
BCR/ABL
thì hoạt tính men tyrosin
kinase của ABL tăng lên rất mạnh, làm khởi động nhiều đường truyền tín hiệu bất thường
trong tế bào như ras, myc, hoặc myb
b2 b3 a2e1
b2
a2e1
a2
e1
e1a2 :
b3a2 :
b2a2 :
198bp
287bp
212bp

1a1b
a2 a3
ABL
gene
(9q34)
intron 1
intron 2
# splicing exons
a1 1
#
##
Major BCR/ABL mRNA
Minor BCR/ABL mRNA
1
2
3
b1
b5
a2e1 e19b2
e19a2
4
minor BCR
major BCR
b2 b3e1 c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7b1 b4 b5
BCR
gene
(22q11)
micro
BCR
e17 18 19 20 21 22 23e12 13 14 15 16

1
3
4
2
Tel
Cent

Hình 1.2: Các vùng điểm gãy và các tổ hợp gen BCR/ABL
3

2.2.1. BCR/ABL và sự truyền tín hiệu nội bào
Trên bệnh nhân BCMDT hoạt tính tyrosine kinase của p210
BCR/ABL
là yếu tố được
chứng minh gây ra bệnh. Protein p210
BCR/ABL
tương tác với một số yếu tố của các con
đường truyền tín hiệu, và gắn với hoặc phosphoryl hóa hơn 20 protein nội bào có vai trò
sinh ung thư. Sự tương tác của tiểu đơn vị phosphatidylinositol-3’-kinase (PI3K) với
p210
BCR/ABL
thì cần thiết cho sự tăng sinh các dòng tế bào có BCR/ABL và tế bào
BCMDT sơ khởi. Các mối tương tác thông qua hoạt động BCR/ABL ảnh hưởng nhiều và
phức tạp đến sự phân bào do các protein kinase hoạt hóa [10]. Ngoài ra, p210
BCR/ABL
điều
hòa hoạt tính serine-threonine kinase do RAF mã hóa. Giảm biểu hiện của RAF ức chế sự
tăng trưởng tế bào BCMDT phụ thuộc BCR/ABL và sự tăng sinh các tế bào gốc tạo máu
bình thường phụ thuộc yếu tố tăng trưởng [24]. Khả năng chuyển dạng tế bào của
BCR/ABL liên quan tới các tín hiệu tyrosine kinase, mà nó được gọi là protein tiếp hợp

(adaptor protein), được truyền đến RAS. Protein p210
BCR/ABL
hoạt hóa nhiều đường khác
nhau của RAS. PI3K được hoạt hóa liên tục do BCR/ABL để tạo ra các lipid inositol và bị
rối loạn điều hòa bởi những polyinositol phosphate ức chế khối u bên dưới BCR/ABL
như PTEN and SHIP1.
CRKL là protein cầu nối, có tính tương ứng với sản phẩm sinh ung thư v- crk và làm
trung gian cho các tín hiệu sinh ung thư của BCR/ABL. Protein p210
BCR/ABL
có thể liên
kết tự nhiên với paxillin qua CRKL và tạo ra các phức hợp protein truyền tín hiệu. Các
phức hợp này chứa paxillin và talin, vốn là những phân tử protein rất quan trọng cho tính
bám dính của tế bào, giải thích được một số khiếm khuyết về sự dính của các tế bào
BCMDT. Các dòng tế bào có biểu hiện p210
BCR/ABL
có hoạt tính cơ bản JAKs và STATs,
thường là JAK2 và STAT5. Cả ABL và BCR đều là các bộ phận điều hòa đa chức năng
của họ protein gắn GTP Rho và protein gắn yếu tố tăng trưởng Grb2, mà các protein này
gắn các tyrosin kinase với RAS và hình thành phức hợp với BCR/ABL và yếu tố biến đổi
nucleotide Sos dẫn đến sự hoạt hóa của RAS [17]. Ngoài ra, protein p210
BCR/ABL
cũng
hoạt hóa Jun kinase và cần sự tham gia của Jun kinase cho sự chuyển dạng tế bào.

4

Hình 1.3: BCR/ABL hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu chủ yếu trong tế bào

2.2.2. Ảnh hưởng của BCR/ABL lên sự dính tế bào
Các tế bào có NST Ph dính với fibronectin và chất nền của tủy xương kém hơn các tế
bào bình thường do khiếm khuyết chức năng của intergrin. Protein p210
BCR/ABL
gắn với
actin và một số protein khung tế bào, và tương tác với sợi actin qua vùng gắn với actin
làm các chuyển động tự nhiên tăng lên, thay đổi màng tế bào, kéo dài sợi actin, tăng tốc
độ lồi ra và co lại của giả túc trên bề mặt fibrinonectin. Các khiếm khuyết trong sự dính
(tiếp xúc và cố định lại) của tế bào nguyên thủy BCMDT tách chúng ra khỏi các tín hiệu
kiểm soát bình thường. Các tín hiệu này được truyền từ tế bào vi môi trường qua
cytokine, giữ cân bằng giữa sự sống và chết, sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào.
Phosphoryl hóa không thích hợp các protein khung tế bào là yếu tố chủ yếu trong rối loạn
chức năng integrin của tế bào BCMDT [17].
2.2.3 Ảnh hưởng của BCR/ABL lên sự chết theo chương trình
Protein p210
BCR/ABL
ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào bằng cách
trì hoãn chuyển qua giai đoạn G2/M của chu kỳ tế bào khi có DNA hư hỏng. Tuy nhiên,
protein p210
BCR/ABL
không ngăn được sự chết theo chương trình ở các tế bào giết tự nhiên

vì nó được hoạt hóa qua lymphokin chống lại tế bào BCMDT hoặc các tế bào bình
( Nguồn: Lichman MA., 2006)
BCR/ABL
Tế bào tăng sinh
Bất thường sự kết dích của tế bào
Ức chế sự chết theo chương trình
BCR/ABLBCR/ABL
Tế bào tăng sinhTế bào tăng sinh
Bất thường sự kết dích của tế bào
Ức chế sự chết theo chương trình
5

thường. Trong giai đoạn tiến triển và chuyển cấp, tốc độ chết theo chương trình của tế
bào chậm hơn. G–CSF và GM–CSF làm giảm đáng kể tốc độ chết theo chương trình của
tế bào trong BCMDT thể bạch cầu đa nhân trung tính [17].
3. Chẩn đoán và phân giai đoạn BCMDT
Triệu chứng lâm sàng phát triển rất chậm và hầu hết bệnh nhân được phát hiện ở
giai đoạn mạn. Ngày nay, nhiều trường hợp được phát hiện sớm khi khám sức khỏe định
kỳ. Lúc đầu, triệu chứng mơ hồ và không đặc hiệu. Khoảng 70% bệnh nhân có triệu
chứng lúc chẩn đoán và thường than phiền nhất là mệt mỏi, biếng ăn, sụt cân, giảm thể
lực, ra mồ hôi nhiều, bệnh nhân cảm thấy khó chịu, căng tức ở hạ sườn trái và ăn mau no.
Khám lâm sàng có thể thấy bệnh nhân xanh xao và lách to.
Chẩn đoán BCMDT dựa trên huyết đồ và tủy đồ. Trên huyết đồ cho thấy số lượng
bạch cầu tăng trong khoảng từ 20 x 10
9
/L đến hơn 500 x 10
9
/L với sự hiện diện tất cả
các giai đoạn của quá trình biệt hóa bạch cầu hạt từ myeloblast đến segment neutrophil
gọi là không có “khoảng trống bạch cầu”, ngoài ra tiểu cầu và bạch cầu ưa kiềm tăng, và

có thiếu máu đẳng sắc, đẳng bào nhưng hồng cầu lưới bình thường trong đa số trường
hợp. Tủy đồ cho thấy mật độ tủy giàu với tăng sinh dòng bạch cầu (tỷ lệ tế bào blast <
5%) và dòng mẫu tiểu cầu, dòng hồng cầu có thể tăng, bình thường hoặc đôi khi giảm.
Xác định chẩn đoán BCMDT khi có sự hiện diện của NST Ph hoặc có sự hiện diện của tổ
hợp gen BCR/ABL.
Bệnh tiến triển qua ba giai đoạn: mạn, tiến triển và chuyển cấp.
3.1. Giai đoạn mạn (Chronic phase)
Hầu hết được chẩn đoán ở giai đoạn này với các triệu chứng điển hình và tỷ lệ tế
bào blast < 5%. Đáp ứng rất tốt với hóa trị và dễ kiểm soát bằng các thuốc chống tăng
sinh tủy. Chất lượng cuộc sống không thay đổi nhiều. Tử vong trong giai đoạn này rất
hiếm, thường do nguyên nhân không liên quan bệnh bạch cầu hoặc do tác dụng phụ của
các phương pháp điều trị bệnh bạch cầu.
3.2. Giai đoạn tiến triển (Accelerated phase): chẩn đoán khi có một hoặc nhiều
triệu chứng sau đây:
6

+ Blast 10 – 19 % trong máu ngoại vi và/hoặc trong tủy xương.
+ Bạch cầu đa nhân ưa kiềm 20 % trong máu ngoại vi.
+ Giảm tiểu cầu kéo dài.
+ Tăng kích thước của lách và số lượng bạch cầu mặc dù đang được điều trị.
+ Tiến triển về di truyền tế bào.
Một số trường hợp chuyển cấp sau vài tháng. Một số khác có tiến triển chậm và
phức tạp hơn. Thời gian sống trung bình của bệnh nhân khoảng một năm.
3.3. Giai đoạn chuyển cấp (Blast crisis): chẩn đoán khi có một hoặc nhiều triệu
chứng sau đây:
+ Blast 20% trong máu ngoại biên hay trong tủy.
+ Có tăng sinh blast ngoài tủy.
+ Kết tụ từng đám lớn tế bào blast trong tủy.
Giai đoạn này có các biểu hiện của bệnh bạch cầu cấp. Bệnh nhân thường bị
nhiễm trùng, nhiễm nấm và xuất huyết do giảm bạch cầu đa nhân và tiểu cầu. Thời gian

sống trung bình của giai đoạn này khoảng 4 - 6 tháng. Rất hiếm trường hợp sống trên một
năm. Có thể chuyển cấp dòng lympho (30%) hoặc dòng tủy (70%).
4. Các phƣơng pháp điều trị và theo dõi điều trị:
Trong các phương pháp điều trị BCMDT kinh điển như sử dụng các thuốc
Busulfan, Hydroxyurea, Aracytine và Interferon alpha hoặc dị ghép tủy xương thì chỉ có
dị ghép tủy xương là phương pháp duy nhất có khả năng chữa lành bệnh nhưng khó tìm
người cho phù hợp và nhiều biến chứng nặng trong quá trình ghép có thể gây tử vong [3].
Busulfan và Hydroxyurea không tạo ra lui bệnh. Interferon alpha kết hợp với Aracytine
liều thấp kéo dài thời gian sống toàn bộ nhưng đắt tiền và có nhiều tác dụng phụ. Những
nghiên cứu dựa trên nền tảng sinh học phân tử về cơ chế sinh bệnh trong những thập niên
gần đây đã đạt được nhiều tiến bộ quan trọng, nhất là sự ra đời của Imatinib (IM) và
BCMDT là mô hình đầu tiên của việc điều trị nhắm trúng đích phân tử.
IM (biệt dược là Glivec hoặc Gleevec của công ty Novartis) là một chất có trọng
lượng phân tử nhỏ, dẫn xuất của 2-phenylaminopyrimidine, có khả năng ức chế đặc hiệu
7

hoạt tính tyrosine kinase của protein BCR/ABL bằng cách cạnh tranh với ATP trong việc
gắn vào protein này, vì vậy được dùng trong điều trị BCMDT [19]. Năm 1998, IM được
đưa vào điều trị BCMDT giai đoạn mạn đề kháng hoặc không dung nạp với interferon
alpha cho tỷ lệ lui bệnh về mặt huyết học là 95% và đáp ứng cao về di truyền tế bào là
60% [15], trong khi đó ở nhóm bệnh nhân được điều trị bằng interferon alpha thì đáp ứng
về mặt huyết học là 70% và đáp ứng cao về di truyền tế bào sau 12 tháng chỉ 21% [11].
Tháng 5 năm 2001, IM được FDA chấp thuận đưa vào sử dụng là phương pháp điều trị
khởi đầu chuẩn cho những bệnh nhân BCMDT mới được chẩn đoán ở giai đoạn mạn. Các
tiêu chuẩn đáp ứng về mặt huyết học và di truyền được đánh giá theo bảng 1.1.
Bảng 1.1: Các tiêu chuẩn đánh giá đáp ứng điều trị
Phân loại
Tiêu chuẩn
Đáp ứng hoàn toàn về huyết học (CHR)
Huyết đồ về bình thường

Đáp ứng tối thiểu (minimal) về di truyền tế bào
66–95% Ph
+
metaphases
Đáp ứng thấp (minor) về di truyền tế bào
36–65% Ph
+
metaphases
Đáp ứng một phần (partial) về di truyền tế bào
1–35% Ph
+
metaphases
Đáp ứng hoàn toàn về di truyền tế bào(CCR)
0% Ph
+
metaphases
Đáp ứng cao (major) về di truyền tế bào (MCR)
0–35% Ph
+
metaphases
Đáp ứng cao về phân tử (MMR)
Giảm ≥3-log của BCR-ABL mRNA
Đáp ứng hoàn toàn về phân tử (CMR)
Âm tính với RT-PCR

Theo kết quả nghiên cứu của IRIS (International Randomized Study of Interferon
and STI571), với IM liều chuẩn là 400 mg mỗi ngày cho BCMDT giai đoạn mạn, tỷ lệ
đáp ứng hoàn toàn về mặt di truyền tế bào là 69% sau 12 tháng và 87% sau 60 tháng và
chỉ có khoảng 7% bệnh nhân chuyển sang giai đoạn tiến triển hoặc chuyển cấp trong 5
năm theo dõi [7]. Trong một số nghiên cứu khác, bệnh nhân BCMDT giai đoạn tiến triển

và chuyển cấp được điều trị với IM 600 – 800 mg/ngày cho cho tỷ lệ đáp ứng tốt hơn hóa
trị liệu. Tỷ lệ đáp ứng về mặt huyết học và về mặt di truyền tế bào là 71% và 21% đối với
BCMDT giai đoạn tiến triển [22], và 50% và 15% đối với BCMDT giai đoạn chuyển cấp
[23].
8

5. Tình hình kháng IM
Sau điều trị IM một thời gian có khoảng 20% đến 30% bệnh nhân BCMDT giai
đoạn mạn được phát hiện kháng IM. Hiện tượng kháng IM được báo cáo đầu tiên vào
năm 2000. Kháng IM được chia thành 2 nhóm là kháng nguyên phát và thứ phát. Kháng
IM nguyên phát là không đạt được lui bệnh về mặt huyết học trong thời gian từ 3 đến 6
tháng tính từ lúc bắt đầu điều trị IM hoặc không đạt được bất kỳ lui bệnh về di truyền tế
bào trong 6 tháng, hoặc không lui bệnh phần lớn về di truyền tế bào trong 12 tháng, hoặc
không lui bệnh hoàn toàn về di truyền tế bào trong 18 tháng. Kháng IM thứ phát là bệnh
nhân có đáp ứng ban đầu với IM nhưng mất đáp ứng về mặt huyết học hoặc di truyền tế
bào sau một thời gian dùng thuốc. Ba cơ chế kháng IM được mô tả, trong đó có 2 cơ chế
liên quan trực tiếp đến gen BCR/ABL là những đột biến trên vùng tyrosine kinase domain
(chiếm 30 - 90% những trường hợp kháng IM tùy theo nghiên cứu) và tăng biểu hiện do
sự khuếch đại của gen BCR/ABL [1,5,13,31,9]. Riêng cơ chế thứ ba thì ít được hiểu rõ
hơn, nó bao gồm tăng hoặc giảm điều hòa của những kênh bơm thuốc ra hoặc vào tế bào
(drug efflux pumps and drug influx transporters), và tăng biểu hiện của những protein
Lyn, Src-family kinase (SFK) [37]. Trong 3 cơ chế trên, cơ chế chính gây ra kháng IM là
việc phát hiện những đột biến gen tại vùng ATP-binding domain nằm trong phần ABL.
Cho đến nay, hơn 100 vị trí và 136 loại đột biến của gen ABL được báo cáo, trong đó đột
biến ở nhóm bệnh nhân kháng IM thứ phát (57%) cao gần gấp đôi ở nhóm kháng IM
nguyên phát (30%) [31]. Trong 136 kiểu đột biến được phát hiện, có 16 kiểu đột biến
thường gặp chiếm đến 86,5% như bảng 1.2.
Các đột biến trong vùng kinase domain của BCR/ABL thường gây kháng TKI. Cơ
chế gây kháng thứ phát thường được mô tả nhất là sự xuất hiện các đột biến điểm, biểu
hiện bởi sự thay thế một axit amin trong vùng kinase domain, làm giảm khả năng gắn kết

thuốc. Tỷ lệ các đột biến rất khác biệt tuỳ thuộc vào phương pháp phát hiện đột biến, bản
chất đột biến và giai đoạn bệnh[28]. Đột biến T315I tạo một liên kết hydro với IM gây ra
do thay thế một axit amin với một isoleucine lớn hơn, làm cho IM không gắn kết bên
trong với ổ gắn kết ATP. T315I là một trong những đột biến thường gặp nhất ở những
9

bệnh nhân điều trị với IM, xảy ra khoảng 4-19% các trường hợp [12,32] và kháng với tất
cả thuốc ức chế ABL kinase.
Bảng 1.2: Các kiểu đột biến kháng IM thường gặp
Axit
amin
Kiểu đột biến
Số
trường hợp
Tỷ lệ (%)
Tỷ lệ
tích lũy (%)

(Guidelines for Mutation Analysis of BCR/ABL Kinase Domain, WMRGL, 2007)
Bốn nhóm đột biến liên quan đến kháng IM là: (1) vị trí gắn kết IM, (2) quai P (vị
trí gắn kết ATP); (3) domain xúc tác và (4) quai A hoạt hoá (axit amin 379 – 398) (Hình
1.4). Đột biến ở vị trí phosphate (quai P, từ axit amin 244 đến 255 của ABL) chiếm tỷ lệ
48% trong tất cả đột biến kháng IM, làm mất ổn định cấu trúc cần thiết cho sự gắn kết
IM, có tiên lượng xấu dù còn nhạy với IM. Đột biến quai P có tiên lượng xấu hơn so với
3 phân nhóm còn lại [31,5], tuy nhiên một số nghiên cứu khác đã không chứng minh điều
này có lẽ do sự khác biệt trong cách chọn bệnh nhân. Nhóm đột biến ở domain xúc tác từ
axit amin 350 đến 363 của ABL tác động đến việc gắn kết của IM. Quai hoạt hoá của
ABL kinase là thành phần điều hoà chính của kinase domain. Đột biến quai hoạt hoá dẫn
đến kháng thuốc do thay đổi cấu hình cần thiết cho hoạt tính của IM. Tuy nhiên, thay thế
axit amin thường xảy ra ở 7 vị trí M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V (quai P), T315I

10

(vị trí gắn kết IM), M351T, F359V (domain xúc tác) chiếm khoảng 85% trong tất cả đột
biến [31].

Hình 1.4: Các kiểu đột biến BCR/ABL gây kháng IM trong BCMDT

Cơ chế kháng thuốc của M351 được xác định khi tương tác ABL SH2 domain và
M351 được thực hiện trong các nghiên cứu. Phá vỡ tương tác này biến kinase thành dạng
hoạt hoá khiến cho IM không gắn lên được. Một số đột biến có thể gây ra kháng IM
tương đối do chỉ làm giảm khả năng gắn kết IM lên ATP-binding domain như M237I,
M244V, G250A, V299L, F311L, T315A, F317V, M351T, Y353H, E355G, E355A,
F359C, V379I, L387F, M388L, và E450K, nên bệnh nhân vẫn còn có đáp ứng với điều
trị nếu được tăng liều IM. Trái lại, có một số đột biến gây ra kháng IM tuyệt đối vì đã làm
thay đổi hoàn toàn cấu hình protein, khiến cho thuốc không còn khả năng gắn lên ATP-
binding domain như L248V, G250E, Y253H, Y253F, E255V, E255K, D276G, E279K,
T315I, G321E, E373G [31]. Trong trường hợp này, bệnh nhân cần phải được thay đổi
điều trị bằng những tyrosine kinase inhibitor thế hệ sau như dasatinib hay nilotinib (Hình
1.5) hoặc dị ghép tủy.

( Nguồn: Soverini S, Blood 2011;118(5):1208-15)
11

Hình 1.5: tương quan giữa đột biến BCR/ABL và tình trạng kháng thuốc

6. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Theo thống kê từ tháng 1/2008 đến tháng 6/2010 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết
học TPHCM, BCMDT chiếm tỷ lệ 5,73% trong bệnh lý của hệ tạo máu và chiếm 22,75%
trong ung thư máu cấp và mạn, được xếp thứ 3 sau ung thư máu cấp dòng lympho và
dòng tủy, với khoảng 150 trường hợp bệnh mới được chẩn đoán hằng năm. Trong một
nghiên cứu tiến hành trên 48 bệnh nhân BCMDT Việt Nam, chúng tôi ghi nhận tỷ lệ NST
Ph dương tính là 91,5%, tương đương số liệu của các nghiên cứu khác trên thế giới [26].
Ngoài ra, một số nghiên cứu khác tại TP. Hồ Chí Minh và Hà Nội đánh giá đáp
ứng điều trị BCMDT giai đoạn mạn bằng hydroxyurea đơn thuần hoặc phối hợp với ly
(Borrow J, West Midlands Regional Genetics Laboratory 2007)
Tăng liều imatinib
Kháng matinib
Điều trị dasatinib
Điều trị nilotinib
Thử nghiệm LS
với MK-0457
Kháng nilotinib
Kháng dasatinib
(Borrow J, West Midlands Regional Genetics Laboratory 2007)(Borrow J, West Midlands Regional Genetics Laboratory 2007)

Tăng liều imatinib
Kháng matinib
Điều trị dasatinib
Điều trị nilotinib
Thử nghiệm LS
với MK-0457
Kháng nilotinib
Kháng dasatinib
12

tách bạch cầu, kết quả cho thấy các phương pháp này không làm lui bệnh và không kéo
dài thời gian sống của bệnh nhân [36,20].
Từ năm 2005 đến nay với sự tài trợ của công ty Norvatis, bệnh nhân BCMDT tại
Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tp. Hồ Chí Minh được điều trị với IM, cho tỷ lệ lui
bệnh về mặt huyết học là 96% và tỷ lệ đáp ứng cao về di truyền tế bào là 67% [21].
Những xét nghiệm di truyền tế bào và sinh học phân tử như nhiễm sắc thể đồ, kỹ thuật lai
tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) và RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain
reaction) đã được thực hiện thường quy tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tp. Hồ Chí
Minh để theo dõi đáp ứng với điều trị và đánh giá tình trạng kháng thuốc. Trước đây, vì
chưa có khảo sát đột biến BCR/ABL nên khi có tình trạng kháng IM trên lâm sàng thì các
bác sĩ quyết định tăng liều IM lên 600 mg đến 800 mg/ngày cho tất cả các bệnh nhân nên
chỉ có một số bệnh nhân đáp ứng (theo bảng 1.2 thì 3 kiểu đột biến T315, E255 và Y253
chiếm đến 32,1% đều không đáp ứng với tăng liều IM).

13

CHƢƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng
Bệnh nhân chẩn đoán BCMDT được điều trị với IM và có biểu hiện kháng IM

nguyên phát hay thứ phát tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tp. Hồ Chí Minh trong
giai đoạn từ 08/2010 đến 09/2012.
2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu
Tất cả bệnh nhân BCMDT được điều trị bằng IM và có biểu hiện kháng IM
nguyên phát hay thứ phát:
- Kháng IM nguyên phát:
+ Không đạt được lui bệnh về mặt huyết học trong thời gian từ 3 đến 6 tháng tính từ
lúc bắt đầu điều trị IM.
+ Không đạt được bất kỳ lui bệnh về di truyền tế bào trong 6 tháng.
+ Không lui bệnh phần lớn về di truyền tế bào trong 12 tháng.
+ Không lui bệnh hoàn toàn về di truyền tế bào trong 18 tháng.
- Kháng IM thứ phát: Bệnh nhân có đáp ứng ban đầu với IM (đạt lui bệnh hoàn toàn về
mặt huyết học trong vòng 3 tháng, đạt lui bệnh hoàn toàn về di truyền tế bào trong 6
tháng, 12 tháng hoặc 18 tháng) nhưng mất đáp ứng về mặt huyết học hoặc di truyền tế
bào sau một thời gian dùng thuốc.
2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ
Bệnh nhân hoặc thân nhân không đồng ý tham gia nguyên cứu.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả loạt ca.
2.3.2 Các bước thực hiện
Quy trình chung (Phụ lục 1): Tách chiết RNA (từ mẫu máu hoặc mẫu tủy)  tổng
hợp cDNA  PCR  Tinh sạch sản phẩm PCR  Cycle sequencing  Kết tủa ethanol
 Đọc trình tự DNA tự động  Phân tích kết quả.
14

Tách chiết RNA: Lấy 2 ml tủy xương từ gai chậu hoặc 5 ml máu ngoại biên trong
chất chống đông EDTA và vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ ở nhiệt độ
phòng. Nếu mẫu để lâu hơn 6 giờ, thì giữ mẫu ở 4
o
C nhưng không được quá 12 giờ. Tách

chiết RNA từ tủy xương hoặc máu ngoại biên bằng RNeasy mini kit của QIAGEN. Mẫu
RNA được lưu trữ ở -80
o
C cho đến khi sử dụng, tối đa là 12 tháng. Phần mẫu còn lại sau
khi tách chiết RNA sẽ được xử lý bằng dung dịch red blood cell lysis buffer để loại bỏ
hồng cầu và lưu trữ trong Sepazol, ở -80
o
C. Tổng hợp cDNA từ RNA sử dụng men sao
chép ngược SuperScript
TM
II Reverse Transcriptase kit của Invitrogen, sau đó, kiểm tra
chất lượng cDNA bằng cặp mồi trên gen ABL.
Khuếch đại BCR/ABL bằng PCR: Các đoạn mồi (Bảng 2.1) được thiết kế bằng
phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn mang accession number NM_007313.2
(Isoform b), NM_005157.4 (Isoform a) của ABL và mang accession number
NM_004327.3 của BCR trong GenBank. Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 20 µL, các
thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250 µM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi 230FL và
mồi ngược R1 (0,5 µM cho mỗi loại), 1,25 unit TaKaRa Taq
TM
HotStart Polymerase
(Takara, Nhật Bản) và 40 ng cDNA. Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy
GeneAmp
®
PCR system 2720 (Applied Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính
ban đầu ở 98
0
C trong 2 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 98
0
C trong 10
giây, gắn mồi và tổng hợp chuỗi DNA ở 68

0
C trong 2 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo
dài sản phẩm ở 72
0
C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch
agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto,
Nhật Bản). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen,
Mỹ) và được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,2%. Trong mỗi đợt thực
nghiệm luôn có một tube chứng âm, trong đó cDNA được thay bằng nước cất đã dùng để
pha master mix.
15

Bảng 2.1: Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu
Tên
mồi
Trình tự (5’ 3’)
Gen (exon)
(bp)
F1
CGGGAGCAGCAGAAGAAGTTGTTC
BCR (12-13)
1765 bp (b3a2)
R1
CAGGCACGTCAGTGGTGTCTCTGTG
ABL (10)
1690 bp (b2a2)
F2
CTGGCCGAGTTGGTTCATCA
ABL (4)

F3
ACTGAGTTCATGACCTACGGGAAC
ABL (6)

R2
TCCACTGCCAACATGCTCGC
ABL (8-9)


Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA: Sản phẩm PCR đã tinh sạch sẽ được thực
hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye Terminator Version 3.1 từ Applied
Biosystems, sử dụng mồi F2, F3, R2 và R1 phủ toàn bộ vùng ATP-biding của ABL
(Bảng 2.1 và Hình 2.1). Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di
formamide, biến tính ở 96
0
C trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA
được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm
(Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape, so sánh
với trình tự tham chiếu của ABL để chẩn đoán tình trạng đột biến. Quy trình chẩn đoán
đột biến gen được thực hiện tại Khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện Truyền máu
Huyết học TP. Hồ Chí Minh.


12 13 3 4 5 6 7 8 9 10214
F1
F2
F2 F3
R1
R1
R1R2

1
st
PCR
2
nd
PCR
Sequencing
aa 218
aa 500
BCR
ABL


Hình 2.1: Cấu trúc gen BCR/ABL và vùng ATP binding của ABL
16

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nội dung 1: Xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen BCR/ABL bằng giải
trình tự chuỗi DNA từ mẫu tủy xƣơng hoặc máu ngoại biên
3.1.1 Tách chiết RNA từ tủy xương hoặc máu ngoại biên, tổng hợp cDNA phù hợp
cho PCR
Chúng tôi đã xây dựng quy trình tách chiết RNA, sau đó tổng hợp cDNA từ mẫu
máu hoặc mẫu tủy xương. Đa số mẫu trong nghiên cứu là mẫu tủy vì hầu hết bệnh nhân
chỉ kháng thuốc về mặt di truyền tế bào, chưa biểu hiện kháng thuốc trên lâm sàng nên
huyết đồ vẫn còn bình thường. Mẫu máu hoặc tủy được loại bỏ hồng cầu, đếm số lượng
tế bào với buồng đếm Neubauer, một phần tế bào sử dụng để tách chiết RNA trực tiếp sử
dụng kit, phần còn lại được lưu trữ để dùng cho các nghiên cứu sau. SuperScript II RT là
men sao chép ngược giúp tổng hợp sợi DNA bổ sung (cDNA) từ sợi đơn RNA và là 1
biến thể của SuperScript RT với việc tạo ra những đột biến điểm ở trung tâm hoạt tính
của RNase H làm giảm hoạt tính RNase H giúp loại bỏ sự thoái gián RNA trong suốt quá

trình tổng hợp cDNA. Lựa chọn SuperScript II RT trong nghiên cứu nhằm đảm bảo chất
lượng cDNA tốt, giúp khuếch đại thành công đoạn gen BCR/ABL.
Kỹ thuật tách chiết RNA và tổng hợp cDNA cần chú ý một số điểm để đảm bảo
kết quả chẩn đoán đột biến gen được chính xác:
+ Khi thao tác với RNA phải đeo găng tay, khẩu trang và xử lý mẫu trong clean
bench để tránh làm nhiễm chéo mẫu và giảm chất lượng RNA.
+ Lựa chọn men sao chép ngược và đoạn mồi tổng hợp cDNA phù hợp để đảm
bảo chất lượng cDNA.
3.1.2 Chuẩn hóa điều kiện PCR với 1 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng ATP-
binding domain của gen BCR/ABL
Khuếch đại thành công đoạn gen đặc hiệu cần khảo sát đột biến là khâu quan trọng
nhất trong toàn bộ quy trình chẩn đoán đột biến gen. Các nghiên cứu trước đây thường sử
dụng semi nested PCR để khuếch đại vùng ATP-binding của BCR/ABL. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi sử dụng Takara Taq
TM
HotStart polymerase (Takara, Nhật Bản) và
17

chuẩn hóa điều kiện nên chỉ 1 phản ứng PCR đã khuếch đại thành công 1765 bp đối với
b3a2 hoặc 1690 bp đối với b2a2. Hình 3.1 minh họa kết quả điện di trên thạch agarose
1,2% sau khi khuếch đại BCR/ABL.
1. Thang chuẩn 100-bp
2. Nƣớc
3. Mẫu bệnh nhân
1 2 3
1500
500
12 13 3 4 5 6 7 8 9 10214
F1 R1
PCR

F2 F3 R1R2
Sequencing
BCR
ABL
A
B

Hình 3.1: Kết quả PCR. (A) Vị trí các cặp mồi dùng để khuếch đại tổ hợp gen
BCR/ABL. (B) Kết quả điện di trên thạch agarose 1,2% sản phẩm PCR.
Có nhiều loại polymerase có độ trung thực cao để dùng cho giải trình tự DNA, tuy
nhiên khi sử dụng các polymerase khác nhau thì có thể cần điều chỉnh lại điều kiện PCR
để có được sản phẩm đặc hiệu.
3.1.3. Tiến hành chẩn đoán đột biến gen BCR/ABL bằng giải trình tự chuỗi DNA
sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR sau khi đã được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit đã
được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,2%. Phản ứng cycle sequencing được
thực hiện với 4 đoạn mồi theo 2 chiều xuôi và ngược phủ toàn bộ vùng ATP-binding.
Trong quá trình thử điều kiện và chuẩn hóa quy trình trước khi ứng dụng khảo sát
đột biến BCR/ABL cho bệnh nhân, chúng tôi đã khảo sát trên 1 mẫu cell line K562 có
mang đột biến T315I (mẫu mang từ Nhật về). Kết quả của chúng tôi cũng xác định được
chính xác đột biến T315I (Hình 3.2A). Ngoài ra, trường hợp mang mã số IR-111 là bệnh
nhân nam, 54 tuổi, kết quả của chúng tôi cho thấy có đột biến E453K (Hình 3.2B). Sau
18

Bình thường
Đột biến
A B

Hình 3.2: Hình ảnh trình tự chuỗi DNA của cell line K562 (A)
và của bệnh nhân IR-111 (B)

đó, bệnh nhân này sang khám bệnh tại Bệnh viện ở Singapore và được bác sỹ cho xét
nghiệm tìm đột biến BCR/ABL. Kết quả bệnh nhân mang về cho bác sỹ tại Bệnh viện
Truyền máu Huyết học TP.HCM tham khảo thì đột biến được xác định vẫn là E453K (kết
quả BV. ở Singapore trả có đột biến E453K, không có hình ảnh).
Gen ABL có 11 exon, trong đó exon 1 có 2 biến thể với trình tự chuỗi khác nhau
gọi là exon 1a và exon 1b. Trong quá trình tạo thành tổ hợp gen với BCR, thì từ exon 2
hoặc exon 3 đến exon 11 của ABL gắn với gen BCR (Hình 1.2). Trình tự chuỗi mRNA
của ABL ở người (homo sapiens) được tìm kiếm trong GenBank chỉ có 2 kiểu với
accession number tương ứng là NM_007313.2 (transcript variant b) và NM_005157.4
(transcript variant a), tương ứng với sự khác nhau của exon 1a và 1b. Đối với trình tự
chuỗi từ exon 2 đến exon 11 của 2 biến thể trên giống nhau hoàn toàn. Vùng ABL kinase
được khuếch đại để phân tích đột biến trải dài từ exon 4 đến exon 10 của ABL nên việc sử
dụng trình tự chuỗi chuẩn để phân tích đột biến là biến thể a hay b đều không ảnh hưởng
đến kết quả của nghiên cứu. Phần mềm SeqScape được sử dụng để so sánh trình tự chuỗi
DNA của bệnh nhân với trình tự chuẩn của ABL. Những trường hợp dòng mang đột biến
chiếm ưu thế (major clone), sóng của alen đột biến thường biểu hiện rõ ràng và dễ dàng
được phần mềm nhận diện có sự khác biệt so với chuỗi DNA chuẩn như trường hợp IR-
19

048 có sóng A thay thế hoàn toàn sóng G ở axit amin 250 (Hình 3.3A) hoặc trường hợp
IR-100 có sóng C thay thế hoàn toàn sóng G ở axit amin 453 (Hình 3.3B).

Hình 3.3: Hình ảnh trình tự chuỗi DNA của bệnh nhân IR-048 (A)
và của bệnh nhân IR-100 (B)
Tuy nhiên, với những trường hợp dòng mang đột biến chiếm tỷ lệ nhỏ (minor
clone), các sóng của alen đột biến thấp hơn nhiều so với sóng của alen bình thường nên
có thể không được phần mềm SeqScape phát hiện. Vì vậy, để tránh bỏ sót chúng tôi đều
Bình thường
Đột biến
A

B

Hình 3.4: Hình ảnh trình tự chuỗi DNA của bệnh nhân IR-029 (A)
và của bệnh nhân IR-035 (B)
20

kiểm tra lại bằng mắt thường cho từng vị trí nucleotide trong tất cả 103 trường hợp, nếu
phát hiện có sóng của alen đột biến thấp hơn nhiều so với sóng của alen bình thường
nhưng xuất hiện trên đồng thời ≥ 2 chuỗi DNA tại cùng 1 vị trí nucleotide và chân sóng
vùng xung quanh đẹp không bị nhiễu thì kết luận có đột biến như trường hợp IR-029
(Hình 4A) và IR-035 (Hình 4B). Trong tất cả các trường hợp, kết quả được phân tích độc
lập bởi 2 người tham gia nghiên cứu.

3.2. Nội dung 2: Xác định tần suất và mô tả các kiểu đột biến trên vùng ATP-
binding domain của gen BCR/ABL
3.2.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu
Trong thời gian từ tháng 08/2010 – 09/2012, chúng tôi đã tiến hành phân tích đột
biến gen BCR/ABL cho 103 trường hợp, bao gồm 61 bệnh nhân nam và 42 nữ, tỷ lệ
nam/nữ là 1,45.
Tuổi trung bình của bệnh nhân là 45 tuổi (khoảng tuổi 14 - 73), trong đó có 37,9%
bệnh nhân ≥ 50 tuổi.
Đa số bệnh nhân được chẩn đoán kháng IM dựa trên tỉ lệ tế bào mang NST Ph với
kỹ thuật FISH để xác định tình trạng kháng thuốc về di truyền tế bào hoặc tỉ lệ tế bào
blast >20% trong tủy xương trong trường hợp chuyển cấp (Phụ lục 3), và chỉ có 20
trường hợp được xác định mất đáp ứng về mặt huyết học dựa vào huyết đồ (Phụ lục 3).
Hiện nay có 2 kỹ thuật để đánh giá tình trạng kháng thuốc về mặt di truyền tế bào là NST
đồ và FISH. Tuy nhiên, độ nhạy của NST đồ không cao do phân tích khoảng 20 – 30 tế
bào, nên các phòng xét nghiệm sử dụng kỹ thuật FISH khảo sát khoảng 200 – 500 tế bào
để tính số tế bào mang NST Ph. Dựa trên tỉ lệ tế bào mang NST Ph sẽ xác định được đáp
ứng về mặt di truyền tế bào theo bảng 1.1.

Trong 103 trường hợp, thì 80 (77,7%) bệnh nhân có đáp ứng ban đầu nhưng biểu
hiện kháng thuốc thứ phát sau đó, còn lại 23 (22,3%) bệnh nhân có biểu hiện kháng thuốc
nguyên phát.
21

3.2.2. Đột biến gen BCR/ABL
Các nghiên cứu trước đây cho thấy có khoảng 136 loại đột biến BCR/ABL nằm
trong vùng ATP-binding trên ABL được phát hiện. Tuy nhiên, cũng có báo cáo trong một
số ít trường hợp đột biến nằm ngoài vùng ATP-binding [33,30]. Để phát hiện nhiều kiểu
đột biến khác nhau như trên thì kỹ thuật giải trình tự DNA được ưu tiên lựa chọn. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự DNA để phân tích đột biến trong
vùng ATP-binding của BCR/ABL.
Đến nay, chúng tôi đã thu thập được mẫu tủy hoặc mẫu máu của 103 bệnh nhân
BCMDT kháng với điều trị IM tại Bệnh viện TMHH, tách chiết RNA, tổng hợp cDNA và
khuếch đại thành công sản phẩm PCR. Việc khảo sát đột biến vùng ATP-binding của
BCR/ABL đã được thực hiện trên tất cả mẫu bệnh nhân được thu thập. Kết quả phân tích
đột biến của 103 trường hợp cho thấy 48 bệnh nhân có đột biến, chiếm tỷ lệ 46,6%. Tỷ lệ
này tương đồng với số liệu trong các nghiên cứu của Hàn Quốc và Ý [16,34], nhưng có
phần thấp hơn số liệu từ Trung Quốc và Ấn Độ [27,2].
Các nghiên cứu trên thế giới đã báo cáo rằng nhóm bệnh nhân BCMDT kháng IM
thứ phát có tỉ lệ đột biến cao hơn nhóm kháng nguyên phát, và đặc biệt rất cao ở nhóm
bệnh tiến triển và chuyển cấp [34]. Trong 80 bệnh nhân được chẩn đoán kháng thuốc thứ
phát trong nghiên cứu này thì có 39 bệnh nhân mang đột biến BCR/ABL, chiếm tỉ lệ
48,8% cao hơn nhóm kháng nguyên phát có 9 bệnh nhân mang đột biến chiếm tỉ lệ
39,1%. Sự khác biệt này được lý giải là do nhóm kháng thuốc thứ phát, đặc biệt nhóm
bệnh tiến triển và chuyển cấp có một thời gian dài điều trị nên tăng tính không ổn định về
di truyền (genetic instability) ở tế bào BCMDT [34].
Phân tích đặc điểm đột biến của 48 bệnh nhân cho thấy đột biến xảy ra ở 20 vị trí
axit amin với 25 kiểu khác nhau. Mỗi bệnh nhân có thể mang 1 hoặc 2 hoặc 3 hoặc 4 kiểu
đột biến. Kết quả cho thấy đột biến M351T chiếm tỷ lệ cao nhất (11/48 trường hợp,

22,9%), kế tiếp là H396R chiếm tỷ lệ 14,6% (7/48 trường hợp), sau đó là M244V, G250E
Y253H, F317L (mỗi loại đột biến gặp trong 5/48 trường hợp, chiếm 10,4%) (Hình 3.5).
Đột biến T315I kháng rất mạnh với IM và cả các thuốc ức chế tyrosine kinase thế hệ sau
22

chỉ gặp trong 4 trường hợp, chiếm tỷ lệ 8,3%. Nghiên cứu của Hàn Quốc, Trung Quốc và
Ấn Độ trên bệnh nhân BCMDT kháng IM cho thấy kiểu đột biến chiếm tỷ lệ cao nhất là
T315I [16,2] hoặc M244V [2,27], khác biệt so với kết quả nghiên cứu này. Đột biến
M351I và H396R đơn độc kháng tương đối với IM nên có thể đáp ứng nếu tăng liều IM,
đồng thời bệnh nhân chỉ mang đột biến này nhạy với các thuốc TKI thế hệ sau như
nilotinib, dasatinib,
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Kiểu đột biến
Số bệnh nhân

Hình 3.5: Phân bố các kiểu đột biến BCR/ABL.
Mỗi chấm tròn đen biểu thị một đột biến điểm.

Đột biến quai P gồm M244I, M244V, K245R, K247R, G250E, Y253F, Y253H,
E255V và E255K gặp trong 26/48 bệnh nhân (54,2%), trong đó có bệnh nhân IR-014

mang 2 kiểu đột biến quai P là Y253H và E255K, và bệnh nhân IR-096 mang đồng thời
3 kiểu đột biến quai P là M244V, K245R, K247R (Bảng 3.1). Trong 4 nhóm đột biến
kháng IM thì nhóm mang đột biến quai P và T315I có tiên lượng xấu hơn 3 nhóm còn lại
[12]. Đột biến Y253H và E255K đơn độc đã kháng mạnh với IM (Hình 1.5) nên bệnh
nhân IR-014 mang cùng lúc 2 đột biến này càng có tiên lượng xấu hơn. Điều này hoàn