Nhân bản, biểu hiện tiết và đặc tính của tái tổ hợp β-annanase từ Bacillus circulans NT 6.7

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Nhân bản, biểu hiện tiết và đặc tính của tái tổ hợp β-mannanase từ Bacillus circulans NT 6.7
GVGD: TS.Đỗ Biên Cương
SVTT: Bùi Trung Hiếu
MSSV: 20112988
Mục lục
i. giới thiệu
1. mannan
2.manose
3.beta-mannanase
ii. Chuyển gen
1. nuôi cấy và nhân bản
2. xây dựng plasmid tái tổ hợp
3. biểu hiện
4. kết quả
1. mannan
-Mannan là một loại polysaccharide không bột với đơn phân là đường mannose.
-Là đơn vị lưu trữ polysaccaride trong tế bào.
-mannan có ở vách tế bào nấm men, thực vật
( đậu tương, cao lương, cám gạo,…)
I. GIỚI THIỆU
2. Mannose
điều chỉnh hệ thống miễn dịch
- bề mặt của các đại thực bào có thể nắm bắt kháng nguyên.
- tăng trong chữa lành vết thương
- tác dụng chống viêm
- ức chế sự phát triển khối u và di căn, tăng ung thư sống sót
- tránh nhiễm khuẩn nhất định, chẳng hạn như nhiễm trùng đường tiết niệu.
I. GIỚI THIỆU
3.βeta-mannanase
- beta-mannanase là một endohydrolase, xúc tác thủy phân ngẫu nhiên liên kết

mannopyranosyl β-1,4-D trong huỗi chính của polysaccharides mannan.
- beta-mannanase được sản xuất bởi nhiều loại vi sinh vật Nó có thể được sử dụng rộng
rãi trong một loạt các thức ăn dinh dưỡng để cải thiện khả năng tiêu hóa và động vật
hoạt động sản xuất để tăng hiệu quả kinh tế.
I. GIỚI THIỆU

nguyên tắc chung
Sinh vật cho gen Vector biểu hiện
DNA tái tổ hợp
Chuyển vào tế bào đích
biểu hiện gen mong muốn

II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE
Tiến hành chuyển gen mã hóa b-mannanase từ B. circulans NT 6.7 biểu hiện trên tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) sử dụng vector biểu hiện
plasmid pET-21D với việc sử dụng vi khuẩn E. coli DH5α làm vật chủ tách dòng gen.
II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE
Tiến hành
1. nuôi cấy và nhân bản
- B. circulansNT 6.7 đã đ c nuôi trong Luria-Bertani (LB) trung bình 37 ° C v i l c 200 rpm đ phân l p các gen DNA.ượ ở ớ ắ ở ể ậ
-
Gen mannanase c aủ B.circulansNT 6.7 đ c thu th p b ng cách s d ng nhân b n PCR (1083 bp).ượ ậ ằ ử ụ ả

II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE
2 Xây dựng các plasmid tái tổ hợp
- DNA của B. circulans NT 6.7 được chiết xuất bằng cách sử dụng các vi khuẩn ™ Illustra genomicPrep Thống spin Kit.
- Mồi F1 (ATGCTTAAAAAGTTAGC AGTCTGYCT)
R1 (TTATTCCGCGATCGGCGTCAA
- Khuếch đại được thực hiện bằng cách sử dụng Dream® Taq DNA polymerase
- chu kỳ phản ứng:
+ ban đầu ở 95 ° C trong 5 phút

+ 30 chu kỳ của 95 ° C trong 1 phút
+ 55 ° C trong 1 phút và 72 ° C trong 2 phút
+ cuối cùng ở 72 ° C trong 5 phút.
+ Các sản phẩm khuếch đại được gắn vào các pGEM-T dễ dàng vector và chuyển đổi thành E. coli DH5α để sắp xếp.


II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE
3 Biểu hiện của mannanase
- E. coli BL21 (DE3) được cấy vào 100 ml LB trung bình 100 mg / ml ampicillin.
- ủ ở 37 ° C và 200 rpm cho đến khi OD600 đạt 1.0
- thêm IPTG với nồng độ là 0,1, 0,5 và 1,0 mM.
- Sau khi IPTG cảm ứng, việc nuôi cấy tiến hành ở 18 ° C với 200 rpm trong 16, 18 và 20 giờ.
- Các tế bào được thu hoạch bằng ly tâm ở 8000 rpm, 4 ° C trong 30 phút.
- rửa hai lần với 50 mM potassium phosphate đệm pH 6,0 và sau đó lơ lửng trong cùng một bộ đệm.
- Chiết xuất tế bào bằng ly tâm ở 13.000 rpm trong 3o phút.

II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE
4. kết quả
-
Gen mannanase đ dài đ y đ c aộ ầ ủ ủ B.circulansNT 6.7 bao g m trình t tín hi u ban đ u c a nó đã đ c nhân b n vô tính thành pET21d, và gen có th đ c ồ ự ệ ầ ủ ượ ả ể ượ
th hi n thành công trongể ệ E.coliBL21 (DE3) đi u khi n b i promoter T7 RNA polymerase.ề ể ở
- Sau khi c m ng v i n ng đ khác nhau c a IPTG, ho t đ ng β-mannanase đ c đo c hai n n văn hóa n i và t bào lysate phân s .ả ứ ớ ồ ộ ủ ạ ộ ượ ở ả ề ổ ế ố
-Ho t đ ng β-mannanase cao nh t đ c tìm th y khi c m ng v i 1.0 mM IPTG, đ c bi t là ph n ngo i bào, trong khi m c đ ho t đ ng β-mannanase trong ạ ộ ấ ượ ấ ả ứ ớ ặ ệ ở ầ ạ ứ ộ ạ ộ
ph n t bào lysate t ng t nh không ph thu c vào n ng đ IPTG s d ng.H n n a, ho t đ ng trong t bào β-mannanase gi m sau khi h n 16 gi mà ầ ế ươ ự ư ụ ộ ồ ộ ử ụ ơ ữ ạ ộ ế ả ủ ơ ờ
không có s gia tăng c a ho t đ ng β-mannanase bào.ự ủ ạ ộ
- các đi u ki n bi u hi n t i u cho s bi u hi n gen mannanase là c m ng 1,0 mM IPTG và 16 gi 18 ° C sau khi c m ng.ề ệ ể ệ ố ư ự ể ệ ả ứ ờ ủ ở ả ứ
=> k t qu :ế ả E.coliBL21 (DE3) ch a ch p pET21d v i gen mannanase mang l i ho t đ ng β-mannanase ngo i bào và n i bào 37,1 U m i ml thô và 515 U m i ml ứ ấ ớ ạ ạ ộ ạ ộ ỗ ỗ
chi t xu t t bào thô, t ng ng, t ng ng v i m t ho t đ ng tích c a 37.100 và 515.000 U m i lít môi tr ng nuôi c y.H u h t các t bào tái t h p β-ế ấ ế ươ ứ ươ ứ ớ ộ ạ ộ ủ ỗ ườ ấ ầ ế ế ổ ợ
mannanase đã đ c tìm th y trong không gian periplasmic c a các t bào .C hai n i bào và ngo i bào β-mannanase cho th y kích th c gi ng h t nhau đó là ượ ấ ủ ế ả ộ ạ ấ ướ ố ệ
kho ng 40 kDa trên SDS-PAGE, và cũng cho th y ho t đ ng b ng cách phân tích zymogram trên b m t gel.ả ấ ạ ộ ằ ề ặ

II. CHUYỂN GEN TẠO CHỦNG MỚI SINH ENZYME B-MANNANASE
Bảng 1 Năng suất tái tổ hợp β-mannanase trong khoang tế bào khác nhau củaE.coli7(từ 100 ml )

Hình 1 SDS-PAGE và zymogram phân tích tái tổ hợp β-mannanase từE.coli7hệ thống biểu hiện.

Đặc tính của tái tổ hợp β-mannanase
Những ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme được xác định cho cả hai tái tổ hợp β-mannanase ngoại bào và nội bào.

Thank you !