Tách chiết Chlorophyll A và chuyển hóa thành Chlorin-e6-Trimetyl Este để làm hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang

ĐẠI HỌC Q ư ỏ c GIA HA NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
;ịí ^ ^ ^
TÊN Đ Ể TÀI:
TÁCH CH1ÉT CH LO R O PH Y L L A VÀ C H U Y Ể N H Ó A
TH ÀNH CH L O RIN-e6-TR IM ETYL ESTE ĐÊ LÀM H O ẠT
CHẤT CHỮA TRỊ ƯNG T H Ư B Ầ N G LIỆU PHÁP Q U A NG
M Ã SỐ: QG-11-08
CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI : PGS. TS. TRẦN THẠCH VĂN
CÁC CÁN B ộ THAM GIA: TS. ĐOÀN DUY TIÊN
TS. TRẦN THỊ THANH VÂN
HVCH. TRẦN THỊ HIÈN
HÀ NỘI - 2013
c Á 0 ( c m r r ? ỉ , L
í. BAO CAO TOM TẢT:
n. "l en đề tài: Tách chiết chlorophyll (I và chuyển hóa thành chlorin-efi-trimetyl
estc đ ê là 111 hoạt ch ât chữ a trị 11 tì <4 thư bang liệu ph áp q ua ng
Mã số: Q G -11 -0 8
b. C hủ trì đề tài: PCìS. TS. Trần Thạch Văn
c. C ác cán bộ tham gia: TS. Đ oàn Duy Tiên
TS. Trần Thị Thanh vân
H VC H. Trần Thị H iền
(I. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
M ục tiên : Xây dựng quy trình tách chiết chlorophyll a từ vi khuẩn lam và chuyển hóa
thành ch lonn-e ó-triinetyl este để làm hoạt chất chữa trị ung thư bằng liệu pháp quang.
N ội (htiĩo:
• Ngh iên cứu quá trình chiết tách liên tục chlorophyll a từ vi khuẩn lam và thực
hiện phản ứng chuyển hóa chlorophyll a thành pheophytin a.
• Nghiên cửu quá trình chiết lách gián đoạn chlorophyll a từ vi khuẩn lam và
chuyển hóa trực tiếp thành metyl pheophorbide a bằng phương pháp chiết và
chuyển vị este một giai đoạn.

• N gh iên cứu phản ứng chuyển hóa m etyl pheophorbide a thành chlorin-er,-
trimetyl este bằng phản ứrm m ở vòng cacboxyclic.
• X ác định cấu trúc các sản phẩm trung gian và ch lorin-e6-trimetyl este.
e. C ác kêt q u ả đ ạt dirọc:
K ết quả thực nghiệm:
• Quy trình tách chiết và chuyển hóa chlorophyll a từ vi khuẩn lam thành chlorin-
e6-trimety] este có độ tinh khiết cao.
• Đ iều chế 2g chlorin-e6-trhnethyl este đủ để xác định cấu trúc và phục vụ cho
các nghiên cứu tiếp theo.
K é t quá c ôn g bố: Với kết quả dó đã cône, bố các côn g trình sau đây:
Trần Thạch Văn, Trần Thị Thanh V ân, Trần Thị H iền, Đ ặng Thị Thủy
A n,N guyên Anh D ĩìno, Đ oàn D uy Tiên, T ách ch iêt chloro phill a từ vi k huân
cy an o bacteria và chuy ến h óa thành p h eop h ytin a, Tạp chí Hóa học T.50 (4A ),
Ir. 2 88 -29 0, 2012.
- Trần Thị Thanh Vân, N guy ễn Thị H iển, Đ oàn D uy Tiên, P h ư o n g p há p m ói tách
chiết chlorophyll a và chuyển hóa một giai đoạn thành methylpheophorbicle
a, Tạp chí Khoa học và C ôn 2, ne;hệ, T .50 (3E), tr. 13 32-1337, 2012.
x é t quả đà o tạo: D ựa trên đề tài đà ctào tạo được
01 sinh viên làm ngh iên cứu khoa học năm học 20 11 -2012: Đặng Thị Thùy An
K 54A
- 01 sinh viên làm khóa luận tốt n°hiệp: N gu yễn A nh D ũng K 54A (năm 2013)
I liền H V C H khóa 20.
f. Tinh hình kinh phí cùa đề tài:
T ổng kinh phí được cấp cho v iệc thực hiện đề tài trong 2 năm là 160 triệu đồng
chủ yếu được dùng để mua hoá chất nghiệm. M ột phần khác được dùng để thuê m ướn
chuyên m ôn và lao động.
Đã quyết toán kình p h í của hai năm.
KIIOA QUAN LY
(Ký và ghi rõ ho tên)
CHỦ TRÍ ĐẺ TAI

(Ký và ghi rõ họ tên)
PGS. TS. Nguyên Thi Câm Hà
PGS. TS. Trần Thạch Văn
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỤ NHIÊN
a. R easerching Project: Isolation and transformation of chlorophyll a to chlorin-e,,-
trimethyl ester using for photodvnamic therapy of cancer
Code: Q T-10-18
b. Director: Tran Thach Van, A ss.Prof.Ph.D
c. Mem bers: - Doan Duy Tien, Ph.D
- Tran Thi Thanh Van, Ph.D
- Tran Thi Hien, M.s
d. Researching Attitudes and Contents:
- Researching A ttitudes: Build the process o f isolation chlorophyll a from
cyanobacteria and transformation to chlorin-e^-trimethyl ester using for photodvnamic
therapy o f cancer
- Researching Contents:
Study on process o f isolation consecutive chlorophyll a from cyanobacteria and
transformation chlorophyll a to pheophythine a.
Study on process o f isolation interruption chlorophyll a from cyanobacteria and
transformation direct to methyl pheophorbide a
- Study on reaction transformation methyl pheophorbide a to chlorin-e6-trimethyl
ester from open carboxyl cyclic.
- Study on structure o f mediation products and chlorin-e6-trimetyl este
e. Results:
• The process o f isolation and transformation chlorophyll a from cyanobacteria
to chlorin-e6-trimethyl ester with good pure
• Synthesis of 2g chlorin-e6-trimethyl ester
• Two reaserching paper has been submitted.
• The reaserching project has contributed to the graduations o f one bachelor, the
researchs o f one junior and one master.

II. SUMMARY:
MỤC LỤC
CÁC KÍ HIỆU VIÉT TẮT
D AN H M Ụ C BẢ N G BIẾU, HÌNH VẼ
MỞ ĐÀ U 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG Q U AN 3
1.1 Cấu tạo và tính chất của hệ quang hợp
3
1.1.] Cấu tạo và tính chất của hệ quane hợp ở thực vật và vi khuẩn 3
1.1.2 Chlorophyll 10
1.2 Giới thiệu về ngành vi khuấn lam ( ngành cyanobacteria)
13
1.2.1 Sơ lược về vi khuẩn lam 13
1.2.2 Cấu tạo tế b à o 15
1.2.3 Phân lo ại 15
1.2.4 Ỷ nghĩa thực tiễn 16
1.3 Tình hình nghiên cứu về chlorophyll a trong nước và quốc tế 17
1.4 Các dẫn xuất của chlorophyll a 18
1.5 Sinh tổng hợp chlorophyll a 19
1.5.1 Sinh tổng hợp axit 5-am inolevulinic 19
1.5.2 Sinh tổng họp pyrol (porphobilinogen) 20
1.5.3 Quá trình đóng vòng của 4 vòng pyrol (tetrapyrol) 21
1.5.4 Đưa ion Mg2+ vào hộ thống vòng 22
1.6 Tổng hợp loàn phần chlorophyll a theo W oodward

23
CHƯƠNG 2: TH ựC NGHIỆM 25
2.1 Mục tiêu thực ngh iệm 25
2.2 Xác định các tính chất vật lý 25
2.2.1 Sắc kí bản m ỏn g 25

2.2.2 Phổ hồng ngoại (1R) 25
2.2.3 Phổ cộng hựởng từ hạt nhân 25
2.2.4 Phổ khối (M S ) 25
2.2.5 Phổ tử ngoại 25
2.3 Nội dung nghiên cứu 25
2.3.1 Nội dung 1 25
2.3.2 Nội dung 2 27
2.3.3 Nội dung 3 28
2.4 Xác định cấu trúc các sản phẩm bàng phổ hồng ngoại, tử ngại và khả kiến, phổ cộng
huỏng từ hạt nhân và phổ khối 29
2.4.1 Cẩu trúc của pheophytin a 29
2.4.2 Cấu trúc của metyl pheophobide a 30
2.4.3 Cấu Irúc cua chlorin e<s- trimetylester 30
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ TH AO LUẬN 32
3 .1 Tách chiết và chuyên hoá chlorophvll a thành pheophytin a
32
3.2 Thực hiện phàn ứng chuvén hoá chloroph\ II a thành metvl pheophobide a 36
3.3 Chuyền hoá metyl pheophobide a thành chlorin - e h trimetylester

40
CHƯƠNG 4 : KẼT LUẬN 45
TAI LIỆU THAM K HẢO 46
PHỤ LỤC
CÁC KÍ HIỆU V IÉT TẮT
PS
: H ệ th ổnc quang họp
III : Phổ hồn° ngoại
u v - V I S
: Phổ tử n^oại và khả kiến
M S

: Phổ khối lirợns,
'H -N M R
: Phổ cộn g hưởng từ hạt nhân 'H.
M PP
: M elyl pheophobide a
pp
: Pheophvtin a
AT P
: A denosin Triphotphat
N A D P : N icotinam it Adenin D inucleotitphotphat
LHC
: Phức họp thu nhận ánh sáng
Bảig 1. 1:
Baig 3.1:
Bảig 3.2:
Bảng 3.3:
Hhh 1.1:
1-i'nh 1.2 :
linh 1.3:
Hiih 1.4:
Hiih 1.5:
Hhh ] .6 :
Hhh 1.7:
Hình 1.8:
Hình 1.9:
Hình 1.10:
Hình 1.11.
I-Inh 1.12:
Hình 1.13:
Hnh 1.14:

H nh 1.15:
H nil 1.16:
H nh 1.17:
H nh 1.18:
H nh 1.19:
H n h 1.20:
H n h 1.2 1 :
H nh 2 .]:
H nh 2 .2 :
H nh 2.3:
H nil 2.4:
*5 -í
DA NH M ỤC BẢNG BIÊU, H ÌNH VẺ
Thành phần của các chlorophyll khác n hau
Bảng dữ liệu phổ 'H-NMR của pheophvtin a

Bảng dừ liệu phổ 'H-NMR của metvl pheophobide a
377
Bảng dữ liệu phổ 'H-NMR của chlorin e6 - trimetylester

422
DA NH M ỤC HÌNH VẺ
Năng lượng bức xạ trong tone họp cua các phân từ hữu CO'

3
Các hệ thống quane hợp 4
Hệ thống ăng ten của các vi khuân t ía 5
Hấp thụ ánh sáng của hệ thốn2 ăng ten trong thực v ậ t

6

Caroten trong hệ quang hợp
6
Cấu trúc trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis 7
Chuỗi eletron vận chuyến của m àng th y lak oid
8
Cố định Cacbon c 6 theo chu trình Calvin-Benson
9
Cố định cacbon theo chu trình c 4

10
Công thức cấu tạo của chlorophyll a 11
Te bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena 15
Các hợp chất chlorophyll phổ biến trong tự n h iên
177
Các hoạt chất sử dụng để chữa trị ung thư bàng liệu pháp quang

1919
Sinh tổng hợp axit 5-aminolevulinic từ glyxin và sucxinyl-C oA

200
Sinh tông hợp axit 5-aminolevulinic 200
Quá trình tổng họp vòng p y ro l
211
Sự tạo thành tetrapyrol 211
Quá trình đóng vòng của tetrepyrol 212
Quá trình tạo thành protophvrin I X 222
Quá trình hình thành phân tử chlorophyll a[l0'30'331 233
Tổng họp chlorophyll a theo W oodward

244

Chuyển hoá chlorophyll a thành pheophytin a
266
Chuyển hoá chlorophyll a thành metyl pheophobide a

277
Chuyển hoá trực tiếp thành metyl pheophobide a từ vi khuẩn lam

28
Chuyển hoá metyl pheophobide a thành chlorin e6- trimetylester

29
lình 3.1: Phố h ồn” ngoại của pheophvtin a
344
linh 3.2: Phổ u v - VIS của Pheophvtin a 344
lình 3.3: Phô khối cùa pheophytin a
355
lình 3.4: Phổ 'H-NM R của pheophvtin a
355
lình 3.5: Phô hồng ngoại của metvl pheophobide a 38
-lình 3.6: Phổ u v - VIS của metyl pheophobide a 3838
lình 3.7: Phổ khối của metyl pheophobide a 39
-lình 3.8: Phổ 'H - NMR của pheophobide a
39
lình 3.9: Phổ u v - VIS cùa chlorin e6 - trimetylester
433
-lình 3.10: Phổ hồng ngoại của chlorin e6- trim etylester 433
lình 3.1 1: Phổ khối cùa chlorin e6 - trimetvlester 44
-linh 3.12: Phồ 'H -N M R của chlorin e6 - trimetylester 444
M Ở Đ À U
Từ làu các nhà khoa học rất quan tâm tói việc chiêt tách các sẳc tố từ lá xanh của

thực vật bậc cao. Cách đâv hon 100 năm các nhà hóa học đã tách được chất màu xanh
lừ lá và liọi chúns là Chlorophyll. Vào năm 1913, Richard Willstatter. nhà hóa học
người Đức đã chi ra rang tất cả các năng lượng sống đều nhờ mặt trời và cây xanh có
một cách nào đó để hấp thụ năng lượng này. Tới năm 1919. ông đã giải thích được
chức năng cua hợp chất hâp thự năng lượng mặt trời chính là Chlorophyll. Thực vật
bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ năng lượng bức xạ và chuvền hóa thành năng
lượng dự trữ trong cơ thể.
Chlorophyll giữ vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình quang họp. là chất hấp
thụ năng lượng ánh sáng trong hệ quang hợp. Chlorophyll chuyên năng lượng ánh
sáng thành năn2, lượng hóa học trong phân tử ATP. trong quá trình này xảy ra các phản
ứníỊ chuyên dịch electron (phản ứng oxy hóa khử).
Chlorophyll và các dẫn xuất của chúng là một đối tượng nghiên cứu hấp dẫn và
trở thành một lĩnh vực phát triển rộng lớn và được các nhà khoa học quan tâm bao
gồm các nghiên cứu về hệ thơm, khả năng hấp thụ ánh sáng, chuyển dời điện tích, tính
chất phổ, sinh tồng hợp và các nghiên cứu y dược.
Chlorophvll và các dan xuất của chúng có nhiều ứng dụng khác nhau trong y học
và công nghiệp. Trong y học, chlorophyll được dùng như một thành phần cơ bản trong
khẩu phần ăn kiêng và thuốc chừa bệnh. Chẳng hạn, Cu-chlorophyllin phòng chống
uns thư từ thức ăn bị thiu mốc chứa hydrocacbon mạch vòng, atlatoxin. Chlorophyll
và các dẫn xuất còn được sử dụng như là chất nhạy sáng đế tiêu diệt các tế bào ung thư
và chống virus, chat chừa vet thươne và khử mùi hôi.
Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kích thích việc phục hồi các mô đã bị
hư hại và ngăn càn tác hại của các chất gây une, thư. Chlorophyll còn có lợi cho hệ tiêu
hoa và có tác dụng dưỡng da.
Một số dẫn xuất chlorophyll có hoạt tính sinh học quí giá như tiêu diệt tế bào ung
thư tủy, virus leukemia, u ác tính (malignant melanoma) theo cơ chế quang trị liệu.
Chlorophvll còn có tác dụna giảm viêm khóp (arthritis), chữa trị u xơ. giảm mùi hôi.
giảm đường máu của người bệnh cao tuổi.
1
Chlorophyll là một nhóm các hợp chất đa dạng bao gồm chlorophyll (a, b. c.

d, ). trong đó chlorophyll a phô biến nhất trong tự nhiên, đó là chlorophyll trong hệ
quang hợp cua thực vật bậc cao. táo biển và vi khuẩn quana họp. Trona thực vật bậc
cao hệ thông quang hợp có cấu tạo rất phức tạp và chứa nhiều loại chlorophyll khác
nhau. Ọuá trình tách các chlorophyll ra khỏi nhau rất khó khăn và phức tạp. Trong các
loại vi khuân quan? họp thì vi khuẩn lam có cấu tạo hệ quane hợp đơn giản nên việc
phân lập dễ đàne hơn. Vì vậy chúng tôi đã lựa chọn đề tài “ Tách chiết chlorophyll a
và chuyến hỏa thành chlorin-e(-trỉm etyỉ este đ ể làm hoạt chấ t chữa trị ung thư bằng
liệu pháp quang" làm đề tài cho nhóm nehiên cứu của mình, với mục đích góp phân
vào việc nghiên cứu trong lĩnh vực hóa học về Chlorophyll chúng tôi tiến hành nghiên
cứu tách chiết Chlorophyll a ra khỏi Tảo lam một cách hiệu quà ớ qui mô phòng thí
nghiệm và từ đó chuyển hóa Chlorophyll a thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học
(chlorin-e6-trimetyl este). Chúng tôi hy vọng sẽ sử dụng những kết quả thu được trong
quá trình thực hiện đề tài làm tiền đề cho những nghiên cứu sau, phục vụ cho mục đích
chuyển hóa Chlorophyll a thành những hợp chất có thể sử dụng làm thuốc chữa trị ung
thư bằng liệu pháp quang, một phương pháp tiên tiến hiện đang được các nhà khoa học
trên thế giới nghiên cứu phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
2
CHƯƠNG 1 : TÒNG QUAN
1. 1. Cấu tạo và tính chất của hộ quang họp
1. 1. 1. Cấu tạo và tính chat của hệ quang họp ở thực vật và vi khuẩn
Quang hợp là cơ sở năng lượng cua sự sốne trên trái đất. Chỉorophvll hấp thụ
năns ánh sáng mặt trời và chuyển quansi năng thành hóa năng bời trung tâm phan ứng
trong hệ quang họp cùa vi khuẩn và thực vật dưới dạng N ADPH và ATP được sử dụng
đề tổng họp cacbohydrat (hình 1.1).
Anoxygenic
Reducing power Carbon
H S
SO /
Energy •G power
Oxygenic

Carbon
• i
W*Y
A
t
/
3P
^ A L
' 1
/
^ W \
P A / V
i
\
k
\
V
ĩ
hv
hv
(CH?0)n
“'ATP
Ị p 0,
'CHO;,.
^W \
nv
ATP
Hình 1.1: Năng lượng bức xạ trong tổng hợp của các phân tử hữu cơ
Các chlorophyll hấp thụ và biến quang năna thành hoá năng với hiệu suất cao.
Các hệ thống quang hợp (PS) (hình 1.2) được phân loại theo cấu trúc của trung tâm

phản ứng chia thành PSI cùa V I khuẩn lam, PSII cùa thực vật bậc cao và PS của vi
khuân tía đêu bao gồm bốn thành phần chính là ăng-ten thu sáng, trung tâm phản ứng,
trung tâm chuyển điện tử và bộ máy cố định cacbon. (3''1
3
&
cyì
^hotosysteT. lỉ
D1 D2
* ' ■ ■ } 'Ã P !: W
M l ! Vb® L V " JL T y J #
LHCf: CP 43 ^ CP 47 ; HC li
FeS
Pno*osybt3'
03 !
a
■
PsaA . P C ; PsaB
//in/; 1.2: Các lìệ tlĩống quang hợpj281
Trung tâm phản ứng của vi khuẩn tía gồm các tiểu đơn vị protein L và M liên kết
với các sắc tố hoạt động và có đối xứng bậc hai. Trung tâm phản ứng được bao quanh
bởi hệ thống ăng ten thu sáng (LH1). Các electron được chuyển vào trung tâm phàn
ứng của một heme-binding cytochrome (cyt).
Trong PSII gồm protein DI và D2 có cấu trúc và chức năng tương đồng với các
tiêu đơn vị L và M của trung tâm phản ứng ở vi khuẩn. Năng lượng ánh sáng được hấp
thụ bởi LHCII và chuyển vào trung tâm phản ứng bởi protein-chlorophyll CP43 và
CP47. Quá trình chuyển dời điện tích thực hiện bởi phức họp của mangan để ôxi hóa
nước và giải phóng oxi vào khí quyển.
Trong PS I, các protein PsaA và PsaB tạo thành một heterodimer giống PSII. Mồi
PsaA và PsaB bao gồm một trung tâm phản ứng tương đương với DI hoặc D2 và một
ăng ten tương đương với CP43 hoặc CP47. Điện tử được lấy từ plastocyanin (PC) ờ

bên trên lumen và chuyên đến sắt sunfua (FeS) ở phía trên stroma để khừ N A D P J
thành NADPH [28].
Hệ thống ăng ten (hình 1.3 và hình 1.4) được tổ chức để thu nhận năng lượng
bằng chuyển electron từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích và chuyển tới
4
trung tâm phản ứnẹ là nơi phản ứnơ quane hoá diễn ra. cấu tạo cua ăng ten LH1 bao
gôm một heterodimer cùa chuồi peptit và hai phân tứ chlorophyll a hoặc b. LH2 bao
gồm một heterodimer của chuồi peplit và ba phân tử chlorophyll a hoặc b. Các sấc tố
khác như caroten (h ìn h ỉ .5) không hoạt động hoá học nhimg có chức năng như một
ãng ten.
Hình 1.3 : Hệ thống ăng ten của các vi khuẩn tíaJ2V/
Hệ thống ăng ten tăng hiệu quả hấp thụ photon bằng cách tăng sổ lượng sắc tổ để
hấp thụ trong dải sóng từ 400nm-800nm. Nếu cường độ của ánh sáng mặt trời thấp,
mỗi phân tử chlorophyll chi hấp thụ một vài photon trone một giây. Bằng cách kết
hợp nhiều chất màu để hấp thụ ánh sáng hiệu suất quang có giá trị cao
n h ấ t j l.4 .7 ,1 ,5 .2 6 .2 7 .2 9 ]
5
H ìn h 1. 4: H ấp thụ á nh sán g của hệ thống ăng ten trong thự c vật1'51
Hình 1.5: Caroten trong hệ quang hợp.
Trung tâm phản ứng của hệ quang hợp bao gồm hàng trăm chlorophyll và một
cặp chlorophyll có t ổ chức đặc biệt, nhờ cấu tạo này mà sự chuyển dời điện tích
xảy ra để thực hiện phản ứng khư NAD+ thành NADPH. Phản ứng ở trung tâm
phản ứng loại I không có sự tạo thành oxy trong khi ở trung tâm phản ứng loại II
oxy được tạo thành.
Trung tâm phản ứng của vi khuẩn Rhodopseudomonas virdis bao gồm bốn tiêu
đơn vị protein {hình 1.6) và các nhóm hoạt động bao gồm chlorophyll dime có tô
c h ứ c đ ặ c b i ệ t , h a i p h â n t ử p h e o p h y t in , p h â n t ử q u i n o n Q A , p h â n t ừ q u in o n Q b v à một
ion sắt (Fe). Chuỗi chuyển dời điện tích bất đầu từ Chlorophyll monome phía bên trái
6
qua chlorophyll dime sang pheophytin đến Chlorophyll monome phía bên phai rỏi

qua pheophvtin phía bên phai tới Quinon A sang Fe và chuyên vê pheophvtin phía bên
trái và trơ về Chlorophyll monome ban đâu. Năng lượng kích thích của electron đâ
dược sư dụne đê tông hợp ATP cao năne từ ADP. Đó chính là cơ sở và bản chất của
quá trình quang hợp.
Hình 1.6: cấu trúc trung tâm phản ứng trong hệ quang hợp
của vi khuẩn Rltodopseudomonas virdis J61
Chuỗi vận chuyển điện tử là những hệ thống của các protein và enzyme thông
qua đó các electron di chuyển từ mức năng lượng cao hơn về một mức độ năng lượng
tháp một cách điều hòa để nâne cao hiệu quả sử dụne năng lượng (hình 1.7). Trong
7
chuỗi vận chuyên điện tử cùa màng thvlakoid bao gồm các enzvm khư săt.
plastoquinon oxiđoreductase và enzvm ATP sỵntase. Dò nạ electron tách ra từ phân tư
nước tới NADP dưới tác dụna cua PS. Chuồi vận chuyển proton thực hiện qua màng
thvlakoid và được sử dụntĩ để tổng hợp ATP. Khi các electron di chuyên vào chuỗi vận
chuyên, các protein luân phiên bị oxi hoá và giải phónạ ra proton đi vào trong màng
thvlakoiđ. Nêu không có chuỗi vận chuyên điện tử từ trạng thái năng lượng cao đên
trạng thái năng lượng thấp thì sự mất mát năng lượng; xảy ra quá nhanh dẫn đên các tê
bào sử dụng năng lượng ánh sáng với hiệu suất quá thấp.
chloroplast stroma
f e rr e d o x in -N A D P r e d u c t a s e
ADP
nil:
t ^ FNR;
i F d - r - f e r r e d o x in
i i f f i i l
ilitl
L ^
~ '\ \ ÁTP
I ) -
1/ ; ^

: ) r
» I
• i
I •
/ / 'A T P s y n t h a s e
OXOXCQ
iilpMillll
họ
plastoqúinone Ỷ ' **►: P C ;-•*»•* v'ỉaỉ*sLw-i
piastocyanin
< V' { H* L
___
■ \
o , ) (H* j



7 / /
Kz3
o x y g e n - e v o lv in g c o m p l e x
thylakoid lumen
Hình 1.7: Chuỗi eletroỉi vận chuyển của màng thyìakoid
Cacbohydrat được tổng họp từ khí cacbonic và nước trong pha tối của bộ máy cô
định cacbon bằng cách sử dụng xúc tác enzyme và năng lượng từ ATP hoặc NADPH
theo chu trình Calvin-Benson C(S (hình 1.8) hoặc chu trình c 4 (hình 1.9).
8
Hình 1.8: cổ định Cacbon c 6 theo chu trình Calvirt-Benson
Cô định Cacbon dioxit theo chu trình Calvin-Benson C6 xảy ra trong stroma của
lục lạp gồm 3 chuỗi phản ứng khác nhau. Pha đầu là phàn ứng của dẫn xuất đường 5
ribulose-l,5-bisphotphat với CƠ2 và phân cắt dẫn xuất đường 6 thành hai phân tử

3-photphoglyxerat. Pha hai là quá trình tái tạo CO' chất ribulose-5-photphat còn pha ba
là phàn img của ribulose-5-photphat với ATP tạo thành ribulose-1.5-bisphotphat. Quá
Irình cố định CO2 xúc tác bởi enzym ribulose-l,5-bisphosphat cacboxylase oxygenase
(RuBisCO). phản ứng của RuBisCO với 0 2 hoặc C 0 2 phụ thuộc vào nồng độ tương
dổi của chúng. Trong tất cả các sinh vật. C 0 3 là chất nền ưu tiên, nếu nồng độ C 0 2 trở
nên thấp hơn nhiều so với nồng độ oxy thỉ sự hô hấp xảy ra ơ mức độ đáng kê.
Hình 1.9: c ố địnlì cacbon theo chu trình c 4
Ờ một số loại thực vật, cơ chất cho quá trình cố định CO2 là phosphoenolpyruvate
(PEP) theo chu trình C4. Tỷ ]ệ sử dụng ATP cho cố định CO2 trong thực vật theo chu
Irình c 4 cao hơn so với chu trình c 6.
1.1.2. Chlorophyll
1.1.2.1. Cấu tạo và tính chất cùa chlorophyll
a. Cau tao
Có 5 loại chlorophyll bao gồm chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c,
chlorophyll d. chlorophyll e. 0 thực vật bậc cao chỉ có 2 loại chlorophvll a và b; còn
chlorophyll c. d. e có ơ vi sinh vật, rong. tảo. vi khuân.
Vê công thức câu tạo. phân tứ chlorophyll a chia ra hai phân: nhân chlorophyll và
đuôi phân tử chlorophyll.
o p h y tvl 1
chlorophyll a
phyty I =
Hình 1.10: Công thức cấu tạo của chlorophyll a
Chlorophyll cl Chlorophyll c2 Chlorophyll d
C3sH,o05N,Mg C35H2805N4Mg C54H7o06N4Mg
-ch= ch2 -c h = c h 2 -c h o
-c h 3 -c h 3 -c h 3
-CH2CH3 -c h = c h 2 -CH2CH3
-CH=CHCOOH -CH=CHCOOH -CH-CH;COO -
Phytyl
Kép Đon Kép

Các loại tào khác Các loại tảo Vi khuẩn lam
nhau khác nhau (cyanobacteria)
Bảng 1.1: Thành phần của các chlorophyll khác nhau
Nhân chlorophyll là phần quan trọng nhất trong phân tử diệp lục. gồm 1 nguyên
tử Mg ở trung tâm liên kết với 4 nguyên tử N của 4 vòng pyrol trong đó có 2 liên kết
phôi trí. Phần nhân chlorophyll bao gồm 4 vòng pyrol liên kết với nhau qua liên kết
metylen, do có mạch liên hợp dài, phân tử chlorophyll có khả năng hấp thụ ánh sáng
rất mạnh.
Đuôi phân tử chlorophyll là gốc rượu phytol có 20 nguyên tử cacbon. Đuôi
chlorophyll có tính ưa lipit nên có vai trò định vị phân tử chlorophyll trên màng quang
họp thilakoit có tính lipit.
II
Chlorophyll a Chlorophyll b
Cphfniùic ^ H 720 5N4Mg C55H7o06N,Mg
Nhỏm C3 -CH=CH2 CH=CH2
Nhóm C7 -CH3 -CHO
Nhóm C8 -CH2CH3 -CH2CH3
-CH,CH2COO- -CH^CH?COO-
Nhóm Cl/ "7 ■ ,
Phvtyl Phytyl
Liên kết _ „
c 7 C18 n
Tần suất Phổ biến Đa số thực vật
/>. rinh chắr của chlorophyll
♦í* Bản chất hoá học của chloroph) II
Chlorophyll khôno, tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ. Khi muốn
chiêt xuât chlorophyll ra khói lá xanh phải dùng các dung môi như este. axeton. rượu,
benzen.
Chlorophyll là este cua axit chlorophvllic với hai rượu là phytol và metanol nên
chun ạ có các phản ứng đặc trưng của một este là phàn ứng xà phòng hoá khi tác dụng

với kiềm đê tạo nên muối chlorophylat vẫn có màu xanh.
Cl 1,011
c 20h 39oh
Chlorophyll a
Chlorophyll tác dụng với axit để tạo nên hợp chất pheophytin có kết tủa màu nâu,
trong đó nhân Mg bị thay thế bới 2H. Pheophytin không hoạt động huỳnh quang như
diệp lục. Điều đó chứng tỏ nguyên tử Mg có vai trò rất quan trọng quyết định tính chất
quang hóa của diệp lục.
M g: ~
C hloro p h y ll a Pheophytin a
Pheophytin có thê tác dụng với một kim loại khác và kim loại này sẽ đây 2H đê
thav thê vào vị trí của Mg tronạ phân tử chlorophyll tạo nên hợp chât có màu xanh rât
bền. Trong môi trường axit mạnh, đun nóng, pheophytin có thể bị thủy phân liên kêt
este với rượu phytol tạo thành hợp chất pheophorbide.
12
Sư mất màu cua diệp lục: Chlorophyll ờ tronc tế bào khó bị mất màu vì năm
t:ong phức hệ với protein và lipit. Trong dung dịch, có ánh sáng và (X chlorophyll sẽ
nat màu do phản ứng quang oxi hoá.
❖ Tính quang học của diệp lục
Tính huỳnh quang: Khi quan sát ánh sáng phản xạ từ dung dịch chlorophyll thây
cung dịch có màu huyết dụ. nếu tat neuồn sáng thấy dune dịch có màu xanh như cũ.
Tính lân quang: cũng gần tươne tự như huỳnh quang nhưna chỉ khác là khi
tắt nguồn sáng thì ánh sáng màu huyết dự còn lưu lại một thời íịian ngắn nữa.
1.1.2.2. Vai trò cua chlorophyll trong hệ quang hợp
Hấp thu năng lượng ánh sán li mặt trời: nhờ cấu trúc đặc trưng của phân từ
chlorophyll mà nó có thê hâp thụ năng lượng ánh sáng với hiệu suât cao.
Vận chuyên nănc, lượng vào trung tâm phản ứng: từ phân tử chlorophyll hấp thu
ánh sáng cho đến trunu tâm phản ứng của quang hợp phải qua một hệ thông cấu trúc
trong màng thilakoid gồm rất nhiều phân tử chlorophyll khác nhau. Năng lượng ánh
sáng phải truyền qua các phân tử chlorophyll đề đến được trung tâm phản ứng.

Tham gia biến đổi năng lượng ánh sáng thành năng lượng hoá học tại trung tâm
phản ứng.
1.2. Giới thiệu về ngành vi khuẩn lam (ngành cyanobacteria)
1.2.1. Sơ lược về vi khuần lam
Vi khuẩn lam có sức sống rất dẻo dai, chúng phân bô rộng rãi trong tât cả các
môi trườn LỊ. Đại bộ phận sổng trong nước ngọt, ớ các ao hồ có nhiều chất hữu cơ và
góp phần hình thành hệ sinh vật nổi (plankton) cua các thủy vực; một số phân bô trong
nước mặn hoặc nước lợ, bùn lầy hay đất ẩm ướt, trên đá, trên vỏ cây âm, ngay cả
những nơi có điều kiện rất khấc nghiệt như trong tuyết và ở nhũng suôi nước nóng đên
69°c.
Vi khuẩn lam thuộc loại ưa nhiệt, có tính bền vững với nhiệt độ. Nhiều loài có
thè phát triển ở nhiệt độ cao, cả trong các suối nước nóng (70 - 80°C). Tảo lam có thể
chịu được nhiệt độ cao như vậy là nhờ trạng thái keo đặc biệt của chât nguyên sinh.
Mặt khác, một số vi khuẩn lam cũng có khả năng tồn tại ở nhiệt độ thấp (những vi
kluiân sổng trong băna, tuyết, hay ở Nam cực. nhiệt độ tới -83°c vẫn tìm thấy một
lượnc lớn vi khuân Nostoc).
13
Vi khuẩn phát triển mạnh ờ nhiệt độ cao (vào các tháng nóna. trons. năm). Với
các \i khuân nước nyọt. nhiệt độ phát triển thích hợp là 30°c.
Khi sinh trướng phát triẽn mạnh, vi khuẩn gâv nên hiện tượng "nước nơ hoa".
Tuy ihiên. một số loài thuộc chi Osciỉìatoria lại gây “nước nở hoa” trên băng ở nhiệt
tíộ cản 0°c. Khi có hiện tượng “nước nở hoa’' do vi khuẩn lam gây ra thì nước không
sử dune được vì khi đó sinh khối cùa tảo đạt tới mức khá lớn (tối đa tới 450-500g/nr)
mà trong đó rất ít loài có thể dùng làm thức ăn cho các sinh vật khác, sau đó chúng
chết hàng loạt và phân hủy. Các chất do vi khuẩn tiết ra và các sản phẩm phân hủy cua
chúng khi chết đều gây hại.
Trong số các cơ thể tự dưỡng được thì vi khuẩn lam được xem là nhóm nguyên
thủy nhất. Di tích hóa thạch của các vi khuân lam dạng sợi phát hiện được cách nay
khoảne, 3.5 tỷ năm. Mặc dầu tế bào không có cấu trúc phúc tạp so với các vi khuân
khác nhưng nó vẫn là đại diện có vai trò quan trọng ở các hệ sinh thái. Vi khuân lam là

sinh vật quang họp đầu tiên tổng hợp chất hữu cơ và cũng là tế bào đầu tiên có hai hệ
thống tiếp nhận ánh sáng (hệ thống quang loại ĩ và II) và giải phóng Oi. Nhiều loài vi
khuẩn lam có khả năng cố định đạm, chuyển Nitơ trong khí quyển từ thể tự do sang,
dạng Nitơ sử dụng được như amoni ( N H ị), amino axil và một loạt hợp chất nitơ khác.
Vi khuẩn lam chưa có nhân điển hình, không có màng nhân, vật chất di truyền
được tập trung trong chất nhân (nucleoid), khône có lưới nội sinh chất, ty thể, thể
golgi. lạp thể và không mang roi, chỉ chứa chlorophyll, sắc tố liên kết với protein
thường làm cho chúng có màu lam (có khả năng tự dưỡng). Chúng cũng chưa có sự
sinh dục hữu phái.
về tồ chức cơ thể, vi khuẩn lam có cấu tạo dơn giản, một sổ có dạng đom bào.
phần Ị ớn dưới dạng tập đoàn hay đa bào hình sợi, hình chuỗi hạt đơn hay phân nhánh.
Đại đa số tế bào vi khuẩn lam dạng sợi - chuỗi hạt thường có tế bào dị hình (dị
bào). Dị bào là những tế bào dặc biệt, lớn hơn các tế bào bình thường khác, có màng
đôi. dày. trong suốt, không có oxy và lthông có hệ thống quang II do đó không sản
xuất ra oxy trong quá trình quang hợp. DỊ bào có 1 hoặc 2 lồ (ở đầu tiếp xúc với tế bào
dinh dưỡng) tùy theo vị trí ờ đầu hay ờ giữa sợi (đặc biệt trong phân loại) qua đó lưu
thông tế bào chất với các tế bào nằm cạnh nó. Khoảng cách của di bào trên sợi chịu
ảnh hưởng của các yếu tố môi trường. Dưói kính hiển vi quang học. chât tế bào trông
14
đồng nhát nhưno dưới kính hiển vi điện tử nó có một hệ thống màns. thườnơ có màu
xanh vànu do có chlorophyll a và caroten nlurnu thiếu phycoxyanin.
Dị bào có vai trò trong việc cố định đạm tronẹ điều kiện hiếu khí.
Trong sự phát triển của sợi, sợi có thể bị tách ra ờ hên cạnh các dị bào này và tạo
thành một nhánh mới đi ra từ sợi chính. Đó là sự phân nhánh giả cua sợi. phân biệt với
sự phân nhánh thật được bắt đầu từ một tế bào sinh dưỡng nào đó của sợi phân chia
đọc và sau đó tế bào non mới hình thành tiếp tục phân chia tạo nhánh bên.
1.2.2. Cấu tạo tế hào
Màng tế bào vi khuân lam khá dầy. gồm 4 lớp, bên ngoài thường hóa nhầy, có
khi tạo thành bao chuyên hóa. bao xung quanh tế bào hoặc nhóm tế bào hay toàn bộ
Chất nguyên sinh ở vi khuẩn lam được phân biệt thành 2 phần:

- Phần ngoài tập trung các phiến mỏng quang hợp (lamen), thể ri bô và các thể
hạt (hạt chât tê bào) khác.
- Phần trong chứa chất nhân (nucleoprotein). Ở giữa ranh giới giữa 2 phần không
rõ ràng chỉ nhận ra khi dùng phẩm Feulgen nhuộm trung bào chất chứa chất nhân.
Các chất màu (sắc tố) phân bố trên các lamen ở phần ngoài nên phân này có màu
(xanh đen hoặc xanh lục).
( ’hất màu gôm có: chlorophyll a (có màu lục); phycoxyanin màu lam và
phycoerythrin màu hồng và các dẫn xuất của caroten. oxycaroten.
Chất dự trữ cua tế bào là glycogen, volutin, không có tinh bột.
1.2.3. Phân loại
Ngành vi khuẩn lam có khoảng 1500 - 2000 loài, tập hợp thành một số bộ, họ
khác nhau. Hiện nay con số các bộ không thống nhất tuỳ theo tác giả. Có người chia
Hìnlí ỉ. 11. Te bào dị hình (*) ở Tảo Annabaena
ngành này thành 3 lớp với nhiều bộ, có người lại chia thành 1 lóp với 4 bộ:
Bộ Chroococcales: Vi khuẩn đơn bào. đơn độc hay tập đoàn. Tế bào tròn không
phàn biệt gốc và đỉnh, khônụ có nội và ngoại bào tử.
Tê bào đơn độc hay tập doàn nhưng không sãp xếp thành hàng hay sợi (họ
Chroococcaceae). thường gặp như: Chroococcus, Microcvstis.
Bộ Dermocarpales: đơn bào.
Bộ Pleurocapsales: Vi khuân đa bào dạns sợi đơn, có phân nhánh hoặc không,
sinh sản cách phân chia tế bào hoặc nội bào tư.
Các chi điên hình: Cyanocystis, Pleurocapsa.
Bộ Hormogonales: đa bào dạng sợi lông, hoặc phân nhánh, thường có tê bào dị
hình, có khi sợi lại tập hợp thành tập đoàn.
Các chi điển hình: Nostoc, Anabaena. Aphanizomenon,
Tác giả khác lại chia thành 2 bộ: Chroococcales với những dạne đơn bàn hay tập
đoàn và Honnogonales với những dạng đa bào.
1.2.4. Ý nghĩa thực tiễn
Trong thực tiễn, vi khuẩn lam có vai trò tích cực và tiêu cực
Trong nông nghiệp, vai trò quan trọng của vi khuẩn lam là làm tăng độ phì cho

đất nhờ khả năng cố định đạm. Hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng 50 loài, phần lớn
thuộc họ vi khuẩn chuồi (Nostocaceae) có khả năng này. Đặc biệt đáng chú ý là loài
Anahaena azollae cộng sinh trong bèo hoa dâu. một loại cây dùng làm phân xanh và
là m t h ứ c ă n g i a s ú c c ó V n g h ĩa k i n h t ế r ấ t lớ n ở n ư ớ c ta .
Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ sự phát triển của vi khuẩn lam trong ruộng
lúa mà hằng năm mỗi hécta đất trồng lúa có thể lấy được thêm từ không khí khoảng 15
- 50 kg nitơ. trung bình là 20 - 25 kg. đôi khi thu được đến 80 kg hay nhiều hơn nữa.
Những năm gần đâv. một số vi khuẩn lam có hàm lượng protein cao như Spirulina
maxima, s. platens is được nuôi trồng với quy mô công nghiệp để thu sinh khối nhằm bô
suns nguồn protein cần thiết cho chăn nuôi và cho con người.
Vi khuẩn lam tích lũv ờ đáy thủy vực, tham gia vào việc hình thành bùn sapropen
được dùng lảm phân bón. thức ăn gia súc giàu vitamin, chế biến làm than côc. khí hơi
và dùng chữa bệnh
Một số vi khuẩn lam được dùng làm thức ăn cho người như Nostoc commune,
16