Nghiên cứu đột biến trên gen FLT3 ở một số bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG NHẬT LỆ
NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN TRÊN GEN FLT3

Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN LƠ XEMI CẤP
DÒNG TỦY

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. LÊ XUÂN HẢI
2. GS.TS. PHAN TUẤN NGHĨA
1
Hà Nội - Năm 2014
2
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, TS. Lê Xuân
Hải những người thầy tận tâm đã hướng dẫn, dìu dắt, dành nhiều thời gian quí báu,
tạo mọi điều kiện tốt nhất và tâm huyết giúp đỡ cho em hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng bày tỏ lòng cảm ơn chân thành nhất đến TS. Phạm Bảo Yên, ThS.
Trịnh Lê Phương, ThS. Ngô Kim Toán và cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập
tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và protein đã giúp đỡ và chia
sẻ kinh nghiệm thực tế trong quá trình thực hiện thí nghiệm phân tích đột biến gen.
Tôi cũng xin được cảm ơn chân thành nhất tới GS.TS. Nguyễn Anh Trí, Viện
trưởng Viện Huyết học- Truyền máu TW, đã hết sức tạo điều kiện để tôi hoàn thành
chương trình học đào tạo của một học viên cao học.
Tôi cũng chân thành cảm ơn Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học và Bộ môn Sinh
lý thực vật và Hóa sinh, các thầy cô trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên đã giúp đỡ tận tình trong thời gian tôi học và hoàn thành luận văn.

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể Khoa H7, Phòng Kế
hoạch tổng hợp, Khoa Huyết thanh học nhóm máu, Khoa Lưu Trữ và Phân phối
máu, Phòng Tổ chức cán bộ và các Khoa phòng trong Viện đã luôn tạo điều kiện tốt
nhất cho tôi trong suốt những năm tháng tôi học tập và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi đã
đồng hành, động viên về mặt tinh thần cũng như vật chất để tôi có thể yên tâm hoc
tập, công tác và hoàn thành luận văn
Hoàng Nhật Lệ
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AML: Lơ xê mi cấp dòng tủy (Acute myelogenlous leukemia)
BN: Bệnh nhân
ddNTP: Dideoxynucleoside triphosphate
dNTP: Deoxynucleoside triphosphate
FAB: French - American - British
FLT3: FMS related tyrosin kinase
Hb: Hemoglobin
HC: Hồng cầu
ITD: Internal tandem duplication
KLB: Không lui bệnh
LBHT: Lui bệnh hoàn toàn
LBMP: Lui bệnh một phần
LXM: Lơ xê mi
NCCN: National Comprehensive Cancer Network
NST: Nhiễm sắc thể
SLBC: Số lượng bạch cầu
SLTC: Số lượng tiểu cầu
WHO: Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)
TB: Tế bào

TBBT: Tế bào bất thường
TKD: Tyrosin kinase domain
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Gi i thi u chung v AML 3ớ ệ ề
1.1.1. L ch s phát hi n AML 3ị ử ệ
1.1.2. Phân lo i b nh AML 4ạ ệ
1.1.3. Phân lo i b nh theo FAB 6ạ ệ
1.2. Tình tr ng m c b nh AML 9ạ ắ ệ
1.2.1. Tình tr ng m c b nh AML trên th gi i 9ạ ắ ệ ế ớ
1.2.2. Tình tr ng m c b nh AML Vi t Nam 10ạ ắ ệ ở ệ
1.3. M t s nguyên nhân gây b nh AML 11ộ ố ệ
1.3.1.Y u t di truy n 11ế ố ề
1.3.2. Y u t môi tr ng 11ế ố ườ
1.3.3. Virus 12
1.3.4. B t th ng v nhi m s c th 12ấ ườ ề ễ ắ ể
1.3.5. Các y u t khác 13ế ố
1.3.6. C ch b nh sinh c a AML 13ơ ế ệ ủ
1.4. Gen FLT3 v các lo i t bi n trên gen FLT3 14à ạ độ ế
1.4.1. C u trúc v ch c n ng c a gen FLT3 (hình 1.6 v hình 1.7)ấ à ứ ă ủ à
14
1.4.2. Ý ngh a c a xét nghi m phát hi n t bi n gen FLT3 trongĩ ủ ệ ệ độ ế
tiên l ng i u tr AML 17ượ đề ị
1.4.3. Các lo i t bi n trên gen FLT3 18ạ độ ế
1.4.4. Ph ng pháp phát hi n t bi n trên gen FLT3 20ươ ệ độ ế
Chương 2 22
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. i t ng nghiên c u 22Đố ượ ứ

2.2. V t li u nghiên c u 22ậ ệ ứ
* Hóa ch t dùng cho ph n ng PCR 22ấ ả ứ
- Dung d ch m Taq DNA polymerase 10 X. 22ị đệ
- Dung d ch MgCl2, MgSO4 25mM. 22ị
- dNTP 8 mM. 22
- M i 11F v 12R. 22ồ à
- N c c t vô trùng (ddH2O). 22ướ ấ
* Hóa ch t dùng cho i n di trên gel agarose 22ấ đệ
- Agarose. 22
- Ethidium Bromide 10 mg/ml. 23
- Dung d ch i n di TAE. 23ị đệ
- Dung d ch hòa loãng m u 6X. 23ị ẫ
- Marker 100 bp v 1kb. 23à
* Hóa ch t dùng bi u hi n c m ng c a gen 23ấ để ể ệ ả ứ ủ
- Môi tr ng TSA, LB. 23ườ
- Xgal, IPTG 100 mM. 23
- Kháng sinh Ampicillin. 23
* Hóa ch t dùng tách chi t plasmid 23ấ để ế
- Dung d ch Sol I: Tris-HCl 25 mM pH 8; EDTA10mM pH 8,0; Glucose 50 ị
mM; RNase A 10 mg/ml 23
- Dung d ch Soll II: SDS 1%, NaOH 0, 2 N. 23ị
- Dung d ch Soll III: Potassium acetate 3 M; acetic acid 11, 5% (pH 5.2) 23ị
Các hóa ch t còn l i u c mua t các hãng qu c t có uy tín v u ấ ạ đề đượ ừ ố ế àđề
t c tinh khi t dùng phân tích. 23đạ đượ độ ế để
2.3. Các thi t b máy móc dùng trong nghiên c u 23ế ị ứ
Các thi t b chính dùng cho nghiên c u bao g m: 23ế ị ứ ồ
- Máy nhân gen (PCR). 23
2.4. Các ph ng pháp nghiên c u 24ươ ứ
2.4.1. ánh giá tình tr ng b nh nhân b ng các tiêu chí lâm s ngĐ ạ ệ ằ à
24

2.4.2. Tách chi t v nh l ng DNA t ng s 25ế àđị ượ ổ ố
2.4.3. Tách chi t DNA plasmid b ng ph ng pháp Bibdo 26ế ằ ươ
2.4.4. i n di phân tách DNA trên gel agarose 27Đệ
Sau khi ki m tra n ng DNA b ng ph ng pháp o h p th ánhể ồ độ ằ ươ đ ấ ụ
sáng tia t ngo i b c sóng A260 /A280, chúng tôi ti nử ạ ở ướ ế
h nh i n di DNA t ng s trên gel agarose 1% trong mà đệ ổ ố đệ
TBE 1 X, v i hi u i n th 90V trong kho ng th i gian 1 gi .ớ ệ đ ệ ế ả ờ ờ
27
m TBE m c g p 10 l n (Tris-axit boric-EDTA 10X): HòaĐệ đậ đặ ấ ầ
tan 108 g Tris v 55 g axit boric trong 600 ml n c. Thêm 40à ướ
ml EDTA 0,5 M v thêm n c c t kh ion l 1 lít. H p vôà ướ ấ ử à ấ
trùng 121oC trong 15 phút, b o qu n nhi t phòng. 27ở ả ả ở ệ độ
Khi s d ng, thêm 900 ml n c v o 100 ml dung d ch TBE g cử ụ ướ à ị ố
(10X) th nh dung d ch TBE 1X. 27à ị
Sau khi i n di xong, b n gel c nhu m v i dung d ch ethidiumđ ệ ả đượ ộ ớ ị
bromide 1% trong 10 phút v soi b n gel trên h th ng máyà ả ệ ố
c geldot. 27đọ
2.4.5. Nhân b n gen b ng PCR s d ng c p m i c hi u c a genả ằ ử ụ ặ ồ đặ ệ ủ
FLT3 27
2.4.6. Nhân dòng gen FLT3 v o E. coli 29à
Tinh s ch o n gen mang t bi n FLT3 b ng kít thôi gel c aạ đ ạ độ ế ằ ủ
hãng Promega 29
Sau khi i n di s n ph m PCR trên gel agarose 2% xác nh sđệ ả ẩ để đị ự
chênh l ch kích th c c a b ng DNA v b ng DNA c c tệ ướ ủ ă à ă đượ ắ
v cho v o ng eppendorf. B sung dung d ch g n m ngà à ố ổ ị ắ à
(membrance binding) v i t l 10 l /10 mg gel, un h n h pớ ỷ ệ μ đ ỗ ợ
trên nhi t 60oC - 65oC cho n khi gel tan ch y ho nở ệ độ đế ả à
to n. Dung d ch ng nh t c chuy n qua c t SVà ị đồ ấ đượ ể ộ
milicolumn (hãng Promega) v nhi t phòng trong 1à ủ ệ độ
phút. Ly tâm c t SV 16000 g x 1 phút lo i b dung d chộ để ạ ỏ ị

qua c t, r a 2 l n b ng dung d ch r a (membrance washingộ ử ầ ằ ị ử
solution). 29
Ti p theo, dung d ch r a c lo i b ho n to n v chuy n c tế ị ử đượ ạ ỏ à à à ể ộ
sang ng eppendorf s ch, vô trùng v b sung 30 l n cố ạ à ổ μ ướ
c kh ion. D ch qua c t ch a m u c thu l i v b ođượ ử ị ộ ứ ẫ đượ ạ à ả
qu n – 20oC ti p t c l m nh ng nghiên c u ti p theo. 29ả để ế ụ à ữ ứ ế
Giai o n gen FLT3 c g n v o vector pGEM-T 29đ ạ đượ ắ à
Các s n ph m trên sau ó c g n tr c ti p v o vector nhân dòngả ẩ đ đượ ắ ự ế à
pGEM-T. Vector nhân dòng n y có u T (pGEM-T) cà đầ đượ
thi t k có ch a m t g c thymydine monophosphate u 3’ế ế ứ ộ ố ở đầ
b sung v i g c adenosine monophosphate c g n v o để ổ ớ ố đượ ắ à ở
u 3’ c a s n ph m PCR khi dùng Taq DNA polymearse. 29đầ ủ ả ẩ
Th nh ph n c a ph n ng g n o n gen FLT3 mã hóa v o vectorà ầ ủ ả ứ ắ đ ạ à
pGEM-T v i t ng th tích l 10 l nh sau: 2,5 l ddH2O, 5ớ ổ ể à μ ư μ
l dung d ch m 2 X, 1 l T4 DNA ligase, 0,5 l vectorμ ị đệ μ μ
pGEM-T, s n ph m thôi gel l 1 l. 29ả ẩ à μ
H n h p ph n ng c 22oC trong kho ng 2-3 gi ho c ỗ ợ ả ứ đượ ủ ả ờ ặ để
nhi t 4oC qua êm, sau ó s n ph m c bi n n p v o tệ độ đ đ ả ẩ đượ ế ạ à ế
b o E. coli. 29à
Bi n n p s n ph m b ng ph ng pháp s c nhi t v o t b o E. coliế ạ ả ẩ ằ ươ ố ệ à ế à
DH5 kh bi n 29α ả ế
T b o kh bi n E.coli ch ng DH5 (do phòng Thí nghi m tr ngế à ả ế ủ α ệ ọ
i m công ngh enzyme v protein s n xu t, l u gi nhi tđể ệ à ả ấ ư ữở ệ
- 80oC) c l y ra v b o qu n trong h p l nh tan tđộ đượ ấ à ả ả ộ ạ để ừ
15- 20 phút trong khi i s n ph m g n c b t ho t enzymeđợ ả ẩ ắ đượ ấ ạ
nhi t 65oC trong 10 phút, sau ó hút 8-10 l h n h p cở ệ ở đ μ ỗ ợ đượ
g n trên b sung v o dung d ch t b o, tr n nh nh ng vắ ở ố à ị ế à ộ ẹ à à
h n h p trên á 15 phút có tác d ng l cho vector bám v ođể ỗ ợ đ ụ à à
th nh t b o. 29à ế à
Sau ó c ti n h nh s c nhi t 42oC trong 40 giây, m u cđ đượ ế à ố ệ ở ẫ đượ

chuy n l i trên t á 5 phút v b sung 800 l dung d ch LBể ạ ủđ à ổ μ ị
l ng, nuôi t v i nhi t 37oC trong 1 gi v l c v i t c ỏ ở ủ ớ ệ độ ờ à ắ ớ ố độ
l 200 vòng/1 phút. 30à
Ti n h nh ly tâm, l i kho ng 50-100 l dung d ch bi n n p ế à để ạ ả μ ị ế ạ để
c y tr i trên a petri có ch a môi tr ng TSA có b sungấ ả đĩ ứ ườ ổ
ampicilin, 15 l Xgal, 15 l IPTG v nuôi c y qua êm tμ μ à ấ đ ở ủ
m 37oC. 30ấ
Ph ng pháp ch n l c khu n l c tr ng – xanh 30ươ ọ ọ ẩ ạ ắ
Vector nhân dòng pGEM -T có gen lacz có tác d ng chuy n hóaụ ể
ng lactose. Vì v y i v i plasmid không mang o n genđườ ậ đố ớ đ ạ
chèn v o, khi ó gen lacz ho t ng bình th ng trong vi cà đ ạ độ ườ ệ
t ng h p -galactosidase khi có m t X-gal v IPTG trong môiổ ợ β ặ à
tr ng thì enzyme s chuy n hóa c ch t th nh m u xanhườ ẽ ể ơ ấ à à
khi có m t c a oxy. 30ặ ủ
Còn i v i plasmid tái t h p có m u tr ng do gen lacz b b t ho tđố ớ ổ ợ à ắ ị ấ ạ
l vì o n gen l chèn v o v l m m t ho t tính –à đ ạ ạ à à à ấ ạ β
galactosidase c a các th tái t h p, quá trình chuy n hóa củ ể ổ ợ ể ơ
ch t không x y ra khi có m t c X-gal v IPTG. 30ấ ả ặ ả à
Do ó theo lý thuy t khu n l c tr ng l nh ng khu n l c có thđ ế ẩ ạ ắ à ữ ẩ ạ ể
mang o n gen t bi n, khu n l c xanh l nh ng khu n l cđ ạ độ ế ẩ ạ à ữ ẩ ạ
không mang o n gen t bi n. 30đ ạ độ ế
Ki m tra khu n l c tr ng thu c b ng PCR v i n di s n ph mể ẩ ạ ắ đượ ằ àđệ ả ẩ
PCR ki m tra úng o n gen c chèn v o hay không,để ể đ đ ạ đượ à
b ng cách ti n h nh nuôi c y v tách chi t plasmid theoằ ế à ấ à ế
ph ng pháp Bibdo v g i m u ã tách chi t plasmid gi iươ à ử ẫ đ ế để ả
trình t . 30ự
2.4.7. Xác nh trình t gen theo nguyên lý c a Sanger v c ng sđị ự ủ à ộ ự
30
2.5. Phân tích, x lý s li u theo ph ng pháp nghiên c u 31ử ố ệ ươ ứ
Chương 3 32

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 32
3.1. c i m lâm s ng v c n lâm s ng c a b nh nhân AML ch n nghiên Đặ để à à ậ à ủ ệ ọ
c u s có m t c a t bi n gen FLT3 32ứ ự ặ ủ độ ế
3.1.1. T l % m c b nh AML theo tu i 32ỷ ệ ắ ệ ổ
3.1.2. T l % m c b nh AML theo gi i 34ỷ ệ ắ ệ ớ
34
3.1.3. T l % m c b nh AML theo phân lo i FAB 35ỷ ệ ắ ệ ạ
3.1.4. So sánh hi u qu i u tr lâm s ng gi a nhóm có t bi nệ ả đề ị à ữ độ ế
v không có t bi n FLT3-ITD 36à độ ế
3.2. Phân tích s có m t c a t bi n gen FLT3 37ự ặ ủ độ ế
3.2.1. Tách chi t DNA t ng s 37ế ổ ố
3.2.2. Nhân b n o n gen mã hóa FLT3 b ng PCR 38ả đ ạ ằ
3.2.3 Nhân dòng FLT3 v o vector 40à
3.2.4. Xác nh trình t gen FLT3 mang gen t bi n 42đị ự độ ế
3.2.5. Phân tích k t qu t bi n gen FLT3 - ITD v i t bi nế ả độ ế ớ độ ế
nhi m s c th 43ễ ắ ể
3.3. c i m lâm s ng v c n lâm s ng c a b nh nhân có t bi n gen Đặ để à à ậ à ủ ệ độ ế
FLT3 44
3.3.1. c i m t b o b nh nhân có t bi n gen FLT3-ITD 44Đặ để ế à ở ệ độ ế
3.3.2. c i m lâm s ng liên quan n tình tr ng xu t huy t c aĐặ để à đế ạ ấ ế ủ
b nh nhân AML 45ệ
45
3.3.3. c i m lâm s ng liên quan n tình tr ng thi u máu c aĐặ để à đế ạ ế ủ
b nh nhân AML 46ệ
KẾT LUẬN 48
KIẾN NGHỊ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại AML 2001 và 2008 của WHO

Bảng 1.2. Ý nghĩa tiên lượng của đột biến FLT3 ở bệnh nhân trưởng
thành
Bảng 1.3. Nhóm tiên lượng theo NCCN 2013 [44]
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR
Bảng 3.1 So sánh tỷ lệ mắc bệnh AML theo tuổi của các tác giả
Qua thống kê phân tích các kết quả nghiên cứu trên đây cho thấy về độ
tuổi mắc bệnh của các tác giả trong nước và ngoài nước có kết quả
tương tự nhau về độ tuổi mắc bệnh AML
Bảng 3.2. Tỷ lệ % mắc bệnh AML theo phân loại FAB
Bảng 3.3. Tỷ lệ xuất hiện đột biến gen FLT3-ITD với đột biến nhiễm sắc
thể
Bảng 3.4. Đặc điểm tế bào ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD
Bảng 3.5. So sánh tình trạng thiếu máu của BN giữa hai nhóm
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M2
Hình 1.2. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M3
Hình 1.3. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M4
Hình 1.4. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M5
Hình 1.5. Hình ảnh nhiễm sắc thể bị mất đoạn và thêm đoạn
Hình 1.6. Vị trí của gene FLT3 trên nhiễm sắc thể số 13
Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc và hoạt động của FLT3
Hình 3.1. Phân bố của bệnh AML theo giới
Hình 3.2. So sánh kết quả điều trị giữa nhóm có đột biến và không đột
biến
Hình 3.3. Hình ảnh một số mẫu bệnh nhân AML được tách DNA tổng số

Hình 3.4. Sàng lọc mẫu bệnh nhân AML bằng PCR
Giếng 1: Đối chứng âm không có DNA khuôn
Hình 3.5. Hình ảnh tinh sạch băng đột biến FLT3
Giếng 1: Thang chuẩn DNA 100 bp

Giếng 2-5: Sản phẩm tinh sạch thôi gel có băng đột biến FLT3 tương
ứng với mẫu bệnh nhân số 124, 127, 146, 160
Để tiếp tục khẳng định sự có mặt của đột biến FLT3 ở trên bệnh nhân
được sàng lọc đột biến FLT3, chúng tôi chọn lọc bệnh nhân số 124, 127,
146, 165 điện di sản phẩm PCR trên gen agarose 2% và thôi gel để thu
băng DNA. Chế phẩm DNA sau khi được tinh sạch và kiểm tra bằng
điện di, kết quả thu được ở hình 3.5 cho thấy có 1 băng duy nhất kích
thước khoảng 400 bp, chứng tỏ rằng băng đột biến tinh sạch đạt yêu
cầu
Hình 3.6. Điện di khuẩn lạc sau khi nhân dòng FLT3
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự mẫu 146.5 có đột biến 45 bp
Khi so sánh trình tự của mẫu 146.5 với đoạn gen FLT3 gốc được cung
cấp trên Genbank chúng tôi thấy đoạn gen thu được là thuộc FLT3 và
có thêm đoạn chèn vào khoảng 45 bp. Kết quả giải trình tự đột biến gen
FLT3 này của chúng tôi cũng được nghiên cứu trong luận văn thạc sỹ
của Đỗ Thị Thanh Trung 2014 [20] về tối ưu qui trình và phát hiện đột
biến phân tử trên gen FLT3 - phụ lục III
Như vậy, kết quả đọc trình tự cho phép chúng tôi khẳng định mẫu thu
được chứa đột biến FLT3-ITD
Hình 3.8. Tình trạng xuất huyết XH giữa nhóm có đột biến và không có
đột biến
ĐẶT VẤN ĐỀ
Lơ xê mi cấp dòng tủy (AML-Acute Myelogenic Leukemia) là một bệnh lý
đơn dòng ác tính của tổ chức sinh máu, bệnh được đặc trưng bởi sự tăng sinh của
các tế bào non (blast) bất thường, chủ yếu ở trong tủy xương và ở máu ngoại vi có
các tế bào non ác tính. Những tế bào này lấn át tế bào bình thường và ức chế quá
trình trưởng thành và phát triển của các dòng tế bào bình thường trong tủy xương
[2,14,21].
Theo các nghiên cứu trên thế giới, hơn 80% các đột biến gen được tìm thấy ở
bệnh nhân mắc AML xảy ra ở 3 gen nucleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosine

kinase 3 (FLT3) và CCAAT- enhancer binding protein alpha (CEBPA) [29,30,32,40].
Khoảng 30% tổng số bệnh nhân mắc AML với kiểu hình nhiễm sắc thể bình
thường bị đột biến gen FLT3, hậu quả là enzyme tyrosine kinase này luôn luôn ở
trạng thái hoạt động mà không cần dimer hóa, dẫn đến rối loạn quá trình phát triển
và biệt hóa tế bào máu. Nhiều nhóm nghiên cứu FLT3 đã phát hiện ra hai kiểu đột
biến thường gặp nhất trên gen này là lặp đoạn nội phân tử (ITD - internal tandem
duplication) và đột biến điểm gây thay thế acid amin aspartic ở vị trí 835 thuộc
vùng tyrosine kinase [38,42,49,55].
Tỷ lệ mắc bệnh LXM cấp ở Mỹ năm 2012 khoảng 3-5 trường hợp trong
100.000 dân, chiếm khoảng 3% tổng số các bệnh ung thư. Ở Việt Nam, theo nghiên
cứu của Bạch Quốc Khánh và cộng sự năm 2012 lơ xê mi cấp chiếm tỷ lệ 41,5%
trong các bệnh máu. Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới. Tuy nhiên bệnh có xu
hướng gặp nhiều hơn ở trẻ em và người già [7]. Nhóm AML thường gặp ở người
lớn trong khi đó, nhóm LXM cấp dòng lympho chiếm 75-80% LXM cấp ở trẻ em
Trước đây việc chẩn đoán AML chủ yếu dựa vào hình thái học tế bào, hóa học
tế bào kết hợp với triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân do đó việc phân loại AML
còn gặp nhiều khó khăn đối với bệnh nhân có bộ nhiễm sắc thể bình thường thì
không phát hiện được những tổn thương trên gen để có định hướng điều trị.
Tuy vậy, hầu như chưa có các nghiên cứu đi sâu phân tích các dạng đột biến
cụ thể gây nên bệnh AML. Chính vì vậy việc áp dụng các phương pháp phân tích
1
DNA để xác định và phát hiện các loại đột biến ở bệnh nhân AML là rất cần thiết và
có ý nghĩa giá trị thực tiễn thiết thực trong chẩn đoán bệnh. Đề tài: ˝Nghiên cứu đột
biến trên gen FLT3 ở một số bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy” của chúng tôi
được đặt ra nhằm mục tiêu:
1. Xác định tỷ lệ đột biến FLT3-ITD ở bệnh nhân bị bệnh lơ xê mi cấp
dòng tủy.
2. Bước đầu xác định các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các bệnh
nhân có đột biến này.
2

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về AML
Lơ xê mi cấp dòng tủy (AML) là một trong các loại ung thư máu ác tính nhất
và tiến triển rất nhanh. Nguyên nhân phát sinh bệnh là do các thay đổi bất thường
(đột biến) dẫn đến làm rối loạn quá trình sản sinh bạch cầu, loại tế bào chịu trách
nhiệm bảo vệ cơ thể thông qua các cơ chế miễn dịch, tạo ra những bạch cầu bất
thường với tốc độ nhanh chóng. Bệnh nhân AML, nếu không được chẩn đoán, điều
trị kịp thời và phát hiện sớm sẽ tử vong [14,19].
1.1.1. Lịch sử phát hiện AML
Năm 1827, bác sỹ Velpeau người Pháp đã mô tả một người bán hoa 63 tuổi
mang một căn bệnh đặc trưng tiến triển bởi sốt, suy nhược, sỏi thận, gan to, lách to.
Velpeau ghi nhận máu của bệnh nhân này giống “như cháo”, ông tiên đoán hiện
tượng này là do số lượng bạch cầu rất nhiều ở trong máu bệnh nhân.
Năm 1845, Bennett mô tả một loạt bệnh nhân tử vong có triệu chứng lách to,
máu thay đổi về màu sắc và tăng độ quánh. Ông cũng sử dụng thuật ngữ
‘leucocythemia’ chỉ đặc điểm ở những bệnh nhân này có dày đặc bạch cầu trong
máu ngoại vi.
Năm 1856, thuật ngữ "bệnh bạch cầu" được đặt ra bởi Rudolf Virchow, nhà
bệnh lý học nổi tiếng người Đức, ông cũng là người tiên phong trong việc sử dụng
kính hiển vi quang học để đọc công thức máu của bệnh nhân, Virchow là người đầu
tiên mô tả các bất thường của các tế bào máu trắng ở bệnh nhân có hội chứng lâm
sàng đã được mô tả bởi Velpeau và Bennett. Virchow đã không tìm ra được nguyên
nhân của việc sản sinh quá nhiều tế bào bạch cầu, ông đã sử dụng thuật ngữ mô tả
"bệnh bạch cầu" (tiếng Hy Lạp: "máu trắng") để chỉ tình trạng này.
Năm 1877, Paul Ehricl đã tìm ra phương pháp nhuộm tiêu bản và đưa
phương pháp này vào việc mô tả sự khác thường giữa bạch cầu bình thường và bất
thường ở bệnh nhân.
3
Năm 1879, Mosler là người đầu tiên đã đưa kỹ thuật xét nghiệm tủy xương vào

chẩn đoán đối với những bệnh nhân có triệu chứng xuất huyết và thiếu máu ở trên.
Năm 1889, Wilhelm Ebstein đã dùng thuật ngữ (leukemia-lơ xê mi cấp) với triệu
chứng bệnh tiến triển nhanh, tiên lượng xấu để chẩn đoán phân biệt với lơ xê mi mạn.
Năm 1900, Naegeli gọi myeloblast là tế bào ác tính trong bệnh lơ xê mi cấp
và chia lơ xê mi cấp thành dòng tủy (AML) và dòng lympho (ALL).
Năm 1976, FAB đã đưa ra phân loại AML dựa vào hình thái học và hóa học
tế bào [31].
Năm 2001, WHO đã đưa ra phân loại lơ xê mi cấp để chẩn đoán xác định về
tế bào blast đã giảm xuống còn ≥ 20% tổng số tế bào có nhân trong tủy được chẩn
đoán xác định so với tiểu chuẩn của FAB (1986) tế bào blast ≥ 30%.
Năm 2008, WHO đã đưa ra phân loại mới dựa trên tổn thương gen để chẩn
đoán và đánh giá tiện lượng của bệnh đề ra phương pháp điều trị thích hợp.
1.1.2. Phân loại bệnh AML
AML có nhiều thể loại khác nhau, phân loại dựa vào các đặc điểm hình thái
học, hóa học tế bào, các dấu ấn miễn dịch trên bề mặt tế bào, các đột biến về mặt di
truyền và gen. Trong bảng phân loại của WHO năm 2001 có nhiều thể bệnh AML
với các rối loạn về di truyền, bất thường trên gen từ đó giúp cho việc chẩn đoán
được tiên lượng về bệnh rõ ràng hơn [31].
Năm 2008 WHO đã đưa ra phân loại mới về AML mở rộng hơn so với phân
loại của WHO năm 2001 với một số bệnh đáng chú ý, trong đó đặc biệt một số gen
được đưa vào để xác định AML (bảng 1.1), gen FLT3 mặc dù chưa được đưa vào
chính thức để áp dụng trong chẩn đoán, nhưng cũng được khuyến cáo nên tiến hành
xét nghiệm trong điều kiện cho phép [56].
4
Bảng 1.1. Phân loại AML 2001 và 2008 của WHO
Phân loại WHO 2008 – AML Phân loại WHO 2001 – AML
1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay gặp 1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay
gặp
AML có t(8;21)(q22;q21); RUNX1-
RUNX1T1

AML với t(8;21) (q22;q21);
(AML/ETO)
AML inv(16)(p13.1q22) hoặc t(16 ;16)
(p13.1q22); CBFβ- MYH11
AML inv(16)(p13.q22)hoặc
t(16;16)(p13.q22); (CBFβ/MYH11)
APL có t(15;17)(q22;q21) ; PML- RARA APL có t(15;17)(q22;q21);(PML/
RARa)
AML có t(9;11)(p22;q23); MLLT3- MLL AML 11q23(MLL)
AML t(6;9)(p23;q34) ; DEK- NUP 214
AML có inv(3)(q21;q26.2)hoặc t(3;3)
(q21;q26.2); RPN1- EV11
AML t(1;22)(p13;q13); RBM15- MKL1
AML có đột biến gen NPM1
AML có đột biến gen CEBPA
2. AML liên quan đến thay đổi rối loạn sinh
tủy
2.AML liên quan đến thay đổi rối loạn
sinh tủy có đột biến đa dòng
3. AML thứ phát sau điều trị các bệnh ác tính 3. AML liên quan đến điều trị
4. AML không phân loại 4. AML không phân loại
AML với sự khác biệt tối thiểu M0 AML với sự khác biệt tối thiểu M0
AML không có sự trưởng thành M1 AML không có sự trưởng thành M1
AML dòng tủy mono M4 AML dòng tủy mono M4
AML dòng mono M5 AML dòng mono M5
AML dòng hồng cầu M6 AML dòng hồng cầu M6
AML dòng mẫu tiểu cầu M7 AML dòng mẫu tiểu cầu M7
5
Phân loại WHO 2008 – AML Phân loại WHO 2001 – AML
AML dòng bạch cầu ưa baso AML dòng bạch cầu ưa baso

AML tăng sinh toàn bộ xơ AML tăng sinh toàn bộ xơ
Myeloid sarcoma (mô liên kết) Myeloid sarcoma (mô liên kết)
5. Tăng sinh tủy liên quan đến hội chứng
Down
6. Blastics plasmacytoid dendrictic cell
neoplasm
1.1.3. Phân loại bệnh theo FAB
Phân loại AML đã được sử dụng rộng rãi từ năm 1976 cho đến nay và dựa
trên chủ yếu là phân loại bằng hình thái học tế bào và hóa học tế bào. Người ta phân
loại thành 8 thể sau:
* Thể M0: AML thể không biệt hóa trong đó có tế bào non bất thường ≥ 90%,
- Tế bào tiền tủy bào < 3%.
* Thể M1: AML thể chưa trưởng thành (AML without maturation):
- ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen.
- ≥ 90% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast.
- ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào.
* Thể M2: AML thể trưởng thành (AML with maturation, hình 1.1):
- ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen.
- ≤ 89% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast.
- ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào.
6
Hình 1.1. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M2
* Thể M3: AML thể tiền tuỷ bào (acute promyelocytic leukemia, hình 1.2):
- ≥ 5% blast dương tính với MPO và hoặc Sudan đen.
- < 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
Đại đa số tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào, có nhiều hạt đặc hiệu trong
bào tương.
Hình 1.2. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M3

* Thể M4: Lơ xê mi cấp tuỷ - mono (acute myelomonocytic leukemia, hình 1.3):
7
- Các phương pháp nhuộm MPO, Sudan đen, Esterase không đặc hiệu dương
tính với hai quần thể tế bào.
- < 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.
- ≥ 30% là blast, tế bào dòng tuỷ (kể cả blast) chiếm 30 - 80%.
- 5% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu/lympho là bạch cầu ưa acid
thì xếp vào thể M4eo.
Hình 1.3. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M4
* Thể M5: Lơ xê mi cấp dòng mono (acute monoblastic leukemia, hình 1.4):
- MPO và Sudan đen âm tính hoặc dương tính yếu. Esterase MPO và Sudan
đen âm tính hoặc dương tính yếu, esterase đặc hiệu dương tính mạnh và không bị ức
chế bởi NaF.
- Trong thể M5 người ta chia thành 2 loại M5a và M5b.
- Trong đó M5a: tế bào blast biệt hóa, trở thành monocyte non, nguyên sinh
chất chiếm tỷ lệ cao.
- M5b: tế bào monocyte chín chiếm tỷ lệ cao trong tủy. Nguyên sinh chất không có
hạt đặc hiệu.
8
Hình 1.4. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M5
* Thể M6: Lơ xê mi cấp dòng hồng cầu (acute erythroblastic leukemia):
- PAS có thể dương tính, các phương pháp nhuộm khác ít có giá trị. MPO,
Sudan đen có thể dương tính.
- ≥ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu và thường bị loạn sản.
- ≥ 30% tế bào không thuộc dòng hồng cầu là blast tuỷ.
- Có thể gặp thể Auer.
* Thể M7: Lơ xê mi cấp dòng mẫu tiểu cầu (acute megakaryoblastic leukemia):
- PAS, esterase không đặc hiệu và peroxydase tiểu cầu dương tính.
- MPO và Sudan đen âm tính.
1.2. Tình trạng mắc bệnh AML

1.2.1. Tình trạng mắc bệnh AML trên thế giới
Theo thống kê của Cộng đồng Châu Âu năm 2000-2002 tỷ lệ mắc bệnh AML
ở các nước trong khu vực như sau: Phía Bắc cộng đồng Châu Âu thì tỷ lệ mắc bệnh
AML là 2,95 trong 100,000 dân, trong đó khu vực miền Trung và miền Nam thì tỷ
lệ mắc bệnh AML trong 100,000 dân lần lượt là 2,92 và 2,90 nhưng riêng nước Anh
và Ireland thì tỷ lệ mắc bệnh AML trong 100,000 dân là 3,24.
Theo thống kê của Hiệp hội Ung thư Canada năm 2007 cho đến nay tỷ lệ mắc
bệnh của người dân Canada cứ 1,130 người mắc AML được chẩn đoán mới thì có
9
587 là nam giới và 543 là nữ giới. Tỷ lệ tử vong năm 2009 của AML là 897 trường
hợp trong đó nam giới là 479 người và nữ giới là 418 người [60]. Năm 2008 ước
tính trên toàn thế giới có khoảng 12,7 triệu ca bị ung thư trong đó có 7,6 triệu ca
chết vì ung thư.
Năm 2012 ở Mỹ có 47,150 người được chẩn đoán là lơ xê mi cấp trong đó
AML chiếm khoảng 3% so với các loại ung thư khác, độ tuổi chiếm 15-25% ở trẻ
nhỏ còn người lớn thì tăng theo tuổi cứ trên 67 tuổi thì tỷ lệ mắc bệnh AML ngày
càng tăng. Năm 2013 ở Mỹ có khoảng 48,610 ca được chẩn đoán mới về ung thư,
trong đó AML có khoảng 14,590 ca được chẩn đoán mới và 10,730 ca tử vong hầu
hết là người trưởng thành [61].
Theo Hiệp hội Ung thư thế giới ở các nước khu vực Tây Âu thì tỷ lệ mắc các
bệnh này là 2,07 trong 100,000 dân.
1.2.2. Tình trạng mắc bệnh AML ở Việt Nam
Bạch Quốc Tuyên, Nguyễn Thị Minh An cho thấy rằng giai đoạn 1974-1990
cho thấy tỷ lệ bệnh nhân đến khám và điều trị lơ xê mi cấp ngày càng tăng [1].
Trong thời gian này chẩn đoán chủ yếu dựa vào việc phân loại hình thái học tế bào
và triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân.
Năm 1997, nghiên cứu của Đỗ Trung Phấn và cộng sự về tình hình bệnh máu
tại Viện Huyết học - Truyền máu - Bệnh viện Bạch Mai cho biết tỷ lệ bệnh nhân
được chẩn đoán là bệnh máu ác tính chiếm 32,03% trong đó là AML chiếm tỷ lệ
cao là 64,3% [13].

Theo thống kê của Trần Thị Minh Hương trong 3 năm (1997-1999) tại Viện Huyết
học - Truyền máu - Bệnh viện Bạch Mai thì tình hình mắc bệnh lơ xê mi cấp ngày càng
tăng, tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp chiếm 38,5% trong các bệnh máu ác tính [5].
Năm 2000-2002, Đỗ Trung Phấn và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nâng cao
chất lượng phân loại lơ xê mi cấp tại Viện Huyết học-Truyền máu-Bệnh viện Bạch
Mai cho thấy tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp là 32,1% trong số các bệnh máu tới khám
và điều trị tại Viện [15].
10
Năm 2006, Nguyễn Hữu Toàn và cộng sự đã có những báo cáo về tiên lượng
trong bệnh AML nhưng chưa đề cập tới tiên lượng của bệnh nhân có đột biến gen
FLT3 [17].
Năm 2008, Trần Thị Phương Túy và cộng sự khi nghiên cứu giá trị dấu ấn
miễn dịch trong chẩn đoán phân loại lơ xê mi cấp tại Bệnh viện trung ương Huế cho
thấy tỷ lệ mắc bệnh là 38,7% [22].
Năm 2010, Nguyễn Triệu Vân và cộng sự cho thấy tỷ lệ mắc bệnh lơ xê mi cấp
cũng tăng theo từng năm trong đó AML chiếm là 63,7% trong lơ xê mi cấp [23].
Bạch Quốc Khánh và cộng sự khi nghiên cứu tình hình bệnh máu đến khám và điều
trị tại Viện Huyết học -Truyền máu TW giai đoạn 2010-2012 cho thấy tỷ lệ lơ xê mi cấp
chiếm 41,5% trong tổng số bệnh nhân đến khám mới tại Viện [7].
Các kết quả thống kê trên đây cho thấy có sự gia tăng của tỷ lệ bệnh nhân lơ xê mi
cấp trong những năm gần đây. Một trong các nguyên nhân của sự gia tăng này có thể liên
quan đến việc áp dụng các kỹ thuật cao trong việc chẩn đoán phân loại bệnh AML.
1.3. Một số nguyên nhân gây bệnh AML
Cho đến nay nguyên nhân gây bệnh AML chưa được xác định một cách rõ ràng,
nhưng người ta vẫn đề cập đến một số yếu tố bệnh cảnh có liên quan đến bệnh AML.
1.3.1.Yếu tố di truyền
Yếu tố gia đình: Có rất nhiều thông báo về tình trạng mắc bệnh lơ xê mi cấp
trong một gia đình. Khả năng mắc bệnh ở những gia đình có người bị bệnh ung thư
tăng gấp 3 lần so với gia đình không có người bị bệnh. Nghiên cứu của Phạm
Quang Vinh cũng cho thấy bệnh nhân và con của bệnh nhân cùng mang một loại

đột biến nhiễm sắc thể [25,26].
Yếu tố di truyền: một số thể bệnh bẩm sinh di truyền như hội chứng Down,
Fanconi, Klinefelter… là những nguyên nhân để bệnh nhân mắc tỷ lệ ung thư máu
rất cao. Nguyên nhân có thể là do cấu trúc nhiễm sắc thể không bền vững rất dễ tổn
thương làm cho nhóm đối tượng này dễ phát sinh bệnh AML.
1.3.2. Yếu tố môi trường
- Tiếp xúc với môi trường độc hại như thuốc trừ sâu, dioxin, benzen, hóa chất đột
11
biến gen như ethidium bromide…làm cho nguy cơ xuất hiện lơ xê mi cấp ngày càng tăng.
- Các tia bức xạ ion hóa làm cho đột biến nhiễm sắc thể dẫn đến ung thư máu. Ví
dụ những cư dân Nhật Bản sống sót tại vụ nổ bom Hiroshima và Nagazaki mắc ung thư
cao gấp nhiều lần so với người khác. Tương tự như vậy vụ nổ nhà máy điện tử hạt nhân
Chernobyl tại Nga cũng là nguyên nhân làm gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh về ung thư.
1.3.3. Virus
Cho tới nay các nhà khoa học chưa tìm thấy được mối liên quan nào giữa virus
và bệnh lơ xê mi cấp. Tuy vậy một số công trình nghiên cứu thực nghiệm cho thấy
có mối liên quan một số virus như Epstein Barr virus (EBV) gây ung thư vòm họng,
Human Papilloma virus (HPV) gây ung thư tử cung và Human T-Cell
Lymphotrophic virus1, 2 (HTLV-1, 2) gây ung thư lơ xê mi dòng T lympho.
1.3.4. Bất thường về nhiễm sắc thể
Trong lơ xê mi thường gặp hiện tượng chuyển đoạn từ một nhiễm sắc thể này
tới một nhiễm sắc thể khác tạo nên một sự sắp xếp mới, chuyển phần promoter của
gen này nối với phần cấu trúc của gen khác làm cho gen được phiên mã, đảo đoạn
có thể trong cùng một nhiễm sắc thể hoặc nhiễm sắc thể khác, mất đoạn, lặp đoạn
đấy là những nguyên nhân thường gặp (hình 1.5).
Hình 1.5. Hình ảnh nhiễm sắc thể bị mất đoạn và thêm đoạn
12