BÀI GIẢNG VỀ PCR(POLYMERASE CHAIN REACTION)-NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG

Trao đổi trực tuyến tại:

TS. BS Đỗ Thị Thanh Thủy

PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)

NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG


MỤC TIÊU BÀI GIẢNG
1. Trình bày được nguyên tắc PCR
2. Trình bày được cách chống ngoại nhiễm
trong PCR
3. Trình bày được ứng dụng của PCR
 Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation)
 1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science”
 Đạt Nobel Prize hóa học 1993
 Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng
khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase,
thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao.

PCR
POLYMERASE CHAIN REACTION
PCR
POLYMERASE CHAIN REACTION
PCR
NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG

35-40 chu kì nhiệt
Amplicon

Số copies = 2
n
.y
n: Số cycle
y: số copies ban đầu
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6
Denaturation
Annealing
Extension
Temperature (° C)
Time (minutes)
Lập lại ≥ 30 lần
(chu kỳ)
Biến tính
92-96
o
C
Bắt cặp
45-55
o

C
Kéo dài
72
o
C
PCR
POLYMERASE CHAIN REACTION
GĐ BIẾN TÍNH (92-96
o
C)
DNA đích
95
o
C
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
GĐ BẮT CẶP (45-55
o
C)
~55
o
C
5’ 3’
3’ 5’
5’
5’
A
B

Primers
A
B
GĐ KÉO DÀI (72
o
C)
72
o
C
5’ 3’
3’ 5’
5’
5’
Taq polymerase
72
o
C
5’ 3’
3’ 5’
5’
5’
Cycle 1
MỘT CHU KỲ NHIỆT
Giai đoạn biến tính (92-96
o
C)
Giai đoạn bắt cặp (45-55
o
C)
Giai đoạn kéo dài (72

o
C)
PCR
POLYMERASE CHAIN REACTION
ĐỘNG HỌC CỦA PCR

THÀNH PHẦN TRONG PCR
DNA đích
5’ 3’
3’
5’
primers
A
B
Nucleotide tự do
Taq DNA
polymerase
Mg
2+
Mg
2+
Mg
2+
Mg
2+
Mg
2+
Mg
2+

Dd đệm chứa
magnesium
NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR

1. DNA đích (đoạn DNA quan tâm)
Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp…,
tóc, phết niêm mạc má, phết cổ tử cung…), [C]  1 µg
(0,1-1 µg)
Đoạn DNA 1kb đến 10kb (thường <1 kb)
2. Mồi (primers)
đoạn đơn DNA thường có 18-22 nucleotide, bổ xung
với đoạn DNA đích. 5’-ACT TTC ACC AGC GTT TCT GG-3’
Mồi xuôi, mồi ngược (F, R).
Tm (Melting Temperature): 52-58 °C
Tm= 4 x (số C + số G) + 2 x (số A + số T)°C
%GC: 40% đến 60%
Ta: Tm - 5 °C
[C]: 0.1-0.5µM


PCR
MIX
5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC TCCTGTGCA TTTCGCCACTAGAG-3’
3’-TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC-5’
5’-ATTCCGATCGCTAATCGATG-3’
3’-CACGTAAAGCGGTGATCTC-5’
Tm=11x2+9x4=58
o
C
Tm=9x2+10x4=58

o
C
3. DNA polymerase:
enzym chịu nhiệt, xúc tác tổng hợp sợi DNA mới, kỹ
thuật đơn giản, đặc hiệu. [C]: 1-2.5 units
Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích
- Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt:
Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus
thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent)…
- Tổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp
như Ampli Taq, Vent (exo).
- Tổng hợp men polymerase
chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai
(proofreading) khi tổng hợp chuỗi
nucleic acid bổ sung (3-5 exonuclease)
như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu.




NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR

4. dNTP (deoxy ribonucleotid):
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
[C]: 20-200µM

5. Ion Mg
++
- cofactor của enzyme
MgCl2: 1.5 mM (0.75-4 mM)

6. Dung dịch đệm
pH 8.3-8.8



NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR

THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR

1. Máy luân nhiệt
(THERMOCYCLER)

(I) Thổi liên tục những
luồng khí nóng sinh ra từ
một đèn phát nhiệt vào
buồng ủ, hay luồng khí
lạnh sinh ra từ một dàn
lạnh của máy làm lạnh
(LightCycler – Roche).
(II) Dựa theo hiệu ứng
Peltier ngược.
Hai thanh kim loại nối với
hai cực của nguồn điện và
được điều chỉnh tự động
để chiều dòng điện đi qua
có thể thay đổi: bên này
nóng, bên kia lạnh. Khi
thay đổi chiều dòng điện thì
nhiệt độ của hai thanh

cũng thay đổi ngược lại:
bên này lạnh, bên kia nóng


THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR

MÁY LUÂN NHIỆT
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH PCR

1. Khuếch đại DNA đích
2. Phát hiện sản phẩm PCR (amplicon)
PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR
Điện di trên gel agarose
(submarine agarose gel electrophoresis)

phân loại DNA dựa vào kích thước

1. Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương, đoạn DNA có kích thước ngắn di chuyển nhanh
hơn so với đoạn có kích thước lớn.
2. Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu
trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan
sát dưới đèn UV
Chuẩn bị gel agarose