Đề cương NCKH đáp ỨNG của tế bào đa NĂNG dây CHẰNG NHA CHU đối với vật LIỆU CALCIUM SILICATE CEMENT (BIODENTINETM) SO với AMALGAM NGHIÊN cứu IN VITRO

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
*********
ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
ĐÁP ỨNG CỦA TẾ BÀO ĐA NĂNG DÂY CHẰNG NHA
CHU ĐỐI VỚI VẬT LIỆU CALCIUM SILICATE CEMENT
(BIODENTINE
TM
) SO VỚI AMALGAM NGHIÊN CỨU IN
VITRO
CHUYÊN NGHÀNH: RĂNG HÀM MẶT
MÃ SỐ: 60 06 01
Người thực hiện: TRẦN NGỌC NHƯ Ý
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NĂM 2015
2
MỤC LỤC
Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục từ viết tắt
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 CƠ SỞ CỦA SỰ LÀNH THƯƠNG MÔ NHA CHU 4
1.1.1 Cấu tạo mô nha chu 4
1.1.2 Cấu tạo và chức năng của dây chằng nha chu 5
1.1.2.1 Cấu tạo của dây chằng nha chu 5
1.1.2.2 Chức năng của dây chằng nha chu 6
1.1.3 Những nghiên cứu về vai trò của tế bào dây chằng nha chu trong lành
thương mô nha chu 6
1.2 TẾ BÀO GỐC 8

1.2.1 Khái niệm tế bào gốc 8
1.2.2 Đặc tính tế bào gốc 8
1.2.3 Phân loại tế bào gốc 8
1.2.4 Tế bào gốc trung mô 9
3
1.2.4.1 Khái niệm tế bào gốc trung mô 9
1.2.4.2 Hình thái tế bào gốc trung mô 9
1.2.4.3 Một số tế bào gốc trung mô 9
1.2.4.4 Tế bào đa tiềm năng dây chằng nha chu người 10
1.3 QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU SINH HỌC 11
1.3.1 Tính tương hợp sinh học 11
1.3.2 Sự gây độc tế bào 12
1.3.3 Các phương pháp thử nghiệm 12
1.3.3.1 Thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp 12
1.3.3.2 Thử nghiệm sự khuếch tán qua agar 12
1.3.3.3 Thử nghiệm dịch chiết 13
1.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 14
1.4.1 Biodentine (Calcium silicate cement) 14
1.4.1.1 Thành phần cấu tạo 14
1.4.1.2 Tính chất vật liệu 15
1.4.1.3 Những nghiên cứu về độc tính của Biodentine trong nha khoa 16
1.4.2 Amalgam 18
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20
4
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 21
2.2.2 Phương tiện nghiên cứu 21
2.2.2.1 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 21
2.2.2.2 Hoá chất 21

2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu 22
2.2.3.1 Cấy chuyển và xác định mật độ tế bào 22
2.2.3.2 Chuẩn bị vật liệu tạo giá thể 25
2.2.3.3 Phương pháp đánh giá độc tính in vitro của vật liệu đối với tế bào dây
chằng nha chu 25
2.2.3.4 Phương pháp đánh giá sự tăng sinh tế bào trên bề mặt vật liệu. 27
2.2.3.5 Phương pháp đánh giá hình thái tế bào trên khối vật liệu bằng cách
chụp ảnh SEM 28
2.2.4 Biến số nghiên cứu 29
2.2.4.1 Biến số độc lập 29
2.2.4.2 Biến số phụ thuộc 29
2.2.5 Thu thập, xử lý và phân tích số liệu 30
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ DỰ KIẾN 32
LỢI ÍCH CỦA ĐỀ TÀI 34
5
ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp và khuếch tán
qua agar 13
Bảng 1.2. Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm dịch chiết 14
Bảng 1.3. Thành phần cấu tạo của Biodentine 15
Bảng 2.4. Một số dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21
Bảng 3.5. Mức độ độc tính sau 24 giờ theo tiêu chuẩn ISO 10993 32
Bảng 3.6. Giá trị trung bình mật độ quang ở bước sóng 450 nm 32
6
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo mô nha chu 4
Hình 2.2. Buồng đếm tế bào 24

Hình 2.3. Nguyên tắc phương pháp MTT 27
Hình 2.4. Sơ đồ minh hoạ tế bào bám trải trên bề mặt vật liệu 29
Hình 3.5. Tế bào bám trải trên bề mặt vật liệu 33
7
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
PDLSCs Periodontal ligament stem cells
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
FBS Fetal bovine serum
DMSO Dimethyl sulfoxide
PBS Phosphate Buffered Saline
EDTA Ethylene Diaminetetraacetid Acid
MTT 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-YL)-2, 5-diphenyl tetrazolium
bromide
ml Mililitre
mm Milimetre
mM Milimol
nm Nanometre
OD Optical Density
SEM Scanning electron microscopy
RT- PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
ARN Ribonucleic Acid
SHED Stem Cells from Exfoliated Deciduous teeth
8
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong thực hành nội nha hàng ngày, các bác sĩ răng hàm mặt thường xuyên phải
đối mặt với những ca khó dễ dẫn tới thất bại. Khi đó, vi khuẩn và những sản phẩm
phụ của nó còn tồn tại trong hệ thống ống tuỷ sẽ thoát ra ngoài và đến mô nha chu để
gây bệnh. Phẫu thuật nội nha được chỉ định để loại bỏ những chất độc từ hệ thống
ống tuỷ trong trường hợp phương pháp tiếp cận từ trên xuống không khả thi do sự
hiện diện của chốt và vật liệu trám vĩnh viễn khác trong ống tuỷ.

Quá trình sửa chữa diễn ra trong các mô quanh chóp sau khi phẫu thuật cắt chóp
đã được chứng minh [6, 18]. Sự lành thương xương sau phẫu thuật liên quan đến việc
tái cấu trúc của bè xương, tái tạo màng xương chức năng và xương vỏ. Sự thành công
cuối cùng của phẫu thuật phụ thuộc vào sự tái cấu trúc của một hệ thống bám dính
chức năng, bao gồm cement phủ lên bề mặt chân răng cắt bỏ, dây chằng nha chu
(PDL), và xương ổ răng [5]. Phẫu thuật cắt chóp kết hợp với trám ngược bằng một
vật liệu không những ngăn chặn lối ra của bất kỳ vi khuẩn còn lại hoặc các sản phẩm
phụ của nó, mà còn cho phép sự hình thành của một màng nha chu bình thường trên
bề mặt bên ngoài của nó [21].
Trước đây, vật liệu nha khoa truyền thống được sử dụng phổ biến để trám ngược
là Almalgam. Tuy nó có thể bị bào mòn, gây ra đổi màu mô mềm bên trên hoặc giải
phóng kim loại vào trong mô nhưng cho đến nay vẫn được đánh giá cao về sự dung
nhận sinh học, đặc tính cơ học chịu nén tốt, ít thay đổi thể tích, độ khít sát cũng như
tính an toàn vật liệu. Nhiều loại vật liệu nha khoa thích hợp khác được sử dụng như là
polycarboxylate cement, IRM (Intermediate Restorative Material), Super EBA
cement (ethoxybenzoic acid), glass ionomer cement, Gần đây, MTA (Mineral
trioxide aggregate) ra đời và được chỉ định sử dụng rộng rãi trong nội nha như trám
9
ngược sau phẫu thuật cắt chóp, điều trị thủng sàn, che tuỷ hay trám bít ống tuỷ [12,
23, 28, 33]. Bên cạnh những ưu điểm như khả năng bám dính vào mô răng cao, tính
tương hợp sinh học cao, độc tính thấp và đặc biệt là có thể kích thích tái tạo mô, cho
phép mô tiếp xúc trực tiếp với vật liệu, MTA cũng bộc lộ một số nhược điểm như
thời gian đông lâu, đặc tính cơ học thấp, khó thao tác, khó lưu trữ và giá thành cao.
Do đó, những vật liệu mới ra đời và phát triển với những tính năng tương tự
nhưng khắc phục được những nhược điểm của MTA đặc biệt là calcium silicate
cement (Biodentine) được báo cáo là một trong những vật liệu có tính tương hợp sinh
học trong nha khoa hiện nay tức là khả năng của vật liệu có thể tạo ra sự đáp ứng phù
hợp của vật chủ. Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu đánh giá độc tính in vitro của
calcium silicate cement (Biodentine) như nghiên cứu của Patrick Laurent và cộng
sự (2008) được thực hiện trên gen đối với bốn dòng vi khuẩn Salmonella

typhimurium, nguyên bào sợi tuỷ răng người và hiệu quả của calcium silicate cement
trên chức năng tế bào đích chuyên biệt bởi hoá mô miễn dịch; hoặc trên tế bào tuỷ
răng chuột được làm bất tử (OD-21) của Marjorie Zanini và cộng sự (2012); hoặc
nghiên cứu của Camila M. Corral Nũnez và cộng sự (2014) đánh giá sự sống của tế
bào và biểu hiện ARN thông tin của IL-1α và IL-6 trong tế bào nguyên bào sợi 3T3
(dòng tế bào nguyên bào sợi phôi chuột) khi tiếp xúc trực tiếp với Biodentine và
MTA; hoặc Andriara De Rossi và cộng sự (2014) đánh giá tuỷ răng và mô quanh
chóp của 60 chân răng chó sau khi thực hiện lấy tuỷ buồng, che tuỷ với Biodentine và
so sánh với MTA bởi phim quanh chóp, phân tích mô học, vi sinh. Tuy các nghiên
cứu đều cho rằngvật liệu này có tính tương hợp sinh học và có thể được dùng an
toàn trên lâm sàng đặc biệt là phục hồi trám các răng sau, che tuỷ trực tiếp, có tiềm
năng thay thế vật liệu truyền thống trong phẫu thuật nôi nha; nhưng cho đến nay,
chưa có nghiên cứu về đáp ứng sinh học đặc biệt là sự đáp ứng của tế bào đa năng
dây chằng nha chu người - quyết định sự lành thương lý tưởng của mô nha chu sau
phẫu thuật cắt chóp kết hợp với trám ngược của loại vật liệu này.
10
Câu hỏi nghiên cứu:
Có hay không có sự đáp ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu đối với vật
liệu Calcium silicate cement (Biodentine
TM
) so với vật liệu truyền thống Amalgam?
Mục tiêu tổng quát:
Xác định sự đáp ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu đối với vật liệu
Calcium silicate cement (Biodentine
TM
) và Amalgam.
Mục tiêu chuyên biệt:
1. Xác định và so sánh mức độ phản ứng của tế bào đa năng dây chằng nha chu
(thế hệ tế bào P4) khi tiếp xúc với dịch chiết của Biodentine và Amalgam
nhằm đánh giá mức độ độc tính in vitro.

2. Xác định và so sánh trung bình mật độ quang OD của tế bào đa năng dây
chằng nha chu khi tiếp xúc với Biodentine và Amalgam nhằm đánh giá khả
năng tăng sinh của tế bào bằng phương pháp MTT.
3. Đánh giá hình thái của tế bào đa năng dây chằng nha chu khi tiếp xúc với
Biodentine và Amalgam dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM).
11
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 CƠ SỞ CỦA SỰ LÀNH THƯƠNG MÔ NHA CHU
1.1.1 Cấu tạo mô nha chu
Mô nha chu được cấu tạo do tập hợp của các mô duy trì và nâng đỡ răng. Bốn
thành phần của mô nha chu là nướu, dây chằng nha chu, xương ổ răng và xê măng
chân răng.
Hai thành phần mô khoáng hoá là xương ổ răng và xêmăng là những trụ cột, nhờ
đó các sợi dây chằng nha chu neo chặt răng vào xương ổ. Sự phân phối của mô sợi và
khoáng hoá của mô nha chu khác nhau do cấu tạo protein, các phần tử tế bào, sự
khoáng hoá, chuyển hoá và do chức năng của chúng.
Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo mô nha chu
12
1.1.2 Cấu tạo và chức năng của dây chằng nha chu
1.1.2.1 Cấu tạo của dây chằng nha chu
Dây chằng nha chu (màng nha chu) là một mô liên kết chặt chẽ, có nhiều tế bào,
nhiều sợi, nằm giữa bề mặt chân răng và xương ổ chính danh, nối xê măng chân răng
với xương ổ. Ở đỉnh xương ổ, nó liên tục với mô liên kết của nướu dính.
Về mặt mô học, các tế bào của dây chằng nha chu có thể được xếp thành ba nhóm
lớn theo nguồn gốc và vai trò của chúng:
• Tế bào mô liên kết: gồm có
- Nguyên bào sợi: Là những tế bào chủ yếu của mô liên kết, chiếm 65% tổng
số các loại tế bào, nằm giữa những sợi collagen có hướng song song với các
sợi. Nguyên bào sợi cóliên quan trực tiếp đến việc tạo ra các protein ngoại tiết
có chức năng tạo ra nhiều dạng sợi collagen khác nhau và các proteoglycan.

Nguyên bào sợi có hoạt tính phophatase kiềm tương tự hoạt tính của các tạo
cốt bào.
- Nguyên bào xương, huỷ cốt bào
- Nguyên bào xê măng, huỷ ngà bào
- Tế bào tiền sinh xê măng và tiền sinh xương (tế bào trung mô không biệt
hoá, đa năng): nằm kề các vùng xê măng và xương. Về mặt hình thái, chúng
gần giống như các nguyên bào sợi không hoạt động. Những tế bào này có khả
năng thay thế (bằng cách phân chia và biệt hoá) một trong những loại tế bào có
trong khoảng nha chu.
• Tế bào biểu mô còn sót lại của bao Hertwig.
• Tế bào bảo vệ gồm các đại thực bào monocyte, lymphocyte, tương bào,
Ngoài ra, khung ngoại bào của dây chằng nha chu có bốn nhóm phân tử lớn
chính gồm collagen lưới và elastin có trong thành phần của khung ngoại bào.
Proteoglycan và glycoprotein của cấu trúc tạo ra phần keo còn gọi là chất căn bản
cùng với hệ thống mạch máu và thần kinh phong phú.
13
1.1.2.2 Chức năng của dây chằng nha chu
Các bó sợi collagen của dây chằng nha chu thực hiện chức năng giữ chặt răng.
Mạng huyết quản và bạch mạch mang lại dưỡng chất và loại bỏ những chất chuyển
hoá của mô mềm trong màng nha chu và một phần nướu. Những sợi thần kinh đi theo
hệ mạch máu và bạch mạch đem các kích thích đến những thành phần cơ của những
thành mạch và phần khác là cảm nhận các phản xạ của nha chu. Ngoài ra, dây chằng
nha chu còn giữ vai trò của màng xương cho xê măng và xương ổ răng. Những tế bào
của dây chằng nha chu liên hệ trực tiếp đến sự thành lập và tiêu huỷ các mô này.
1.1.3 Những nghiên cứu về vai trò của tế bào dây chằng nha chu trong lành
thương mô nha chu
Melcher và cộng sự (1970) đã đề xuất rằng các tế bào của dây chằng nha chu và tế
bào "con cháu" của nó thể hiện khả năng ức chế tạo xương, một quan điểm được hỗ
trợ bởi Line, Polson và Zander (1974) và đã tiếp tục đề nghị (Melcher 1976) rằng các
tế bào dây chằng nha chu và các tế bào xương có thể ngăn chặn lẫn nhau xâm nhập

vào các khu vực tương ứng của chúng.
Nghiên cứu của Andreasen và cộng sự (1972) đánh giá kiểu lành thương dựa trên mô
học của 70 ca phẫu thuật nội nha cho thấy thấy kết quả phẫu thuật chóp có thể được
chia thành ba loại chính: (1) lành thương với sự hình thành các màng nha chu hoặc
ankylosis, và không có hoặc viêm quanh chóp nhẹ, (2) lành thương bằng sự hình
thành các mô xơ (mô sẹo ), thỉnh thoảng có sự ankylosis, và các mức độ khác nhau
của hiện tượng viêm, và (3) viêm quanh chóp vừa hoặc nặng mà không có các vết
sẹo.
Gould và cộng sự (1980) đã nghiên cứu về sự di cư và phân chia của quần thể tế
bào tổ tiên của dây chằng nha chu sau khi lành thương ở chuột cho thấy rằng 3 ngày
sau khi dây chằng nha chu bị hoại tử, có sự hiện diện một lượng lớn nguyên bào sợi ở
14
dây chằng kế cận tổn thương và ở trong tổn thương sau 5 ngày cùng với xê măng bào,
tế bào tạo xương di cư đến bề mặt mô nha chu và xương ổ răng tại mép tổn thương.
Boyko và cộng sự (1981) đã nhổ các răng tiền hàm từ tám con chó, và lấy các tế bào
từ dây chằng nha chu và nướu dính nuôi trong ống nghiệm. Các răng cửa bên được
nhổ sau và được trám bít ống tuỷ, sau đó chia thành ba nhóm. Tế bào nướu nuôi cấy
đã được gắn liền với những chân răng trong nhóm đầu tiên, các tế bào dây chằng nha
chu gắn với những chân răng trong nhóm thứ hai và nhóm thứ ba không được gắn tế
bào đóng vai trò là nhóm chứng. Các chân răng được cấy chuyển vào các lỗ xương ổ
răng của răng cối nhỏ hàm dưới đã mất và được bao phủ hoàn toàn bởi một vạt nướu.
Kết quả thu được là tất cả các chân răng đều bị ankylosis và tiêu trừnhững chân răng
mang tế bào dây chằng nha chu được nuôi cấy đã liên kết với những mảnh mô sợi
mới được xác định là dây chằng nha chu trên cơ sở định hướng các sợi của nó, đồng
thời có sự hiện diện của các sợi Sharpey trong xương và răng, và nguyên bào xương
và nguyên bào cement ở vị trí bình thường.
Nghiên cứu của Nymanvà cộng sự (1982) cũng cho rằng có thể hình thành bám dính
mới trên bề mặt chân răng trên bệnh nhân bị nha chu viêm dẫn đến mất bám dính từ
các tế bào có nguồn gốc từ dây chằng nha chu. Isidor và cộng sự (1986) cũng đã đưa
ra kết luận rằng sự hiện diện của các tế bào có nguồn gốc từ dây chằng nha chu là

một điều kiện tiên quyết cho sự hình thành bám dính mới nhằm tái lập quần thể nha
chu của bề mặt chân răng bị cắt rời.
Để hiểu rõ vai trò của các tế bào trong quá trình tái tạo mô nha chu, Somermanvà
cộng sự (1988) đã tiến hành nghiên cứu so sánh các tế bào dây chằng nha chu và các
nguyên bào sợi nướu người trong ống nghiệm. Kết quả là sự sản xuất protein và
collagen trong các tế bào dây chằng nha chu lớn hơn đáng kể so với các nguyên bào
sợi nướu. Ngoài ra, các tế bào dây chằng nha chu có nồng độ phosphatase kiềm cao
hơn khi so sánh với các nguyên bào sợi nướu.
15
1.2 TẾ BÀO GỐC
1.2.1 Khái niệm tế bào gốc
Tế bào gốc là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hóa trong mô sống, có khả
năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức phận sinh lý.
1.2.2 Đặc tính tế bào gốc
• Tính tự làm mới: tế bào có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kì phân
bào nguyên nhiễm, mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa.
• Tính tiềm năng không giới hạn:tế bào đó có khả năng biệt hoá thành bất kì
kiểu tế bào trưởng thành nào. Trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng với các tế bào
gốc toàn năng, hoặc vạn năng. Tuy nhiên, một tế bào gốc đa năng (hay tế bào
tiền thân) cũng nhiều khi được gọi là tế bào gốc.
1.2.3 Phân loại tế bào gốc
Với các tác giả khác nhau, có thể có những cách phân loại khác nhau. Hiện nay, tác
giả Shinyya Yamanaka và James Thompson (2008) đề nghị phân loại, chia tế bào gốc
thành năm nhóm chính (3):
• Tế bào gốc phôi: thu nhận từ phôi giai đoạn tiền làm tổ.
• Tế bào gốc nhũ nhi: thu nhận từ thai, mô máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối,
• Tế bào gốc trưởng thành: thu nhận từ cơ thể trưởng thành.
• Tế bào gốc vạn năng cảm ứng: có thể tạm hiểu là tế bào gốc phôi nhân tạo, có
tiềm năng như các tế bào gốc phôi (được tạo ra do có sự thao tác in vitro trên
chính bộ gene đã biệt hoá chức năng của chúng).

• Tế bào gốc ung thư: được coi là nguồn gốc của khối u và chỉ có trong các khối
u.
1.2.4 Tế bào gốc trung mô
1.2.4.1. Khái niệm tế bào gốc trung mô
16
Tế bào gốc trung mô là các tế bào gốc đa tiềm năng có thể biệt hóa thành nhiều loại
tế bào khác nhau. Dưới điều kiện thích hợp chúng có thể biệt hóa thành nhiều loại tế
bào chuyên hóa như như tế bào mỡ, sụn, xương, cơ, thần kinh và beta của tụy đảo…
1.2.4.2 Hình thái tế bào gốc trung mô
Khi chưa biệt hóa, tế bào gốc trung mô có hình dạng giống tế bào fibroblast (hình
thoi dài).
1.2.4.3 Một số tế bào gốc trung mô
Tế bào gốc trung mô có mặt ở nhiều mô khác nhau trong cơ thể người trưởng thành
và chúng có khả năng tạo ra các tế bào đảm nhận các chức năng chuyên biệt tại mô
đó. Hiện nay, tế bào gốc trung mô chủ yếu được thu nhận từ tủy xương, máu cuống
rốn, mô mỡ, răng. Ngoài ra, trong màng xương, màng hoạt dịch, cơ, lớp da nằm dưới
biểu bì, máu,…cũng có tế bào gốc trung mô.
Loại tế bào gốc của răng người được phân lập đầu tiên là tế bào từ mô tủy răng
(dental pulp stem cells - DPSCs) của răng khôn (Gronthos và cs., 2000). Các tế bào
này cho thấy có khả năng biệt hóa thành tế bào dạng nguyên bào ngà và tạo mô dạng
phức hợp ngà-tủy khi cấy dưới da chuột đã bị suy giảm miễn dịch. Tiếp theo, nhiều
loại tế bào gốc trung mô của răng đã được phân lập như tế bào gốc từ răng sữa rụng
(stem cells from exfoliated deciduous teeth - SHED) (Miura và cs.,2003), tế bào gốc
từ dây chằng nha chu (periodontal ligament stem cells - PDLSCs) (Seo và cs., 2004),
tế bào gốc bao răng (dental follicle precursor cells - DFPCs) (Morsczeck và cs.,
2005) và tế bào gốc nhú chóp răng (stem cells from apical papilla - SCAP)
(Sonoyama và cs., 2006, 2008).
1.2.4.4 Tế bào đa tiềm năng dây chằng nha chu người (tế bào gốc trung mô)
17
Gần đây, việc phân lập tế bào gốc ở người từ mô dây chằng nha chu người

(PDLSCs) đã mở ra những cơ hội mới cho ngành kỹ thuật mô nha khoa. PDLSCs có
những đặc tính điển hình của tế bào gốc trung mô có nguồn gốc tuỷ xương như khả
năng tự làm mới, biểu hiện những marker bề mặt tương tự như tế bào gốc trung mô
có nguồn gốc tuỷ xương như là CD10, CD13, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 và
CD105. PDLSCs cũng sở hữu đặc tính đa tiềm năng để biệt hoá thành những loại tế
bào khác như nguyên bào xương, tế bào tạo mỡ, tế bào tạo sụn, tế bào tạo thần kinh
in vitro. Thêm vào đó, PDLSCs có khả năng đặc biệt hình thành xê măng và mô
tương tự dây chằng nha chu in vivo. Các dữ liệu cho thấy rằng PDLSCs có đủ hai
đặc tính của tế bào gốc sinh dưỡng (tế bào gốc trưởng thành có thể tự làm mới và biệt
hóa thành các tế bào chuyên hóa về chức năng) (Seo và cộng sự (2004), Bartold và
cộng sự (2006), Huang và cộng sự (2009), Wada (2009), Feng và cộng sự (2010)).
Ha Le Bao Tran và cộng sự (2014) - Bộ môn sinh lý học và công nghệ sinh học động
vật thuộc trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ
Chí Minhđã nuôi cấy thành công tế bào từ mô dây chằng nha chu ở người. Tế bào
dây chằng nha chu biểu hiện những marker của tế bào gốc trung mô như CD44,
CD73 và CD90 và cũng sở hữu đặc tính đa tiềm năngcó thể biệt hoá thành những loại
tế bào khác nhau như nguyên bào xương và tế bào tạo mỡ in vitro.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tế bào dây chằng nha chu đa tiềm năng
ở người có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn sinh lý học và công nghệ
sinh học động vật thuộc trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia
Thành phố Hồ Chí Minh.
1.3 QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU SINH HỌC
Chúng ta cần đánh giá để xác định được vật liệu sinh học có khả năng tương hợp
sinh học hay không và liệu chúng có thể thực hiện chức năng phù hợp trong môi
18
trường in vivo hay không? Các kết quả đánh giá trong điều kiện in vitro có thể cung
cấp các dữ liệu về sự tương tác sinh học nhanh và ít tốn kém. Khi được áp dụng hợp
lý, các thử nghiệm in vitro sẽ cung cấp những kiến thức hữu ích để đưa ra quyết định
có nên tiếp tục đánh giá vật liệu này trong những mô hình thí nghiệm in vivo tốn kém
hay không.

1.3.1 Tính tương hợp sinh học
Tính tương hợp sinh học là khả năng thực hiện chức năng cùng với một đáp ứng
thích hợp của cơ thể chủ trong một tình huống đặc trưng. Thuật ngữ "tính tương hợp
sinh học" ngụ ý đến tính tương hợp hoặc hoà hợp với hệ thống sống.
19
1.3.2 Sự gây độc tế bào
Sự gây độc tế bào là sự gây ra các tác động độc ở mức tế bào như giết chết, thay
đổi tính thấm màng tế bào, ức chế hoạt động của enzyme Một vật liệu được gọi là
độc khi nó giải phóng một lượng hoá chất đủ để giết chết tế bào theo cách trực tiếp
hoặc gián tiếp thông ức chế các con đường trao đổi chất chính. Số lượng tế bào bị ảnh
hưởng sẽ cho biết liều lượng và độc lực của hoá chất.
1.3.3 Các phương pháp thử nghiệm
1.3.3.1 Thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp
Thử nghiệm này được thiết kế cho các vật liệu có nhiều hình dạng khác nhau. Thử
nghiệm này không thích hợp cho các vật liệu có tỉ trọng rất thấp hoặc rất cao vì có thể
gây hư hỏng tế bào do cơ học. Độc tính được đánh giá thông qua sự vắng mặt của các
tế bào được nhuộm bên dưới và xung quanh mẫu thử nghiệm. Các mẫu thử được
đánh giá là đạt yêu cầu nếu mức phản ứng từ 2 trở xuống (phản ứng nhẹ) theo bảng
1.1.
1.3.3.2 Thử nghiệm sự khuếch tán qua agar
Agar phải có chất lượng tốt để hỗ trợ sự tăng trưởng của tế bào và lớp agar phải đủ
mỏng để cho phép khuếch tán các chất rò rỉ. Trong thử nghiệm này, thuốc nhuộm
sống (đỏ trung tính) thường trộn trong agar để dễ quan sát các tế bào sống (các tế bào
sống khoẻ mạnh hấp thụ và giữ lại nên có màu).Do đó, độc tính được đánh giá thông
qua sự mất màu thuốc nhuộm bên dưới và xung quanh mẫu thử nghiệm. Các mẫu thử
được đánh giá là đạt yêu cầu nếu mức phản ứng từ 2 trở xuống (phản ứng nhẹ).
20
Bảng 1.1: Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm tiếp xúc trực tiếp và khuếch tán
qua agar
Mức độ Phản ứng Mô tả vùng phản ứng

0 Không Không thể phát hiện được vùng phản ứng xung
quanh và bên dưới mẫu
1 Rất nhẹ Một ít tế bào bị chuyển dạng hoặc bị thoái hoá
bên dưới mẫu
2 Nhẹ Có xuất hiện vùng phản ứng giới hạn bên dưới
mẫu
3 Vừa Vùng phản ứng lan xa mẫu 0,5 - 1,0 cm
4 Nghiêm trọng Vùng phản ứng lan xa mẫu hơn1,0 cm
1.3.3.3 Thử nghiệm dịch chiết
Thử nghiệm này phù hợp cho những vật liệu tỉ trọng cao và cho các đánh giá đáp
ứng liều. Quy trình chiết mẫu được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ sinh lý hoặc không
sinh lý trong những khoảng thời gian gián đoạn. Chuẩn bị dịch chiết vật liệu: sử dụng
môi trường nuôi không chứa hoặc có chứa huyết thanh, diện tích bề mặt mẫu thử trên
1 ml chất chiết (0,1-0,2 g vật liệu). Môi trường nuôi cấy có huyết thanh làm chất chiết
có thể mô phỏng theo điều kiện sinh lý hơn. Độc tính đối với tế bàođược đánh giá sau
24 giờ ủ ở nhiệt độ chiết là 37 ± 1
o
C trong tủ CO
2
. Các tế bào sống hay chết có thể
được phân biệt bằng cách nhuộm sống hoặc hoá mô.Các dịch chiết của mẫu thử được
đánh giá là đạt yêu cầu nếu mức phản ứng từ 2 trở xuống (phản ứng nhẹ) theo bảng
1.2.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thử nghiệm dịch chiết vì Biodentine và
Amalgam có tỉ trọng cao và môi trường sử dụng để chuẩn bị dịch chiết là
DMEM/F12 thương mại (Sigma).
21
Bảng 1.2: Các mức độ phản ứng trong thử nghiệm dịch chiết
Mức độ Phản ứng Tình trạng của đĩa nuôi
0 Không

Các hạt trong bào tương riêng rẽ, không có sự ly
giải tế bào.
1 Rất nhẹ
Không quá 20% tế bào ở dạng tròn, bám dính lỏng
lẻo và không có hạt trong bào tương, thỉnh thoảng
xuất hiện các tế bào ly giải.
2 Nhẹ
Không quá 50% tế bào ở dạng tròn và không có
hạt trong bào tương, không có sự ly giải tế bào lan
rộng và vùng trống giữa các tế bào.
3 Vừa
Không quá 70% lớp đơn tế bào chứa tế bào dạng
tròn hoặc bị ly giải.
4 Nghiêm trọng Lớp đơn tế bào gần như bị phá huỷ hoàn toàn.
1.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
1.4.1 Biodentine (calcium silicate cement)
1.4.1.1 Thành phần cấu tạo
22
Bảng 1.3:Thành phần cấu tạo của Biodentine
1.4.1.2 Tính chất vật liệu
• Biodentine được mô tả có khả năng tương tác với nước dẫn đến sự thành lập và
đông cứng cement. Phản ứng tạo thành sản phẩm gel calcium silicate được
hydrate hoá (CSH gel) và calcium hydroxide (Ca(OH)
2
).
• Thời gian làm việc trong 6 phút và đông cứng hoàn toàn là 12 phút. CaCl
2
là
một trong những chất xúc tác hiệu quả nhất của quá trình hydrat hoá và đông
cứng. Việc thêm CaCl

2
vào pha chất lỏng có tác dụng làm giảm thời gian đông
cứng của vật liệu.
• Vật liệu có tính cản quang nhờ oxide zirconium.
• Vật liệu chịu lực nén tốt do không có thành phần aluminate và tạp chất khác
Ứng dụng lâm sàng: phục hồi sang thương sâu răng sâu và lớn bên cạnh những chỉ
định trong nội nha như sửa chữa thủng sàn, tiêu chân răng, kích thích đóng chóp và
trám ngược.
1.4.1.3 Những nghiên cứu về độc tính của Biodentine trong nha khoa
Patrick Laurent và cộng sự (2008) đánh giá độc tính in vitro trên gen đối với bốn
dòng vi khuẩn Salmonella typhimurium, nguyên bào sợi tuỷ răng người và hiệu quả
của calcium silicate cement trên chức năng tế bào đích chuyên biệt bởi hoá mô miễn
dịch đã đưa ra kết luận vật liệu mới không ảnh hưởng chức năng của tế bào đích như
như sự khoáng hoá, biểu hiện collagen loại 1, biểu hiện gen tiền ngà. Như vậy,
Bột
Tri-calcium Silicate (C3S) Thành phần vật liệu chính
Di-calcium Silicate (C2S) Thành phần vật liệu phụ
Calcium Carbonate và Oxide Chất độn
Oxide sắt Độ màu
Oxide Zirconium Chất cản quang
Lỏng
Calcium chloride Chất xúc tác
Polymer Hydrosoluble Yếu tố giảm nước
23
cement mới có tính tương hợp sinh học và có thể được dùng an toàn trên lâm sàng
đặc biệt là phục hồi trám các răng sau, có tiềm năng thay thế vật liệu truyền thống
trong phẫu thuật nội nha.
Marjorie Zanini và cộng sự (2012) thực hiện nghiên cứu đánh giá hiệu quả sinh
học của Biodentine trên tế bào tuỷ răng chuột được làm bất tử (OD-21). Tế bào OD-
21 được nuôi cấy trong môi trường có hoặc không có Biodentine. Tác giả đánh giá

vật liệu trên sự tăng sinh tế bào sau 2, 3, 5 ngày kích thích, trên mức độ gen với kỹ
thuật RT-PCR, trên mức protein bằng cách đo hoạt động photphatase kiềm và nhuộm
tế bào để định lượng sự khoáng hoá sinh học. Tác giả đã đưa ra kết luận Biodentine
có hoạt tính sinh học vì có sự tăng sinh tế bào OD-21 và khoáng hoá sinh học khi so
sánh với nhóm chứng. Vì vậy, Biodentine có thể được xem như là vật liệu thích hợp
trên lâm sàng đối với chỉ định tái tạo phức hợp ngà-tuỷ cụ thể là che tuỷ trực tiếp.
Nghiên cứu của Camila M. Corral Nũnez và cộng sự (2014) đánh giá sự sống của
tế bào và biểu hiện ARN thông tin của IL-1α và IL-6 trong tế bào nguyên bào sợi 3T3
(dòng tế bào nguyên bào sợi phôi chuột) khi tiếp xúc trực tiếp với Biodentine và
MTA. Nhóm thử nghiệm bao gồm Biodentine và MTA được phủ lên một nắp trượt,
nhóm chứng bao gồm mẫu không được phủ vật liệu và mẫu còn lại được phủ bởi vật
liệu GIC Fuji IX. Nắp trượt này được thực hiện nuôi cấy với tế bàonguyên bào sợi
3T3. Đánh giá sự sống tế bào bằng cách sử dụng chất nhuộm Alamar Blue sau 3, 6,
24, 72 giờ. Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào khi tiếp xúc với Biodentine và MTA
bằng cách quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét và biểu hiện cytokine ở mức ARN
thông tin bởi RT-PCR sau 3, 24 giờ tiếp xúc trực tiếp với vật liệu.Kết quả nghiên cứu
cho thấy sự sống của tế bào khi tiếp xúc với Biodentine và MTA tương tự với nhóm
chứng tại tất cả các thời điểm (ngoại trừ thời điểm 6 giờ, sự sống tế bào giảm ở cả 2
loại vật liệu). Quan sát trên ảnh chụp SEM thấy có sự bám dính tế bào ở hầu hết bề
mặt Biodentine sau 24 giờ và nhiều hơn có ý nghĩa so với MTA. Biểu hiện ARN
thông tin của IL-1α và IL 6 giữa Biodentine và MTA tương tự nhau.
24
Andriara De Rossi và cộng sự (2014)đánh giá của tuỷ răng và mô quanh chóp của
60 chân răng chó sau khi thực hiện lấy tuỷ buồng, che tuỷ với Biodentine và so sánh
với MTA bởi phim quanh chóp, phân tích mô học, vi sinh. Các tác giả giết chó sau
120 ngày và đem răng xử lý mô học. Kết quả của nghiên cứu là cầu ngà khoáng hoá
được hình thànhkhi qua sát trên phim tia X trong đa số mẫu được điều trị với
Biodentine (96,8%) so với MTA (72,2%) (p=0,2) và có tính hoàn nguyên của lamina
dura. Không có sự thay đổi về xương quanh chóp răng hoặc tiêu chân răng ở tất cả
các mẫu. Phân tích mô bệnh học cũng cho kết quả tương tự (sự hình thành cầu ngà

khoáng hoá, sự sống của mô tuỷ, tính hoàn nguyên của lớp nguyên bào ngà, ).
Nghiên cứu đưa ra kết luận rằng Biodentine có tính tương hợp sinh học đối với mô
sống và cho phép sự hình thành cầu ngà khoáng hoá sau khi lấy tuỷ buồng.
Các nghiên cứu về Biodentine trên thế giới và Việt Nam cho đến nay chưa nhiều
đặc biệt là tính tương hợp sinh học đối với mô dây chằng nha chu người - quyết định
sự lành thương lý tưởng của mô nha chu.
1.4.2 Amalgam
Amalgam nha khoa được xem là một vật liệu an toàn, bền và có khả năng phục hồi
răng đa năng đã được sử dụng hơn 150 năm. Amalgam nha khoa chứa một hỗn hợp
kim loại gồm thủy ngân, bạc, đồng và thiếc được kết lại với nhau thành một chất rắn
bền và an toàn.
Phản ứng đông cứng: đối với Amalgam tỷ lệ đồng cao:
Ag
3
Sn + Cu + Hg à Ag
2
Hg
3
+ Cu
6
Sn
5
+ Ag
3
Sn
• Ưu điểm:
- Độ bền cơ học cao,
- Khít kín, tạo và duy trì được hình dạng của răng
- Ít đòi hỏi đặc biệt về thao tác kỹ thuật
- Đã chứng tỏ sự thành công lâu dài về lâm sàng,

- Kinh tế
• Nhược điểm:
- Không phù hợp về màu
- Có thể bị ăn mòn trong miệng và tạo dòng galvanic
- Ô nhiễm và nguy hại do thủy ngân
• Ứng dụng lâm sàng:
25
Ngoài việc Amalgam được dùng cho các miếng trám vĩnh viễn ở răng sau, và
cho phục hồi các mất chất lớn để làm cùi răng, Amalgam còn được sử dụng
trong trám ngược các răng sau phẫu thuật cắt chóp.
• Các đặc điểm quan trọng của Amalgam là:
- Sự thay đổi kích thước, thể tích: thay đổi kích thước giữa 5 phút và 24 giờ:
từ -15 đến +20 µm/cm.Amalgam tốt khi chỉ co/dãn 0,1%.
- Độ bền:độ bền nén tăng dần theo thời gian:Độ cứng tối đa đạt sau 24giờ và
còn tiếp tục tăng ít (80 MPa sau 1giờ; 300 MPa sau 24giờ).
- Tính chảy:sau khi trộn và trong quá trình cứng, Amalgam bị biến dạng dẻo
tối đa là 1%
- Sự ăn mòn
Mặc dù amalgam nha khoa là một nguồn tiếp xúc với thủy ngân và có liên quan
với việc thải chất thủy ngân qua đường bài tiết, nhưng không có chứng cứ khoa học
nào về hậu quả của độc tố lâm sàng có thể đo lường được ngoại trừ một vài trường
hợp hiếm hoi có phản ứng nhạy cảm. Tổ Chức Y Tế Thế Giới và Liên Đoàn Nha
Khoa Thế Giới tuyên bố nhất trí (9/1997): “Không có nghiên cứu công khai nào cho
thấy có những ảnh hưởng xấu mang tính hệ thống đối với sức khỏe từ việc phục hồi
răng bằng amalgam. Việc phục hồi răng bằng amalgam rất bền và có hiệu quả kinh
tế; tuy nhiên, chúng không được giống màu của răng cho lắm”.
Trong nghiên cứu, chúng tôi chọn Amalgam để so sánh với vật liệu mới
Biodentine do Amalgam là vật liệu truyền thống vẫn được lựa chọn sử dụng trong
trám ngược hiện nay do những ưu điểm được nêu như trên.