Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy asen vào cây thuốc lá

4

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1
MỤC LỤC 4
DANH MỤC BẢNG 10
DANH MỤC HÌNH 11
MỞ ĐẦU 12
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15
1.1. Tình hình nghiên cứu ô nhiễm kim loại nặng ở trong và ngoài nƣớc. 15
1.2. Tình hình ô nhiễm Asen. 18
1.2.1. Sơ lược về Asen. 18
1.2.2. Tình hình ô nhiễm Asen ở Việt Nam. 19
1.2.3. Ảnh hưởng của Asen đến sức khỏe của con người. 19
1.2.4. Xử lý ô nhiễm Asen trong đất. 20
1.2.4.1. Phương pháp xử lý truyền thống. 20
1.2.4.2. Phương pháp sinh học. 20
1.3. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật. 22
1.3.1. Khái niệm chuyển gen 22
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật. 22
1.3.2.1. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 22
1.3.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp 22
1.3.2.3. Các hệ thống vector chuyển gen thực vật. 25
1.3.2.4. Giới thiệu về vector pCAMBIA1301. 28
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
5

2.1. Vật liệu nghiên cứu 31
2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm 31
2.1.2. Vật liệu sinh học phân tử 31
2.1.3. Vật liệu thực vật 31

2.1.4. Hóa chất 32
2.1.5. Môi trường nuôi cấy 32
2.1.6. Máy móc và thiết bị 32
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 33
2.2.1. Thiết kế vector pCambia1301 mang gen arsC. 33
2.2.1.1.
Nuôi cấy và lưu giữ chủng
33
2.2.1.2. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ tế bào vi khuẩn E.coli DH5α. 33
2.2.1.3. Phương pháp nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR 34
3.2.1.4. Phương pháp điện di trên gel agarose 35
2.2.1.5. Phương pháp tinh sạch từ bản gel agarose bằng bộ kit của hãng
Fermentas (Mỹ). 36
2.2.1.6. Phương pháp xử lý với enzyme giới hạn 37
2.2.1.7. Phản ứng ghép nối gen arsC với vector pCAMBIA1301. 37
2.2.2. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
phương pháp sốc nhiệt. 38
2.2.2.1. Kiểm tra chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng PCR 39
2.2.2.2. Kiểm tra chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng cắt enzyme giới
hạn 39
2.2.3. Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng
xung điện 40
6

2.2.4. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens 40
2.2.4.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens 40
2.2.4.2. Biến nạp 41
2.2.4.3. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
41
2.2.4.4. Sàng lọc chồi thuốc lá chuyển gen trên môi trường có kháng sinh

chọn lọc.
41
2.2.4.5. Tái sinh cây hoàn chỉnh 41
2.2.4.6. Ra cây trên môi trường đất : trấu : cát 42
2.2.5. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 42
2.2.5.1. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR. 42
2.2.5.2. Lai Southern blot. 42
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ 47
3.1. Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC 47
3.1.1. Sơ đồ vector pCAMBIA1301-arsC dự định thiết kế 47
3.1.2. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCAMBIA 1301 47
3.1.3. Biến nạp pCAMBIA1301-arsC vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng
phương pháp sốc nhiệt. 49
3.1.4 Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301 – arsC 50
3.1.4.1. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng phản ứng PCR –
colony. 50
3.1.4.2. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng enzyme giới hạn
NcoI và Eco72I 51
3.2. Biến nạp vector pCAMBIA1301 – arsC vào vi khuẩn A. tumefaciens. 53
3.3. Tạo cây thuốc lá chuyển gen arsC. 54
7

3.4. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen đƣợc trồng ngoài tự nhiên 64
3.4.1. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 64
3.4.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng Southern Blot. 65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68
Kết luận 68
Kiến nghị 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO 69
PHỤ LỤC

8

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A.tumefaciens
As
BAP
Bp
CaMV35S
Cefo
DNA
dNTPs
EDTA
Gus
Kan
Kb

KLN
LB
MS
NAA
OD
PCR
RNA
SDS
SSC
Agrobacterium tumefaciens
Asen
Benzylaminopurine
Base pair
Cauliflower Mosaic Virus 35S
Cefotaxime
Deoxyribonucleic Acid
Deoxy Nucleoside Triphosphate
Ethylene Diamine tetra- acetate Acid
-glucuronidase
Kanamycin
Kilo base

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Naphthalene Acetic Acid
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Polymerase Chain Reaction
Ribonucleic Acid
Sodium dodecyl sulfate
Saline sodium sitrate

9

TAE
Taq
T-DNA
Ti-plasmid
UV
Vir

 Axit acetic  EDTA
Thermus aquaticus
Transferred-DNA

Ultraviolet (light)


10

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. arsC 31
Bảng 2.2. -arsC NcoEco72I 37
Bảng 2.3. NcoEco72I 37
Bảng 2.4. arsC  38
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11

DANH MỤC HÌNH
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Hình 1.2.  29
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48
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Hình 3.15.  66
12

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

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13

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(Vetiveria zizanioides (Pteris vittata L)Brassica juncea),
Polygonum hydropiper[2], [3], [59].

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
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
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KLN  
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14

                

t
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

     “Nghiên cứu
chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào cây thuốc lá”. 


2. Mục tiêu nghiên cứu
arsC 
arsC.
3. Nội dung nghiên cứu
-       pCAMBIA1301-arsC  A.
tumefaciensC58
- arsC.
-  .



15

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu ô nhiễm kim loại nặng ở trong và ngoài nƣớc
Nước ngoài

 
 ZIP 1, ZIP 2,
IRT1 (ion-regulated transporter), AtNramp, AtNramp 3 (metal transpoter gene
family),       CAD1, GmPCS1 (phytochelatin
synthase) [47] MT1, MT2 

CAX 1 CAX 2
Arabidopsis 
[49]. 
 
             
 [66].
  gen arsC   
Arabidopsis
arsC SRS1p
gen γ-ECSACT2p) Arabidopsis 
          [39].    
PvACR2 Pteris vittata
 [41]. M
          -   
PvGRX5 Pteris vittata 
ArabidopsisArabidopsis n gen


PvGRX5 
16

Pteris vittata 
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    
Pteris vittata Dennstaedtia scabra, 
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    D. scabra      41.63 mg/kg [55].
Pteris vittata 
              

 [54].
ThePteris vittata 

  g/l) [50],
[60]. Cucumis
sativus)        
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17

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[20], [22], [23]. 
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18

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1.2. Tình hình ô nhiễm Asen
1.2.1. Sơ lược về Asen
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Hình 1.1. 
19

1.2.2. Tình hình ô nhiễm Asen ở Việt Nam

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[25]. 
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1.2.3. Ảnh hưởng của Asen đến sức khỏe của con người

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
Ase

20





   15     
 [51].
1.2.4. Xử lý ô nhiễm Asen trong đất
1.2.4.1. Phương pháp xử lý truyền thống






[35].


    
[34], [36].
1.2.4.2.Phương pháp sinh học




  
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Bacillus 
 
[8], [32], [33], [40], [44]:
21

- Phyto-transformation): 

 u
gPopulus 
Myriophyllium spicatum

- Rhizosphere remediation


                


- Phytostabilisation


- Phytoextraction

 
      Brassica
junceaHelianthus spp.

- Rhizo-filtration


- Phyto-volatilization
Brassica juncea



22












arsC 
1.3. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật
1.3.1. Khái niệm chuyển gen




[14].
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật
1.3.2.1. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
-  
- .
- .
- .
- .
1.3.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp
- .
- Agrobacterium tumefaciens.
23

Agrobacterium  1970.
Agrobacterium tumefaciens (A.tumefaciens
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Agrobacterium tumefaciens 
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24

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25

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1.3.2.3. Các hệ thống vector chuyển gen thực vật
Ti-    
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Agrobacterium. -
26


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
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27

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1.3.2.4. Giới thiệu về vector pCAMBIA1301
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