Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men truyền thống

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN



HOÀNG THỊ THANH MÙI



PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO TỪ
THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học


Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. TRẦN THỊ THÚY

HÀ NỘI, 2014



TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN



HOÀNG THỊ THANH MÙI



PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
VI KHUẨN LACTIC SINH AXIT LACTIC CAO TỪ
THỰC PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. TRẦN THỊ THÚY

HÀ NỘI, 2014


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Trần Thị Thúy
đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo cũng nhƣ truyền dạy những kinh nghiệm quý báu,
ngƣời đã quan tâm và giúp đỡ em nhiệt thành trong quá trình thực hiện và hoàn
thành đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung - Tổ trƣởng bộ môn
Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN-Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2, đã dạy cho em
những bài học đầu tiên về Vi sinh, qua đó truyền cảm hứng cũng nhƣ niềm đam mê
đƣợc thử sức với lĩnh vực này. Em cảm ơn cô đã tạo điều kiện cho em có đƣợc môi
trƣờng làm việc tốt và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các cán bộ phòng thí nghiệm
CNSH - Vi sinh, khoa Sinh học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội đã giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại tổ bộ môn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, động viên, cũng nhƣ những góp ý quý
báu của các anh/chị và các bạn cùng làm việc trên phòng thí nghiệm.
Cuối cùng tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những ngƣời đã tiếp
thêm niềm tin, yêu thƣơng- mẹ và em trai - đã tƣ vấn, giúp đỡ con rất nhiều, cảm
ơn những ngƣời bạn thân đã động viên tôi trong suốt quá trình.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Hoàng Thị Thanh Mùi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả
nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với
các tác giả khác.

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Hoàng Thị Thanh Mùi

CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU : Colony Forming Unit
Cs : Cộng sự
ĐC : Đối chứng
EM : Effective microorganism
G
+
: Gram dƣơng
G
-
: Gram âm
GRAS : Generally Regarded As Safe
GYP : Glucose-Yeast extract-Peptone
OD : Optical Density (mật độ quang)
MRS : de Man - Rogosa - Sharpe
Nxb : Nhà xuất bản
STT : Số thứ tự
VK : Vi khuẩn
VSV : Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.Các kiểu lên men lactic 6
Hình 1.2. Cấu trúc axit lactic 6
Hình 1.3. Hai loại đồng phân của axit lactic 7
Hình 2.4. Chuẩn độ bằng buret (a) và màu dung dịch sau chuẩn độ bằng dung dịch
NaOH với sự có mặt của thuốc thử phnolphthalein (b) 15
Hình 2.5. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào/ml dịch nuôi
và OD
600
của chủng T6 17
Hình 2.6. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào/ml dịch nuôi
và OD
600
của chủng TH2 18
Hình 3.7. Phân lập vi khuẩn lactic trên đĩa Petri môi trƣờng MRS 20
Hình 3.8. Kiểm tra hoạt tính catalase của chủng vi khuẩn lactic TH2 (a) và
thí nghiệm đối chứng trên vi khuẩn E. coli 28
Hình 3.9. Chủng TH2 và T6 đƣợc nuôi trong ống Durham sau 48 giờ 28
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự sinh trƣởng, phát triển và sinh
axit tổng số của chủng TH2 32
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trƣởng, phát triển và sinh axit

tổng số của chủng T6 33














DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng MRS 12
Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng GYP 12
Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 33 chủng vi khuẩn lactic 21
Bảng 3.4. Sự sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp axit lactic của 10 chủng vi
khuẩn lactic tuyển chọn 25
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn
lactic tuyển chọn 26
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng, phát triển và sinh axit
tổng số của chủng TH2 30
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng, phát triển và sinh axit tổng
số của chủng T6 31
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng bán tổng hợp
đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và
T6 34

Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng cải tiến đến sinh trƣởng, phát triển và
khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 36
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc chiết bắp cải và môi trƣờng MRS đến sinh
trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 37











MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………. 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2
5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3
7. Những đóng góp mới của đề tài 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Vi khuẩn lactic 4
1.1.1. Lƣợc sử nghiên cứu vi khuẩn lactic 4
1.1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 4
1.1.3. Các kiểu lên men lactic ở vi khuẩn lactic 5
1.2. Axit lactic 6

1.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic 7
1.3.1. Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic 7
1.3.2. Sử dụng vi khuẩn lactic trong nông nghiệp và môi trƣờng 8
1.3.3. Sử dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp chế biến bảo quản rau quả, thịt và
thức ăn gia súc 9
1.3.4. Sử dụng vi khuẩn lactic trong y học 10
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
2.1. Vật liệu và thiết bị 11
2.1.1. Vi sinh vật 11
2.1.2. Máy móc, thiết bị 11
2.1.3. Hóa chất 11
2.1.4. Môi trƣờng 12
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 13


2.2.1. Phƣơng pháp làm mẫu phân lập 13
2.2.2. Phân lập vi khuẩn lactic 13
2.2.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao 14
2.2.4. Xác định axit tổng số 14
2.2.5. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 15
2.2.5.1. Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm đơn 15
2.2.5.2. Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram 16
2.2.6. Bảo quản chủng giống 16
2.2.6.1. Bảo quản trên thạch nghiêng 16
2.2.6.2. Bảo quản trong dung dịch 30% glycerin 16
2.2.6.3. Phƣơng pháp ria thuần chủng chủng giống 16
2.2.7. Phƣơng pháp xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế
bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD
600
16

2.2.8. Các phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa và khả năng sinh
axit lactic của chủng đƣợc tuyển chọn 18
2.2.8.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính catalase 18
2.2.8.2. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh khí từ glucose 18
2.2.8.3. Xác định ảnh hƣởng của các yếu tố lý hóa và môi trƣờng nuôi cấy tới sự
sinh trƣởng, phát triển và sinh axit lactic 19
2.2.9. Phƣơng pháp thống kê và xử lí kết quả

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20
3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các
chủng sinh axit lactic cao 20
3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic cao 24
3.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6 25
3.4. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lý hóa đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng
sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 29
3.4.1. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit
lactic của chủng TH2 và T6 29


3.4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh
axit lactic của chủng TH2 và T6 32
3.5. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng thay thế lên khả năng sinh trƣởng, phát
triển và sinh axit lactic của chủng TH2 và T6 34
3.5.1. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng tổng hợp lên sự
sinh trƣởng, phát triển và khả năng sinh axit lactic của chủng TH2 và
T6………… 34
3.5.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nƣớc chiết giá đỗ và bắp cải cải tiến đến sinh
trƣởng phát triển và sinh axit tổng số của chủng TH2 và T6 35
3.5.3. Ảnh hƣởng của tỉ lệ nƣớc chiết bắp cải trộn với MRS đến sinh trƣởng, phát
triển và hiệu suất sinh axit lactic của chủng TH2 và T6

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Vi khuẩn (VK) lactic là nhóm vi sinh vật (VSV) có lịch sử và ứng dụng lâu đời.
VK lactic đƣợc xem là an toàn (GRAS - Generally recognised as safe) và là loại
VSV thực phẩm (food grade).
Ứng dụng đầu tiên của VK lactic là trong ngành công nghiệp sản xuất axit
lactic, một nguồn nguyên liệu rất cần thiết cho nhiều ngành. Axit lactic có tác
dụng làm mềm và nở da (công nghiệp thuộc da), làm thuốc nhuộm (công nghiệp
dệt), làm dung môi trong sơn (công nghiệp in ấn, sơn), làm tiền chất để tổng hợp
chất dẻo sinh học PLA (poly lactic axit) và nhiều ứng dụng khác.
Chất dẻo sinh học có thể phân hủy đang là xu hƣớng nghiên cứu và phát triển
hiện nay. Các loại nhựa sinh học đang dần thay thế các loại nhựa có nguồn gốc dầu
mỏ. PLA là sản phẩm nhựa trong suốt, phân hủy sinh học, đƣợc tổng hợp từ axit
lactic. Đây là nguồn nguyên liệu mới thân thiện với môi trƣờng.
Axit lactic có mặt trong hoa quả, các sản phẩm lên men lactic, nƣớc giải khát,
ngoài tạo hƣơng còn kích thích sự tiết dịch vị, tăng nhu động ruột, thúc đẩy quá
trình tiêu hóa. Axit lactic giảm mùi thực phẩm và độ ngấy sau bữa ăn nhiều năng
lƣợng. Axit lactic giúp hòa tan các vitamin, khoáng chất. Muối lactate với các
nguyên tố vi lƣợng cũng thƣờng đƣợc dùng làm dƣợc phẩm, bổ sung cho cơ thể
dƣới dạng dễ hấp thu. Loại muối này còn đƣợc dùng trong công nghệ bảo quản
thực phẩm: giò lụa, chả, xúc xích, mì sợi… thay cho hàn the.
Với liều lƣợng phù hợp trong các sản phẩm đƣỡng da, axit lactic có tác dụng
làm cho da mềm, mịn (giữ ẩm và trẻ hóa làn da), làm trắng da (do tính tẩy nhẹ của
axit hữu cơ, trung hòa độ nhờn), đồng thời ngăn chặn sự xâm nhập của VK gây

viêm nhiễm. Axit lactic tạo môi trƣờng toan, ức chế các VSV khác. Ở ngƣời, động
vật, axit lactic có mặt ở ruột, âm đạo. Các sản phẩm lên men lactic cũng làm tăng
cƣờng miễn dịch đƣờng ruột, giảm cholesterol, chống các tác nhân gây ung thƣ.
Việt Nam từ xa xƣa đã có rất nhiều sản phẩm lên men truyền thống độc đáo và
có giá trị thực tiễn cao. Do khả năng sinh nhiều loại chất ức chế VSV (axit lactic,
2

diacetyl, bacteriocin…), lên men lactic đã trở thành một giải pháp bảo quản thực
phẩm hữu hiệu trong dân gian dƣới các hình thức: muối dƣa, muối cà, sản xuất
nem chua, tôm chua, Đây là nguồn VSV sinh axit lactic an toàn, cho axit lactic
cao, dễ sản xuất, giá thành rẻ, tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu tự nhiên. Việc
tuyển chọn những chủng VK lactic từ các sản phẩm lên men truyền thống có khả
năng sinh axit lactic cao là một hƣớng nghiên cứu có triển vọng, phù hợp với công
nghệ chế biến thực phẩm an toàn hiện nay.
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã chọn thực hiện đề tài: “Phân lập,
tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao từ thực phẩm lên men
truyền thống”.
2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao
từ thực phẩm lên men truyền thống để phục vụ công nghiệp chế biến thực phẩm.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống và sơ tuyển các
chủng sinh axit lactic cao
3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic cao
3.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn lactic TH2 và T6
3.4. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lý hóa đến sinh trƣởng, phát triển và khả năng
sinh axit lactic của chủng TH2 và T6
3.5. Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng thay thế lên khả năng sinh trƣởng, phát triển
và sinh axit lactic của chủng TH2 và T6
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

VK lactic đƣợc phân lập và tuyển chọn từ thực phẩm lên men truyền thống.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phƣơng pháp vi sinh học
Phân lập VK lactic; làm tiêu bản, quan sát hình thái VK dƣới kính hiển vi,
nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa và khả năng sinh axit lactic của chủng VK
tuyển chọn; xác định số lƣợng tế bào VK trong dịch nuôi; bảo quản chủng giống
3

VSV.
5.2. Phƣơng pháp hóa sinh
Chuẩn độ, xác định hàm lƣợng axit lactic trong dịch lên men.
5.3. Phƣơng pháp thống kê xác suất
Phân tích và thống kê các số liệu thu đƣợc theo excel 2007.
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
6.1. Ý nghĩa thực khoa học
Dựa trên các nghiên cứu về VK lactic và các phƣơng pháp tăng hiệu suất lên
men lactic trƣớc đây.
6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tuyển chọn đƣợc 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao để phục vụ công
nghiệp chế biến thực phẩm cũng nhƣ y học và dinh dƣỡng.
7. Những đóng góp mới của đề tài
Tuyển chọn đƣợc 1 - 2 chủng VK lactic sinh axit lactic cao để phục vụ công
nghiệp chế biến thực phẩm cũng nhƣ y học và dinh dƣỡng.

4

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn lactic
1.1.1. Lược sử nghiên cứu vi khuẩn lactic
Con ngƣời từ lâu đã biết chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, phomát,
muối dƣa, muối cà…), ủ chua thức ăn cho gia súc để tăng thời gian bảo quản cũng
nhƣ tăng hƣơng vị cho sản phẩm. Cho đến những năm 80 của thế kỉ 18, VK lactic
mới đƣợc giới khoa học phát hiện và bắt đầu chú ý nghiên cứu.
Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhelm Scheele lần đầu tiên tách
đƣợc axit lactic từ sữa bò lên men chua gọi là “axit sữa”… Nhƣng mãi đến năm
1857, Louis Pasteur mới chứng minh đƣợc việc làm chua sữa là kết quả hoạt động
của một nhóm VK đặc biệt là VK lactic [7].
Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công VK lactic đầu tiên và đặt tên là
Bacterium lactic (nay gọi là Streptococus lactic) [7].
Đến nay, các nhà khoa học đã phân lập và nghiên cứu nhiều loại VK lactic từ
nhiều nguồn cơ chất khác nhau trong tự nhiên: trong phân, rác, xác động thực vật,
trong các sản phẩm muối chua [15]… thậm chí trong niêm mạc đƣờng tiêu hóa, âm
đạo của ngƣời và động vật [22], [24]. Ngoài ra, một số loài VK lactic sống kí sinh
trên cơ thể thực vật, hút các chất tiết từ mô cây [23], [24].
1.1.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
VK lactic là tên gọi chung của những VK sinh axit lactic nhƣ là sản phẩm chính

trong quá trình chuyển hóa cacbonhydrat [7]. Do đặc tính chung này, các VK lactic
đƣợc xếp chung vào họ Lactobacteriaceace mặc dù chúng không đồng nhất về mặt
hình thái (bao gồm cả các VK dạng que ngắn, que dài, lẫn các VK hình cầu) [1].
VK lactic đƣợc đặc trƣng bởi khả năng sinh axit lactic từ các loại đƣờng khác
nhau, đặc biệt là đƣờng lactose. Hầu hết các VSV sinh axit lactic đều thuộc về họ
Lactobacteriaceae và đƣợc xếp vào 13 chi: Carnobacterium, Enterococcus,
Lactosphaera, Lactococcus, Melissococcus, Oenococus, Tetragenococcus,
Vagococcus, Weissella, Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc
5

[24]. Chúng có tế bào dạng hình cầu hoặc hình que, thành tế bào Gram dƣơng,
không di động, không sinh nội bào tử. Tuy nhiên, hiện nay ngƣời ta tìm thấy một số
giống trong họ VK lactic có khả năng sinh nội bào tử. VK lactic không khử nitrate,
phản ứng catalase âm tính, kỵ khí tùy nghi, một vài loài kị khí bắt buộc sống trong
hệ tiêu hóa của con ngƣời.
VK lactic là những VK đa khuyết dƣỡng. Để sinh trƣởng bình thƣờng ngoài
nguồn cacbon, chúng cần nitơ, một phần dƣới dạng các axit amin, một số vitamin,
nhiều yếu tố sinh trƣởng và khoáng vi lƣợng khác nhau… Chúng không thể phát
triển đƣợc trong môi trƣờng đơn giản chỉ gồm có đƣờng glucose và các khoáng
chất. Vì thế, ngƣời ta thƣờng phải bổ sung vào môi trƣờng một số dịch chiết giàu
dinh dƣỡng nhƣ: cao nấm men, cao thịt, các loại nƣớc chiết rau, củ, quả….
VK lactic đƣợc tìm thấy khắp nơi trong tự nhiên: dƣới da, trong hệ tiêu hóa,
trên bề mặt hoa quả và đặc biệt là các sản phẩm lên men truyền thống…
1.1.3. Các kiểu lên men lactic ở vi khuẩn lactic
Có hai kiểu lên men lactic là lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị
hình. Lên men lactic đồng hình tạo ra axit lactic là sản phẩm trao đổi chất chính
(chiếm > 90%). Trong khi đó, lên men lactic dị hình ngoài tạo ra axit lactic (50-60%
lƣợng sản phẩm trao đổi chất) còn tạo ra ethanol, axit acetic, glycerol và một số hợp
chất khác. Do vậy, lên men lactic đồng hình có ý nghĩa về mặt ứng dụng trong công
nghiệp sản xuất axit lactic [4] .

6


Hình 1.1.Các kiểu lên men lactic
1.2. Axit lactic
Axit lactic là chất hữu cơ không màu, mùi nhẹ, tan trong nƣớc và cồn. Công
thức hóa học của axit lactic là CH
3
CHOHCOOH (Hình 1.2 [25]). Đây là axit alpha
hydroxy (AHA), trong dung dịch, nó có thể mất một proton từ nhóm axit tạo ra ion
lactate CH
3
CHOHCOO
-
. Khối lƣợng phân tử của axit lactic là 90,08g. Nhiệt độ sôi
là 122
0
C, điểm tan 1
0
C.

Hình 1.2. Cấu trúc axit lactic
Axit lactic còn có tên gọi khác là 1- hydroxyethanol cacboxylic hay axit 2 -
hydroxypropanoic. Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất đối xứng
nên chúng có hai đồng phân quang học: D - axit lactic và L - axit lactic. Hai đồng
7

phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, nhƣng chỉ khác là khả năng làm
quay mặt phẳng phân cực của ánh sáng. Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn
toàn khác nhau.

Loại L - axit lactic ở dạng tinh thể, tan trong nƣớc, cồn etylic, eter, không tan
trong CHCl
3
. Nhiệt độ nóng chảy là 28
0
C, góc quay cực ở 15
0
là 2,67
0
.
Loại D - axit lactic ở dạng tinh thể, tan trong nƣớc, cồn. Nhiệt độ nóng chảy là
28
0
C, nhiệt độ sôi là 103
0
C, góc quay cực ở 15
0
là -2,26
0
.
Nếu D - axit lactic và L - axit lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50 : 50
ngƣời ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Hỗn hợp này đƣợc kí hiệu là DL - axit lactic.
Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỉ lệ lí tƣởng này mà chỉ
có khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL - axit lactic là dịch lỏng dạng siro, có khả
năng tan trong nƣớc, trong cồn, không tan trong CHCl
3
, nhiệt độ nóng chảy 16,7
0
C,
nhiệt độ sôi 122

0
C [9].
Tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, VK lactic sản xuất hai loại đồng
phân quang học: D (-) và L (+) lactic. Ở ngƣời, cả 2 loại đồng phân này đều đƣợc
hấp thu trong đƣờng ruột.

Hình 1. 3. Hai loại đồng phân của axit lactic
1.3. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
VK lactic đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp, nông
nghiệp, y dƣợc, và nhiều nhất là trong chế biến và bảo quản thực phẩm. Trong
những năm gần đây, VK lactic đƣợc quan tâm nghiên cứu nhƣ là nguồn VSV hữu
ích bổ sung vào chế phẩm probiotics cho ngƣời và vật nuôi.
1.3.1. Sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất axit lactic
Năm 1881, con ngƣời đã bắt đầu ứng dụng VK lactic để sản xuất axit lactic
8

trên quy mô công nghiệp. Lên men lactic là quá trình trao đổi chất và năng lƣợng
chủ yếu của nhiều nhóm VK lactic. Quá trình lên men này chuyển hóa đƣờng
lactose hoặc glucose, galactose thành nguồn năng lƣợng ATP phục vụ cho mọi hoạt
động sống của VK lactic. Axit lactic là sản phẩm phụ của quá trình lên men, đƣợc
VK tiết ra bên ngoài tế bào [1].
Axit lactic đƣợc con ngƣời sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau bởi những
ƣu điểm sau:
- Tăng cƣờng khả năng tiêu hóa protein sữa.
- Kích thích sự tiết dịch vị.
- Tăng nhanh cử động đầy thức ăn đi xuống dạ dày.
- Ức chế sinh trƣởng, phát triển của một số VSV gây bệnh trong đƣờng tiêu hóa.
- Là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp tế bào khi cần thiết.
Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng
dụng VK lactic trong công nghiệp chế biến sữa, phomat, xúc xích, dƣa chua; thịt,

tôm, cá muối chua; trong ủ chua thức ăn xanh; làm probiotics.
Axit lactic đƣợc sử dụng trong công nghiệp thuộc da (làm mềm và làm nở da),
trong công nghiệp dệt (làm thuốc nhuộm), trong công nghiệp mỹ phẩm (làm nguyên
liệu tạo các sản phẩm dƣỡng tóc, giảm sự lão hóa của tóc), trong in ấn, sơn và chế
tạo chất dẻo
Muối lactate với các nguyên tố khoáng thƣờng đƣợc dùng làm dƣợc phẩm
nhằm bổ sung cho cơ thể dƣới dạng dễ hấp thụ: lactate sắt đƣợc dùng để bổ sung sắt
cho những bệnh nhân thiếu máu; lactate canxi bổ sung canxi cho những bệnh nhân
loãng xƣơng…
Ngoài ra, axit lactic còn đƣợc dùng để làm hạ pH đƣờng ruột xuống 4 - 5. Do
đó, ức chế sự phát triển của VSV gây thối và E. coli (loại VSV thích nghi ở pH 6 - 7).
1.3.2. Sử dụng vi khuẩn lactic trong nông nghiệp và môi trường
VK lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium - loại nấm gây bệnh
điển hình trong đất. Nấm Fusarium khi phát triển quanh vùng rễ cây sẽ làm cây yếu
đi tạo điều kiên cho các bệnh cơ hội gây bệnh cho cây trồng [2].
9

Chế phẩm EM (Effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu,
bao gồm 80 chủng VSV trong đó có sự góp phần của VK lactic. Hiệu quả của chế
phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi
trƣờng [2].
1.3.3. Sử dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp chế biến bảo quản rau quả, thịt
và thức ăn gia súc
VK lactic là những VSV có nhiều đặc tính tốt nhƣ: sử dụng đƣợc nhiều nguồn
cacbon khác nhau, có khả năng sinh axit và nhiều chất ức chế khác nhau, phát triển
đƣợc ở nhiệt độ khá rộng và chịu mặn nên chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong
công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm.
Quá trình lên men lactic của VSV sinh ra các axit hữu cơ (axit lactic, axit
acetic ) do đó làm giảm pH môi trƣờng. Dƣới tác động của pH thấp, hầu hết các
VSV gây bệnh, gây hỏng thối thực phẩm nhƣ E. coli, Pseudomonas sp., Sarcina sp.,

Samonella sp., B. cereus, P. vulgaris, B. mensenterium, Clostridium hay
Archromobacter … [10], [12] đều bị tiêu diệt. Bacteriocin là một phát hiện có giá trị
trong bảo quản thực phẩm nói chung, trong thực phẩm lên men nói riêng.
Bacteriocin là những peptide hay protein, đƣợc tổng hợp ở riboxom của VK có khả
năng ức chế các VSV có quan hệ về chủng loài gần với chủng sinh ra bacteriocin.
Sữa chua là sản phẩm sữa lên men lactic nhờ một hoặc vài chủng VK lactic
khác nhau. Hai chủng: Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus là
hai chủng VK lactic thƣờng đƣợc sử dụng trong lên men sữa chua.
Sử dụng lên men lactic để chế biến các sản phẩm rau, quả, thịt, cá, sữa là một
phƣơng pháp bảo quản thực phẩm phổ biến hiện nay. Lên men lactic không những
giúp kéo dài thời gian bảo quản các sản phẩm thực phẩm để cung cấp cho ngƣời
tiêu dùng ở những khu vực xa xôi, khi thời tiết xấu, khan hiếm rau tƣơi, lúc giáp
vụ,… mà còn tạo ra sự đa dạng về sản phẩm thực phẩm với màu sắc, độ rắn chắc và
hƣơng vị mong muốn nhƣ: phomát, xúc xích, nem chua [3].
Lên men lactic đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất các thực phẩm muối chua
truyền thống nhƣ: nem chua, tôm chua, thịt chua, rau quả muối chua… ở khắp nơi
10

trên thế giới. Từ các sản phẩm đặc trƣng nhƣ kim chi Hàn Quốc, nem chua Việt
Nam, nham của Thái Lan đến các sản phẩm rau quả muối chua nhƣ cải bắp
Sauerkraut của Đức, rau dƣa muối chua vùng Đông Nam Á… [11], [19]. Đây là loại
thực phẩm đƣợc sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của
từng dân tộc.
Ngoài ra, lên men lactic còn đƣợc sử dụng để ủ chua thức ăn xanh cho gia súc,
dự trữ một nguồn thức ăn giàu dinh dƣỡng cho gia súc trong suốt mùa khô, mùa
đông lạnh.
1.3.4. Sử dụng vi khuẩn lactic trong y học
Gần đây, ngƣời ta đã phát hiện một vai trò lớn của VK lactic đối với sức khỏe
con ngƣời cũng nhƣ các động vật nuôi. Một số VK lactic sinh “kháng sinh” đƣợc sử
dụng làm chế phẩm “men tiêu hóa sống” probiotics để chữa một số bệnh rối loạn

tiêu hóa, tiêu chảy và phục hồi cân bằng hệ VSV đƣờng ruột. Trong đó, nổi bật là
Lacidophilus, khi đƣợc bổ sung vào đƣờng tiêu hóa, chúng phát triển tại ruột già, ức
chế một số VK gây bệnh đƣờng ruột. Nhờ vào khả năng sinh axit lactic và
bacteriocin trong đƣờng ruột, Lactobacillus cải thiện đƣợc tình trạng tiêu chảy, tăng
nhu động ruột, chữa đƣợc chứng táo bón.
Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị các
bệnh rối loạn và viêm nhiễm, bao gồm: viêm ruột kết, đầy hơi, ung bƣớu, làm hạ
cholesterol trong máu, đau đầu, viêm âm đạo không điển hình và cải thiện đƣợc tình
trạng không sử dụng đƣợc lactose.



11

CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vi sinh vật
Các chủng VK lactic phân lập từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống
nhƣ: nem chua, tôm chua, thịt chua, dƣa cải muối chua, bắp cải muối chua… tự chế
biến theo cách thức truyền thống.
VSV đối chứng: E. coli.
2.1.2. Máy móc, thiết bị
- Các thiết bị để khử trùng, vô trùng: Tủ cấy (Sanyo, Nhật), nồi khử trùng
(Melag autoclave 23, Đức), tủ sấy (Ketong, Trung Quốc), lò vi sóng (M907, Thụy
Điển), máy cất nƣớc (Trung Quốc), bể siêu âm (Đức)…
- Các thiết bị để nuôi cấy và giữ giống: Tủ ấm (Thermosi SR 3000, Bỉ), máy
lắc ổn nhiệt (Gallen Kamp, Anh), tủ lạnh (Sanyo, Nhật), tủ lạnh sâu (Sanyo ultra
low, Nhật)…

- Các thiết bị để nghiên cứu đặc điểm hình thái và số lƣợng tế bào: kính hiển
vi quang học (Olympus CH-2, Nhật)…
- Các thiết bị nghiên cứu khác: Cân điện tử (BP610, Nhật), máy ly tâm thƣờng
(Centrifuge 5415C, Đức), máy li tâm lạnh (Avanti TM30 centrifuge, Đức), máy đo
pH (Mettler delta 320, Trung Quốc), máy đo quang phổ (Hewlett Packard 8452A,
Đức), máy khuấy từ (MM3M, Nga), ổn nhiệt (Hanke K15, Nhật)…
2.1.3. Hóa chất
Thành phần hữu cơ: Cao nấm men (Difco - Mỹ); Cao thịt (Himedia- Ấn Độ);
Pepton (Nhật); Thạch và Glucose (Công ty vật tƣ khoa học kĩ thuật, Việt Nam);
(NH
4
)
3
C
6
H
5
O
7
và
,
CH
3
COONa (Peking’s reagent, Trung Quốc).
Thành phần vô cơ: CaCO
3
; NaCl (Việt Nam); NaOH (AR, Trung Quốc);
MgSO
4
.7H

2
O (BDH, Anh); MnSO
4
(Trung Quốc); NaH
2
PO
4
(Kanto, Nhật), FeSO
4
.
7H
2
O.
12

Ngoài ra: Tím gentian (Việt Nam), Safranin O (Anh), Tween 80 (Guang Zhou,
Trung Quốc)…
2.1.4. Môi trường
2.1.4.1. Môi trường phân lập, nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu vi khuẩn lactic
(môi trường MRS có CaCO
3
)
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng MRS
Thành phần
Môi trƣờng
đặc (g/l)
Thành phần
Môi trƣờng đặc
(g/l)
Pepton

10
MgSO
4
.7H
2
O
0,1
Cao thịt
5
MnSO
4

0,05
Cao nấm men
5
CaCO
3

5
Glucose
20
Thạch
20
NaH
2
PO
4

2
Tween 80

1,0 ml
CH
3
COONa
5
Nƣớc cất
1000 ml
(NH
4
)
3
C
6
H
5
O
7

2
pH
6,5 ± 0,2

2.1.4.2. Một số môi trường nghiên cứu vi khuẩn lactic.
- Môi trƣờng GYP (g/l)
Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng GYP
Thành phần
Môi trƣờng
đặc (g/l)
Thành phần
Môi trƣờng

đặc (g/l)
Cao thịt
2
CH
3
COONa
2
Cao nấm men
10
Tween 80
0,5 ml
Glucose
10
Dung dịch muối
0,5 ml
Pepton
5
Thạch
20
CaCO
3

5
Nƣớc cất
1000 ml


pH
6,8 ± 0,2
Thành phần của 100ml dung dịch muối (w/v) là:

MgSO
4
. 7 H
2
O: 4,0g; NaCl: 0,2g; MnSO
4
. 4H
2
O: 2,0 g; FeSO
4
. 7H
2
O: 0,2g.
13

- Một số môi trƣờng thay thế:
Đun sôi 250g nguyên liệu hữu cơ (giá đỗ, bắp cải, khoai tây, rau má, hành tăm
hoặc cải ngọt) trong 1 lít nƣớc, trong 15 phút. Để nguội rồi lọc lấy dịch trong, đƣợc
1 lít dịch chiết 25%.
Riêng đỗ tƣơng, chúng tôi tiến hành ngâm nƣớc 250g đỗ tƣơng, để qua một
đêm. Sau đó, xay nhuyễn đỗ tƣơng bằng máy xay sinh tố. Dùng vải màn, lọc lấy
dịch. Bổ sung nƣớc vừa đủ 1 lít.
Môi trƣờng Giá - đƣờng (g/l): Dịch chiết giá đỗ 25 % bổ sung thêm 20g
glucose.
Môi trƣờng Bắp cải - pepton (g/l): Dịch chiết bắp cải 25 % bổ sung thêm 10g
pepton.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp làm mẫu phân lập
Các mẫu phân lập là những mẫu muối chua tự làm dựa trên các công thức
truyền thống, không chứa chất bảo quản. Nguyên liệu đƣợc lựa chọn là nguyên liệu

sạch từ các sản phẩm hữu cơ: thịt lợn sạch, bì lợn sạch, các loại rau hữu cơ, tôm
nƣớc ngọt…
2.2.2. Phân lập vi khuẩn lactic
Phân lập trực tiếp trên môi trƣờng MRS có CaCO
3
theo phƣơng pháp của Koch.
Nghiền nhuyễn mẫu, trộn đều và cân lấy 1g. Sau đó, hòa tan 1g mẫu này trong
nƣớc cất đã vô trùng để đạt độ pha loãng từ 10
-1
đến 10
-8
. Dùng pipet lấy 100μl ở độ
pha loãng từ 10
-3
đến 10
-8
nhỏ lên bề mặt môi trƣờng MRS trong hộp Petri, gạt đều
bằng que trang vô trùng. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho mỗi độ pha loãng mẫu.
Để các hộp Petri trong tủ ấm 30
0
C.
Đếm số khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO
3
ở các thời điểm 12, 24, 36 giờ nuôi
cấy. Số lƣợng tế bào VK lactic trong 1g mẫu đƣợc tính theo phƣơng pháp đếm CFU
(Colonies forming unit - đơn vị hình thành khuẩn lạc). Đếm 3 đĩa của mỗi độ pha
loãng ở thời điểm 36 giờ và kết quả (a) là trung bình cộng của cả 3 lần đếm:

14

N= a.1000/v. Df
Trong đó:
N: Tổng số CFU của vi khuẩn lactic trong 1g mẫu.(tế bào/ml).
a: Số CFU tạo vòng phân giải CaCO
3
trên đĩa phân lập có độ pha
loãng Df (10
-n
).
v: Thể tích mẫu hút để trang lên đĩa thạch.
Sau khi đếm, dựa vào sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc của VK lactic mọc
trên bề mặt môi trƣờng trong đĩa Petri (kích thƣớc, màu sắc, vòng phân giải
CaCO
3
), tiến hành tách một số khuẩn lạc ra khỏi môi trƣờng phân lập và nuôi cấy
trên thạch nghiêng (môi trƣờng MRS) trong tủ ấm 30
0
C. Sau 24 giờ nuôi cấy,
chuyển các ống thạch nghiêng này vào giữ trong tủ lạnh 4
0
C để sử dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo [12].
Để tiện lợi cho việc tuyển chọn, chúng tôi tạm gọi mỗi khuẩn lạc đƣợc tách ra
nhƣ trên là một chủng VK lactic.
2.2.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao
Khả năng sinh axit của chủng nghiên cứu khi nuôi trong môi trƣờng MRS dịch
thể ở các điều kiện thí nghiệm khác nhau đƣợc xác định bằng sự giảm pH của dịch
nuôi cấy so với pH ban đầu của môi trƣờng. Độ pH đƣợc xác định bằng máy đo pH
(pH mettle delta 320) [12].
Chủng nào có pH cuối thấp (pH < 4) sẽ đƣợc tiếp tục nghiên cứu khả năng

sinh axit tổng số bằng phƣơng pháp chuẩn độ axit lactic với dung dịch NaOH 1%.
Sau đó chọn ra khoảng 10 chủng có axit tổng số cao và sinh trƣởng tốt để nuôi
cấy tĩnh ở 30ºC với OD
600
ban đầu là 0,1 và chọn ra 1 - 2 chủng sinh axit tổng số
cao nhất dựa vào để tiếp tục nghiên cứu.
2.2.4. Xác định axit tổng số
Xác định axit tổng số theo Therner:
Một độ Therner tƣơng đƣơng 1 ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 100ml nguyên liệu.
Nguyên tắc: axit tổng đƣợc đo bằng cách chuẩn độ 100ml mẫu dịch lên men
bằng dung dịch NaOH 0,1N. Trƣớc khi chuẩn độ, thêm 2 - 3 giọt phenolphthalein
15

1% vào dung dịch mẫu thí nghiệm để làm chất chỉ thị. Kết quả % axit lactic đƣợc
tính theo công thức:
 
 
ẫ 

Trong đó: M: Khối lượng phân tử axit lactic (g)
90: trọng lượng phân tử lactic (g)
D: Độ pha loãng
Cách tiến hành:
Bổ sung 10ml mẫu vào 90ml nƣớc cất.
Thêm 2-3 giọt phenolphthalein 1% làm chất chỉ thị. Sử dụng buret chứa 25ml
dung dịch NaOH 0,1M để chuẩn độ (Hình 2.4 và Hình 2.5) cho đến khi dung dịch
mẫu xuất hiện mầu hồng không đổi. Xác định V
NaOH
0,1N đã sử dụng để chuẩn độ.

(a) (b)
Hình 2.4. Chuẩn độ bằng buret (a) và màu dung dịch sau chuẩn độ bằng dung
dịch NaOH với sự có mặt của thuốc thử phenolphthalein (b)

2.2.5. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn
2.2.5.1. Quan sát tế bào trên tiêu bản nhuộm đơn
Nhỏ một giọt thuốc nhuộm Xanh metylen hoặc Fuchsin kiềm lên tiêu bản VK
(đã cố định mẫu VK lactic), nhuộm trong 30 giây đến 1 phút. Sau đó rửa nƣớc,
thấm khô và soi kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000X.
Kết quả soi tiêu bản nhuộm đơn cho phép xác định đƣợc hình dạng tế bào VK
(hình thái tế bào). Dựa vào sự đồng nhất của các tế bào trên tiêu bản để xác định