Nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến trên gen CYP11B1 ở người bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
o0o




LUẬN VĂN THẠC SĨ



NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN
TRÊN GEN CYP11B1
Ở NGƢỜI BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG THẬN BẨM SINH



Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60420114



Học viên: Nguyễn Thu Hiền

Lớp: K15-Sinh học

GVHD: TS. Nguyễn Huy Hoàng

Hà Nội, tháng 10 năm 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC VIẾT TẮT i
DANH MỤC HÌNH ii
DANH MỤC BẢNG iv

MỞ ĐẦU 1
I. TỔNG QUAN 3
1.1. Hormone tuyến thƣợng thận 3
1.1.1. Tuyến thượng thận 3
1.1.2. Q 4
1.1.3. Điều hòa hoạt động steroid hydroxylase 7
1.2. Cytochrome P450 8
1.2.1. Vai trò và chức năng 8
1.2.2. Cấu trúc không gian cytochrome P450 10
1.3. Gen CYP11B1 11
1.3.1. Cấu trúc và chức năng 11
1.3.2. Cấu trúc không gian của CYP11B1 12
1.4. Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh (TSTTBS) 14
1.4.1. Khái niệm 14
1.4.2. Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11β-hydroxylase 14
1.4.2.1.Cơ chế gây bệnh 14
1.4.2.2. Biểu hiện lâm sàng 15
1.4.2.3. Cơ sở di truyền 16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.4.3. Tăng sản thượng thận bẩm sinh do nguyên nhân khác 16
1.5. C 18
1.5.1. Chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh 18
1.5.2. Điều trị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 19
1.6. Tình hình nghiên cứu 20
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Vật liệu nghiên cứu 26
2.1.1. Bệnh nhân 26
2.1.2. Hóa chất 26
2.1.3 Thiết bị 28
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 28
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 28
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose 28
2.2.3. Đo quang phổ DNA 29
2.2.4. Nhân gen bằng kĩ thuật PCR 29
30
2.2.6. Giải trình tự gen tự động trên máy 30
2.2.7. Tạo đột biến điểm trực tiếp (Site-directed mutagensis) 31
2.2.8. Biểu hiện trong tế bào COS-1 và phân tích hoạt tính enzyme 31
2.2.9. Phân tích trình tự gen trên phần mềm tin học 32
PHẦN III: KẾT QUẢ 33
3.1. Tách DNA tổng số 33
3.2. Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA bằng quang phổ kế 34
3.3. Khuếch đại đoạn gen CYP11B1 35


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3.4. Phân tích ảnh hƣởng của đột biến trên gen CYP11B1 ở bệnh nhân 38
3.4.1. Bệnh nhân 01 38
3.4.1.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh 38
3.4.1.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến 39
3.4.1.3. Biểu hiện của đột biến trong tế bào động vật 40
3.4.2. Bệnh nhân 02 42
3.4.2.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh 42
3.4.2.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến 43
3.4.2.3. Biểu hiện của đột biến trong tế bào động vật 44
3.4.3. Bệnh nhân 03 46
3.4.3.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh 46
3.4.3.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến 47
3.5. Phân tích cấu trúc 48
3.5.1. So sánh trình tự amino acid của CYP11B1 48
3.5.2. Mô hình cấu trúc 3D của các đột biến điểm trên CYP11B1 53
3.5.2.1. Mô hình cấu trúc không gian của CYP11B1 53
3.5.2.2. Đột biến R51K 54
3.5.2.3. Đột biến E147D 55
3.5.2.4. Đột biến N152K 56
IV. THẢO LUẬN 58
V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66
4.1. Kết luận 66
4.2. Kiến nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỞ ĐẦU

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) (Congenital Adrenal Hyperplasia –
CAH) là một nhóm các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đặc trưng bởi sự thiếu
hụt một trong số các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp hormone của vỏ thượng
thận. Trong đó, thiếu hụt 21-hydroxylase chiếm 90-95%, 11β-hydroxylase chiếm từ 5-
8% các trường hợp trẻ đẻ sống và rất hiếm gặp trường hợp thiếu hụt 3β-hydroxysteroid
dehydrogenase. Bệnh TSTTBS là bệnh di truyền với các dấu hiệu suy thượng thận cấp
có thể dẫn đến tử vong ở thể mất muối hay trẻ có các biểu hiện nam tính hoá ở trẻ gái,
giả dậy thì sớm ở trẻ trai… gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển chiều cao, chức
năng sinh dục, sinh sản và tâm lý.
Hiện nay, sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và kỹ thuật sinh học
phân tử nói riêng đã góp phần quan trọng đưa đến nhiều thành công trong lĩnh vực
nghiên cứu các bệnh di truyền người. Phân tích đột biến gen CYP21A2 mã hóa cho 21-
hydroxylase và đột biến gen CYP11B1 mã hóa 11β-hydroxylase có vai trò quan trọng
trong việc khẳng định chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh TSTTBS. Sự kết hợp giữa
chẩn đoán phân tử, lâm sàng và hóa sinh sẽ giúp cho bác sĩ hoặc những người tư vấn di
truyền có một cái nhìn toàn diện, tổng quát về tình trạng của bệnh nhân, giúp định
hướng cho việc chỉ định điều trị bằng liệu pháp hormone thay thế suốt đời.
Trong những năm gần đây, tại các bệnh viện ở Việt Nam, số lượng các bệnh
nhân, đặc biệt các bệnh nhi, có hiện tượng TSTTBS ngày càng xuất hiện nhiều hơn.
Hiện nay, tại một số bệnh viện và cơ sở nghiên cứu trong nước đã bắt đầu sử dụng kỹ
thuật sinh học phân tử để phát hiện các đột biến gen gây bệnh TSTTBS. Tuy nhiên, các
nghiên cứu chỉ chủ yếu phát hiện đột biến trên gen CYP21A2 bằng cách lọc các đột
biến thường gặp bằng kỹ thuật MLPA.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Xuất phát từ các lý do trên đây, luận văn “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG
CỦA ĐỘT BIẾN TRÊN GEN CYP11B1 Ở NGƢỜI BỆNH TĂNG SẢN THƢỢNG
THẬN BẨM SINH” được tiến hành với những nội dung:
- Xác định đột biến trên gen CYP11B1 ở bệnh nhân và gia đình bệnh nhân

có hiện tượng tăng sản thượng thận bẩm sinh.
- Xác định mức độ ảnh hưởng của đột biến lên hoạt tính của enzyme 11β
hydroxylase
Từ đó, đánh giá mối tương quan giữa kiểu hình và kiểu gen của đột biến trên
gen CYP11B1.













Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

I. TỔNG QUAN
1.1. Hormone tuyến thƣợng thận
1.1.1. Tuyến thƣợng thận
Tuyến thượng thận gồm hai tuyến nhỏ hình tam giác nằm ở cực trên hai thận. Ở
trẻ em, cân nặng trung bình mỗi tuyến là 4 gram, gồm hai phần: phần vỏ và phần tủy,
khác nhau về bào thai học, sinh hoá học và chức năng. Phần vỏ có ba vùng: vùng cầu
(vùng glomerulosa), vùng bó (vùng fasciculata) và vùng lưới (vùng reticularis) (Hình
1.1).

Hình 1.1: Vị trí và cấu tạo tuyến thƣợng thận [9]

Vỏ tuyến thượng thận sản xuất ra một phức hệ nhiều steroid hormone bao gồm
glucocorticoid, mineralocorticoid, androgen (hormone sinh dục nam giới) và estrogen
(hormone sinh dục nữ giới). Tuyến này bao bọc xung quanh lõi thượng thận và bao
gồm nhiều vùng sản xuất ra các steroid khác nhau (Hình 11). Do được tổng hợp từ
cholesterol, các hormone vỏ thượng thận đều có bản chất là steroid và được gọi là
corticosteroid hay corticoid (xuất phát từ chữ cortex nghĩa là vỏ). Mặc dù có cùng
nguồn gốc và bản chất, những thay đổi về cấu trúc hoá học gồm thay đổi các gốc hoá
học và các vị trí liên kết carbon đã tạo nên các nhóm corticoid có tác dụng sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

khác nhau. Người ta đã chiết xuất được trên 50 dẫn xuất corticoid và chia làm ba
nhóm:
Hormon chuyển hoá muối (mineralocorticoid), tổng hợp ở vùng cầu.
Hormon chuyển hoá đường (glucocorticoid), tổng hợp ở vùng bó.
Hormon sinh dục nam (androgen), tổng hợp ở vùng lưới.
Cortisol là thành phần chính của glucocorticoids, tham gia vào quá trình chuyển
hóa năng lượng và đáp ứng các stress của cơ thể.
1. ợp các steroid hormone ở tuyến thƣợng thận
Steroid hormone, trong đó có hormone vỏ thượng thận, được tổng hợp nhờ sự
tham gia trực tiếp của một chuỗi các enzyme. Phản ứng hydroxyl hoá giữ vai trò quan
trọng trong sự tổng hợp cholesterol từ acetate cũng như quá trình chuyển hoá
cholesterol thành steroid hormone và muối mật. Vì vậy, các enzyme tham gia tổng hợp
hormone vỏ thượng thận là những enzyme xúc tác quá trình hydorxyl hoá, gọi chung là
các hydroxylase. Trừ enzyme 3β- hydroxysteroid dehydrogenase (3β- HSD), các
enzyme tổng hợp corticoid đều thuộc họ protein cytochrom P-450, viết tắt là CYP bao
gồm: CYP11A1 (chuỗi cholesterol bị phân cắt ra làm nhiều mảnh nhỏ, còn gọi là
cytochrome P450 hoặc P450scc), CYP17 (17α-hydroxylase/ 17,20-lyase or P450c17),
CYP21A2 (21-hydroxylase cytochrome P450 hoặc P450c21), CYP11B1 (11β-
hydroxylase hoặc P45011β), CYP11B2 (aldosterone synthase hoặc P450aldo), và

CYP19 (aromatase hoặc P450aom) [36] (Hình 1.2).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


1.2 vỏ [10, 13]
, được gọi
là steroid 27-carbon. Các mô tế bào steroidogenic có thể tổng hợp cholesterol bằng
phương pháp de novo từ muối acetate, muối axetat này có thể làm biến đổi những este
nội bào của cholesterol, hoặc nhận lipoprotein từ huyết thanh. Trong quá trình tổng hợp
steroid hormone tuyến thượng thận, cholesterol được chuyển đổi thành steroid
hormone hoàn chỉnh nhờ sự xúc tác trung gian của các enzyme cytochrome P450 trong
ty thể và lưới nội chất. Quá trình tổng hợp bắt đầu xảy ra trong ty thể, tiếp tục trong
lưới nội chất, và hoàn tất trong ty thể. Do đó, dạng tiền chất của steroid hormone nằm ở
giữa ty thể và các ngăn của tế bào chất là rất quan trọng trong quá trình tổng hợp các
hormone tuyến thượng thận.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Quá trình tổng hợp steroid hormone bị giới hạn bởi sự vận chuyển cholesterol từ
ngoài vào trong màng ti thể và vùng hoạt động của CYP11A1 (chuỗi 20, 22-
hydroxylase cholesterol). Trong quá trình tổng hợp steroid hormone, cholesterol được
tập trung lại và đưa đến trung tâm hoạt động của CYP11A1, nơi trực tiếp liên kết với
vùng bên trong màng ty thể. Các protein sẽ có nhiệm vụ thực hiện sự vận chuyển này
có tên là protein điều hòa steroidgenic [66]. Các pregnenolone sau đó đi từ ty thể đến
lưới nội chất để tiếp tục các quá trình chuyển hóa tiếp theo. Mặt khác, pregnenolone
còn có thể được chuyển đổi trực tiếp thành progesterone nhờ 3β-hydroxysteroid
dehydrogenase (3βHSD). , pregnen
17α-hydropregnenolone nhờ 17α-hydroxylase (CYP17) để sản
xuất ra 17α-hydroxypregnenolone. Sau đó, 17α-hydroxypregnenolone sẽ được 3βHSD

biến đổi thành 17α-hydroxyprogesterone hoặc steroid C19, dehydroepiandrosterone
nhờ xúc tác 17,20 lyase từ CYP17. Bên cạnh đó, dehydroeiandrosterone (DHEA) được
3βHSD biến đổi thành androstenedione tham gia vào cấu tạo các tiền chất của hormone
giới tính. P - - -
21 để sản xuất ra lần lượt 11-deoxycorticosterone và
11- deoxycortisol. Những sản phẩm này của CYP21A2 sau đó được đưa trở lại vào ty
thể, nơi bước cuối cùng của quá trình tổng hợp steroid hormone trong lớp vỏ tuyến
thận diễn ra. Hai đồng phân CYP11B là 11β-hydroxylase/aldosterone synthase
(CYP11B2) và 11β-hydroxylase (CYP11B1), làm xúc tác cho quá trình chuyển hóa
deoxycorticosterone và 11-deoxycortisol lần l
, vùng cầu, sản xuất ra
mineralocorticoid aldosterone bền vững từ deoxycorticosteone nhờ sự xúc tác của
CYP11B2. Một sự khác biệt về enzyme ở giữa vùng cầu và vùng bó là sự vắng mặt của
CYP17 tại vùng cầu. cầu có xu hướng biểu hiện ra
CYP11B2. Tại vùng lưới, androstenedione được chuyển đổi thành testosterone và
esterone/estradiol nhờ 17β-ketosteroid reductase (17βHSD) và 19-hydroxylase

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

(CYP19). Trong cơ thể người, cortisol được sản xuất ra với số lượng lớn hơn so với
aldosterone và chiếm khoảng 80% lượng glucocorticoid. Androgen, DHEA và
androstenedione, được sản xuất ra tại vùng lưới, được chuyển hóa thành testosterone
hoặc estrogen bở
ra corticosterone (ví dụ như loài chuột và những loài gặm nhấm khác) có tương đối ít
hormone giới tính do nguyên nhân từ tuyến thượng thận [24, 40, 66].
1.1.3. Điều hòa hoạt động steroid hydroxylase
Quá trình tổng hợp adrenocorticosreroid được điểu khiển bởi vùng dưới đồi và
tuyến yên trước (Hình 1.3). Vùng dưới đồi điều khiển sản xuất ra hormone sinh
corticotropin (CRH) vào trong tĩnh mạch máu, từ đó máu sẽ đi vào tuyến yên. CRH
kích thích tuyến yên sản sinh ra adrenocorticotropin (ACTH) vào trong trong hệ thống

lưu thông máu. ACTH lại kích thích tuyến thượng thận chuyển đổi cholesterol thành
pregnenolone. Pregnenolone sau đó sẽ tạo thành glucocorticoid, hormone giới tính và
aldosterone lần lượt ở trong reticularis, fasciculata và glomerulosa. Thêm vào đó,
angiotensin II và ion K
+
ở nồng độ cao kích thích tạo thành aldosterone synthase
(CYP11B2) trong vùng glomerulosa để tạo thành aldosterone. Ngược lại,
glucocorticoid và androgen ức chế sự hình thành hoạt tính của CRH ở vùng não điều
khiển và ngăn cản sự tạo thành ACTH ở tuyến yên. Trong khi đó, aldosterone không
gây ức chế sự sản sinh ra ACTH và CRH như những hormone trên.
Sự tổng hợp cortisol được kiểm soát căn bản bởi ACTH [61]. ACTH hoạt động
thông qua một G protein có 2 điểm thụ cảm đặc trưng ở trên bề mặt của tế bào tuyến
thượng thận để tăng lượng cAMP (adenosine 3’, 5’ monophotphate) [50]. AMP tuần
hoàn có một tác động ngắn vừa phải (vài phút đến vài giờ) đến sự vận chuyển
cholesterol vào trong ty thể để tăng cường sự tổng hợp protein điều hòa hoạt động
steroidogenic (StAR) [58]. Mức độ tăng cao của cAMP nội bào có một sự tác động dài

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

hơn (nhiều giờ đến vài ngày) lên sự dịch mã của gen mã hóa enzyme cần thiết cho sự
tổng hợp cortisol bao gồm CYP11B1 [60], và ưu tiên biểu hiện mRNA của CYP11B1
hơn so với CYP11B2 [31, 32].

Hình 1.3: Quá trình điều hòa hoạt động 11β-hydroxylase (CYP11B1)
1.2. Cytochrome P450
1.2.1. Vai trò và chức năng
Cytochrom P450 (CYP450) là một nhóm enzyme khá đa dạng, xúc tác quá trình
oxy hóa các chất hữu cơ. Nó có khả năng xúc tác nhiều phản ứng trong cơ thể như:
phản ứng hydroxy hóa, nitơ hóa, oxy hóa, sulfua hóa, epoxide, khử amin và oxy hóa
khử nitơ [27], chiếm khoảng 75% tổng số các phản ứng chuyển hóa khác nhau [14].

Các chất nền của enzyme CYP bao gồm các chất trung gian của quá trình trao đổi chất
như chất béo và kích thích tố steroid, cũng như các chất xenobiotic như các loại thuốc
và hóa chất độc hại khác. Vào năm 1991, Nebert cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu
để thành lập khóa phân loại enzyme cytochrome P450 [48]. Hệ thống phân loại này đã
sắp xếp liên họ enzyme cytochrome P450 theo sự giống nhau về trình tự của mỗi họ
enzyme và từng nhóm nhỏ, cùng với đó là theo enzyme từ mỗi loài sinh vật. Hiện nay
đã có hơn 11000 gen P450 khác nhau đã được tách dòng từ động vật, thực vật, vi nấm,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

vi khuẩn và những động vật bậc cao khác [49], tuy nhiên, các enzyme này lại không
được tìm thấy ở E. coli [11, 22]. Hiện nay, enzyme này được sử dụng trong các nghiên
cứu về nhiều lĩnh vực như: hóa sinh, y dược học, sinh lý học, hóa học nội bào, công
nghệ sinh học và môi trường [28].
Phản ứng phổ biến nhất được xúc tác bởi cytochrome P450 là một phản ứng
monooxygenase, phản ứng tạo thành oxy đơn nguyên tử hoặc oxy phân tử ở cơ chất. Ví
dụ, chèn một nguyên tử oxy vào một chất nền hữu cơ (RH), giải phóng nước:
RH + O
2
+ NAD(P)H + H
+
 ROH + H
2
O + NAD(P)
+

Hầu hết các CYPs cần một phân tử cung cấp một hay nhiều điện tử để giảm sắt
(và oxy phân tử). Cytochrome P450 hấp thu ánh sáng có bước sóng gần 450 nm khi
gắn với carbon monoxide (CO), cho ra phức hợp có màu hồng, nên chúng có tên vị trí
“sắc tố 450” hay “màu hồng 450”. Căn cứ tính chất của các phân tử chuyển điện tử

CYPs có thể được phân loại thành nhiều nhóm [16].

Hình 1.4: Những nhóm hệ thống enzyme P450. A) Hệ thống ở vi khuẩn
(nhóm Ia); B) Hệ thống ở ti thể (nhóm Ib); C) Hệ thống ở eukaryote (nhóm II) [26, 37]
Thông thường, cytochrome P450 chia làm 2 nhóm chính: nhóm enzyme ở vi
khuẩn hoặc ty thể và nhóm enzyme ở tế bào eukaryote [26]. Nhóm I liên quan đến hầu
hết hệ thống P450 ở vi khuẩn cũng như ở ty thể trong tế bào eukaryote. Chúng bao

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

gồm 3 loại protein riêng biệt: FAD - containing reductase vận chuyển những chất khử
tương ứng từ pyramide nucleotide (NADH hoặc NADPH) đến thành phần thứ hai của
hệ thống là ferredoxin và chính bản thân nó sẽ khử enzyme P450 [37]. Cả 3 loại
protein này đều ở dạng tan trong vi khuẩn (Hình1.4 A). Tuy nhiên, chỉ có có ferredoxin
là protein tan trong ty thể, trong khi đó reductase và P450 lần lượt là chất kết hợp với
màng và chất tạo ra liên kết với vùng bên trong màng tythể [26, 37].
Nhóm protein P450 thứ II rất phổ biến ở eukaryote và thể hiện những phản ứng
xúc tác cực kỳ đa dạng. Hệ thống monooxygenase của nhóm này được tìm thấy ở trong
lưới nội chất (ER) của tế bào eukaryote chứa hai protein màng chính là enzyme P450
và NADPH-dependent P450 reductase (Hình 1.4 C) và FMN, cả hai cùng thực hiện sự
chuyển những chất khử cần thiết từ NADPH đến một trong những isozyme P450.
1.2.2. Cấu trúc không gian cytochrome P450
Poulos và cộng sự đã miêu tả cấu trúc tinh thể của P450cam (CYP101) từ
Pseudomonas putida [54]. Vào đầu những năm 1990, người ta đã xác định được cấu
trúc của những cytochrome P450, tên là P450BM3 (CYP102) [55], P450terp (CYP108)
[38], P450eryF (CYP107) [29] và P450nor (CYP55) [47]. Cho đến nay, những chuyên
gia nghiên cứu cấu trúc tinh thể đã xác định được cấu trúc của một số P450 của vi
khuẩn. Sự phân tích những cấu trúc này đã cho thấy sự xác định trình tự giữa những
cytochrome P450 khác nhau thậm chí có khuynh hướng rất kém thì tất cả cytochrome
đều biểu thị là một dạng nếp gấp và hình học Topo. Nói chung, những P450 đều thể

hiện một dạng nếp gấp với việc là các liên kết đầu N- và C- cuối cùng được sắp xếp
xung quanh các heme sắt. Cấu trúc lõi của P450 gồm có 6 dạng xoắn: D, E, I, L, J và
K. Trong khi đó, cấu trúc gấp nếp β bao gồm hai dạng: gấp nếp β dạng 1 chứa 5 sợi và
cấu trúc gấp nếp β dạng 2 chứa 2 sợi. Heme sắt nằm ở giữa dạng xoắn I và L [53]. Dựa
vào sự sắp xếp của các thành viên họ CYP2C, Gotoh cho rằng 6 vùng tham gia vào
việc nhận dạng cơ chất, định rõ SRS (vùng nhận dạng cơ chất) [34]. Tại SRS-1 (xoắn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

B’), SRS-2 (carboxyl cuối của dạng xoắn F) và SRS-3 (axit amin cuối ở dạng xoắn G),
có một cấu trúc không gian biến đổi liên tục. Ngược lại, vùng SRS-4 (giữa dạng xoắn
I), SRS-5 (β6-1/β6-4) và SRS-6 (β4-hình kẹp tóc) chỉ chứa những cấu trúc không gian
giới hạn. Bên cạnh đó, những dạng trình tự đồng nhất bao gồm dạng EXXR tại liên kết
C- cuối ở dạng xoắn K, dạng CXGXXLA ở túi Cys và dạng AGXXT ở dạng xoắn I,
gồm có một vài những chất lắng lại giữa những CYP và dạng DXXXF ở dạng xoắn
K’[45].
1.3. Gen CYP11B1
1.3.1. Cấu trúc và chức năng
Tên chính thức của gen này là Cytochrome P450, họ 11, phân lớp B,
polypeptide 1 thường được viết tắt là CYP11B1. Gen CYP11B1 –
. Cụ thể, enzyme giúp chuyển đổi
một phân tử 11-deoxycortisol thành cortisol [31] đồng thời nó cũng chuyển hóa 11-
deoxycorticosterone thành corticosterone hoặc 18-hydroxy-11-deoxycorticosterone
nhưng quá trình hydroxy hóa tại vị trí 18 của corticosterone là rất thấp [2].Các quá
trình này được kích hoạt bởi hormone gọi là nội tiết tố thượng thận corticotrophic
(ACTH) do tuyến yên sản xuất. Cortisol giúp duy trì lượng đường trong máu, bảo vệ
cơ thể khỏi sự căng thẳng, ngăn chặn các tình trạng viêm nhiễm. Corticosterone được
chuyển thành các hormone aldosterone bởi các enzyme aldosterone synthase, được mã
hóa bởi gen CYP11B2. Aldosterone giúp kiểm soát huyết áp bằng cách duy trì lượng
muối và nước trong cơ thể.

Gen CYP11B1 nằm trên cánh dài của chromosome 8, tại vị trí 21, có kích thước
khoảng 7 kb, bao gồm 9 exon và 8 intron. Gen CYP11B2 độ tương đồng 93% so với
gen CYP11B1, nằm trên cánh dài của chromosome 8, giữa vị trí 21 và 22 (Hình 1.5).
Tuy 2 protein này có độ tương đồng cao nhưng trọng lượng phân tử của chúng lại khác
nhau, lần lượt là 51 kDa và 49 kDa khi chạy trên điện di SDS-PAGE [31, 50].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

CYP11B1 không thể chuyển hóa corticosterone đến aldosterone. Ngược lại, CYP11B2
có hoạt tính 11β-hydroxylase yếu hơn CYP11B1 nhưng nó lại có thể hydroxyl hóa ở vị
trí C-18 và sau đó tiếp tục 18-hydroxy corticosterone tới aldosterone. CYP11B2 có thể
chuyển hóa 11-deoxycortisol đến 18-oxocortisol. Phản ứng này không có ý nghĩa ở in
vivo vì nó không biểu hiện trong vùng fasciculata, nhưng nó lại đóng vai trò quan trọng
ở các bệnh nhân có hội chứng glucocorticoid áp chế tăng aldosterone [2].

Hình 1.5: Vị trí của CYP11B1 và CYP11B2 trên chromosome 8 [17]
1.3.2. Cấu trúc không gian của CYP11B1
Để tìm hiểu về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của CYP11B1 đòi hỏi
phải nghiên cứu về cấu trúc không gian 3D của enzyme này. Sự xác định cấu trúc
protein nhờ sự nhiễu xạ tia X-quang thường xuyên gặp phải những vấn đề trong trường
hợp protein chứa màng như CYP11B1 và CYP11B2, và sự xác định cấu trúc cộng
hưởng từ hạt nhân bị giới hạn ở các protein có kích thước nhỏ hơn. Những phương
pháp này được kiểm soát và sử dụng để phân tích dư lượng các hợp chất xác định được

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

trong quá trình nghiên cứu đột biến gen. Sự khác nhau chủ yếu của hai loại protein này
nằm trong cùng một vị trí heme nguyên tử sắt (Hình 1.6B).
A

B
Hình 1.6: A:Hình mẫu cấu trúc không gian CYP11B1 (xanh) và CYP11B2 (da
cam) [10]. B:Sự khác biệt giữa những heme sắt của hai loại protein.
Người ta đã đưa ra một góc nhìn tầm 20
0
ở giữa những heme sắt của hai protein
này, thấy rằng các vị trí heme sắt phụ thuộc vào sự tương tác giữa những chuỗi bên và
sự định hướng những sự kết nối những chu kì của nó. Trong trường hợp của CYP11B1,
một nhóm heme sắt propionat tạo thành các liên kết hydro với Arg448 và thứ hai là
tương tác với Arg348, trong khi đó ở CYP11B2, toàn bộ nhóm heme sắt propionate
đều tham gia tạo liên kết hydro ở Arg448. Cả 2 đột biến ở Arg448 và Arg348 đã được
tìm thấy trên CYP11B1 ở bệnh nhân mắc bệnh TSTTBS [30]. Tất cả những đột biến đã
được biết đến ở vị trí codon 348 và 448 đều dẫn đến sự mất hoàn toàn hoạt tính
enzyme, phần lớn có thể là do sự mất ổn định của các holoprotein. Kết quả của việc tạo
ra những liên kết hydro khác nhau xung quanh vị trí Arg348, Arg448 và nhóm heme
sắt propionate là vùng trung tâm hoạt động của CYP11B2 được cho là nhỏ hơn so với
CYP11B1. Bên cạnh đó, Ulmshneider tập trung vào nghiên cứu tương tác của chất làm
bất hoạt protein và mối quan hệ giữa cấu trúc chức năng của những chất gây ức chế đã
được phát triển sâu hơn [59]. Thêm vào đó, hình mẫu CYP11B1 của Roumen và cộng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

sự mang đến sự tìm hiểu sâu hơn đối với các vùng được lựa chọn nghiên cứu, các cấu
tử ở các enzyme và sự tương tác giữa các cấu tử này [57].
1.4. Bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh (TSTTBS)
1.4.1. Khái niệm
Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc
thể thường, được đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoạt động của một trong các enzyme cần
thiết để tổng hợp cortisol từ cholesterol của vỏ thượng thận như: 21-hydroxylase (21-
OH), 11β-hydroxylase (11-OH), 17- hydroxylase (17-OH), 3β- hydroxysteroid

dehydrogenase (3β- HSD) và 20/22 Desmolase [8]. Bệnh này thường có dấu hiệu là sự
tăng cao hơn mức bình thường hormone sinh dục đực hay còn gọi là sự nam hóa. Biểu
hiện rõ rệt nhất là sự xuất hiện cơ quan sinh dục của nam giới bên ngoài cơ quan sinh
dục của nữ giới hay cơ quan sinh dục của nam giới phát triển hơn bình thường [23].
1.4.2. Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh do thiếu hụt 11β-hydroxylase
Theo Zachmann và cộng sự, có khoảng 5-8% trường hợp TSTTBS bắt nguồn từ
sự suy giảm 11β-hydroxylase [65]. TSTTBS do thiếu hụt 11β-hydroxylase thường kết
hợp với tăng huyết áp. Nhiều trường hợp mắc CAH do suy giảm 11β-hydroxylase đã
được tìm thấy trong số những người Do thái ở Israel nhập cư từ Ma Rốc. Trong nhóm
người này, tỷ lệ mắc bệnh lên tới 1/5.000 – 1/7.000 ca mới sinh [56] so với mức bình
thường là 1/200.000 ca mới sinh [58].
1.4.2.1.Cơ chế gây bệnh
Trong quá trình chuyển hóa hormone ở tuyến thượng thận, bình thường dưới
xúc tác của 11β-hydroxylase, 11-deoxycortisol (S) và 11-deoxycorticosterone (DOC)
sẽ lần lượt được chuyển hóa một cách hiệu quả thành cortisol và corticosterone. Tuy
nhiên khi cơ thể thiếu hụt 11β-hydroxylase, DOC và S sẽ không đươc chuyển hóa dẫn
đến bị ứ đọng trong tuyến thượng thận (Hình 1.2). Chính sự ứ đọng này gây ra hiện

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

tượng tăng huyết áp ở bệnh nhân CAH, do thiếu hụt 11β-hydroxylase nên một lượng
lớn cortisol không được tạo ra. Ngoài ra, do 11-deoxycortisol bị ứ quá nhiều nên dạng
tiền chất của nó là 17-OH progesterone sẽ đi vào con đường tổng hợp androgen, dẫn
đến sự tăng cao hơn mức bình thường của hormone nam giới và sự biến dạng cơ quan
sinh dục (Hình 1.2). Như vậy, có thể nói biểu hiện rõ rệt nhất của tăng sản thượng thận
bẩm sinh do thiếu hụt 11β-hydroxylase là hiện tượng huyết áp và hormone nam giới ở
bệnh nhân tăng cao.
1.4.2.2. Biểu hiện lâm sàng
Tăng huyết áp là sự rối loạn phổ biến ở bệnh nhân CAH do suy giảm 11β-
hydroxylase, tuy nhiên huyết áp lại tăng không đồng nhất ở trong những nhóm những

bệnh nhân cụ thể. Những nhóm bệnh nhân có thể được xác định dựa trên nền tảng
những phản ứng kích thích steroid hormone và kích thích sinh học. Những nhóm này
xuất hiện những triệu chứng như suy giảm renin và không có yếu tố điều hòa steroid
hormone. Người ta ước tính rằng khoảng 2/3 bệnh nhân thiếu hụt 11β-hydroxylase có
biểu hiện huyết áp tăng cao [56], triệu chứng này thường xuất hiện ngay ở những năm
đầu đời [65]. Trong khi đó, sự thiếu hụt cortisol dẫn đến tăng huyết áp
mineralocorticoid có thể liên quan đến những vấn đề về đường võng mạc, hơn 1/3 bệnh
nhân có biểu hiện sự to lên của bộ não và số người tử vong do đứt mạch máu não đã
được nêu ra [35, 56]. Những dấu hiệu khác của sự tăng cao mineralocorticoid như hạ
kali trong máu và cơ bắp yếu hoặc chuột rút có thể xảy ra ở đa số bệnh nhân nhưng lại
không ảnh hưởng đến huyết áp. Hoạt tính renin trong huyết thanh thường bị ức chế khi
trẻ lớn tuổi hơn và mức độ aldosterone thường ở mức thấp mặc dù khả năng tổng hợp
aldosterone không thật sự bị kìm hãm [62].
Đối với hiện tượng tăng cao hormone nam giới, những bé gái có triệu chứng
thiếu hụt 11β-hydroxylase, sinh ra có biểu hiện đực hóa, dương vật xuất hiện bên ngoài
cơ quan sinh dục. Nguyên nhân của nó là do có sự tiết quá nhiều androgen trong thận

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

trong suốt quá trình hình thành phôi và thai nhi. Trái ngược với cơ quan sinh dục bên
ngoài, cấu trúc tuyến sinh dục bên trong hoàn toàn bình thường, như cơ thể bé gái vẫn
có tử cung, âm đạo và buồng trứng. Sự phát triển nhanh chóng tế bào soma ở lúc còn
nhỏ cùng với sự phát triển xương nhanh trước tuổi dẫn đến sự kết thúc sớm của xương
đỉnh não, và tầm vóc người lớn thấp bé là những dấu hiệu của việc thừa hormone nam
giới ở những bé trai và bé gái mới sinh. Thêm vào đó, những em bé bị những ảnh
hưởng trên có thể dẫn đến sự kết thúc sớm sự phát triển giới tính [52]. Những bệnh
nhân với sự suy giảm một phần 11β-hydroxylase sinh ra với cơ quan sinh dục bên
ngoài bình thường nhưng vẫn có những dấu hiệu và triệu chứng của việc thừa hormone
sinh dục đực ví dụ phụ nữ trưởng thành có thể biểu hiện của sự rậm lông và kinh
nguyệt ít.

1.4.2.3. Cơ sở di truyền
TSTTBS do thiếu hụt enzyme 11-OH là bệnh di truyền lặn do đột biến gen trên
NST thường. Khả năng sinh con bị bệnh là 25% và sinh con dị hợp tử mang gen bệnh
lặn là 50%. Những người dị hợp tử này rất khó phát hiện và là người truyền gen bệnh
cho các thế hệ tiếp theo. Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh như nhau. Bệnh xảy ra không liên
tục, ngắt quãng qua các thế hệ. Sự kết hôn trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập
làm tăng khả năng sinh con bệnh và tăng tần số người mang gen bệnh lặn trong quần
thể.
1.4.3. Tăng sản thƣợng thận bẩm sinh do nguyên nhân khác
TSTTBS do thiếu hụt 21- hydroxylase
Đây là nguyên nhân chính chiếm 90 – 95% nguyên nhân gây bệnh TSTTBS
[19]. Sự thiếu hụt hoạt động của 21-OH dẫn đến sự thiếu hụt cortisol và/ hoặc thiếu hụt
aldosterone cũng như thừa androgen thượng thận. Trẻ gái có biểu hiện nam hoá bộ
phận sinh dục ngoài và tình trạng giả dậy thì sớm ở trẻ trai. Ở thể mất muối, bệnh nhân
có các triệu chứng lâm sàng tương tự như thể nam hoá đơn thuần, và có kèm theo thiếu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

hụt aldosterone ở trẻ sơ sinh. Nếu không được điều trị sớm, bệnh nhân có thể tử vong
do cơn suy thượng thận cấp.
TSTTBS do thiếu hụt cholesteron desmolase
TSTTBS do thiếu cholesteron desmolase còn được gọi là hội chứng Prader
Gurtner. Trong hội chứng này, do thiếu desmolase, cholesterol không chuyển được
thành pregnenolon nên sự tổng hợp của cả ba loại steroid là mineralocorticoid,
glucocorticoid và androgen đều giảm.
Sau khi ra đời, trẻ bị suy thượng thận với biểu hiện mất muối, mất nước và truỵ
mạch. Trẻ trai có bộ phận sinh dục ngoài giống như trẻ gái. Đây là bệnh hiếm gặp, có
tỷ lệ tử vong cao.
TSTTBS do thiếu hụt 17α- hydroxylase (17-OH)
TSTTBS do thiếu 17α- hydroxylase còn được gọi là hội chứng Biglieri. Trong

hội chứng này, do thiếu 17-OH, pregnenolon không chuyển được thành 17-
hydroxypregnenolon và progesteron không chuyển được thành 17 hydroxyprogesteron
nên sự tổng hợp glucocorticoid và androgen giảm. Trong khi đó đường sinh tổng hợp
mineralocorticoid không bị gián đoạn nên sự sản xuất các steroid trong đường đó tăng
lên.
Bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng cao huyết áp và giả ái nam ái nữ ở trẻ trai. Đây
là bệnh hiếm gặp, có thể điều trị được bằng hormone glucocorticoid.
TSTTBS do thiếu hụt 3β- hydroxysteroid dehydrogenase
TSTTBS do thiếu hụt 3β- hydroxysteroid dehydrogenase còn được gọi là hội
chứng Bongiovani. Do thiếu enzyme này, sự tổng hợp các steroid có liên kết đôi Delta
4 giảm, gây giảm tổng hợp glucocorticoid, mineralocorticoid và androgen, trong khi
đó, sản xuất DHA và androstendiol Delta 5 tăng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Trẻ trai có biểu hiện dị dạng bộ phận sinh dục ngoài như tật lỗ đái thấp và
không có bìu. Trẻ gái có thể phì đại âm vật và môi lớn dính giống bìu. Đôi khi có
trường hợp có kèm theo biểu hiện mất muối. Đây là bệnh hiếm gặp, có thể điều trị
được bằng hormone glucocorticoid.
TSTTBS do thiếu hụt 18- dehydrogenase
TSTTBS do thiếu hụt enzyme 18- dehydrogenase còn được gọi là hội chứng
Olick. Do thiếu enzyme này, corticosterone không chuyển được thành aldosterone gây
hội chứng mất muối trên lâm sàng. Đây là bệnh hiếm gặp và có thể điều trị được bằng
hormone mineralocorticoid.
1.5. C và điều trị
1.5.1. Chẩn đoán tăng sản thƣợng thận bẩm sinh
:
Khi thiếu enzyme, một hay nhiều đường tổng hợp hormone bị tắc nghẽn và
hormone dưới chỗ tắc không được sản xuất đủ, đặc biệt là cortisol, qua cơ chế điều
hoà, kích thích tuyến yên sản xuất và bài tiết ACTH gây tăng sản tuyến thượng thận,

kích thích các tế bào chứa melanin tạo sắc tố đen vì trong phân tử ACTH có 13 acid
amin đầu giống hormone kích thích tế bào sắc tố (Melanocyte Stimulating Hormone -
MSH), tăng ứ đọng các tiền chất (precussor) trên chỗ tắc dẫn đến tăng sản xuất các
hormone ở đường tổng hợp không bị tắc.
, người ta
đã dựa chủ yếu và định lượng trong máu ba sản phẩm cuối của ba đường tổng hợp
hormone vỏ thượng thận là aldosterone, cortisol và testosterone cùng các chất chuyển
hoá trong nước tiểu. Nhưng sự thay đổi ba loại hormone này còn xảy ra trong cả bệnh
TSTTBS do rối loạn các enzyme khác. Nồng độ aldosterone và cortisol giảm trong cả
bệnh Addison hay trong bệnh suy tuyến yên toàn bộ, và nồng độ testosterone tăng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

trong cả các bệnh gây dậy thì sớm khác như u tuyến yên, u vỏ thượng thận nam hoá
hay u tinh hoàn. Thêm vào đó, việc thu thập nước tiểu 24 giờ để định lượng các chất
chuyển hoá đối với trẻ sơ sinh hoặc bệnh nhi đang trong cơn suy thượng thận thường
gặp nhiều trở ngại vì không lấy hết được nước tiểu và phải tiêm hydrocortison ngay. Vì
vậy, kết quả thu được nhiều khi không chính xác. Trong đó, mức độ tăng cao của 17-
OHP là nguy cơ tiềm tàng dẫn đến TSTTBS.
:
Từ giữa những năm 80, khi kỹ thuật phản ứng khuếch đại gen (Polymerase
chain reaction- PCR) ra đời, các nghiên cứu về DNA trong sinh học phân tử nói chung
và y học nói riêng có những bước tiến nhảy vọt. Ưu điểm của phương pháp phân tử
được áp dụng trong Y sinh học là nhanh, nhạy và chính xác, có thể phân tích gen từ
một lượng DNA rất nhỏ. Đặc biệt trong chẩn đoán trước sinh, sử dụng các kỹ thuật
sinh học phân tử chẩn đoán có độ chính xác cao, tránh tình trạng nhiễm máu của mẹ
dẫn đến kết quả chẩn đoán không chính xác. Một số phương pháp sinh học phân tử
được áp dụng phổ biến trong chẩn đoán bệnh TSTTBS như phương pháp MLPA, PCR,
giải trình tự và sâu hơn nữa là phương pháp tạo đột biến điểm trực tiếp, biểu hiện trong
tế bào động vật, phân tích hoạt tính enzyme.

1.5.2. Điều trị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh [6]
TSTTBS là bệnh kéo dài suốt đời, không có cách nào chữa trị hoàn toàn. Không
thể thay thế enzyme và phẫu thuật não hoặc phẫu thuật tuyến thượng thận cũng không
giúp được gì. Tuy nhiên, có thể thay thế hay bổ sung các hormone bị thiếu – tức là
cortisol và hormone giữ muối bằng cách uống thuốc. Các loại thuốc này cần duy trì
hàng ngày, suốt đời, kể cả khi trẻ có thể hoàn toàn khỏe mạnh.
Một số loại thuốc như hydrocortisone, cortisone, prednisolone, dexamethasone
có thể thay thế hormone cortisol. Tuy nhiên, mỗi loại thuốc này có công hiệu và thời

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

gian tác dụng khác nhau. Hydrocortisone có công hiệu tương tự cortisone và thời gian
tác dụng ngắn, là loại thuốc nên dùng nhất cho trẻ bị TSTTBS. Trong khi đó
prednisolone có công hiệu mạnh hơn gấp 5 lần còn dexamethasone mạnh gấp 40-80 lần
cortisone và có thời gian tác dụng dài hơn. Dexamethosone thường không áp dụng cho
trẻ đang tăng trưởng do công hiệu quá lớn và thời gian tác dụng kéo dài (24-48 giờ), có
khả năng gây cản trở đến sinh trưởng của trẻ. Tuy nhiên, khi trẻ đã đạt chiều cao bình
thường của người lớn thì thuốc này lại có hiệu quả rất tốt, giúp kiểm soát bệnh 24/24
giờ. Nếu cần thêm hormone giữ muối bệnh nhân có thể dùng thêm fludrocortisone.
Liều dùng thuốc chính xác để điều trị CAH thay đổi tùy từng trẻ, tùy theo khổ
người, khả năng hấp thụ của ruột và nhân tố khác. Liều dùng thuốc do bác sĩ xác định
riêng cho từng người, dựa trên kết quả xét nghiệm lâm sàng và hóa sinh thường xuyên,
kết hợp với theo dõi lâm sàng sự tăng trưởng của trẻ, sự phát triển và huyết áp. Khi trẻ
lớn lên, liều dùng sẽ tăng lên.
1.6. Tình hình nghiên cứu
Tình hình nghiên cứu trên thế giới
-
-
.
Đột biến trên gen CYP11B1- Arg448His, gây bệnh TSTTBS lần đầu tiên được

miêu tả vào năm 1991 bởi White và cộng sự [62]. Hiện nay đã có nhiều đột biến trên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

gen CYP11B1 được tìm thấy nhờ phương pháp PCR và đọc trình tự. Tính đến nay đã
có hơn 60 đột biến mới được xác định và công bố trên thế giới [7]. Rất nhiều đột biến
điểm được tìm thấy ở bệnh nhân mắc bệnh CAH đã gây ra những sự rối loạn chức năng
của 11β-hydroxylase khi biểu hiện đột biến trên nuôi cấy tế bào (bảng 1.9).

Hình 1.7: Đột biến trên gen CYP11B1
Gần đây, Zhang M. và cộng sự khi nghiên cứu ở chín bệnh nhân có biểu hiện
bệnh TSTTBS do đột biến trên CYP11B1 đã phát hiện đột biến phổ biến p.R454C và
ba đột biến mới p.V148G, IVS7-9C> A, c.1359_1360insG. Khi nghiên cứu về mức độ
biểu hiện của các đột biến cho thấy các p.R141X, p.V148G, c.1359_1360insG và đột
biến p.R454C chỉ biểu hiện 4,9%, 3,9%, 3,7%, 4,5% hoạt tính enzyme [67].